KR20140096162A - 연속 세포주 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 동물 또는 인간의 살아있는 세포를 제공하고, 상기 세포에 UV 광을 조사하고 상기 세포를 증식시키고 증식하는 세포를 연속 세포주의 세포로서 선택하는 것을 포함하는 연속 세포주의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

연속 세포주 제조 방법{METHOD FOR PRODUCING CONTINUOUS CELL LINES}

본 발명은 세포주를 제조하는 방법에 관한 것이다.

세포주는 백신 생산에 귀중한 도구가 되었다. 일부 중요한 백신 및 바이러스성 벡터의 생산은 여전히 유정 계란 또는 1차 닭 배아 섬유모세포 내에서 수행된다. 바이러스 복제용 1차 조류 조직은 SPF(특정 병원체 부재) 생산 플랜트에 의해 제공된다. SPF 유래된 조직은 값비싸며 종종 원료의 질을 조절하기 어렵다. 따라서, 공급에 있어서의 비일관성 및 부족이 SPF란에 기초한 기술의 가장 주요한 단점이다. 이것은 1차 섬유모세포 단일층 배양이 사용되는 접근법에 있어서도 동일하다. 세포주를 무한정 증식시키기 위해서는 세포들이 불멸화되어야 한다. 현재 사용되고 있는 대부분의 불멸화된 세포주는 암 세포의 또는 융합된 하이브리도마 세포의 후손이다. 그러나, 후자의 기술은 골수종 세포와의 융합에 제한된다. 다른 종류의 불멸화된 세포를 생산할 수 있는 일반적인 기술은 존재하지 않는다.

<발명의 요약>

불연속 세포 물질로부터 연속 세포를 생산하는 것이 본 발명의 목적이다. 구체적으로, 외부 바이러스성 유전자의 도입 없이 증식하는 잠재력을 가진 연속 세포주를 제공하는 것이 목표였다.

따라서, 본 발명은 동물 또는 인간의 살아있는 세포를 제공하고, 상기 세포에 UV 광을 조사하고 상기 세포를 증식시키며 20 회 이상 통과 이후에도 증식가능한 세포를 연속 세포주의 세포로서 선택하는 것을 포함하는 연속 세포주의 제조 방법을 제공한다.

이와 같은 연속 세포주는 단백질과 같은 생분자의 재조합 발현 또는 바이러스성 항원 또는 전체 바이러스 집단과 같은 바이러스성 산물의 생산, 구체적으로 예방접종 목적을 위해 번식 및 사용될 수 있는 세포의 배양이다.

따라서, 본 발명은 발명 방법으로부터 얻을 수 있는 연속 세포주의 세포를 제공하고, 상기 세포를 바이러스로 감염시키고 상기 바이러스를 상기 세포 내에서 번식시키고 상기 바이러스를 모으는 것을 포함하는 바이러스의 제조 방법 또한 제공한다.

또 다른 태양에서 본 발명은 발명 방법으로부터 얻을 수 있는 연속 세포주의 세포를 제공하고, 유전자 산물을 암호화하는 핵산으로 세포를 형질감염시키고 상기 유전자 산물을 발현시키고 임의로, 상기 유전자 산물을 모으는 것을 포함하는 재조합 유전자 산물의 제조 방법을 제공한다.

추가의 태양에서 본 발명은 동물 또는 인간의 살아있는 세포를 제공하고, 상기 세포에 유효 조사량의 UV 광을 조사하고 상기 세포를 증식시키며 20 회 이상 통과 이후에도 증식가능한 세포를 연속 세포주의 세포로서 선택하는 것을 포함하는 방법으로 얻을 수 있는 연속 세포주를 제공한다.

외부 바이러스성 유전자의 도입 없이 증식하는 잠재력을 가진 연속 세포주를 제공할 수 있다.

도 1은 UV 처리 과정의 도식을 나타낸다.
도 2는 연속 메추라기 세포 배양을 나타낸다.
도 3은 계통발생 나무 및 연속 메추라기 세포주 제조의 처리 경로를 나타낸다.
도 4는 UV 조사량 대 조사 시간을 연속 세포를 제조하는데 사용된 준비와 함께 나타낸다.

본 발명은 세포의 UV 처리를 통한 연속 세포주의 제조를 제공한다.

세포주는 1차 세포 배양의 1 이상의 계대배양에 의해 형성된 세포의 집단이다. 각 회의 계대배양은 통과로 지칭된다. 세포가 계대배양되는 경우, 이들은 통과되었다고 지칭된다. 특정 집단의 세포 또는 세포주는 이것이 통과된 횟수로 특성화될 수 있다. 1차 배양은 조직으로부터 세포가 단리된 후의 제1 배양이다. 제1 계대배양 이후, 세포는 2차 배양(1회 통과)으로 기술된다. 제2 계대배양 이후, 세포는 3차 배양(통과 2), 등이 된다. 통과 기간 동안 많은 집단 배가가 있을 수 있음이 당업자에게 이해될 것이다; 따라서, 배양의 집단 배가 수는 통과 수보다 크다. 통과 사이 기간 동안의 세포 팽창(즉, 집단 배가 수)은 시딩 밀도, 기재, 배지, 성장 조건 및 통과 사이의 시간을 포함한, 그러나 여기에 제한되지 않는 많은 인자에 의존한다. 세포 배지의 접종, 세포에 의해 융합성 세포 배양 또는 연속 필름이 형성될 때까지 세포가 성장하게 둠 및 융합성 세포의 일부로 새로운 세포 배지를 접종시키는 것에 의해 배양을 수행할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 통과는 번식 능력을 평가하는 도구이다. 일반적으로, 조직으로부터 단리된, 비-조사된 세포를 포함한 세포는 그들이 더 이상의 번식 또는 세포 배가가 일어나지 않는 상태에 이를 때까지 약 10-20회 통과될 수 있다. 그 후 세포는 더 이상의 계대배양을 얻을 수 없는 노년 상태에 들어간다. 그에 반해 연속 세포주는 20회 초과 통과 이후, 예컨대 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 55, 60, 65, 70, 75 또는 80회 통과 이후 증식 가능하다. 이제 발명자들은 20번째 통과를 넘어 다수 회 통과될 수 있는 이와 같은 연속 세포주, 구체적으로 불멸화된 세포는 UV 처리에 의한, 즉 이들 세포에 유효 조사량의 UV 광을 조사함에 의한 세포의 변이를 통해 얻을 수 있음을 발견했다. 용어 "유효 조사량의 UV 광"은 본 발명에 따르면 불연속 세포주를 연속 세포주로 형질전환시키는데 필요한 조사량일 것이다. UV 광의 유효 조사량은 전체로서, 이와 같은 형질전환에 요구되는 최소의 조사량 내지 세포 배양에의 치명적인 결과 없이 이들 세포에 의해 용인될 수 있는 최대의 조사량 범위이다. 유효 조사량 한계 초과 또는 미만에서 연속 세포주를 얻을 수 없음은 자명하다. 당업자는 여기에 포함된 정보 및 지시에 기초해 통상적인 최적화로 각 세포주에 대한 최적의 유효 조사량을 쉽게 결정할 수 있다. 세포는 1차 세포 또는 몇 회의 통과 이후 번식할 수 있는 세포일 수 있다. 세포주의 배양은 표준 세포 배양 기술로, 예컨대 T-플라스크 시스템 또는 롤러 병 시스템 내 또는 교반 탱크 또는 다른 생반응기 형식 내에서 수행될 수 있다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 배양은 혈청-부재 조건에 적응 및 혈청-부재 조건 하에 유지된다.

본 출원에서, 용어 "UV 광"은 10 내지 400 nm, 구체적으로 100 내지 400 nm의 파장을 가진 자외선을 의미한다. UV 광은 UV C(100 내지 280 nm), UV B(280 내지 320 nm) 및 UV A(320 내지 400 nm)으로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 파장은 200 내지 300 nm이다. 본 발명의 모든 실시양태에서 필수적인 것은 아니나, UV 조사의 변이 효과를 강화시키기 위해 DNA 내로 끼어드는 것들 및 UV 광에 의해 활성화되는 것들과 같은 광증감제를 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시양태에서, UV 광은 약 100 내지 약 280 nm의 파장을 갖는 UV C이다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, UV 광은 약 240 내지 약 290 nm의 파장을 갖는다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서 UV 광의 약 85 % 이상이 약 254 nm의 파장을 갖는다.

임의의 이론에 얽매이지 않고, UV 광이 세포의 유전 물질을 변이시키고, 이는 돌연변이를 도입시킨다고 생각된다. 이와 같은 변이는 일반적으로 세포의 회복 기전에 의해 회복될 수 있지만, 일부 변이는 남을 수 있다. 이들 변이는 치명적인 돌연변이 및 세포 불멸화를 야기하는 변이 또한 도입시킬 수 있다. UV 조사 실험으로부터, 세포의 상당 부분을 불멸화시키고 배양가능하도록 만드는 최적의 조사량을 선택할 수 있다. 통과 이후, 번식 가능한 생존가능한 세포만이 선택된다고 생각되며, 이들은 불멸화를 불러오는 1 이상의 변이를 갖는 변이는 소량만 가질 것으로 기대된다. 조사된 세포의 상당 부분은 불멸화되지 않고 사멸 또는 괴사성 세포를 생성하는 상이한 변이를 얻을 것이다. 그러나, 원칙적으로, 불멸화를 유발하는 변이를 갖는 단 하나의 세포가, 이 세포가 여기에 기술된 바와 같이 계속 번식하고 다수 회의 통과를 통해 살아남을 것이기 때문에, 연속 세포 배양을 얻기에 충분하다.

UV 광 방출은 UV 광 방출의 연속적인 형태, 예컨대 수은 램프 기술 또는 파동형태의 UV 빛, 예컨대 단색 레이저 기술일 수 있다. 바람직한 UV 강도는 2 이상의 램프를 합침으로써 생성할 수 있다. 2회 이상의 조사 과정이 그 사이의 휴지기와 합쳐질 수 있다. 본 발명의 주제는 UV 광의 임의의 유효 조사량, 즉 세포를 연속적으로 증식하도록 변이시킬 수 있는 UV 광의 임의의 조사량을 포함한다. 유효 조사량은 해당 분야에 일반적으로 알려진 다양한 인자, 예컨대 UV 조사 챔버의 물리적 지표, 예컨대 램프 및 챔버의 크기 및 지름, 세포 함유 배지와 UV 광원 사이의 거리, 챔버 물질의 흡광 및 반사 성질에 의존할 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 세포는 단일층, 표면 위의 하나의 세포층 내에서 조사된다. 또한, UV 광의 파장 및 강도와 세포가 UV 광에 노출되는 접촉 시간 또한 유효 조사량에 중요하다. 추가로, 유효 조사량은 또한 세포 그 자체, 바이러스를 함유하는 배지 및 그들의 흡광 성질에도 영향을 받는다. 본 발명의 다양한 실시양태에서, 유효 조사량은 샘플 내에 수용된 세포의 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % 이상 또는 100 %를 변이시키기에 충분하고 다른 실시양태에서 유효 조사량은 10 % 이상의 세포가 연속적으로 성장하도록 변이되는 수준으로 세포를 변이시키기에 충분하다. 10 % 내지 90 %의 세포는 조사에 의해 죽을 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 세포를 함유하는 샘플은 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 또는 70 mJ/cm² 이상의 유효 조사량에 노출된다. 일부 실시양태에서 유효 조사량은 약 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 180, 150, 130 또는 105 mJ/cm² 이하이다. 본 발명의 특정 실시양태에서, UV 조사량은 약 70 내지 105 mJ/cm²이다. 일부 실시양태에서, 이들 조사량은 UV C 광에 의해 도입된다. 용어 "약"은 단일 파장(레이저에서와 같이)에서 분리된 UV 광을 제공하지 않고 근처의 파장에서도 빛을 방출하는 가우스 모양 스펙트럼을 갖는 통상적인 UV 램프의 성질을 지칭한다. 이들 램프 중 몇몇을 사용하는 실시양태에서, "약"은 10 %의 파장 값의 편차를 지칭한다.

방사선 조사 또는 통과 이전 또는 이후에, 세포주는 품질 관리 기준, 예컨대 멸균성, 미코플라즈마 오염 부재, 외래 바이러스 오염 부재 및/또는 역전사 효소의 존재에 대한 F-퍼트(F-pert) 시험의 통과와 해당 분야에서 의학 생명공학 용도로 세포주를 선택하는데 사용하는 다른 품질 관리 기준을 만족시키도록 추가로 선택될 수 있다. 여기서, "부재"는 오염이 현재의 품질 시험 공정의 검출 한계 미만으로 감소되었다는 것으로 이해된다. 본 기술이 바이러스성 벡터의 사용 또는 레트로바이러스의 도입 없이 연속 세포주를 생성할 수 있으므로, 본 발명의 세포주는 역 전사효소 활성에 대한 분석에 의해 시험될 수 있는 바와 같이 종종 임의의 레트로바이러스성 활성을 갖지 않는다. 그러나, 이와 같은 레트로바이러스성 활성은 예컨대 세포주 내에서 바이러스 또는 단백질의 생산 목적을 위해 분자 공학 기술에 의해 본 발명의의 세포주 내로 특별히 도입될 수 있다.

세포주는 임의의 진핵 세포, 특히 고등 생물의 것, 예컨대 어류, 조류, 파충류, 양서류 또는 포유류 세포 및 심지어는 곤충 또는 식물 세포일 수 있다. 일부 실시양태는 햄스터, 생쥐, 쥐, 개, 말, 소, 영장류 또는 인간의 것과 같은 포유동물 세포를 사용한다; 다른 실시양태는 조류 세포, 예컨대 닭, 오리, 카나리아, 앵무새, 메추라기, 타조, 에뮤, 칠면조 또는 거위의 것을 사용한다. 일반적으로, 임의의 새 종류가 본 발명에 사용하기 위한 조류 세포의 공급원이 될 수 있다. 일부 실시양태에서, 더 통상적으로 사육되는 종(예컨대 닭)에서 유행하는 바이러스로의 가축 조직의 잠재적인 오염을 피하기 위해, 덜 자주 사육되는 종(예컨대 메추라기 또는 에뮤)을 사용하는 것이 바람직하다.

방사선 조사되는 세포는 임의의 종류의 조직일 수 있다. 일부 실시양태에서 조직은 배아에서 유래된다. 많은 실시양태에서, 붕괴 조직 또는 복합 조직에서 얻을 수 있는 바와 같이 1 종류 초과의 조직의 혼합된 배양이 사용된다. 추가의 실시양태에서 세포는 배아 탯줄의 것이다. 방사선 조사된 세포 또는 조직(들)은 예컨대 내피 세포, 상피 세포, 다능성 또는 전능성 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 신경 세포, 콩팥 세포, 간 세포, 근육 세포, 결장 세포, 백혈구, 폐 세포, 난소 세포, 피부 세포, 비장 세포, 위 세포, 갑상선 세포, 혈관 세포, 췌장 세포 및/또는 그들의 전구 세포 및 그들의 조합의 것이거나 이들을 포함할 수 있다.

많은 실시양태에서 세포는 방사선 조사 도중 또는 배양 도중 표면에 부착된다. 표면 상에서의 배양은 내피 세포에 특히 적절하고, 이로써 세포는 추가의 품질 기준, 예컨대 단일층을 형성하는 그들의 능력을 만족시키는데 대해 추가로 선택될 수 있고, 이는 UV 조사량이 너무 많은 손상 변이를 도입시키는 경우 방해될 수 있다. 이와 같은 표면 상에서, 세포는 단일층을 형성할 수 있다. 구체적으로 세포는 미세 담체 상에서 배양 또는 방사선 조사된다. 별법으로 세포는 현탁액 내에서 방사선 조사 또는 배양되거나 또는 방사선 조사 및 배양될 수 있다. 처음에 표면 상에서 방사선 조사 또는 배양된 세포를 이후에 현탁액 배양 내에서의 성장에 적응시킬 수 있다.

또 다른 태양에서 본 발명은 발명의 방법에 의해 얻을 수 있는 연속 세포주의 세포를 제공하고, 상기 세포를 바이러스로 감염시키고, 상기 바이러스를 상기 세포 내에서 번식시키고 상기 바이러스를 모으는 것을 포함하는 바이러스의 제조 방법을 제공한다.

본 발명에서, 생산될 바이러스는 연속적인 또는 분절된, 센스 또는 안티센스, 단일 또는 이중(DNA) 가닥 게놈을 갖는, 외피 또는 비외피 DNA 또는 RNA 바이러스에서 선택된다. 바이러스는 베큘로바이러스(baculovirus), 폭스바이러스(poxvirus), 아데노바이러스(adenovirus), 파포바바이러스(papovavirus), 파보바이러스(parvovirus), 헤파드나바이러스(hepadnavirus), 코로나바이러스(coronavirus), 플라비바이러스(flavivirus), 토가바이러스(togavirus), 에스트로바이러스(astrovirus), 피코나바이러스(picornavirus), 레트로바이러스(retrovirus), 오르토믹소바이러스(orthomyxovirus), 필로바이러스(filovirus), 파라믹소바이러스(paramyxovirus), 랍도바이러스(rhabdovirus), 아레나바이러스(arenavirus) 및 분야바이러스(bunyavirus)로 구성되는 군에서 선택될 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 바이러스는 플라비바이러스, 토가바이러스, 레트로바이러스, 코로나바이러스, 필로바이러스, 랍도바이러스, 분야바이러스, 오르토믹소바이러스, 파라믹소바이러스, 아레나바이러스, 헤파드나바이러스, 허페스바이러스(herpesvirus) 및 폭스바이러스를 포함한 외피 바이러스의 군에서 선택된다. 다른 실시양태에서, 바이러스는 외피 바이러스, 예컨대 인플루엔자 A, B 또는 C를 포함한 인플루엔자, 웨스트 나일 바이러스(West Nile Virus), 백시니아 바이러스(Vaccinia Virus), 변형된 백시니아 바이러스 또는 로스 리버 바이러스(Ross River virus)이다. 본 발명의 다른 실시양태에서, 바이러스는 플라비바이러스, 토가바이러스, 레트로바이러스, 코로나바이러스, 필로바이러스, 랍도바이러스, 분야바이러스, 오르토믹소바이러스, 파라믹소바이러스 및 아레나바이러스를 포함한 외피 RNA 바이러스의 군에서 선택된다. 특정한 실시양태에서, 바이러스는 MVA(변형된 백시니아 바이러스 앙카라(Ankara)), TBE(진드기 뇌염) 바이러스, 황열 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 뉴 칼레도니아 바이러스(New Caledonia virus) 또는 인플루엔자 바이러스이다.

수집단계 이후, 예컨대 본원에 참조로 도입된 미국 공개 번호 제2006/0270017 Al호에 개시된 것과 같은 바이러스 불활성화에 대한 임의의 공지된 수단에 의해 바이러스를 불활성화시킬 수 있다. 구체적으로, 포름알데히드 처리 및/또는 UV 조사 단독 또는 조합에 의해 불활성화를 수행할 수 있다.

일반적으로, 혈청 또는 혈청-유래된 물질, 예컨대 알부민, 트랜스페린 또는 인슐린은 세포 배양을 오염시킬 수 있는 원하지 않는 시약 및 얻어지는 그들의 생물학적 산물을 포함할 수 있다. 추가로, 인간 혈청 유래된 첨가물은 혈청을 통해전달될 수 있는 간염 바이러스 및 HIV를 포함한 모든 알려진 바이러스에 대해 시험되어야 한다. 따라서, 발명된 방법의 일부 실시양태에 따르면, 세포주의 세포는 혈청 부재 배지에서의 성장에 적응된다, 예컨대 그들은 혈청 부재 배지 내에서 성장하는 그들의 능력에 대해 선택된다. 배지는 혈청 또는 혈청 분획 또는 일반적인 혈액 구성성분도 부재일 수 있다. 본 발명의 이들 실시양태에 대한 배지는 전체로서 여기에 참조로 도입된 제US 2007/0212770호에 기술된 바와 같은 DMEM/햄(HAM) F12, RPMI, MEM, BME, 웨이마우스(Waymouth) 배지, 구체적으로 올리고펩티드- 또는 단백질 부재 배지 또는 그들의 조합에서 선택될 수 있다. 상기 올리고펩티드 부재 배지는 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5 또는 4개의 아미노산 초과의 크기를 갖는 혈액 단백질 또는 올리고펩티드 부재일 수 있으나, 글루타티온을 포함할 수 있다. 단백질 부재 배지는 실질적으로 단백질이 없으나, 세포주에 의해 생산된 단백질 또는 프로테아제를 함유할 수 있다. 구체적으로 배지는 또한 성장 촉진제로서 폴리아미드를 포함할 수 있고/있거나 제US 2007/0212770호에 기술된 바와 같은 화학적으로 정의된 배지일 수 있다. 용어 "화학적으로 정의된"은 배지가 임의의 정의되지 않은 보충물, 예컨대 동물 성분, 장기, 샘, 식물 또는 효모의 추출물을 포함하지 않음을 의미한다. 따라서, 화학적으로 정의된 배지의 각 성분은 정확하게 정의된다. 화학적으로 정의된 배지는 실질적으로 단백질 또는 세포 가수분해물 부재이나, 세포주에 의해 생산된 단백질 또는 프로테아제를 함유할 수 있다. 이와 같은 배지의 예는 www.invitrogen.com/content/sfs/brochures/332032442_SFMBrochure.pdf)에서 WWW를 입수가능한 문헌 [A guide to Serum-Free Cell Culture, GIBCO cell culture (2003)]에 주어진다.

혈청 부재 배지, 올리고펩티드 부재 배지 또는 화학적으로 정의된 배지를 포함한 이들 배지는 바이러스 접종 전 또는 후에 글루타티온 및/또는 프로테아제, 특히 트립신, 예컨대 돼지 또는 재조합 트립신도 포함할 수 있다(문헌 [Klenk et al. (1975) Virology, 68: 426-439]). 이와 같은 프로테아제는 세포가 강한 내지 매우 약한 접착을 보임으로써 표면에 부착되기 때문에, 세포주의 배양 중에도 요구될 수 있다. 강하게 부착되는 세포는 프로테아제 및/또는 킬레이트 약, 예컨대 EDTA에 의해 탈착될 수 있다(문헌 [Doyle et al. Chapter 4: Core Techniques, in: Cell & Tissue Culture: Laboratory Procedures, ECACC, John Wiley & Sons, Chichester (1996)]). 또한 배지, 구체적으로 단백질 부재 배지는 접종 전 또는 후에 식물 또는 효모 가수분해물을 포함할 수 있다. 물론 배지는 본 발명의 세포주에 의해 생산된 단백질 또는 대사 산물도 포함할 것으로 생각된다.

본 발명의 방법으로 얻을 수 있는 세포주는 일반적으로 비-종양 형성성 및/또는 비-발암성이다. 일부 실시양태에서 세포주의 세포는 F-퍼트 시험과 같은 품질 시험을 통과하는 것에 대해 시험 및 선택된다.

추가의 태양에서 본 발명은 발명의 방법으로부터 얻을 수 있는 연속 세포주의 세포를 제공하고, 유전자 산물을 암호화하는 핵산으로 세포를 형질감염시키고 상기 유전자 산물을 발현시키고 임의로, 상기 유전자 산물을 모으는 것을 포함하는 재조합 유전자 산물의 제조 방법을 제공한다. 핵산은 DNA, RNA 또는 PNA일 수 있다. 유전자 외에, 핵산은 세포 내에서의 발현을 위한 촉진자 및 선택 마커를 포함할 수 있다.

추가의 태양에서 본 발명은 동물 또는 인간의 살아있는 세포를 제공하고, 상기 세포에 유효 조사량의 UV 광을 조사하고 상기 세포를 증식시키며 20 회 이상 통과 이후에도 증식가능한 세포를 연속 세포주의 세포로서 선택하는 것을 포함하는 방법으로 얻을 수 있는 연속 세포주를 제공한다. 본 발명의 세포주는 이와 같이 제조된 세포주의 후손도 포함한다. 구체적으로 세포주는 본원에 기술된 방법의 실시양태에 의해 얻을 수 있는 것으로 정의된다. 얻을 수 있는 연속 세포주는 연속 세포주를 제조하는데 필수적인 UV 조사와 관련된 특정한 핵형의 말단소립 활성과 같은 특징적인 특성을 가질 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 세포주의 세포는 비-종양 형성성 및/또는 비-발암성이며 특히 F-퍼트 시험과 같은 품질 시험 또한 통과한다.

특정 실시양태에서, 세포주는 각각 제출 참조번호 QOR/RE07-169, QORl CJ07 및 CORECB/SF08-06에 대응하는 기탁 접근 번호 08020602, 08020603 또는 08020604로 ECACC에 기탁된 세포주이다. 추가의 발명의 세포주는 상기 기탁된 세포주와 같은 번식 능력, 세포주기 패턴, 끝분절효소 활성, 핵형, 염색체 패턴 또는 말단소립 길이 및 당연히 연속 세포주가 되는 것과 같은 특징적인 특성을 갖는다.

본 발명은 아래의 실시예에 의해 추가로 도시되나, 여기에 제한되지는 않는다.

실시예

실시예 1: 돌연변이 물질을 생산하기 위한 UV 광으로의 베로( Vero ) 세포의 시간적으로 상이한 조사.

TC-베로 배지

N1-완충액

트립신(1:10 희석)

트립신 저해제

6-웰 판, 코닝(Corning) 카탈로그 번호 3516

25 cm² T-플라스크, 눈크(Nunc) 카탈로그 번호: 163371

UV 램프, VL 50C, 240 nm 격자-튜브, 50 W, 빌버-로어멧사(Vilber-Lourmet)

공정:

6-웰 판 내에서 1x10⁶ 세포/웰 및 5 ml의 배지 부피로 준비를 수행했다(이중 설정). 총 7 개의 판(각 경우에 2 웰/판)을 준비했다.

24 시간 후, 우수한 단일층 배양을 얻었다. 5 ml의 배지를 1 ml로 비워냈고, 개봉된 판에 UV 광을 조사했다(판에서 UV 램프의 거리 = 9 cm)

판 A: 15 분

판 B: 30 분

판 C: 45 분

판 D: 60 분

판 E: 90 분

판 F: 120 분

판 G: 대조군, 방사선 조사 안함

조사 후, 양 웰의 세포를 트립신화 했고(1 ml 트립신 + 0.5 ml 트립신 저해제/웰), 여기서 세포수(CC) 및 생육성을 측정하는데 제1 웰의 세포를 사용했으며 제2 웰의 세포는 25 cm² 루(roux) 내 10 ml의 배지로 통과시켰다.

<표>

T-플라스크 25 내용물을 트립신화시켰고, 세덱스(Cedex)를 사용해 TCC 및 생육성을 측정했다:

<표>

* 세덱스 내의 세포 수가 정확한 세포 수를 측정하기에 너무 낮으므로 실제 값은 더 낮다!!!

실시예 2: 조류 세포의 UV 조사

본 연구의 목적은 백신 생산에 적절한 연속 세포주의 생산을 위한 도구로서 UV-광 처리의 잠재적인 용도를 조사하는 것이었다.

최초의 1차 단일층 배양의 제조를 위한 출발물질로서 1차 닭 및 메추라기 배아를 사용했다. UV 광 노출에 기초한 유도 공정에 거기서 유래된 품질 관리된 세포 배양을 사용했다.

1차 세포의 UV 광(254 nm)에의 노출. 밥화이트(bobwhite) 메추라기 또는 닭 배아의 1차 세포로부터 UV 조사의 방법으로 연속 세포주가 발달되었다.

메추라기 배아의 1차 세포로부터 유래되는 세포주의 안전 뱅크 생산까지의 상세한 발달 경로는 도 3에 계통발생 나무의 형태로 도시된다.

UV 조사를 위한 출발 물질로서, 각 경우에 닭 배아, 일본 메추라기의 및 밥화이트 메추라기의 배아(붕괴된 완전한 배아의 혼합된 배양)의 세포 제제에서 기원된 제1 평가 세포 뱅크의 하나의 앰플(닭, 일본 메추라기 및 밥화이트 메추라기)을 해동시켰다.

6-웰 판 내에서 1x10⁶ 세포/웰의 세포 시드 및 5 ml의 배지 부피로 UV 조사를 위한 준비를 수행했다. 5 %의 FBS 및 항생제(페니실린, 스트렙토마이신 및 젠타마이신)를 가진 TBE 배지(FSME)를 배지로 사용했다. 총 7 개의 판(각 경우에 2 웰/판)을 준비했다. 24 시간 후, 웰 내에 균일한 단일층 배양을 관찰할 수 있었다. 세포의 방사선 조사를 위해, 5 ml의 배지를 1 ml로 비워냈고, 아래와 같이 박판형 유동 벤치(laminar flow bench) 내에서 개봉된 판에 UV 광을 조사했다. 판에서 UV 램프의 거리는 9 cm였다. 빌버-로어멧사의 UV 램프(VL 5OC, 240 nm 격자-튜브, 50 W)를 UV 광원으로 사용했다.

판 A: 0.5 분

판 B: 1 분

판 C: 2 분

판 D: 3 분

판 E: 4 분

판 F: 5 분

판 G: 대조군, 방사선 조사 안함

조사 후, 세포를 웰 내에서 트립신화 했고(N1 완충액으로 1:10 희석된 트립신 1 ml), 여기서 CC 및 생육성을 측정하는데 세포 현탁액 1 ml(총 6 ml)를 사용했으며 나머지 세포는 25 cm² 루(roux) 내 5 ml의 배지로 통과시켰다. 결과를 본 실시예의 표에 요약했다.

제1 배양기간 동안(약 25-35 일), 배지 교환만 있었으며, 개별적인 시험에서 세포의 형태 및 접착은 광학적으로 평가하였다. T-25 플라스크 내 유착성으로 성장하는 세포의 섬 형성이 관찰된 직후에, 균일한, 유착성 세포 콜로니화를 촉진하기 위해 시험 A-E의 세포를 트립신화시키고 6-웰 판(T-25 플라스크보다 표면이 더 작음)에 옮겼다. 이 시점에서(약 K40-K50), 80-100 %의 합류에 이른 세포를 매 6-9일 마다 T-25 및 T-75 플라스크 내에서 추가로 통과시켰고 평가 세포 뱅크를 제조하기 위한 출발 물질로 기능한 1-2 개의 안전 앰플(약 10 개의 앰플) 내에 준비했다. 실시예 3에서 상기 세포 집단의 트립신화 및 통과를 기술한다.

사용한 제제

배지: - TBE 배지(FSME) + 5 % FBS + 항생제 혼합물(페니실린/스트렙토마이신 lOO mg/l 및 50mg/l 젠타마이신)

-TBE 배지(FSME) + 10 % FBS

-TC 베로 배지 + 10 % FBS

-N1 완충액

-감마 트립신

-DMSO (시그마(Sigma) 사)

축약: CC...세포 수, T-25/75/175...25/75/l75 cm² T-플라스크

표: 방사선 조사 후 개별적인 시험의 세포 수 및 생육성

<표>

* 측정 안됨

개별적인 시험 준비 A-G의 유사한 세포 수 값 및 생육성 때문에, 세포의 UV-조사 시간에 따른 현저한 차이를 볼 수 없었다. 이는 상세한 사항을 인식하기 위해 비교된 배양의 형태 및 접착을 거의 일간으로 평가한 이유이다.

모든 시험 준비 A-F 중에서, 준비 E로부터의 세포 집단이 연속적, 유착성으로 성장하는 세포주의 가장 우수한 성질, 예컨대 균일 세포 구조, 상이한 T-플라스크 내에서의 배양, 몇몇 통과 이후 지속적인 세포 성장, 냉동보존 능력 및 바이러스(예컨대, MVA 바이러스) 증식에의 적절성을 보였다.

메추라기 세포의 경우, 준비 F로부터의 세포 집단은 성공적으로 배양할 수 없었다. UV 광을 조사하지 않은 세포(시험 G)에서 6 회 초과의 통과 이후 불균일한 세포-론(cell-lawn) 형성(큰 통합체)을 수반하는 감소된 세포 성장을 관찰할 수 있었다. 16 회 통과부터, 세포는 그들의 분열 능력을 잃었으며 더 이상 배양할 수 없었다. 대체로, 메추라기 및 닭 세포 시험에서 유사한 결과에 도달할 수 있었다.

실시예 3: 세포의 트립신화 및 통과

베로 셀에 대해 통상적으로 사용되는 것과 유사한 통과 도식으로 유착성으로 성장하는 메추라기 세포의 트립신화 및 통과를 수행했다. 배양 배지를 부은 후, N1 완충액으로 세척 단계를 수행하고 상응하는 양의 1:10 희석된 감마 트립신의 층(들)으로 배양을 덮고 세포가 배양 용기에서 탈착(약한 노킹(knocking)에 의해) 될 때까지 37 ℃의 온도에서 인큐베이션 시켰다(6-웰 판 및 T-25(T-25...25 cm² T-플라스크)에서는 실온이 충분하다). 배양 배지 내에 함유된 FBS 때문에 트립신의 작용을 막기 위한 트립신 저해제의 첨가는 필수적이지 않다. 이어서, 세포를 새로운 배양 배지로 옮기고, 각 분할에 상응하여 추가의 배양 용기 내로 나누었고 다시 성장하도록 두었다.

아래의 표는 트립신화 중 사용된 양을 나타낸다.

<표>

실시예 4: UV 램프 VL 50C로의 세포 불멸화를 위한 UV -C 선량측정

UV 조사로 연속 세포주를 얻기 위한 조사량을 측정했다. 선량측정 준비는 세포 처리를 위한 준비와 유사했다. UV-C 광으로의 조사는 완충 용액 내에 용해된 요오드화 칼륨 및 요오드산 칼륨의 황갈색 삼-요오드화물로의 변형을 야기한다. 삼-요오드화물은 352 nm에서 그의 최대 흡수를 가지며 스펙트럼 광도계에서 정량적으로 측정될 수 있다. 이 이론은 노출 시간에 따른 세포 단일층 노출 중 적용되는 UV 조사량을 측정할 수 있게 한다. 따라서, 6-웰 판에서의 측정에 기초해, 0.5 내지 5 분의 노출 시간이 20 내지 120 mJ/cm²의 UV 조사량에 상응한다(도 4).

세포주 시험과 같이, 선량측정을 최대한 정확하게 수행했다. 각 경우에 6-웰 판의 하나의 웰 내에서 약 2.5/cm, 4.5/cm 및 7.5/cm의 흡수 계수(367 mn)를 갖는 1 ml의 모델 용액을 조사했다. 각 모델 용액을 6 번 조사했다. 조사 시간 = 30 초, 1 분, 2 분, 3 분, 4 분 및 5 분. 각 조사 시간에 대한 정확한 조사량을 찾기 위해, 사용된 배지의 OD(253.7 nm)를 측정했다.

사용한 물질:

-휴대용 UV 램프, VL50C, 254 nm, 50 W, 빌버-루어멧사

-스펙트럼 광도계, 터마(Therma)사, 기기 번호: PA5007-012MM

-6-웰 판

-붕산 99.9 %, 리델-데 한(Riedel-de Haen)사, 롯트 번호: 60460

-NaOH 환약, 벡스터(Baxter)사, 롯트 번호: 318608

-PVP K17 PF(폴리비닐-피롤리돈 콜리돈(Collidon) K17), 바스프(Basf)사, 롯트 번호: 30408609T0

-요오드화 칼륨, 시그마 알드리히(Sigma Aldrich)사, 롯트 번호: P2963-500G

-요오드산 칼륨, 머크(Merck)사, 롯트 번호: K32577451622

-TC 베로 배지(VT), 충전: ORSFVTC0700401

-WFI 수, 벡스터사, PP2

세 개의 모델 용액을 충분한 양으로 제조했다.

표 1: 모델 용액의 조성

모델 용액은 그들이 사용될 때까지, 그러나 적어도 47일까지 어두운 곳에서 저장될 수 있다.

모델 용액 1, 2 및 3으로부터 각각 60 ml를 취해 보정 곡선을 만들었다. 입사광으로부터 이들 샘플을 보호하면서, 보정 곡선을 생성하는 IBC로 보냈다. 모델 용액 1, 2 및 3으로부터 각각 100 ml를 스콧(Schott) 플라스크 내로 옮기고 입사광으로부터 보호했다. 휴대용 UV 램프 VL 5OC을 외곽 구조에 위치시켰다. 테이블 판과 휴대용 UV 램프의 바닥측 사이의 거리는 9 cm이다. 휴대용 UV 램프는 필터가 테이블 판(즉, 아래쪽)을 향하도록 맞추었다.

휴대용 UV 램프를 사용 30 분 전에 켰다.

100 ml의 모델 용액 1, 2 및 3을 갖는 3 개의 스콧 플라스크, 피펫, 피펫보이(pipettboy), 빈 스콧 플라스크 및 3 개의 6-웰 판을 준비했다. 1 ml의 모델 용액 1을 6-웰 판의 왼쪽 상단 웰 내로 피펫으로 옮겼다. 이 웰을 덮개 없이 휴대용 UV 램프 아래에 위치시켜 이것을 필터 아래 중앙에 위치 되도록 했다. 조사 30 초 후, 웰을 휴대용 UV 램프 아래의 그 위치로부터 재빨리 제거했다. 조사된 1 ml 용액 370 μl를 박막 실리카 크벳(cuvette)으로 옮기고 5 분 내에 OD367 nm를 측정했다. 이것을 3회 측정하고 기록했다. 이들 3개 값의 평균값을 결정했다. 결정된 값이 광도계의 보정 영역 밖인 경우, 상응하여, 상이한 층 두께의 크벳을 사용할 것이다. 웰 내의 상청액을 빨아내어 버렸다.

이들 단계를 모든 조사 횟수마다 반복했다. VT 배지의 얻어진 곡선 함수 및 OD(253.7 nm)에 기초해, 30 초 내지 5 분의 각각의 UV 조사량[mJ/cm²]을 계산했다. 결과를 아래 표에 나타낸다.

표: 각 곡선 함수에 기초해 계산한 UV 조사량

<표>

이 표에서 볼 수 있는 바와 같이, 조사량의 곡선 함수는 y = 24.09x + 4.3125이다. x는 분 단위의 조사 시간이고 y는 mJ/cm² 단위의 조사량이다(표 4).

실시예 5: 연속 세포 내에서의 바이러스 생산

MVA, r-MVA, TBE 및 인플루엔자를 연속 메추라기 세포 내에서 번식시켰다. 상기와 같이 메추라기 세포의 롤러 병 배양을 생성했다. (GMP) MVA, 트로벡스(TroVax), TBE 및 인플루엔자 바이러스로 배양을 감염시켰다. 현재의 MVA 생산 과정에 따라 MOI를 선택했다. 3 내지 4일 후 바이러스성 산물을 수확했다. 배양 배지로서 TC-베로 10 % FBS를 32 ℃ 인큐베이션에서의 인큐베이션 중 사용했다.

감염: 최종 부피(60 ml)에서 1 시간 후 10 ml로 수행했다.

TBE: 50 μl 바이러스

MVA: 250 μl 바이러스

뉴 칼레도니아(NC): 50 μl

축약: KXX...배양 XX일

샘플 취함: 3x1 ml 샘플, 노바(NOVA), NaBr- + NC, HA, 현미경 사진

TBE

MVA

뉴 칼레도니아

대조군

롤러 병 실험에서 성장시킨 MVA 및 r-MVA에 대해 달성된 바이러스 역가:

바이러스 TCID₅₀/ml

MVA 8x10⁸

r-MVA(트로벡스) 9x10⁸

롤러 병 실험에서 성장시킨 TBE 및 인플루엔자에 대해 달성된 바이러스 역가:

바이러스	역가(log pfu/ml)	HA(HAU/50 μl)	CPE (%)
TBE	6.9	64	100
뉴 칼레도니아	측정 안됨	32	100

*실시예 6: 상이한 세포 배양의 F-퍼트 분석

F-퍼트 분석은 PCR에 의해 역전사 효소 활성을 검출할 수 있게 하며, 안전 확인을 위해 필수적이다. 상이한 배양(베로(음 대조), 1차 닭(양 대조), 연속 메추라기 및 연속 닭 세포)을 동일한 과정에 따라 제조했다. 배양 상청액을 수확하고 F-퍼트 품질 관리 시험을 위해 가공했다.

F-퍼트 시험 결과

세포 배양	F-퍼트
베로(대조)	음
CEC(1차 닭 세포)	양
메추라기 세포(4 개의 상이한 배양)	음
닭 세포(2 개의 상이한 배양)	음

유러피언 콜렉션 오브 셀 컬쳐스 ECACC08020602 20080206 유러피언 콜렉션 오브 셀 컬쳐스 ECACC08020603 20080206 유러피언 콜렉션 오브 셀 컬쳐스 ECACC08020604 20080206

Claims (1)

1. 동물 또는 인간의 살아있는 세포에 유효 조사량의 UV 광을 조사하는 것을 포함하는 연속 세포주의 제조 방법.

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