EA009008B1 - Способ амплификации вируса оспы - Google Patents

Способ амплификации вируса оспы Download PDF

Info

Publication number
EA009008B1
EA009008B1 EA200500448A EA200500448A EA009008B1 EA 009008 B1 EA009008 B1 EA 009008B1 EA 200500448 A EA200500448 A EA 200500448A EA 200500448 A EA200500448 A EA 200500448A EA 009008 B1 EA009008 B1 EA 009008B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
cells
virus
serum
medium
free medium
Prior art date
Application number
EA200500448A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200500448A1 (ru
Inventor
Ингмар Рете
Ева Фельдер
Карл Хеллер
Original Assignee
Бавариан Нордик А/С
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=31970216&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA009008(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Бавариан Нордик А/С filed Critical Бавариан Нордик А/С
Publication of EA200500448A1 publication Critical patent/EA200500448A1/ru
Publication of EA009008B1 publication Critical patent/EA009008B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/275—Poxviridae, e.g. avipoxvirus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/275—Poxviridae, e.g. avipoxvirus
    • A61K39/285—Vaccinia virus or variola virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C12N7/04—Inactivation or attenuation; Producing viral sub-units
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C12N7/04—Inactivation or attenuation; Producing viral sub-units
    • C12N7/08—Inactivation or attenuation by serial passage of virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24151—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к способу культивирования первичных клеток. Первичные клетки культивируют в бессывороточной среде, содержащей фактор, выбранный из группы, состоящей из факторов роста и факторов прикрепления. Способ культивирования первичных клеток может быть одной стадией способа амплификации вирусов, таких как вирусы оспы. По данному последнему способу первичные клетки культивируют в бессывороточной среде, содержащей фактор, выбранный из группы, состоящей из факторов роста и факторов прикрепления. Затем клетки инфицируют вирусом и инфицированные клетки культивируют в бессывороточной среде до получения вируса потомства.

Description

Настоящее изобретение относится к способу культивирования первичных клеток. Первичные клетки культивируют в бессывороточной среде, содержащей фактор, выбранный из группы, состоящей из факторов роста и факторов прикрепления. Способ культивирования первичных клеток может быть одной из стадий в способе амплификации вирусов, таких как вирусы оспы. По данному последнему способу первичные клетки культивируют в бессывороточной среде, содержащей фактор, выбранный из группы, состоящей из факторов роста и факторов прикрепления. Затем клетки инфицируют вирусом, и инфицированные клетки культивируют в бессывороточной среде до продукции потомства вируса.
Уровень техники изобретения
Большинство вирусных вакцин, таких как аттенуированные или рекомбинантные вирусы, промышленно получают в системах клеточных культур. Использованные для продукции вируса/вакцины клетки могут быть клеточными линиями, т.е. клетками, которые непрерывно растут ίη νίίτο либо как суспензионная культура единичных клеток в биореакторах, либо как монослой на поддерживающей клетки поверхности колб для культуры клеток тканей или вращающихся колбах. Некоторыми примерами клеточных линий, используемых для получения вирусов, являются эмбриональная клеточная линия легкого человека МКС-5, используемая для производства вирусов полиомиелита, и эмбриональная клеточная линия легких человека ^1-38, используемая для производства вируса кори, вируса свинки и вируса краснухи (ММК II), Мегк 8йатр & Пойте.
Для промышленного производства вакцин используются не только клеточные линии, но также и первичные клетки животных. Примером первичных клеток, которые используются для получения вируса, являются эмбриональные фибробласты цыпленка (клетки СЕЕ). Данные клетки используются для продуцирования вируса кори и японского энцефалита (Райеит Мепеих), вируса свинки (производимого Ргоуассте), вируса бешенства (производимого СЫтоп ВетЫпд СтЬН & Со.), вируса желтой лихорадки (производимого ЛргПтах). вируса гриппа (производимого \Ууе111 ЬаЬк и 8тййК1ше & Веесйат) и модифицированного вируса вакцины Анкара (МУА).
Клетки СЕЕ используются часто, так как большинство вирусных вакцин получают аттенуированием вирулентности, вызывающей заболевание вируса последовательными пассажами в клетках СЕЕ. Аттенуированный вирус более не вызывает заболевание, но он все еще способен стимулировать эффективный защитный иммунитет против вирулентной формы вируса. Примером данного типа вируса является МУА. Репликация данного вируса сильно ограничена у людей и большинства животных. МУА разрабатывают в качестве вакцины-вектора, поскольку его можно использовать для экспрессии антигенов, полученных из множества агентов, вызывающих заболевания у людей. Аттенуированные вирусы, такие как МУА, предпочтительно не размножают в клетках человека, так как существует опасение, что вирусы могли бы стать снова способными к репликации в клетках человеческого происхождения. Впрочем, вирусы, которые восстановили способность реплицироваться в клетках человека, могли бы быть опасными для здоровья, если их вводить людям, в особенности, если люди имеют предварительно активированный иммунитет. По этой причине некоторые аттенуированные вирусы, такие как МУА, если они предназначены для использования у людей, производятся строго в клетках СЕЕ.
Кроме того, клетки СЕЕ используются для тех вирусов, которые растут только в указанных клетках. Примерами таких вирусов, в частности, являются вирусы птиц, такие как вирусы оспы птиц, в особенности вирус оспы канареек, АЕУАС, вирус оспы домашней птицы и ЫУУАС.
Клеточные линии и первичные клетки, растущие в условиях культивирования ίη νίίτο, нуждаются в специальной ростовой и поддерживающей среде, которая может обеспечить (I) размножение клетки в логарифмической фазе и (II) жизнедеятельность клетки, когда клетки больше не делятся, т.е. когда клетки находятся в стационарной фазе. Обычно используемая для клеточной культуры среда содержит обогащенный солевой раствор, включающий витамины, аминокислоты, необходимые микроэлементы и сахара. Г ормоны роста, ферменты и биологически активные белки, необходимые для поддержания роста и жизнедеятельности клетки, обычно добавляют к среде в качестве добавки в виде полученного из крови животных продукта сыворотки. Примерами полученных из крови животных продуктов сыворотки являются эмбриональная телячья сыворотка, сыворотка курицы, сыворотка лошади и сыворотка свиньи. Указанные сыворотки получают из фракционированной крови, из которой удалены красные кровяные и белые кровяные клетки. Первичные клетки, такие как клетки СЕЕ, даже более зависимы от источников происхождения сыворотки животных, чем клеточные линии. Так, первичные клетки обычно культивируют в среде для культуры клеток, содержащей от 5 до 10% сыворотки, в большинстве случаев эмбриональной телячьей сыворотки (ЕС8).
Сыворотки животных содержат не только факторы, необходимые для роста клеток, но также и факторы, которые необходимы для клеток, которые растут в природе как адгезивные клетки, для прикрепления к поддерживающей клетки поверхности сосуда для культивирования. Таким образом, для адгезивных клеток критично, чтобы к среде добавлялось достаточное количество сыворотки, чтобы дать клеткам возможность вырасти и образовать монослой.
К сожалению, бычья/эмбриональная телячья сыворотка, а также сыворотки других животных могут содержать случайные патогенные агенты, такие как вирусы. Существует потенциальная опасность, что данные патогенные агенты передадутся животному/человеку, которого будут лечить или вакцинировать
- 1 009008 вакциной или любым другим фармацевтическим продуктом, продуцированным в клеточной культуре. Это имеет особую значимость, если продукты клеточной культуры вводят людям с предварительно активированным иммунитетом. Одной из множества потенциальных основных проблем, связанных с широко используемой добавкой бычьей сыворотки, является возможность передачи агента, вызывающего бычью губчатую энцефалопатию (В8Е), животным/людям, которые контактируют с продуктами, продуцированными в клеточной культуре.
Ввиду возможной опасности, связанной с использованием сывороток животных в клеточной культуре, становится ясно, что производственные процессы, свободные от использования продуктов животных, весьма желательны.
С этой целью для непрерывно растущих клеточных линий и для получения вирусов в непрерывно растущих клеточных линиях, соответственно, разработаны специальные среды, к которым не нужно добавлять сыворотки животных. Примером такой бессывороточной среды, которую можно использовать для культивирования клеточных линий, является УР-8ЕМ, производимая 01Ьсо ВКЕ/Ьйе Тсс11по1ощс5. УР-8ЕМ, согласно информации производителей, специально создана для роста УЕВО, СО8-7, ΜΌΒΚ, Нер2, ΒΗΚ-21 и других важных клеточных линий (Рпсс. Р. апб Еусдс. Е. Еосик, 1997, 19:67-69) и для получения вирусов в указанных клеточных линиях. Не имеется никакой информации относительно культивирования первичных клеток в указанной среде.
В И8 5503582 описано культивирование клеток СЕЕ в среде, содержащей 4% сыворотку теленка, которое сопровождается инфицированием клеток вирусом оспы домашней птицы в бессывороточной среде. 8ра1аго, А.С. с1 а1., 1. Се11. 8сг 1976, 21, 407-413 обнаружил, что можно поддерживать жизнедеятельность клеток СЕЕ в бессывороточной среде в течение 24 ч до образования монослоя. Таким образом, согласно двум публикациям среды, которые используются для культивирования клеток после посева, содержат сыворотку. Бессывороточная среда использовалась только для поддержания жизнедеятельности клеток, которые уже прикреплены к поверхности и которые достигли стационарной фазы. Если посев выполнен на обычную среду, такую как среда 199 или ВРМ1-1640, не содержащую сыворотку, монослой не образуется, и клетки формируют в средах нежизнеспособные агрегаты.
XV О 98/15614 относится к конкретной бессывороточной среде для культивирования клеток животных ίη уйго. Клетки, которые можно культивировать в среде, как описано в ХУО 98/15614, представляют собой клетки животного происхождения, включая клетки, полученные от млекопитающих, птиц, насекомых или рыб. Клетки млекопитающих могут быть первичными клетками человеческого происхождения. Не сделано никаких ссылок на первичные клетки от птиц.
В И8 5405772 приведено описание бессывороточной среды для пролиферации и развития клеток. Клетки предпочтительно представляют собой гематопоэтические и стромальные клетки костного мозга. Первичные клетки птиц не упоминаются.
В ХУО 98/04680 приведено описание бессывороточной среды для роста зависимых от фиксации клеток млекопитающих, таких как клеточные линии ΒΗΚ, Уего или МВС-5. ХУО 98/04680 не относится ни к первичным клеткам, ни к клеткам птиц.
Цель изобретения
Цель настоящего изобретения относится к способу, позволяющему культивировать первичные клетки, в особенности первичные клетки птиц в бессывороточной среде, где способ обеспечивает (I) выращивание клеток во время логарифмической фазы и (II) поддержание жизнедеятельности клеток в стационарной фазе. Кроме того, если клетки являются адгезивными клетками, среда предпочтительно может обеспечить (III) прикрепление адгезивных клеток к поверхности сосуда для культивирования клеток. Дальнейшая цель настоящего изобретения относится к способу получения вируса с использованием первичных клеток в бессывороточных условиях.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к способу культивирования первичных клеток, отличающемуся тем, что клетки культивируются в бессывороточной среде, содержащей фактор, выбранный из группы, состоящей из факторов роста и факторов прикрепления.
По настоящему изобретению первичные клетки, которые растут в природе как адгезивные, прикрепляются к поверхности сосуда для культивирования клеток после посева и растут в логарифмической фазе до образования монослоя. Согласно настоящему изобретению оставшиеся клетки можно содержать в среде, использованной во время прикрепления и логарифмического роста клеток.
Способ настоящего изобретения не ограничен для клеток, которые образуют монослои. По альтернативному осуществлению способ по настоящему изобретению можно использовать для всех других типов первичных клеток, таких как клетки, растущие в природе в суспензионной культуре (например, лимфоциты или другие типы клеток крови), или клетки, которые в природе росли бы как адгезивные клетки, но которые были адаптированы к росту в суспензионной культуре.
Как показано ниже, клетки можно также использовать для бессывороточной амплификации вирусов, которые могли бы быть применимы в качестве вакцин.
- 2 009008
Было неожиданно, что первичные клетки, растущие в природе в качестве адгезивных клеток, (I) могут эффективно прикрепляться к поверхности сосудов для культивирования клеток без образования неприемлемого количества агрегатов и (II) могут расти в логарифмической фазе в отсутствие сыворотки, поскольку обычно полагали, что первичные клетки зависят от множества содержащихся в сыворотке различных факторов и компонентов. Кроме того, полагали, что адгезивные клетки образуют нежизнеспособные агрегаты, которые не прикрепляются к поверхности сосудов для культивирования клеток при культивировании в бессывороточной среде. Таким образом, оказалось неожиданным, что достаточно добавить к бессывороточной среде фактор, выбранный из группы, состоящей из факторов роста и факторов прикрепления, для того, чтобы достичь прикрепления и роста адгезивных первичных клеток. Кроме того, оказалось неожиданным, что первичные клетки, культивированные в суспензионной культуре, могут расти в среде, использованной в способе по настоящему изобретению. К тому же было удивительно, что такие первичные клетки птиц, как эмбриональные фибробласты цыпленка (СЕЕ), можно культивировать до прикрепления к поверхности сосуда для культивирования клеток без образования неприемлемого количества агрегатов в бессывороточной среде, содержащей фактор, выбранный из группы, состоящей из факторов роста и факторов прикрепления, так как было известно, что клетки растут крайне плохо в бессывороточной среде, не содержащей факторов роста или факторов прикрепления, т.е. было неожиданным, что слабые ростовые свойства первичных клеток птиц можно было значительно улучшить, добавляя к бессывороточной среде фактор, выбранный из факторов роста и факторов прикрепления.
Используемый в настоящем описании термин «первичные клетки» хорошо известен специалистам в данной области. Не ограничивая следующее определение, термин «первичные клетки» означает клетки, которые были только что выделены из ткани животного или человека, органа или организма, причем клетки не способны к непрерывной и неограниченной репликации и делению. Обычно первичные клетки делятся в клеточной культуре менее чем 100 раз, часто менее чем 50 раз, часто менее чем 25 раз. Таким образом, первичные клетки не подвержены явлению иммортализации. Примерами первичных клеток служат лимфоциты пуповинной крови и фибробласты человека или животных. Предпочтительными примерами фибробластов животных являются фибробласты птиц, наиболее предпочтительны фибробласты эмбриона цыпленка (клетки СЕЕ). Предпочтительным примером для первичных фибробластов человека являются фибробласты крайней плоти человека.
Способы выделения первичных клеток хорошо известны специалистам в данной области. В основном первичные клетки получают непосредственно из тканей, органов или эмбрионов. Для получения единичных клеток ткани, органы или эмбрионы подвергаются действию протеазы. Затем клетки культивируют по способу настоящего изобретения в условиях культивирования ίη νίΐτο.
Более определенно, клетки СЕЕ получают из расщепленных протеазой эмбрионов цыплят. По настоящему изобретению клетки СЕЕ хорошо растут как адгезивные клетки, прикрепленные к твердой поддерживающей клетки поверхности. Клетки начинают размножаться и образуют монослой. Если клетки СЕЕ (после расщепления эмбриона) культивировать ίη νίίτο в стандартной культуральной среде без сыворотки животного, они случайным образом прикрепятся к твердой поддерживающей клетки поверхности, а не реплицируются до образования монослоя клеток и со временем медленно отсоединятся от твердой поддерживающей клетки поверхности. Напротив, если клетки СЕЕ культивируют по способу настоящего изобретения, клетки, прикрепленные к твердой поверхности, растут в логарифмической фазе, пока не образуется монослой, и можно поддерживать их жизнедеятельность в стационарной фазе в течение нескольких дней.
Термин «культивирование клеток» в бессывороточной среде в контексте адгезивных первичных клеток означает посев клеток в сосуд для культивирования с бессывороточной средой для роста клеток в бессывороточной среде в логарифмической фазе до тех пор, пока не образуется монослой, и/или для поддержания жизнедеятельности клеток в бессывороточной среде, как только образуется монослой. Наиболее предпочтительно термин «культивирование клеток» в бессывороточной среде означает способ, в котором все вышеуказанные стадии выполняют в бессывороточной среде, так что никаких продуктов сыворотки животных не присутствует во время всего процесса культивирования клеток. Таким образом, в большинстве общепринятых значений термин «культивирование клеток в бессывороточной среде» означает тот факт, что все среды, приводящие к образованию монослоя, представляют собой бессывороточные среды. Используемые на всех вышеуказанных стадиях среды могут содержать фактор, выбранный из факторов роста и факторов прикрепления. Однако может быть значительным добавление такого фактора только к среде, используемой для прикрепления клеток и/или роста клеток в логарифмических условиях.
Термин «культивирование клеток» в бессывороточной среде в контексте роста клеток в суспензионной культуре означает посев клеток в сосуд для культивирования с бессывороточной средой, рост клеток в бессывороточной среде в логарифмической фазе и/или поддержание жизнедеятельности клеток в бессывороточной среде, как только получат плотность насыщения, при которой не происходит дальнейшее размножение. Более предпочтительно термин «культивирование клеток» в бессывороточной среде означает способ, в котором все вышеуказанные стадии выполняют в бессывороточной среде, так что никаких продуктов сыворотки животных не присутствует во время всего культивирования клеток. Исполь
- 3 009008 зуемые на всех вышеуказанных стадиях среды могут предпочтительно содержать фактор, выбранный из группы факторов роста. Однако может быть значительным добавление такого фактора только к среде, используемой для посева клеток и/или роста клеток в логарифмических условиях. Как более подробно объяснено ниже, возможно также культивирование клеток, которые росли бы нормально в качестве прикрепленных клеток, также как в качестве суспензионной клеточной культуры, если выбраны подходящие условия инкубации (например, используя «волновую» инкубацию). Способ по настоящему изобретению также используют для данного типа инкубации.
Термин «бессывороточная» среда означает любую среду для клеточной культуры, которая не содержит сывороток животного или человеческого происхождения. Подходящие среды для клеточных культур хорошо известны специалистам в данной области. Данные среды содержат соли, витамины, буферы, источники энергии, аминокислоты и другие вещества. Примером среды, подходящей для бессывороточного культивирования клеток СЕТ, является среда 199 (Могдап, Мойоп апб Рагкег; Ргос. 8ос. Ехр. ΒίοΙ. Меб. 1950, 73, 1; доступная в числе других от ЫГе Тесйпо1од1е§).
Используемые по способу настоящего изобретения среды, в особенности среды, используемые для адгезивных клеток, таких как клетки СЕТ, содержат фактор, выбранный из группы, состоящей из факторов роста и факторов прикрепления. Примером фактора прикрепления является фибронектин.
Для клеток, которые росли бы в природе как адгезивные клетки, которые, однако, культивируют тем не менее в суспензионной культуре (которая предназначена, например, для клеток СЕТ), особенно предпочтительно использовать фактор, выбранный из группы факторов роста. Примерами факторов роста, применимых для данного типа культивирования, являются рекомбинантный эпидермальный фактор роста (ЕСТ) быка, мыши, курицы или человека. Наиболее предпочтительным является рекомбинантный ЕСТ человека (гй-ЕСТ) (Сйетюоп Ιηΐ., номер по каталогу СТ001).
Для клеток, растущих в природе в суспензионной культуре, среда может предпочтительно включать фактор, выбранный из группы факторов роста, включая ЕСТ. Наиболее предпочтительно факторы роста для данного типа клеток представляют собой факторы, специфичные для неадгезивных клеток. Примерами таких факторов роста являются интерлейкины, СМ-С8Т, С-С8Т и др. Специалисты в данной области могут легко определить обычным экспериментированием, какой тип фактора подходит для какого типа клеток.
Если добавляемым к бессывороточной среде фактором является ЕСТ, в особенности гй-ЕСТ, его предпочтительно добавляют к среде в концентрации от 1 до 50 нг/мл, более предпочтительно от 5 до 20 нг/мл. Однако специалисты в данной области осознают тот факт, что для оптимального результата различные типы клеток могут нуждаться в слегка различной концентрации ЕСТ.
Если добавляемым к бессывороточной среде фактором прикрепления является фибронектин (например, Сйетюоп Ιηΐ.; фибронектин плазмы человека; номер по каталогу ТС010), его предпочтительно добавляют к среде в концентрации от 1 до 50, более предпочтительно от 1 до 10 мкг/см2 поверхности сосуда для культивирования клеток. Однако специалисты в данной области осознают тот факт, что для оптимального результата различные типы клеток могут нуждаться в слегка различной концентрации фибронектина.
По настоящему изобретению достаточно добавлять к среде только один фактор, выбранный из факторов роста и факторов прикрепления, в особенности, если клетки являются адгезивными. Однако возможно добавление к среде двух и более факторов, выбранных из факторов роста и факторов прикрепления. Среда может предпочтительно содержать ЕСТ и фибронектин, предпочтительно в диапазонах определенных выше концентраций, в особенности, если первичными клетками являются такие адгезивные клетки, как клетки СЕТ.
Среда может дополнительно содержать одну или несколько добавок, выбранных из микробных экстрактов, растительных экстрактов и экстрактов из животных, не являющихся млекопитающими. Микробный экстракт предпочтительно представляет собой дрожжевой экстракт или ультрафильтрат Уеа51о1а1е. Растительный экстракт предпочтительно представляет собой рисовый или соевый экстракт. Экстракт из животных, не являющихся млекопитающими, предпочтительно представляет собой рыбный экстракт.
По предпочтительному осуществлению настоящего изобретения можно добавлять аспарагин к коммерчески доступной бессывороточной среде, к которой был добавлен фактор, выбранный из факторов роста и факторов прикрепления. Более предпочтительно аспарагин добавляют к среде, которую используют во время инфицирования вирусом (см. ниже). Коммерческая бессывороточная среда обычно содержит аспарагин в диапазоне концентраций от 0,3 до 1,0 мМ. Предпочтительные количества аспарагина для добавления к среде находятся в диапазоне от 0,5 до 1,5 мМ. Наиболее предпочтительным является добавление аспарагина в концентрации 1 мМ. Общая концентрация аспарагина в среде предпочтительно составляет менее чем 2 мМ и более предпочтительно находится в диапазоне от 0,8 до 1,8 мМ. Наиболее предпочтительной концентрацией аспарагина в среде является 1,3 мМ.
Более того, к среде предпочтительно можно добавлять глутамин. Более предпочтительно глутамин добавляют к среде, которую использовали во время инфицирования вирусом (см. ниже). Предпочтительные количества глутамина, добавляемые к среде, находятся в диапазоне от 1 до 5 мМ, более предпочти
- 4 009008 тельно - в диапазоне от 2 до 4 мМ. Указанные диапазоны также соответствуют предпочтительным общим концентрациям в среде, поскольку большинство коммерчески доступных сред не содержит глутамин.
По дальнейшему осуществлению изобретение относится к способу амплификации вируса, включающему в себя следующие стадии:
на первой стадии первичные клетки культивируют по способу, описанному выше, т. е. первичные клетки культивируют в бессывороточной среде, содержащей фактор, выбранный из группы, состоящей из факторов роста и факторов прикрепления, в зависимости от типа клеток. Все условия, определения, предпочтительные осуществления и также порядок предпочтительных и наиболее предпочтительных осуществлений, приведенные выше для описания способа культивирования первичных клеток, также применяют для определения первой стадии способа амплификации вируса по данному осуществлению настоящего изобретения;
на второй стадии первичные клетки инфицируют вирусом;
на третьей стадии инфицированные клетки инкубируют в бессывороточной среде до продукции потомственного вируса.
Термин «амплификация вируса» используется для объяснения того, что способ по настоящему изобретению предпочтительно используют для увеличения количества вируса благодаря продуктивной вирусной репликации вируса в инфицированных клетках. Другими словами, соотношение полученного вируса и вводимого вируса должно предпочтительно превышать 1. Таким образом, по настоящему изобретению для определенного вируса выбираются те первичные клетки, в которых вирус способен продуктивно реплицироваться.
Термин «репродуктивная репликация» означает тот факт, что определенный вирус реплицируется в определенной первичной клетке до такой степени, что продуцируется инфекционный вирус потомства, где соотношение полученного и вводимого вируса превышает 1.
Специалисты в данной области знают, какие вирусы могут продуктивно реплицироваться в каком типе первичных клеток. Если вирусом, который будут амплифицировать, является цитомегаловирус человека, то в качестве примера первичных клеток могут служить фибробласты крайней плоти человека; если вирусом, который будут амплифицировать, является вирус кори, вирус свинки, вирус бешенства, вирус японского энцефалита, вирус желтой лихорадки, вирус гриппа или вирус оспы, такой как вирус коровьей оспы, в особенности модифицированный вирус коровьей оспы Анкара (МУА), то первичными клетками могут быть клетки СЕЕ.
Специалистам в данной области известны способы инфицирования первичных клеток по второй стадии настоящего осуществления. В качестве примера вирус можно просто добавить к среде. Альтернативно среду можно удалить, и вирус можно добавить к свежей среде, которую в свою очередь добавляют к клеткам. Для того чтобы получить эффективное инфицирование, количество суспензии вирус/среда должно быть настолько низким, насколько возможно для получения высокой концентрации вируса. После интеграции вируса можно добавить дополнительную среду.
На третьей стадии клетки инокулируют в бессывороточной среде до продукции потомственного вируса.
Бессывороточная среда, которую используют на второй и третьей стадии способа амплификации вируса, может быть той же самой средой, которую уже использовали ранее, т.е. бессывороточной средой, содержащей фактор, выбранный из факторов роста и факторов прикрепления в зависимости от типа клеток. Тем не менее, для экономии расходов также возможно использование на одной или как на второй, так и на третьей стадиях бессывороточной среды, которая не содержит фактор, выбранный из фактора роста и факторов прикрепления.
Во время всех стадий можно дополнить среду аспарагином и/или глутамином, как описано выше, где общая концентрация аспарагина в среде является предпочтительно такой, как описано выше.
Вирус потомства можно концентрировать и очищать способами, известными специалистам в данной области.
По предпочтительному осуществлению способ амплификации вирусов применяют для вирусов оспы (поксвирусов). Таким образом, по данному предпочтительному осуществлению изобретение относится к способу амплификации вируса оспы, включающему в себя следующие стадии:
(I) культивирование первичных клеток по способу, как описано выше, т.е. способом, в котором первичные клетки культивируют в бессывороточной среде, содержащей фактор, выбранный из группы, состоящей из факторов роста и факторов прикрепления, в зависимости от типа клеток;
(II) инфицирование первичных клеток вирусом оспы;
(III) культивирование инфицированных клеток в бессывороточной среде до продукции потомственного вируса.
Было неожиданно найдено, что вирус оспы можно амплифицировать в клетках, культивируемых в бессывороточных условиях, поскольку клетки очень плохо растут в известной бессывороточной среде. Таким образом, ожидали, что дополнительный стресс, связанный с инфицированием вирусом оспы убьет уже стрессированные клетки до того, как произойдет значительная амплификация вируса оспы.
Вирус оспы (поксвирус) предпочтительно является ортопоксвирусом. Примерами ортопоксвирусов служат вирусы птичьей оспы и вирусы коровьей оспы.
- 5 009008
Термин «вирус оспы птиц» означает любой вирус оспы птиц, такой как вирус оспы домашней птицы, вирус оспы канарейки, аномальный вирус оспы, вирус оспы майны, вирус оспы голубя, вирус оспы попугая, вирус оспы перепелки, вирус оспы павлина, вирус оспы пингвина, вирус оспы воробья, вирус оспы скворца и вирус оспы индюка. Предпочтительными вирусами оспы птиц являются вирус оспы канарейки и вирус оспы домашней птицы.
Примером вируса вирус оспы канарейки является штамм КепйсЫет. Очищенный методом бляшек штамм вируса оспы канарейки, названный АЬУЛС (И8 5766598) поместили согласно условиям Будапештского договора в Американскую коллекцию типовых культур (АТСС), номер доступа УК-2547. Другими штаммом вируса оспы канарейки является коммерческий штамм вакцины вируса оспы канарейки, обозначенный ЬЕ2 СЕР 524241075, доступный в ИъШШе Мепеих, 1пс.
Примерами вируса оспы домашней птицы являются штаммы ЕР-1, ЕР-5 и ТКОУАС (И8 5766598). ЕР-1 представляет собой штамм ОигеИе. модифицированный для использования в качестве вакцины для однодневных цыплят. Данный штамм является коммерческим штаммом вакцины вируса оспы домашней птицы, обозначенным как О ОСЕР 25/СЕР67/2309 Ос1оЬет 1980, и является доступным в 1п81йи1е Мепеих, 1пс. ЕР-5 является коммерческим штаммом вакцины вируса оспы домашней птицы, полученным из эмбриона цыпленка, доступным в Лшепсап 8с1епйДс БаЬога1опе5 (Όίνίδίοη о£ Зсйегшд Согр.) Мэдисон, Висконсин, Ветеринарная лицензия Соединенных Штатов № 165, порядковый № 30321.
Примерами штаммов вируса коровьей оспы являются штаммы Тетр1е о£ Ηеаνеη, Сорепйадеп, Ратщ, Вийарей, Иаиеп, Сат, МК1УР, Рег, ТаШкепк ТВК, Тот, Вегп, Ра!тайапдаг, В1ЕМ, В-15, Ш1ег, ЕМ-63, Иет Уотк Сйу Воагй о£ Неа11й, ЕкПее, 1кейа и ^К. Изобретение предпочтительно выполняется с модифицированным вирусом коровьей оспы Анкара (МУЛ) (8иИег, С. е! а1. 1994, Уассше 12:1032-40). Типичным штаммом МУА является МУА 575, который поместили в Европейскую коллекцию культур клеток животных под номером хранения ЕСАСС У00120707. Наиболее предпочтительным является МУЛ-ВИ или его производное, которое было описано в заявке РСТ/ЕР01/13628, поданной в Европейское патентное ведомство 22 ноября 2001 г., названной «Вариант модифицированного вируса коровьей оспы Анкара». МУЛ-ВИ был помещен в Европейскую коллекцию клеточных культур животных под номером хранения ЕСАСС У00083008. Характеристика МУЛ-ВИ, описание биологических исследований, позволяющих установить, является ли МУЛ МУЛ-ВИ или его производным, и способов, позволяющих получить МУЛ-ВИ или его производные, описаны в упомянутой выше заявке РСТ, которая включена сюда в качестве ссылки.
Вирус, который необходимо амплифицировать по способу настоящего изобретения, может быть вирусом дикого типа, аттенуированным вирусом или рекомбинантным вирусом.
Термин «рекомбинантный вирус» означает любой вирус, несущий введенный в вирусный геном гетерологичный ген, который не является природной частью вирусного генома. Гетерологичный ген может быть терапевтическим геном, геном, кодирующим пептид, содержащий по крайней мере один эпитоп для индукции иммунного ответа, кассетой, экспрессирующей антисмысловую последовательность, или геном рибозима. Специалистам в данной области известны способы конструирования рекомбинантных вирусов. Наиболее предпочтительным вектором на основе вируса оспы является МУЛ, в особенности МУЛ 575 и МУЛ-ВИ (см. выше).
«Аттенуированный вирус» представляет собой вирус, происходящий от патогенного вируса, но который при инфицировании организма хозяина приводит к низкой смертности и/или заболеваемости по сравнению с неослабленным исходным вирусом. Примеры аттенуированных вирусов оспы известны специалистам в данной области. Примером для аттенуированного вируса коровьей оспы является штамм МУЛ, в особенности штамм, который был помещен в ЕСАСС под номером хранения У00083008 (см. выше).
Как указано выше, для вирусов оспы первичными клетками предпочтительно могут быть первичные клетки птицы, такие как клетки СЕЕ или первичные фибробласты эмбриона утенка. Также специалисты в данной области представляют, какие первичные клетки подходят для амплификации какого вируса оспы. Клетки СЕЕ особенно предпочтительны для амплификации МУЛ. Для амплификации МУЛ в клетках СЕЕ предпочтительное осуществление состоит в выборе одного или двух факторов, выбранных из ЕСЕ и фибронектина.
Если способ по настоящему изобретению используется для амплификации МУЛ в клетках СЕЕ, то предпочтительно, чтобы начальное значение рН среды находилось в диапазоне приблизительно от 7,0 до приблизительно 8,5. Особенно предпочтительным является начальное значение рН 7,0.
Далее изобретение относится к вирусам, в особенности к вирусам оспы, полученным описанным выше способом. По предпочтительному осуществлению вирусом оспы является вирус коровьей оспы, наиболее предпочтительно штамм МУЛ, такой как МУЛ-ВИ.
Далее изобретение относится к композиции, содержащей вирус, в особенности вирус оспы, полученный способом по настоящему изобретению. Как отмечалось выше, вирус оспы предпочтительно представляет собой вирус коровьей оспы, наиболее предпочтительно штамм МУЛ, такой как МУЛ-ВИ. Благодаря способу амплификации вируса, в композиции отсутствуют какие-либо продукты и/или инфекционные агенты, содержащиеся в сыворотках животных. Напротив, композиции, содержащие вирусы,
- 6 009008 полученные по общепринятым способам, содержат остаточные соединения, происходящие из сыворотки животных. Особенно это касается композиций, содержащих вирусы оспы, такие как штаммы вируса коровьей оспы.
Далее изобретение относится к вирусу, в особенности к вирусам, как определено выше, в качестве лекарственного средства или вакцины. Если вирус является вирусом дикого типа или аттенуированным вирусом, то его можно использовать для вакцинации против вируса как такового. Для этой цели особенно предпочтительны аттенуированные вирусы. Если вирус является рекомбинантным, экспрессирующим белки, экспрессируемые из генов, гетерологичных для вирусного генома, то возможна вакцинация против вируса как такового и/или против экспрессируемого гетерологичного белка. Если рекомбинантный вирус экспрессирует терапевтический ген, такой как антисмысловая РНК или рибозим, то вирус можно использовать в качестве лекарственного средства.
Далее изобретение относится к применению вируса, как описано выше, или композиции, как описано выше, для изготовления вакцин;
к способу лечения или вакцинации животных, включая человека, нуждающихся в этом, включающему в себя введение вируса, как описано выше, или композиции, как описано выше, в тело животного или человека.
Примеры
Если в следующих примерах не указано иного, бессывороточной средой является среда 199 (Ше Тсе11по1ощс5). Добавляемым БОР обычно является рекомбинантный БОБ человека, полученный от С11С1шеоп. Фибронектин (ΡΝ) получен от Сйеткои.
Пример 1. Получение клеток эмбриональных фибробластов цыпленка (СЕР).
Оплодотворенные яйца, лишенные специфических патогенов (8РР), хранили не более 12 дней при 4°С. Яйца помещали в инкубатор и инкубировали в течение 10-12 дней при 37,8±8°С. Одну чашку Петри на максимум 11 яиц готовили с использованием 10-20 мл РВ8. Яйца помещали в специализированную картонную коробку для яиц и обрабатывали большим количеством ВасШо1, чтобы стерилизовать наружную сторону оболочки яиц. После высушивания в яйцах сделали дырочки и осторожно удалили оболочку. Хориоаллантоисную мембрану отодвинули в сторону. Эмбрионы поднимали за ноги, и затем отрезали им головы. Затем эмбрионы переносили на подготовленные чашки Петри. После удаления ног туловища снова промывали РВ8. Максимум 11 туловищ помещали в пластмассовый шприц объемом 20 мл и выдавливали в колбу Эрленмейера. Добавляли 5 мл предварительно нагретого (37°С) раствора трипсина с ЭДТА на туловище, и раствор перемешивали в течение 15 мин в бессывороточной среде при комнатной температуре, используя магнитную мешалку.
Трипсинизированные клетки наливали через слой сита в химический стакан. Все клетки переносили в одну пробирку для центрифугирования объемом 225 мл и центрифугировали при 20°С, 470/д в течение 7 мин в настольной центрифуге. Осадок после удаления супернатанта тщательно ресуспендировали пипетированием в 1 мл свежей предварительно согретой (37°С) бессывороточной ростовой среды, содержащей 10 нг/мл ЕОБ на туловище. Добавляли до общего объема 150 мл свежую предварительно нагретую (37°С) бессывороточную ростовую среду, содержащую 10 нг/мл ЕОБ. Повторяли стадию центрифугирования. Удаляли супернатант и осадок ресуспендировали, как описано выше. Добавляли до общего объема 100 мл свежую, предварительно нагретую (37°С) бессывороточную ростовую среду, содержащую 10 нг/мл ЕОБ. Клетки подсчитывали, как описано в следующем разделе. Необходимое количество клеток высеивали во вращающуюся колбу с бессывороточной ростовой средой, содержащей 10 нг/мл ЕОБ, и инкубировали при 37°С. На четвертый день после посева клетки были готовы к инфицированию вирусом.
Пример 2. Подсчет плотности клеток.
Образец клеточной суспензии (см. раздел получения СЕР) брали и смешивали с одним объемом трипанового синего, приводящим в итоге к количеству клеток от 20 до 100 клеток на 16 маленьких квадратах гемоцитометра, поставляемого РисЙ5-Ко5еи1йа1 под названием Нетосу1оте1ег Ра51 Реаб 102 (разведение 1:2-1:10). Для того чтобы предотвратить реагрегацию/седиментацию клеток, образец брали непосредственно после ресуспендирования клеток. После нескольких минут инкубационного времени с трипановым синим для того, чтобы краситель должным образом вошел в мертвые клетки, 10 мкл суспензии клеток добавляли в гемоцитометр. Только белые живые клетки подсчитывали под световым микроскопом, используя объектив 10/ . В общем, было подсчитано 3 репрезентативных больших квадрата, содержащих 3/16 маленьких. Из каждого большого квадрата только две границы в форме буквы Б включали в расчет. Брали среднее количество подсчитанных клеток и окончательную концентрацию клеток вычисляли, используя следующую формулу:
Среднее количество клеток х разведение χ 104 = клеток/мл.
Суспензию клеток окончательно разбавляли до желаемой рабочей концентрации.
- 7 009008
Пример 3. Влияние добавления фактора, выбранного из факторов роста, и фибронектина к бессывороточной культуральной среде на образование монослоя СЕР.
В предварительных экспериментах авторы изобретения показали, что клетки СЕР не прикрепляются к поверхности сосуда для культивирования клеток, если используют среду 199, которая не содержит РС8. Более того, монослои не образуются. Нормальное образование монослоя наблюдают, если используют среду 199, содержащую 7% РС8. Было проанализировано, можно ли достичь прикрепления и роста клеток СЕР в бессывороточной среде 199, если среду дополнить добавками.
Исследуемые добавки включали в себя рекомбинантный эпидермальный фактор роста (т-ЬЕСР) и фибронектин (ΡΝ).
Для экспериментов клетки СЕР выращивали в среде 199 с различными добавками по отдельности или в комбинации. Клетки, растущие в среде 199 без каких-либо добавок, служили в качестве отрицательного контроля. Клетки, культивируемые в среде 199, содержащей 7% РС8, служили в качестве положительного контроля. Все эксперименты выполняли в 6-луночных планшетах для культивирования клеток с 3 мл среды. Добавки, до их использования в клеточных культурах, обрабатывали по таблицам данных поставщиков. Перед использованием проводили адсорбцию фибронектина на поверхность планшетов для культивирования клеток в течение 25 мин. Фибронектин использовали в концентрации 3 мкг/см2 и ЕСР - в концентрации 10 нг/мл. Перед добавлением любых клеток осуществляли контакт планшетов для культивирования клеток с содержащей фибронектин средой в течение 25 мин.
Каждую культуральную среду с добавками, которые необходимо было тестировать, культивировали в двух повторах, 6-луночные планшеты для культивирования клеток инкубировали в течение 4 дней при температуре 37°С. С 1- по 4-й день, используя микроскоп, оценивали прикрепление и рост клеток.
Для положительного контроля наблюдали нормальное прикрепление и рост клеток СЕР. Для среды 199 без добавок почти не смогли обнаружить прикрепления клеток СЕР.
Значительное улучшение в образовании монослоя обнаружили при использовании добавленного к среде 199 ЕСР, по сравнению со средой 199 без добавок. Было обнаружено, что клетки прикрепились и образовали типичную для фибробластов морфологию. Более того, непрерывный рост можно было наблюдать весь период из 4 дней.
Улучшения прикрепления клеток также достигали, добавляя фибронектин к культуральной среде. Добавление и ЕСР, и фибронектина приводило к слабому улучшению по сравнению с добавлением только ЕСР и только фибронектина.
В итоге сделали вывод, что образованию монослоя клеток СЕР в бессывороточной среде 199 можно способствовать, используя добавки ЕСР и фибронектина.
Кроме того, в параллельных рядах экспериментов 1 х 107 клеток СЕР высевали в среду, содержащую 10% РС8, среду, не содержащую РС8, и среду, не содержащую РС8, но содержащую ЕСР. Количество клеток подсчитывали через 2 дня после посева. Количество клеток составляло 42, 6 и 44% соответственно от количества клеток, использованных для посева. Таким образом, результаты для клеток, высеянных в бессывороточную среду, содержащую ЕС8, были также хороши, как и результаты, полученные со средой, включающей РС8, и значительно лучше, чем со средой, не содержащей ни сыворотки, ни ЕСР.
Дополнительно среду, содержащую ЕСР, сравнивали с различными стандартными бессывороточными средами, такими как ИМЕМ, Θρίί-Меш или 293-8РМ. С этой целью 1х107 клеток СЕР высевали в различные бессывороточные среды и культивировали в течение 4 дней. Количество клеток, культивируемых в среде, содержащей ЕСР, было в 24, 5 и 12 раз выше, чем количество клеток, культивированных в бессывороточной среде ИМЕМ, Θρίί-Меш и 293-8РМ соответственно.
Пример 4. Инфицирование клеток СЕР МУЛ.
Клетки инфицировали через 4 дня после посева во вращающиеся колбы. В этот момент времени клетки выросли до соответствующего монослоя. Клетки инфицировали МУА при МО1 1,0 или 0,1. Для инфицирования ростовую среду удаляли из колб. Требуемое количество вируса на вращающуюся колбу разводили в 20 мл подходящей для инфицирования бессывороточной среде. На данной стадии бессывороточная среда может содержать или может не содержать фактор, выбранный из факторов роста, и фибронектин. Клетки инкубировали с вирусом в течение 1 ч при 37°С при 0,3-0,5 об/мин. в инкубаторе для вращающихся колб. Через 1 ч вращающиеся колбы наполняли подходящей бессывороточной ростовой средой до общего объема 200 мл на вращающуюся колбу. На данной стадии бессывороточная среда может содержать или может не содержать фактор, выбранный из факторов роста, и фибронектин. Репликацию вируса останавливали через 48 или 72 ч, замораживая вращающуюся колбу до -20°С.
Пример 5. Получение вирусных экстрактов из инфицированных клеток СЕР и титрование МУА.
Замороженные вращающиеся колбы оттаивают при комнатной температуре. Во время процесса оттаивания клетки отделяются от поверхности вращающихся колб, и их можно механически удалить, встряхивая колбы. Суспензию вирус/клетка собирали и готовили аликвоты для меньших объемов. Для высвобождения вируса из инфицированных клеток суспензии вирус/клетка 3 раза замораживали/оттаивали. Замороженные/оттаявшие образцы вируса использовали для титрования.
- 8 009008
Титрование выполняли на клетках СЕТ первого пассажа в 96-луночных планшетах, используя 10кратное разведение вирусной суспензии и 8 репликаций на разведение. После инфицирования инфицированные клетки визуализировали при помощи антител против вируса коровьей оспы и подходящего окрашивающего раствора.
Подробнее, в 0-й день исследования первичные клетки СЕТ (см. раздел «Получение клеток эмбриональных фибробластов цыпленка (СЕТ)») трипсинизировали и подсчитывали, как описано в разделе «Подсчет плотности клеток». Клетки разводили до концентрации 1х105 клеток/мл в среде ΚΡΜΙ с 7% ТС8. После такого разведения 100 мкл высевали в каждую лунку 96-луночных планшетов, используя многоканальную пипетку. Клетки инкубировали в течение всей ночи при температуре 37°С и 5% СО2. Образцы вируса подвергали титрованию (см. раздел «Получение вирусного экстракта из инфицированных клеток СЕТ»), последовательно разводя с 10-кратным шагом от 10-1 до 10-12, используя бессывороточную ΚΡΜΙ. Такое последовательное разведение выполняют, добавляя 900 мкл ΚΡΜΙ ко всем лункам 96-луночного планшета с глубокими лунками. 100 мкл образца вируса добавляли ко всем лункам первого ряда и перемешивали. После этого 100 мкл каждого образца переносили в следующий ряд лунок, используя многоканальную пипетку. При проведении разведений 96-луночные планшеты с глубокими лунками держали на льду. Планшеты инкубировали в течение 5 дней при 37°С и 5% СО2 для осуществления инфицирования. Через 5 дней клетки иммуногистохимически окрашивали антителом, специфичным для вируса коровьей оспы. Для окрашивания культуральную среду удаляли, поворачивая 96-луночный планшет вверх дном над резервуаром. Клетки фиксировали смесью метанол/ацетон (1:1) в концентрации 100 мкл/лунку в течение 10 мин при комнатной температуре. Фиксирующий раствор удаляли и планшеты высушивали на воздухе. После высушивания клетки отмывали один раз ΡΒ8 и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с антителом против вируса коровьей оспы (антитело против вируса коровьей оспы, кроличье поликлональное, фракция 1дО (ОиаПей, Берлин, Германия #9503-2057), разведенным до 1:1000 в ΡΒ8 с 3% ТС8. После удаления антитела клетки дважды отмывали ΡΒ8 и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с конъюгированным с ΗΚΡ (конъюгированный с пероксидазой хрена) антикроличьим антителом (козье поликлональное антитело против 1дО кролика, конъюгированное с ΗΚΡ (Нгошеда, Маннхейм, Германия # \У4011), разведенным до 1:1000 в ΡΒ8 с 3% ТС8. Клетки снова отмывали ΡΒ8 и окрашивали либо о-дианизидином, либо ТМВ. Для использования способа окрашивания о-дианизидином клетки инкубировали с окрашивающим раствором в количестве 100 мкл/лунку, состоящим из 5 мг о-дианизидина и 180 мкл 30% Н2О2 на 60 мл фосфатно-цитратного буфера в концентрации 50 мМ. Клетки инкубировали при комнатной температуре, пока они не окрашивались в коричневый цвет. Инфицированные клетки были хорошо видны через 1-3 ч. Используя способ окрашивания ТМВ, клетки инкубировали с ТМВ в количестве 30 мкл/лунку в концентрации 1,2 мМ (8егашип О1адпо8йса ОшЬН). После 15 мин инкубации раствор ТМВ удаляли и клетки один раз отмывали ΡΒ8. Инфицированные клетки выглядели темно-синими. На планшетах подсчитывали инфицированные клетки. Вирусный титр вычисляли с использованием формулы Спирмена и Кербера. Для вычисления ТСШ50 каждая лунка, имеющая коричневые или синие клетки, маркировалась как положительная. Поскольку параметры анализа содержат константу, использовали следующую упрощенную формулу:
Титр вируса [ТСШ5о/мл] = 10 [а+1,5+ха/8+хЬ/8+хс/8] где а представляет собой фактор разведения последней колонки, в которой все восемь лунок являются положительными;
ха представляет собой количество положительных лунок в колонке а+1; хЬ представляет собой количество положительных лунок в колонке а+2; хс представляет собой количество положительных лунок в колонке а+3.
Пример 6. Оптимальная плотность посева клеток СЕТ в бессывороточную среду и оптимальное количество МУА для инфицирования клеток СЕТ.
Для бессывороточного роста клеток СЕТ определили оптимальную клеточную плотность посева равную 7,5х107 клеток/850 см2 (поверхность одной вращающейся колбы). Клетки были способны образовать хороший монослой без образования больших скоплений на 4-й день после посева, и в данные момент времени их можно было инфицировать.
Для того чтобы определить наилучший уровень вирусной инокуляции и продолжительность инфицирования для максимальной продукции МУА из клеток СЕТ, культивируемых бессывороточным способом, проводили эксперименты. Клетки СЕТ высевали при плотности 7,5 х107 клеток/850 см2 в среду по настоящему изобретению. На 4-й день после посева клетки инфицировали различными количествами МУА в диапазоне от 0,05 до 1,0 ТСШ50/клетку МУА. Наилучшие результаты получали при 0,1 ТСШ50/клетку МУА.
Пример 7. Оптимальное значение рН бессывороточной среды для культивирования и инфицирования МУА.
Инфицирования МУА и другими вирусами оспы чувствительны к значениям рН ниже 7,0. Вирусы оспы нестабильны при кислом значении рН, и очищенные вирусы оспы рекомендуют хранить в буферном растворе при рН выше 7,0, чтобы гарантировать стабильность и вирусную целостность при хранении
- 9 009008 в качестве жидкого вирусного препарата. Для того чтобы определить влияние проведения инфицирования при различном начальном значении рН на выход вируса, проводили эксперименты. Вращающиеся колбы засевали клетками СЕЕ обычным способом в бессывороточную среду, содержащую 10 нг/мл ЕОЕ с добавлением 4 мМ Б-глутамина, и культивировали в течение 4 дней. Клетки инфицировали МУЛ в количестве 0,1 ТСГО50/клетку в бессывороточной среде, содержащей 10 нг/мл ЕОЕ с добавлением Б-глутамина и 1 мМ аспарагина, при различных значениях рН, находящихся в диапазоне от 6,5 до 9,0. Через 72 ч после инфицирования измеряли рН среды и определяли выход вирусов обычным способом при помощи титрования клеточных экстрактов. Результаты представлены в следующей таблице, в которой показано влияние начального рН среды в начале инициирования на выход вируса.
Для инфицирования, проведенного в бессывороточной среде, содержащей 10 нг/мл ЕОЕ, дополненной Б-глутамином и аспарагином, вирусная продукция была относительно постоянна при начальном значении рН от 7,0 до 8,5, но при начальном рН 6,5 и 9,0 вирусная продукция была ниже. Наилучший выход получили при начальном значении рН 7,0. Коммерчески доступные стандартные бессывороточные среды обычно имеют значение рН 7,4. Следовательно, доведение рН бессывороточной среды до 7,0 может помочь улучшить выход вируса.
Пример 8. Влияние добавления аспарагина к бессывороточной среде.
В предварительных экспериментах выявили, что количество аспарагина может быть ограничивающим во время культивирования клеток СЕЕ и инфицирования клеток СЕЕ МУА. Для того чтобы преодолеть уменьшение количества аспарагина в бессывороточной среде во время процесса культивирования и инфицирования, дополнительное количество аспарагина добавляли к среде в качестве добавки перед инфицированием клеток СЕЕ. Для того чтобы определить оптимальное количество аспарагина для добавления к среде, вращающиеся колбы засевали клетками СЕЕ (7,5х107 клеток/850 см2) в бессывороточной среде, содержащей 10 нг/мл ЕОЕ с добавлением 4 мМ Б-глутамина. Через 4 дня после посева клетки инфицировали МУА в количестве 0,1 ТСГО50/клетку в бессывороточной среде, содержащей 10 нг/мл ЕОЕ с добавлением 4 мМ Б-глутамина, дополненной аспарагином в различных концентрациях (0,5, 1,0 и 1,5 мМ). Вирусную репликацию останавливали через 72 ч после инфицирования и определяли вирусные титры. Результаты представлены в следующей таблице, в которой показана продукция МУА клетками СЕЕ, дополненными различными уровнями аспарагина на стадии инфицирования. Титры представляют собой средние значения для 3 вращающихся колб для каждого дополнения аспарагином.
Дополнительный аспарагин Вирусные титры после 72 часов инфицирования [ΤΟΙϋ50/Μπ]
0,0 мМ 1,8x10®
0, 5 мМ 1,3x10®
1,0 мМ 6,8x10®
1,5 мМ 1,0x10®
Данные результаты демонстрируют, что дополнение аспарагином бессывороточной среды, содержащей 10 нг/мл ЕОЕ, может улучшить вирусную продукцию, и для процесса инфицирования дополнение до 1 мМ оптимально.

Claims (18)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ амплификации вируса оспы, включающий в себя следующие стадии:
    культивирование первичных клеток птицы в бессывороточной среде, содержащей по крайней мере один фактор, выбранный из группы, состоящей из факторов роста и факторов прикрепления;
    инфицирование первичных клеток птицы вирусом оспы;
    культивирование инфицированных клеток в бессывороточной среде для получения потомства указанного вируса оспы, причем первичными клетками птицы являются клетки, позволяющие осуществить продуктивную репликацию вируса оспы.
  2. 2. Способ по п.1, в котором первичными клетками птицы являются эмбриональные фибробласты цыпленка (СЕР).
  3. 3. Способ по любому из пп.1, 2, в котором фактором роста является эпидермальный фактор (ЕОР), в частности рекомбинантный ЕОР человека.
  4. 4. Способ по п.3, в котором концентрация ЕОР составляет от 5 до 20 нг/мл среды.
  5. 5. Способ по любому из пп.1-4, в котором фактором прикрепления является фибронектин.
  6. 6. Способ по п.3, в котором концентрация фибронектина составляет от 1 до 10 мкг/см2 поверхности сосуда для культивирования клеток.
  7. 7. Способ по любому из пп.1, 2, в котором среда содержит два и более факторов, выбранных из факторов роста и факторов прикрепления.
  8. 8. Способ по п.7, в котором среда содержит ЕОР и фибронектин в диапазонах концентраций, как определено в пп.4 и 6.
  9. 9. Способ по любому из пп.1-8, в котором среда дополнительно содержит один или более компонентов, выбранных из экстракта эукариотических клеток, растительного и животного экстрактов, где животное не является млекопитающим.
  10. 10. Способ по п.9, в котором экстрактом эукариотических клеток является дрожжевой экстракт или ультрафильтрат УсаПокИс.
  11. 11. Способ по п.9, в котором растительным экстрактом является рисовый или соевый экстракт.
  12. 12. Способ по п.9, в котором животным экстрактом является рыбный экстракт.
  13. 13. Способ по любому из пп.1-12, в котором вирусом оспы является ортопоксвирус.
  14. 14. Способ по п.13, в котором ортопоксвирусом является вирус коровьей оспы.
  15. 15. Способ по п.14, в котором вирусом коровьей оспы является модифицированный вирус коровьей оспы Анкара.
  16. 16. Способ по любому из пп.13-15, в котором вирус оспы является аттенуированным или рекомбинантным вирусом.
  17. 17. Способ по любому из пп.1-16, в котором в бессывороточной среде на одной или обеих стадиях инфицирования первичных клеток птицы вирусом оспы и культивирования инфицированных клеток в бессывороточной среде для получения потомства вируса оспы отсутствуют факторы, выбранные из факторов роста и факторов прикрепления.
  18. 18. Способ по любому из пп.1-17, в котором после стадии культивирования инфицированных клеток в бессывороточной среде необязательно проводят одну или более стадий очистки потомства вируса оспы.
EA200500448A 2002-09-05 2003-09-01 Способ амплификации вируса оспы EA009008B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DKPA200201302 2002-09-05
PCT/EP2003/009704 WO2004022729A1 (en) 2002-09-05 2003-09-01 Method for the cultivation of primary cells and for the amplification of viruses under serum free conditions

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200500448A1 EA200500448A1 (ru) 2005-08-25
EA009008B1 true EA009008B1 (ru) 2007-10-26

Family

ID=31970216

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200500448A EA009008B1 (ru) 2002-09-05 2003-09-01 Способ амплификации вируса оспы

Country Status (23)

Country Link
US (4) US7695939B2 (ru)
EP (1) EP1434858B2 (ru)
JP (2) JP2005537793A (ru)
KR (1) KR101044538B1 (ru)
CN (1) CN1692156B (ru)
AT (1) ATE393212T2 (ru)
AU (1) AU2003264144C1 (ru)
BR (1) BRPI0313559B8 (ru)
CA (1) CA2494379C (ru)
CY (1) CY1114598T1 (ru)
DE (1) DE60320520T3 (ru)
DK (1) DK1434858T4 (ru)
EA (1) EA009008B1 (ru)
ES (1) ES2305514T5 (ru)
HK (1) HK1080507B (ru)
MX (1) MXPA04012966A (ru)
NO (1) NO343489B1 (ru)
NZ (1) NZ538575A (ru)
PL (1) PL215169B1 (ru)
PT (1) PT1434858E (ru)
SI (1) SI1434858T2 (ru)
UA (1) UA85543C2 (ru)
WO (1) WO2004022729A1 (ru)

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100537773C (zh) * 2000-11-23 2009-09-09 巴法里安诺迪克有限公司 改良安卡拉痘苗病毒变体
US7445924B2 (en) * 2000-11-23 2008-11-04 Bavarian Nordic A/S Modified Vaccinia Ankara virus variant and cultivation method
ATE393212T2 (de) * 2002-09-05 2008-05-15 Bavarian Nordic As Verfahren zur amplifikation von einem poxvirus in serumfreien verhältnissen
EP1528101A1 (en) 2003-11-03 2005-05-04 ProBioGen AG Immortalized avian cell lines for virus production
CA2593532C (en) 2005-02-23 2017-05-02 Bavarian Nordic A/S Use of a modified poxvirus for the rapid induction of immunity against a poxvirus or other infectious agents
FR2884255B1 (fr) * 2005-04-11 2010-11-05 Vivalis Utilisation de lignees de cellules souches aviaires ebx pour la production de vaccin contre la grippe
RU2489486C2 (ru) 2006-06-20 2013-08-10 Трансжене С.А. Процесс получения поксвирусов и композиции поксвирусов
SG178090A1 (en) 2009-07-21 2012-03-29 Transgene Sa Enzymatic composition for the digestion of chicken embryos
WO2011103137A1 (en) * 2010-02-17 2011-08-25 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Cell-based methods and reagents
BR112012026095A2 (pt) 2010-04-14 2015-09-15 Emd Millipore Corp métodos de produção de estoques de vírus de alta pureza e altos títulos e métodos de uso dos mesmos.
AU2011281982B2 (en) * 2010-07-20 2015-12-17 Bavarian Nordic A/S Method for harvesting expression products
KR101504159B1 (ko) * 2012-04-20 2015-03-19 한국생명공학연구원 미세조류의 성장을 촉진하는 엑소피아라 올리고스퍼마 및 이의 용도
WO2015195758A1 (en) * 2014-06-18 2015-12-23 Medimmune, Llc Cell culture methods and media comprising n-acetylcysteine
KR101677231B1 (ko) 2014-12-18 2016-11-30 제주대학교 산학협력단 무혈청배지（serum free medium）를 이용한 메갈로사이티바이러스의 효율적 제조방법
CN105462911B (zh) * 2015-12-22 2018-04-13 肇庆大华农生物药品有限公司 用于培养病毒的无血清培养液及其制备方法
CN107129963A (zh) * 2017-04-24 2017-09-05 浙江美保龙生物技术有限公司 一种df‑1细胞培养液添加剂及其制备方法、使用方法
CA3061678A1 (en) 2017-05-15 2018-11-22 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stable virus-containing composition
CA3062549A1 (en) 2017-05-15 2018-11-22 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stable virus-containing composition
US20210301263A1 (en) * 2018-08-08 2021-09-30 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Methods for improved poxvirus yields
WO2020049151A1 (en) 2018-09-06 2020-03-12 Bavarian Nordic A/S Storage improved poxvirus compositions
BR112022017438A2 (pt) 2020-03-12 2022-10-18 Bavarian Nordic As Composições que melhoram a estabilidade do poxvírus
CN113355297A (zh) * 2021-06-23 2021-09-07 吉林冠界生物技术有限公司 一种灌流式培养全悬浮mdck细胞生产重组禽流感病毒的方法
WO2024003238A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 Bavarian Nordic A/S Epstein-barr-virus vaccine
WO2024003239A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 Bavarian Nordic A/S RECOMBINANT MODIFIED saRNA (VRP) AND VACCINIA VIRUS ANKARA (MVA) PRIME-BOOST REGIMEN
CN116656628A (zh) * 2023-07-31 2023-08-29 深圳市卫光生物制品股份有限公司 一种痘病毒载体疫苗的制备方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4072565A (en) * 1974-11-04 1978-02-07 The Dow Chemical Company Production of viruses in tissue culture without use of serum
WO1992005246A1 (en) * 1990-09-25 1992-04-02 Smithkline Beecham Corporation Medium for culture of mammalian cells
WO1998004680A1 (en) * 1996-07-26 1998-02-05 University Of Manitoba Serum-free medium for growth of anchorage-dependant mammalian cells
US20020022268A1 (en) * 2000-01-11 2002-02-21 Chunhui Xu Conditioned media for propagating human pluripotent stem cells

Family Cites Families (66)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2004402A (en) * 1934-04-07 1935-06-11 Conklin John Edward Atomizer
US3887430A (en) * 1972-02-24 1975-06-03 Dow Chemical Co Culture medium for tissue culture techniques
US3914408A (en) * 1973-10-12 1975-10-21 Univ Nebraska Vaccine for neonatal calf diarrhea
DE2714665A1 (de) * 1977-04-01 1978-10-05 Mayr Anton Praeparat zur behandlung von herpes zoster und anderen herpes-infektionen, sowie verfahren zu seiner herstellung
US5338683A (en) * 1981-12-24 1994-08-16 Health Research Incorporated Vaccinia virus containing DNA sequences encoding herpesvirus glycoproteins
US5155020A (en) * 1989-03-08 1992-10-13 Health Research Inc. Recombinant poxvirus host range selection system
US5833975A (en) * 1989-03-08 1998-11-10 Virogenetics Corporation Canarypox virus expressing cytokine and/or tumor-associated antigen DNA sequence
AU613583B2 (en) * 1986-08-22 1991-08-08 Transgene S.A. Proteins and the method for preparing them, DNA sequences, antibodies and their application, poxviruses, transformed or infected cells, pharmaceutical compositions which are useful in the prevention of schistosomiasis and application by way of an agent possessing glutathione s-transferase activity
US5024947A (en) * 1987-07-24 1991-06-18 Cetus Corporation Serum free media for the growth on insect cells and expression of products thereby
CA1341245C (en) * 1988-01-12 2001-06-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Recombinant vaccinia virus mva
US6248333B1 (en) 1990-04-04 2001-06-19 Health Research Inc. Isolated nucleic acid sequence of equine herpesvirus type 1 glycoprotein D (EHV-1 gD)
AT393277B (de) * 1990-01-04 1991-09-25 Immuno Ag Verfahren zur herstellung von fruehsommer- meningoenzephalitis-virus (fsme-virus)-antigen
WO1992015672A1 (en) * 1991-03-07 1992-09-17 Virogenetics Corporation Genetically engineered vaccine strain
US5843456A (en) * 1991-03-07 1998-12-01 Virogenetics Corporation Alvac poxvirus-rabies compositions and combination compositions and uses
US5766598A (en) 1991-03-07 1998-06-16 Virogenetics Corporation Recombinant attenuated ALVAC canarypoxvirus expression vectors containing heterologous DNA segments encoding lentiviral gene products
IL102929A (en) 1992-08-24 1996-11-14 Interpharm Lab Ltd Serum-free medium for mammalian cells
US5403582A (en) * 1993-01-21 1995-04-04 Nippon Zeon Co., Ltd. Vaccine comprising fowlpox virus recombinants expressing the envelope glycoprotein of an avian reticuloendotheliosis retrovirus
US5405772A (en) 1993-06-18 1995-04-11 Amgen Inc. Medium for long-term proliferation and development of cells
US5768598A (en) 1993-09-13 1998-06-16 Intel Corporation Method and apparatus for sharing hardward resources in a computer system
US6015686A (en) * 1993-09-15 2000-01-18 Chiron Viagene, Inc. Eukaryotic layered vector initiation systems
US6190655B1 (en) * 1993-12-03 2001-02-20 Immunex Corporation Methods of using Flt-3 ligand for exogenous gene transfer
DE4405841C1 (de) * 1994-02-23 1995-01-05 Mayr Anton Prof Dr Med Vet Dr Multipotente Paramunitätsinducer auf der Basis von Kombinationen von Pockenviruskomponenten, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung als Arzneimittel
EP0758397B1 (en) * 1994-04-29 2005-06-22 Baxter Healthcare S.A. Recombinant poxviruses with foreign polynucleotides in essential regions
US5756341A (en) * 1994-11-10 1998-05-26 Immuno Ag Method for controlling the infectivity of viruses
US6146873A (en) * 1994-11-10 2000-11-14 Baxter Aktiengesellschaft Production of orthomyxoviruses in monkey kidney cells using protein-free media
US5753489A (en) * 1994-11-10 1998-05-19 Immuno Ag Method for producing viruses and vaccines in serum-free culture
DK0791055T3 (da) 1994-11-10 2012-04-16 Baxter Healthcare Sa Fremgangsmåde til fremstilling af biologiske produkter i proteinfri kultur
US5503582A (en) 1994-11-18 1996-04-02 Micron Display Technology, Inc. Method for forming spacers for display devices employing reduced pressures
UA68327C2 (en) 1995-07-04 2004-08-16 Gsf Forschungszentrum Fur Unwe A recombinant mva virus, an isolated eukaryotic cell, infected with recombinant mva virus, a method for production in vitro of polypeptides with use of said cell, a method for production in vitro of virus parts (variants), vaccine containing the recombinant mva virus, a method for immunization of animals
JPH09154571A (ja) * 1995-12-05 1997-06-17 Kurabo Ind Ltd ウイルス製造用無血清培地
EP0882134B8 (en) 1996-02-21 2009-09-02 Genetic Immunity kft. Methods and compositions for protective and therapeutic genetic immunization
ID19548A (id) 1996-09-24 1998-07-23 Bavarian Nordic Res Inst As Virus mva rekombinan yang mengekspresikan antigen-antigen virus demam dan penggunaan daripadanya dalam vaksin-vaksin
AU4751697A (en) 1996-10-10 1998-05-05 Douglas Danner Animal cell culture media comprising plant-derived nutrients
WO1998017283A1 (en) 1996-10-25 1998-04-30 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Method of vaccinating infants against infections
US6204250B1 (en) * 1996-11-22 2001-03-20 The Mount Sinai Medical Center Of The City Of New York Immunization of infants
US20030138454A1 (en) * 1997-06-09 2003-07-24 Oxxon Pharmaccines, Ltd. Vaccination method
GB9711957D0 (en) 1997-06-09 1997-08-06 Isis Innovation Methods and reagents for vaccination
GB0023203D0 (en) 2000-09-21 2000-11-01 Isis Innovation Vaccination method
AT407255B (de) * 1997-06-20 2001-02-26 Immuno Ag Rekombinanter zellklon mit erhöhter stabilität in serum- und proteinfreiem medium und verfahren zur gewinnung des stabilen zellklons
AU3910097A (en) 1997-08-05 1999-03-01 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Live recombinant vaccine comprising inefficiently or non-replicating vir us
WO2000008179A1 (en) * 1998-08-04 2000-02-17 Immunex Corporation Ikr-1 and ikr-2, protein kinases which are related to the i kappa b kinases
DE69839970D1 (de) 1998-11-10 2008-10-16 Univ Rochester Methoden zu herstellung von genbanken
EP1160323A1 (en) 1998-11-18 2001-12-05 Oxford Biomedica (UK) Limited 5T4 tumour-associated antigen for use in tumour immunotherapy
GB2370571B (en) 1998-11-18 2003-05-07 Oxford Biomedica Ltd A modified 5t4 antigen
US6497883B1 (en) * 1999-06-10 2002-12-24 Merial Porcine circovirus recombinant poxvirus vaccine
DE19935351A1 (de) 1999-07-29 2001-02-01 Abb Daimler Benz Transp Verfahren zur Energieoptimierung bei einem Fahrzeug/Zug mit arbeitspunktabhängigem Wirkungsgrad
DK1263936T3 (da) * 2000-03-14 2006-02-13 Bavarian Nordic As andret stamme af den modificerede Vacciniavirus Ankara (MVA)
EP1283718A2 (en) 2000-05-24 2003-02-19 Merial Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (prrsv) recombinant avipoxvirus vaccine
PL366397A1 (en) * 2000-07-11 2005-01-24 Bayer Aktiengesellschaft Use of strains of the parapox ovis virus for producing antiviral pharmaceuticals and anticancer pharmaceuticals
DK1358319T3 (da) * 2000-09-25 2009-10-05 Polymun Scient Immunbio Forsch Levende influenzavaccine og fremgangsmåde til fremstilling heraf
US7445924B2 (en) * 2000-11-23 2008-11-04 Bavarian Nordic A/S Modified Vaccinia Ankara virus variant and cultivation method
CN100537773C (zh) 2000-11-23 2009-09-09 巴法里安诺迪克有限公司 改良安卡拉痘苗病毒变体
US7097842B2 (en) * 2000-11-23 2006-08-29 Bavarian Nordic A/S Modified vaccinia virus ankara for the vaccination of neonates
UA82466C2 (ru) * 2001-07-18 2008-04-25 Бавариан Нордика А/С Способ усиления амплификации хордопоксвируса
KR101042458B1 (ko) * 2001-12-04 2011-06-16 벤처 테크놀로지스 에스디엔 비에이치디 플라비바이러스 ｎｓ1 서브유닛 백신
US6951752B2 (en) 2001-12-10 2005-10-04 Bexter Healthcare S.A. Method for large scale production of virus antigen
BR0214822A (pt) 2001-12-10 2004-12-14 Bavarian Nordic As Formulações contendo poxvìrus e processo para preparar composições contendo poxvìrus estáveis
UA77735C2 (en) * 2001-12-20 2007-01-15 Bavarian Nordic As Method for recovery of poxviruses from infected cells
FR2836924B1 (fr) 2002-03-08 2005-01-14 Vivalis Lignees de cellules aviaires utiles pour la production de substances d'interet
AU2003219057A1 (en) * 2002-03-15 2003-09-29 Baxter Healthcare S.A. Recombinant drug-sensitive vaccinia virus as smallpox vaccine
JP4895505B2 (ja) * 2002-05-16 2012-03-14 バヴァリアン・ノルディック・アクティーゼルスカブ 変異ワクシニアウイルスアンカラ（ｍｖａ）ゲノム中の挿入部位としての遺伝子間領域
KR20040108804A (ko) * 2002-05-16 2004-12-24 버베리안 노딕 에이/에스 우두 ａｔｉ 프로모터를 사용하는 것에 의한 변형백시니아 바이러스 안카라에서 유전자의 발현
ATE393212T2 (de) 2002-09-05 2008-05-15 Bavarian Nordic As Verfahren zur amplifikation von einem poxvirus in serumfreien verhältnissen
ATE467678T1 (de) 2003-07-22 2010-05-15 Vivalis Produktion von poxviren mit adhärenten oder nicht adhärenten vogelzellinien
US6915752B2 (en) * 2003-09-30 2005-07-12 Lockheed Martin Corporation Utility service protection strip
US6976752B2 (en) * 2003-10-28 2005-12-20 Lexmark International, Inc. Ink jet printer with resistance compensation circuit

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4072565A (en) * 1974-11-04 1978-02-07 The Dow Chemical Company Production of viruses in tissue culture without use of serum
WO1992005246A1 (en) * 1990-09-25 1992-04-02 Smithkline Beecham Corporation Medium for culture of mammalian cells
WO1998004680A1 (en) * 1996-07-26 1998-02-05 University Of Manitoba Serum-free medium for growth of anchorage-dependant mammalian cells
US20020022268A1 (en) * 2000-01-11 2002-02-21 Chunhui Xu Conditioned media for propagating human pluripotent stem cells

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PIETRZKOWSKI Z. ET AL.: "DEXTRAN T-500 IMPROVES SURVIVAL AND SPREADING OF CHICK EMBRYO CELLS IN SERUM-FREE MEDIUM". FOLIA HISTOCHEMICA ET CYTOBIOLOGICA, 1988, vol. 26, no. 3, pages 123-132, XP008026877 & ISSN: 0239-8508, the whole document *

Also Published As

Publication number Publication date
CA2494379A1 (en) 2004-03-18
HK1080507B (zh) 2011-10-07
EP1434858A1 (en) 2004-07-07
JP2005537793A (ja) 2005-12-15
PL373992A1 (en) 2005-09-19
CY1114598T1 (el) 2016-10-05
PT1434858E (pt) 2008-07-28
US8329466B2 (en) 2012-12-11
ES2305514T5 (es) 2019-06-14
US20050214324A1 (en) 2005-09-29
EP1434858B1 (en) 2008-04-23
WO2004022729A8 (en) 2005-03-17
US8673318B2 (en) 2014-03-18
ES2305514T3 (es) 2008-11-01
AU2003264144A2 (en) 2004-03-29
AU2003264144A1 (en) 2004-03-29
AU2003264144C1 (en) 2009-12-17
DE60320520T2 (de) 2008-12-11
SI1434858T2 (sl) 2019-05-31
NO343489B1 (no) 2019-03-25
EA200500448A1 (ru) 2005-08-25
US7964397B2 (en) 2011-06-21
DK1434858T4 (en) 2019-04-01
HK1080507A1 (en) 2006-04-28
DE60320520T3 (de) 2019-05-09
DE60320520D1 (de) 2008-06-05
US20130089913A1 (en) 2013-04-11
WO2004022729A1 (en) 2004-03-18
KR101044538B1 (ko) 2011-06-27
AU2003264144B2 (en) 2009-05-14
EP1434858B2 (en) 2018-12-19
ATE393212T2 (de) 2008-05-15
KR20050037551A (ko) 2005-04-22
JP5612338B2 (ja) 2014-10-22
UA85543C2 (ru) 2009-02-10
CN1692156A (zh) 2005-11-02
CN1692156B (zh) 2011-05-11
US7695939B2 (en) 2010-04-13
US20090029459A1 (en) 2009-01-29
DK1434858T3 (da) 2008-08-11
BRPI0313559B8 (pt) 2021-05-25
MXPA04012966A (es) 2005-05-16
US20110217749A1 (en) 2011-09-08
SI1434858T1 (sl) 2008-10-31
CA2494379C (en) 2012-11-06
BRPI0313559B1 (pt) 2019-02-26
BR0313559A (pt) 2005-07-12
PL215169B1 (pl) 2013-10-31
NO20051175L (no) 2005-03-04
JP2010148522A (ja) 2010-07-08
NZ538575A (en) 2007-03-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5612338B2 (ja) 無血清条件下で初代細胞を培養する方法及びウイルスを増幅させる方法
KR101624678B1 (ko) 바이러스 백신의 제조를 위한 오리 배아 유래 줄기 세포주
EP1427815B1 (de) Verfahren zur grosstechnischen herstellung von impfstoffen
EP1427817B1 (de) Vermehrung von viren in zellkultur
RU2007141705A (ru) Способ производства противовирусных вакцин в суспензионных линиях птичьих эмбриональных стволовых клеток
KR20060057577A (ko) 부착성 또는 비부착성 조류 세포주를 이용한폭스바이러스의 생산
EA006628B1 (ru) Способы амплификации и размножения хордопоксвируса
KR20140096162A (ko) 연속 세포주 제조 방법
RU2819260C2 (ru) Бессывороточная среда для производства птичьей вакцины и ее использование
Mehrabanpour et al. Plaque formation of lasota strain of newcastle disease virus adapted in chick embryo fibroblast cells
EP3911731A1 (en) Serum-free medium for avian vaccine production and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ KZ KG MD TJ TM