JP5653223B2 - 連続細胞系の生成方法 - Google Patents

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Description

本発明は、細胞系を生成する方法に関する。
細胞系は、ワクチン製造のための有用なツールになっている。いくつかの重要なワクチンおよびウイルスベクターの生成は、有胚ニワトリ卵または初代ニワトリ胚線維芽細胞にていまだに行われている。ウイルス複製のための初代鳥類組織は、SPF(特定病原体除去)生成プラントにより提供される。SPF由来組織は高価であり、供給材料の品質は、しばしば制御が困難である。よって、供給が不安定でかつ不足することがSPF卵に基づく技術の最も大きな短所である。初代線維芽細胞単層培養物を用いるアプローチについても同じことが言える。細胞系を無限に増やす(multiply)ためには、細胞を不死化させる必要がある。現在最も用いられている不死化細胞系は、癌細胞または融合ハイブリドーマ細胞の子孫である。しかし、最近の技術は、骨髄腫細胞との融合に限定されている。種々の型の不死化細胞を作製できる普遍的な技術は存在しない。
本発明の目的は、非連続細胞材料から連続細胞を生成することである。特に、外来ウイルス遺伝子を導入することなく増殖(proliferate)する能力を有する連続細胞系を提供することが目標であった。
よって、本発明は、動物またはヒトの生細胞を提供することと、前記細胞にUV光を照射することと、前記細胞を増殖させることと、少なくとも20回の継代の後に増殖(proliferate)できる細胞を、連続細胞系の細胞として選択することとを含む、連続細胞系の生成方法を提供する。
このような連続細胞系は、増殖(propagate)でき、タンパク質などの生体分子の組換え発現のため、またはウイルス抗原もしくはウイルス全体の集団のような特にワクチン接種目的のためのウイルス産物の製造のために用いることができる細胞の培養物である。
よって、本発明は、本発明の方法により得ることができる連続細胞系の細胞を提供することと、前記細胞に前記ウイルスを感染させることと、前記ウイルスを前記細胞内で増殖させることと、前記ウイルスを回収することとを含む、ウイルスを生成する方法も提供する。
別の態様において、本発明は、本発明の方法により得ることができる連続細胞系の細胞を提供することと、前記細胞に組換え遺伝子産物をコードする核酸で形質移入することと、前記組換え遺伝子産物を発現させることと、前記遺伝子産物を所望により回収することとを含む、前記組換え遺伝子産物を生成する方法を提供する。
さらなる態様において、本発明は、動物またはヒトの生細胞を提供し、前記細胞に有効量のUV光を照射し、前記細胞を増殖させ、少なくとも20回の継代の後に増殖できる細胞を、連続細胞系の細胞として選択する方法により得ることができる連続細胞系を提供する。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
(項目1)
動物またはヒトの生細胞に有効量のUV光を照射する工程と、少なくとも20回の継代の後に増殖(proliferate)できる細胞を、連続細胞系の細胞として選択する工程とを含む連続細胞系の生成方法。
(項目2)
前記細胞に、10nm〜400nmの間の波長のUV光を照射する工程を含む、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記波長が200nm〜300nmの間である、項目2に記載の方法。
(項目4)
前記UV光の照射量が少なくとも50mJ/cm である、項目1に記載の方法。
(項目5)
前記UV光の照射量が300mJ/cm までである、項目1に記載の方法。
(項目6)
前記細胞が鳥類または哺乳類の細胞である、項目1に記載の方法。
(項目7)
少なくとも40回の継代を含む前記細胞を選択する、項目1に記載の方法。
(項目8)
前記細胞が、表面に接着しているか、または懸濁されている、項目1に記載の方法。
(項目9)
前記細胞が胚の細胞である、項目1に記載の方法。
(項目10)
前記細胞が、1を超える型の組織の混合培養物である、項目1に記載の方法。
(項目11)
前記細胞が内皮細胞である、項目1に記載の方法。
(項目12)
前記細胞が単層にある、項目1に記載の方法。
(項目13)
ウイルスを生成する方法であって、項目1に記載の前記細胞に、前記ウイルスを、ウイルス増殖(proliferation)を許容する条件下で感染させる工程と、前記ウイルスを回収する工程とを含む方法。
(項目14)
前記ウイルスが、バキュロウイルス、ポックスウイルス、アデノウイルス、パポバウイルス、パルボウイルス、ヘパドナウイルス、コロナウイルス、フラビウイルス、トガウイルス、アストロウイルス、ピコルナウイルス、レトロウイルス、オルソミクソウイルス、フィロウイルス、パラミクソウイルス、ラブドウイルス、アレナウイルスおよびブニヤウイルスから選択される、項目13に記載の方法。
(項目15)
前記ウイルスが、MVA、TBEウイルス、黄熱病ウイルス、ウエストナイルウイルス、ニューカレドニアウイルスまたはインフルエンザウイルスから選択される、項目13に記載の方法。
(項目16)
組換え遺伝子産物を生成する方法であって、項目1に記載の細胞に、前記組換え遺伝子産物をコードする核酸を、前記組換え遺伝子産物の生成を許容する条件下で形質移入する工程と、前記遺伝子産物を所望により回収する工程とを含む方法。
(項目17)
前記細胞系の細胞が、無血清培地中での成長に適応されている、項目1に記載の方法。
(項目18)
前記培地が、DMEM/HAM's F12、RPMI、MEM、BME、ウェイマウ
ス培地、オリゴペプチド非含有培地、既知組成培地またはそれらの組み合わせから選択される、項目17に記載の方法。
(項目19)
前記細胞系の細胞が、非腫瘍原性および/または非癌原性であることについて選択される、項目1に記載の方法。
(項目20)
動物またはヒトの生細胞を提供し、前記細胞にUV光の有効用量を照射し、前記細胞を増殖させ、少なくとも20回の継代の後に増殖できる細胞を、連続細胞系の細胞として選択する方法により得ることができる連続細胞系。
(項目21)
前記UV光の有効用量が少なくとも50mJ/cm である、項目20に記載の細胞系。
(項目22)
前記UV光の有効用量が300mJ/cm までである、項目20に記載の細胞系。
(項目23)
ECACCに寄託受託番号08020602、08020603または08020604で寄託された細胞系。
(項目24)
前記細胞系の細胞が非腫瘍原性および/または非癌原性である、項目20に記載の細胞系。
(項目25)
前記細胞系の細胞が固体表面で培養できるかまたは懸濁液で培養できる、項目20に記載の細胞系。
(項目26)
前記細胞系の細胞が無血清培地で培養できる、項目20に記載の細胞系。

図1は、UV処理手順のスキームを示す。 図2は、連続ウズラ細胞培養物を示す。 図3は、系統樹と、連続ウズラ細胞系を生成する処理経路とを示す。 図4は、連続細胞を生成するために用いる設定での照射時間に対するUV照射量(UV dosage)の相関を示す。
本発明は、細胞のUV処理による連続細胞系の生成を提供する。
細胞系は、初代細胞培養物からの1つまたは複数の継代培養物により形成される細胞の集団である。継代培養の各ラウンドは、継代という。細胞が継代培養される場合、これらは継代されたという。細胞の特定の集団または細胞系は、それが継代された回数で特徴付けることができる。初代培養物は、組織からの細胞の単離の後の最初の培養物である。最初の継代培養の後に、細胞は、2次培養物(1回の継代)と記載される。2番目の継代培養の後に、細胞は3次培養物(継代2)になり、以下同様である。継代の期間中に、多くの集団倍加があり得ることが当業者により理解される。よって、培養物の集団倍加の数は、継代数よりも大きい。継代間の期間中の細胞の増殖(すなわち集団倍加の数)は、それらに限定されないが播種密度、基質、培地、成長条件および継代間の時間を含む多くの因子に依存する。培養は、細胞培地への播種と、細胞により集密な細胞培養物または連続的なフィルムが形成されるまで細胞を成長させることと、集密な細胞の一部を新しい細胞培地に播種することにより行うことができる。それにもかかわらず、継代は、増殖する能力を評価するツールである。通常、組織から単離される非照射細胞を含む細胞は、さらなる増殖または細胞倍加が生じない状態に到達するまで、約10〜20回継代できる。次いで、細胞は、そこからさらなる継代培養物を得ることができない老化状態に入る。これとは反対に、連続細胞系は、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、55、60、65、70、75または80回を超える継代後のような20回を超える継代後に増殖できる。今回、本発明者らにより、20回の継代を超える複数回継代できるこのような連続細胞系、特に不死化細胞が、UV処理、すなわちこれらの細胞に有効量のUV光を照射することによる細胞の改変により得ることができることが見出された。本発明による用語「有効量のUV光」は、非連続細胞系を連続細胞系に変換するために必要な照射量であるものとする。UV光の有効量は、このような変換に必要とされる最小照射量から、細胞培養物全体について致死的な結果をもたらすことなくこれらの細胞が耐える最大照射量までの範囲である。有効量の限度を超えるかまたはそれより低いと、連続細胞系を得ることができないことが明らかである。当業者は、通常の最適化をしながら、本明細書に含まれる情報および手引きに基づいて、それぞれの細胞系について最適な有効照射量を容易に決定できる。細胞は、初代細胞または数回の継代の後に増殖(propagation)可能な細胞であってよい。細胞系の培養は、Tフラスコ系もしくはローラーボトル系、または撹拌タンクもしくはその他のバイオリアクターフォーマットのような標準的な細胞培養技術を用いて行うことができる。本発明のいくつかの実施形態において、培養は、無血清条件に適応されているか、無血清条件に保たれる。
本出願において、用語「UV光」は、10〜400nm、特に100〜400nmの波長を有する紫外線を意味する。UV光は、UVC(100〜280nm)、UVB(280〜320nm)およびUVA(320〜400nm)からなる群より選択してよい。本発明のいくつかの実施形態において、波長は、200〜300nmの間である。DNA中にインターカレートし、UV光により活性化される光感作剤などの光感作剤を用いて、UV照射の改変効果を増進してよいが、これらは本発明の全ての実施形態において必要なわけではない。本発明のある実施形態において、UV光は約100〜約280nmの波長を有するUVCである。本発明の別の実施形態において、UV光は約240〜約290nmの波長を有する。本発明の別の実施形態において、UV光の約85%以上は、約254nmの波長を有する。
いずれの理論にも結び付けられることなく、UV光は、細胞の遺伝子材料を改変し、変異を導入すると考えられている。このような改変は、細胞の修復機構により、通常、修復できるが、いくらかの改変が残る場合がある。これらの改変は、致死的な変異と、細胞の不死化をもたらす改変とを導入できる。UV照射実験から、不死化され、かつ培養され得る大部分の細胞をもたらすように最適な照射量を選択できる。継代の後に、不死化をもたらす少なくとも1つの改変を含むいくつかの小さい改変のみを有すると予測される増殖できる生細胞のみが選択されると考えられる。照射細胞の大部分は不死化されないが、アポトーシス細胞または壊死性細胞に導く異なる改変を獲得する。しかし、原則的に、不死化を誘導する改変を有する1つの細胞のみが、連続細胞培養物を得るために十分である。なぜなら、この細胞が、本明細書に記載される複数ラウンドの継代の間に増殖および生存を続けるからである。
UV光放射は、UV光放射の連続的な形態、例えば水銀ランプ技術、またはパルスUV光、例えば単色性レーザ技術であってよい。所望のUV強度は、2つ以上のランプを組み合わせることにより生じさせてよい。少なくとも2つの照射手順を、それらの間に休止をもたせて組み合わせてよい。本発明の主題は、任意の有効照射量のUV光、すなわち、連続的に増殖(proliferate)するように細胞を改変させる任意の照射量のUV光を含む。有効照射量は、当該分野において通常公知の種々の因子、例えばランプおよびチャンバのサイズならびに直径、細胞含有培地とUV光源との間の距離、チャンバの材料の光吸収および反射の特性のようなUV照射チャンバの物理的なパラメータに依存し得る。本発明の特定の実施形態において、細胞は、単層、すなわち表面上の1つの細胞層において照射される。その上、UV光の波長および強度ならびに細胞がUV光に曝露される接触時間も、有効照射量にとって重要である。さらに、有効照射量は、細胞自体、ウイルスを含有する培地およびそれらの光吸収特性によっても影響される。本発明の種々の実施形態において、有効照射量は、試料に含まれる細胞の少なくとも20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%または100%を改変するのに十分であり、別の実施形態において、有効照射量は、細胞の少なくとも10%が連続的に成長するように改変するレベルにまで細胞を改変するのに十分である。細胞の10%〜90%が照射により死滅され得る。本発明のあるいくつかの実施形態において、細胞を含有する試料は、少なくとも約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65または70mJ/cmの有効照射量に曝露される。いくつかの実施形態において、有効照射量は、約500、450、400、350、300、250、200、180、150、130または105mJ/cmまでである。本発明の特定の実施形態において、UV照射量は、約70〜105mJ/cmの間である。いくつかの実施形態において、UVC光によりこれらの照射量が使用される。用語「約」は、(レーザでのように)単一波長にて不連続のUV光を提供しないが、近傍波長の光も放射するガウス型スペクトルを有する通常のUVランプの特性のことをいう。これらのランプのいくつかを用いる実施形態において、「約」は、10%の波長の値の偏差のことをいう。
照射もしくは継代の前または後に、細胞系は、滅菌性、マイコプラズマ汚染がないこと、外来ウイルス汚染がないこと、および/または逆転写酵素活性の存在についてのF−Pert試験に合格することのような品質管理基準、ならびに医療用バイオテクノロジーにおける使用のための細胞系を選択するための当該技術分野において用いられるその他の品質管理基準を満たすことについてさらに選択できる。この意味において、「・・・がないこと」とは、現在の品質試験手順の検出限界未満に汚染が低減されると理解される。本発明の技術は、ウイルスベクターを使用せずにまたはレトロウイルスを導入せずに連続細胞系を作製できるので、本発明の細胞系は、逆転写酵素活性についてのアッセイにより調べることができるように、頻繁に、いずれのレトロウイルス活性も有さない。しかし、このようなレトロウイルス活性は、例えば、細胞系におけるウイルスまたはタンパク質の生成を目的とする分子工学技術により本発明の細胞系に特異的に導入してよい。
細胞系は、任意の真核生物のもの、特に魚類、鳥類、爬虫類、両生類または哺乳類の細胞に加えて、昆虫または植物の細胞のような高等生物のものであり得る。いくつかの実施形態では、ハムスター、マウス、ラット、イヌ、ウマ、ウシ、霊長類またはヒトのような哺乳類細胞を用いる。その他の実施形態では、ニワトリ、アヒル、カナリヤ、オウム、ウズラ、ダチョウ、エミュー、シチメンチョウまたはガチョウのような鳥類細胞を用いる。一般的に、任意の鳥の種が、本発明において用いるため鳥類細胞の起源となり得る。いくつかの実施形態において、あまり頻繁に家畜化されていない(ウズラまたはエミューのような)種を用いて、より一般に家畜化されている(ニワトリのような)種において流行しているウイルスとの保存組織(stock tissue)の汚染の可能性を避けることが有利である。
照射細胞は、任意の型の組織のものであり得る。いくつかの実施形態において、組織は胚に由来する。多くの実施形態において、崩壊組織または複数の組織により得ることができるような1つを超える型の組織の混合培養物が用いられる。さらなる実施形態において、細胞は胚の臍帯のものである。照射細胞または組織(複数可)は、例えば内皮細胞、上皮細胞、多分化能性もしくは全能性の幹細胞、胚性幹細胞、神経細胞、腎臓細胞、肝臓細胞、筋肉細胞、結腸細胞、白血球、肺細胞、卵巣細胞、皮膚細胞、脾臓細胞、胃細胞、甲状腺細胞、血管細胞、膵臓細胞ならびに/またはそれらの前駆細胞ならびにそれらの組み合わせのものであり得るか、あるいは照射細胞または組織(複数可)は、例えば内皮細胞、上皮細胞、多分化能性もしくは全能性の幹細胞、胚性幹細胞、神経細胞、腎臓細胞、肝臓細胞、筋肉細胞、結腸細胞、白血球、肺細胞、卵巣細胞、皮膚細胞、脾臓細胞、胃細胞、甲状腺細胞、血管細胞、膵臓細胞ならびに/またはそれらの前駆細胞ならびにそれらの組み合わせを含み得る。
多くの実施形態において、細胞は、照射中または培養中に表面に接着する。表面上での培養は内皮細胞にとって特に適切であり、そのことにより細胞を、UV照射量により大きすぎる損傷変化が導入されると妨げられ得る単層の形成能力のようなさらなる品質基準を満たすことについてさらに選択できる。このような表面上で、細胞は単層を形成し得る。特に、細胞は、微小担体上で培養または照射される。代わりに、細胞は、懸濁物中で照射もしくは培養のいずれかまたはその両方を行ってよい。表面上で最初に照射または培養される細胞は、後になって、懸濁培養において成長するように適応させてよい。
別の態様において、本発明は、本発明の方法により得ることができる連続細胞系の細胞を提供することと、前記細胞に前記ウイルスを感染させることと、前記ウイルスを前記細胞内で増殖させることと、前記ウイルスを回収することとを含む、ウイルスを生成する方法を提供する。
本発明において、生成されるウイルスは、1本鎖もしくは2本鎖(DNA)で、センスもしくはアンチセンスで、連続型もしくは分節型のゲノムを有する包膜もしくは非包膜DNAまたはRNAウイルスから選択される。ウイルスは、バキュロウイルス、ポックスウイルス、アデノウイルス、パポバウイルス、パルボウイルス、ヘパドナウイルス、コロナウイルス、フラビウイルス、トガウイルス、アストロウイルス、ピコルナウイルス、レトロウイルス、オルソミクソウイルス、フィロウイルス、パラミクソウイルス、ラブドウイルス、アレナウイルスおよびブニヤウイルスからなる群より選択してよい。本発明のいくつかの実施形態において、ウイルスは、フラビウイルス、トガウイルス、レトロウイルス、コロナウイルス、フィロウイルス、ラブドウイルス、ブニヤウイルス、オルソミクソウイルス、パラミクソウイルス、アレナウイルス、ヘパドナウイルス、ヘルペスウイルスおよびポックスウイルスを含む包膜ウイルスの群より選択される。その他の実施形態において、ウイルスは、インフルエンザA、BもしくはCを含むインフルエンザ、ウエストナイルウイルス、ワクシニアウイルス、改変ワクシニアウイルスまたはロスリバーウイルスのような包膜ウイルスである。本発明のその他の実施形態において、ウイルスは、フラビウイルス、トガウイルス、レトロウイルス、コロナウイルス、フィロウイルス、ラブドウイルス、ブニヤウイルス、オルソミクソウイルス、パラミクソウイルスおよびアレナウイルスを含む包膜RNAウイルスの群から選択される。特定の実施形態において、ウイルスは、MVA(改変ワクシニアウイルスアンカラ)、TBE(ダニ媒介脳炎)ウイルス、黄熱病ウイルス、ウエストナイルウイルス、ニューカレドニアウイルスまたはインフルエンザウイルスである。
回収ステップの後に、ウイルスを、例えば本明細書に参照により組み込まれる米国特許公開番号2006/0270017A1に開示されるようなウイルス不活化のための任意の公知の手段により不活化させることができる。特に、不活化は、単独または組み合わせでのホルムアルデヒド処理および/もしくはUV照射により行うことができる。
一般に、血清、または例えばアルブミン、トランスフェリンもしくはインスリンのような血清由来物質は、細胞培養物およびそれから得られる生物学的産物に混入し得る望ましくない物質(agent)を含む場合がある。さらに、ヒト血清由来添加物は、血清により伝播できる肝炎ウイルスおよびHIVを含む全ての公知のウイルスについて調べられなければならない。よって、本発明の方法のいくつかの実施形態によると、細胞系の細胞は、無血清培地における成長に適応されており、例えば、これらは、無血清培地で成長する能力について選択される。培地は、血清もしくは血清画分、または一般的な血液構成成分も含まない場合がある。本発明のこれらの実施形態のための培地は、DMEM/HAM’s F12、RPMI、MEM、BME、ウェイマウス培地、特に本明細書にその全体が参照により組み込まれるUS2007/0212770に記載されるようなオリゴペプチド非含有もしくはタンパク質非含有の培地またはそれらの組み合わせから選択される。上記のオリゴペプチド非含有培地は、血液タンパク質または15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5もしくは4アミノ酸を超えるサイズのオリゴペプチドを含まなくてもよいが、グルタチオンを含んでよい。タンパク質非含有培地は、タンパク質を実質的に含まないが、細胞系により生成されるタンパク質またはプロテアーゼを含んでよい。特に、培地は、成長促進剤としてのポリアミドを含み、かつ/またはUS2007/0212770に記載されるような既知組成培地(chemically defined medium)であってよい。用語「既知組成(chemically defined)」は、培地が、例えば動物成分、器官、腺、植物または酵母の抽出物のようないずれの規定されない補足成分も含まないことを意味する。よって、既知組成培地のそれぞれの成分は、厳密に規定される。既知組成培地は、タンパク質または細胞加水分解産物を実質的に含まないが、細胞系により生成されるタンパク質またはプロテアーゼを含んでよい。このような培地の例は、www.invitrogen.com/content/sfs/brochures/332−032442_SFMBrochure.pdfにてWWWが利用可能な「A guide to Serum−Free Cell Culture」、GIBCO cell culture(2003年)に示される。
無血清培地、オリゴペプチド非含有培地または既知組成培地を含むこれらの培地は、グルタチオンおよび/またはプロテアーゼ、特にブタもしくは組換えのトリプシンのようなトリプシンを、ウイルス接種の前または後に含んでもよい(Klenkら(1975年)Virology、68巻:426〜439頁)。このようなプロテアーゼは、細胞系の培養中にも必要とされる場合もある。なぜなら、表面に接着する細胞は強い接着から非常に弱い接着までを示すからである。強く接着する細胞は、プロテアーゼおよび/またはEDTAのようなキレート化剤により剥離できる(Doyleら、Cell & Tissue Culture: Laboratory Procedures、ECACC、John Wiley & Sons、Chichester(1996年)中の第4章:Core Techniques)。さらに、培地、特にタンパク質非含有培地は、接種の前または後に、植物または酵母の加水分解産物を含んでよい。もちろん、培地は、本発明の細胞系により生成されるタンパク質または代謝産物を含むことも予測される。
本発明の方法により得ることができる細胞系は、通常、非腫瘍原性および/または非癌原性である。いくつかの実施形態において、細胞系の細胞は、F−pert試験のような品質試験に合格することについて調べられ、選択される。
さらなる態様において、本発明は、組換え遺伝子産物を生成する方法であって、本発明の方法により得ることができる連続細胞系の細胞を提供することと、前記細胞に前記遺伝子産物をコードする核酸を形質移入することと、前記遺伝子産物を発現させることと、前記遺伝子産物を所望により回収することとを含む方法を提供する。核酸は、DNA、RNAまたはPNAであってよい。遺伝子に加えて、核酸は、細胞における発現のためのプロモーター、および選択マーカーを含んでよい。
さらなる態様において、本発明は、動物またはヒトの生細胞を提供し、前記細胞に有効量のUV光を照射し、前記細胞を増殖させ、少なくとも20回の継代の後に増殖できる細胞を、連続細胞系の細胞として選択する方法により得ることができる連続細胞系を提供する。本発明の細胞系は、このように生成される細胞系の子孫も含む。特に、細胞系は、本明細書に記載される方法の実施形態により得ることができると規定される。得ることができる連続細胞系は、連続細胞系を生成するために必要なUV照射に関連する特定の核型(caryotype)のテロメア活性のような特有の特徴を有してよい。本発明の特定の実施形態において、細胞系の細胞は、非腫瘍原性および/または非癌原性であり、特に、F−pert試験のような品質試験にも合格する。
特定の実施形態において、細胞系は、ECACCに、それぞれQOR/RE07−169、QOR1CJ07およびCORECB/SF08−06のファイル参照番号に対応する寄託受託番号08020602、08020603または08020604で寄託された細胞系である。さらに、本発明の細胞系は、上記の寄託された細胞系と同様の増殖する能力、細胞周期パターン、テロメラーゼ活性、核型、染色体パターンまたはテロメア長、およびもちろん連続細胞系であることのような特有の特徴を有する。
本発明を、これらを限定しない以下の実施例によりさらに説明する。
(実施例1)変異体を生成するためのUV光でのベロ細胞の時間的に異なる輻射
材料:
TC−ベロ培地
N1バッファー
トリプシン(1:10希釈)
トリプシン阻害剤
6ウェルプレート、Corning Cat.No.3516
25cmTフラスコ、Nunc Cat.No.:163371
UVランプ、VL50C、240nmグリッド−チューブ、50W、Vilber−Lourmet社
手順:
6ウェルプレート中、1×10細胞/ウェルおよび5mlの培地容量(二重の設定において)で設定する。合計で7枚のプレート(各回2ウェル/プレート)を設定する。
24時間後に、良好な単層培養物が得られた。
5mlの培地を1mlまで排出し、開放したプレートにUV光を照射した(UVランプからプレートまでの距離=9cm)。
プレートA:15分
プレートB:30分
プレートC:45分
プレートD:60分
プレートE:90分
プレートF:120分
プレートG:対照、照射なし
照射の後に、両方のウェルの細胞をトリプシン処理し(1mlトリプシン+0.5mlトリプシン阻害剤/ウェル)、ここで、第1ウェルの細胞を、細胞数(CC)および生存率の決定のために用い、第2ウェルの細胞を、10mlの培地を含む25cmのルー(roux)中で継代する。
Figure 0005653223
Tフラスコ25の内容物をトリプシン処理し、Cedexを用いてTCCおよび生存率を決定する。
Figure 0005653223
(実施例2)鳥類細胞のUV照射
本研究の目的は、ワクチン生成のために適切な連続細胞系の作製のためのツールとしてのUV光処理の使用の可能性を探索することであった。
初代ニワトリおよびウズラの胚を、最初の初代単層培養物の生成のための出発材料として用いた。それらに由来する品質管理された細胞培養物を、UV光曝露に基づく誘導手順のために用いた。
初代細胞のUV光(254nm)への曝露。連続細胞系を、UV照射により、コリンウズラまたはニワトリの胚の初代細胞から発展させた。
ウズラ胚の初代細胞に由来する細胞系の発展の、安全バンクの製造までの詳細な経過は、系統樹の形態で図3に示す。
UV照射のための出発材料として、それぞれの場合に、ニワトリ胚、ニホンウズラ胚およびコリンウズラ胚の細胞調製物(崩壊完全胚の混合培養物)を起源とする最初の評価細胞バンク(ニワトリ、ニホンウズラおよびコリンウズラ)の1アンプルを解凍した。
UV照射のための設定は、6ウェルプレート中で、1×10細胞/ウェルの播種細胞および5mlの培地容量で行った。5%のFBSおよび抗生物質(ペニシリン、ストレプトマイシンおよびゲンタマイシン)を含むTBE培地(FSME)を、培地として用いた。それぞれ2ウェル/プレートでの合計7枚のプレートを設定した。24時間後に、均質な単層培養物がウェル中で観察できた。細胞の照射のために、5mlの培地を1mlまで排出し、開放されたプレートに、層流ベンチ中でUV光を以下のようにして照射した。UVランプからプレートまでの距離は9cmであった。Vilber−Lourmet社のUVランプ(VL50C、240nmグリッド−チューブ、50W)をUV光源として用いた。
プレートA:0.5分
プレートB:1分
プレートC:2分
プレートD:3分
プレートE:4分
プレートF:5分
プレートG:対照、照射なし
照射の後に、細胞をウェル中でトリプシン処理し(N1バッファーで1:10希釈した1mlトリプシン)、ここで、細胞懸濁物の1ml(合計6ml)をCCおよび生存率の決定のために用い、残りの細胞を、25cmのルー中の5mlの培地を用いて継代した。結果を、本実施例の表にまとめる。
最初の培養期間中に(約25〜35日間)、培地交換のみを行い、細胞の形態および接着を、個別の試験において光学的に評価した。T−25フラスコ内で接着して成長する細胞の島の形成が観察された後にのみ、試験A〜Eの細胞をトリプシン処理し、均質な接着細胞のコロニー形成を促進するために、6ウェルプレート(T−25フラスコよりも小さい表面)に移した。およそK40〜K50のこの時点から、80〜100%の集密に到達した細胞を、T−25およびT−75のフラスコ中で6〜9日ごとにさらに継代し、1〜2本の安全アンプルを設定し、これらは評価細胞バンク(約10アンプル)を生成するための出発材料として用いた。上記の細胞集団のトリプシン処理および継代は、実施例3に記載する。
用いた調製物
培地:−TBE培地(FSME)+5%FBS+抗生物質混合物(ペニシリン/ストレプトマイシン100mg/lおよび50mg/lゲンタマイシン)
−TBE培地(FSME)+10%FBS
−TCベロ培地+10%FBS
−N1バッファー
−ガンマトリプシン
−DMSO Sigma社
略語:CC...細胞数、T−25/75/175...25/75/175cmのTフラスコ
Figure 0005653223
個別の試験設定A〜Gの細胞数の値および生存率がよく似ていたので、細胞のUV照射時間に関して著しい差を示すことができなかった。これが、比較した培養物の形態および接着をほぼ毎日評価して、特殊性を認識した理由である。
試験設定A〜Fの全てのうち、設定Eからの細胞集団が、均質な細胞構造、異なるTフラスコでの培養、数回の継代の後の変わらない細胞成長、凍結保存ができること、およびウイルス増殖(propagation)(例えばMVAウイルス)に適することのような、接着して成長する連続細胞系の最良の特性を示した。
ウズラ細胞の場合、設定Fからの細胞集団は、うまく培養できなかった。不均質な細胞ローン(cell−lawn)の形成(大きな全体)とともに細胞成長の低減が、UV光を照射しなかった細胞(試験G)を用いて6回を超える継代の後に観察できた。16回以降の継代から、細胞はその分裂能力を喪失し、もはや培養できなかった。全体として、ウズラおよびニワトリの細胞試験を用いて、同様の結果を得ることができた。
(実施例3)細胞のトリプシン処理および継代
接着して成長するウズラ細胞のトリプシン処理および継代を、ベロ細胞について通常用いられるものと同様の継代スキームで行った。培養培地を捨てた後に、洗浄ステップを、N1バッファーを用いて行い、その後、培養物を、1:10に希釈した対応する量のガンマトリプシンの層(複数可)で覆い、37℃の温度(6ウェルプレートおよびT−25(T−25...25cmTフラスコ)を用いては室温で十分である)にて、培養容器から細胞が剥離する(穏やかにたたくことにより)までインキュベートする。トリプシン阻害剤を加えてトリプシンの効果を停止することは、培養培地にFBSが含まれているので必要でない。その後、細胞を新しい培養培地に移し、それぞれの分割に対応する培養容器にさらに分配し、再び放置して成長させる。
以下の表は、トリプシン処理中に用いた量を示す。
Figure 0005653223
(実施例4)UVランプVL50Cを用いる細胞不死化のためのUV−C照射量測定(dosimetry)
UV照射を用いて連続細胞系を得るための照射量を測定した。照射量測定の設定は、細胞処理についての設定と同様であった。UV−C光での輻射は、バッファー溶液中に溶解したヨウ化カリウムおよびヨウ素酸カリウムの、茶色〜黄色の3ヨウ化物への変換を引き起こす。3ヨウ化物は、その最大吸収が352nmにあり、分光光度計において定量的に測定できる。この原理により、曝露時間に依存する細胞単層曝露中に加えられたUV照射量を測定することが可能になる。よって、6ウェルプレート中での測定に基づいて、0.5〜5分間の曝露時間は、20〜120mJ/cmのUV照射量に相当する(図4)。
照射量測定は、細胞系試験と同様に、できる限り正確に行う。それぞれの場合において、約2.5/cm、4.5/cmおよび7.5/cmの吸収係数(367mn)を有するモデル溶液1mlに対して、6ウェルプレートの1つのウェル中で照射を行う。それぞれのモデル溶液は6回照射される。照射時間=30秒、1分、2分、3分、4分および5分。それぞれの照射時間についての厳密な照射量を見出すために、用いた培地のOD(253.7nm)を決定する。
用いた材料:
−ポータブルUVランプ、VL50C、254nm、50W、Vilber−Lourmat社
−分光光度計、Therma社、デバイスNo.:PA5007−012MM
−6ウェルプレート
−ホウ酸99.9%、Riedel−de Haen社、ロットNo.:60460
−NaOHペレット、Baxter社、ロットNo.:318608
−PVP K17 PF(ポリビニルピロリドンCollidon K17)、Basf社、ロットNo.:30408609T0
−ヨウ化カリウム、Sigma Aldrich社、ロットNo.:P2963−500G
−ヨウ素酸カリウム、Merck社、ロットNo.:K32577451622
−TC VERO培地(VT)、管理:ORSFVTC0700401
−WFI水、Baxter社、PP2
3つのモデル溶液を、十分な量で調製する。
Figure 0005653223
モデル溶液は、暗所で用時まで貯蔵できるが、少なくとも47日目までである。
モデル溶液1、2および3のそれぞれの60mlを用いて、検量線を作製する。入射光から保護して、これらの試料を、検量線を確立するIBCに送る。モデル溶液1、2および3のそれぞれから100mlをSchottフラスコに移し、入射光から保護する。ポータブルUVランプVL50Cを枠(framework)に配置する。テーブルプレートとポータブルUVランプの底側との間の距離は9cmである。ポータブルUVランプを、フィルタがテーブルプレートを指すように(すなわち下向き)調節する。
ポータブルUVランプを、使用の30分前に点ランプする。
100mlのモデル溶液1、2および3を含む3つのSchottフラスコ、ピペット、ピペットボーイ、空のSchottフラスコならびに3枚の6ウェルプレートを準備する。1mlのモデル溶液1を、6ウェルプレートの左上のウェルにピペットを用いて入れる。このウェルを、ポータブルUVランプの下に、覆いをせずに、フィルタの下の中央に配置されるように配置する。30秒間の照射の後に、ウェルを、ポータブルUVランプの下のその位置から迅速に移動させる。照射した1ml溶液のうちの370μlを、薄層シリカキュベットに移し、OD367nmを5分以内に決定する。同じ測定を3回行い、記録する。これらの3つの値の平均値を決定する。測定値が光度計の較正範囲を超える場合は、それに応じて、異なる厚さの層を有するキュベットを用いる。ウェル中の上清を吸い上げて廃棄する。
これらのステップを、全ての照射時間について反復する。得られた曲線関数およびVT培地のOD(253.7nm)に基づいて、それぞれのUV照射量[mJ/cm]を、30秒から5分まで算出する。結果を、以下の表に示す。
Figure 0005653223
この表からわかるように、照射量の曲線関数は、y=24.09x+4.3125である。xは分での照射時間であり、yはmJ/cmでの照射量である(図4)。
(実施例5)連続細胞におけるウイルス生成
MVA、r−MVA、TBEおよびインフルエンザを、連続ウズラ細胞において増殖させた。ウズラ細胞のローラーボトル培養物を、上記のようにして確立した。培養物に、(GMP)MVA、TroVax、TBEおよびインフルエンザウイルスを感染させた。MOIは、現在のMVA生成プロセスに従って選択した。ウイルス産物を、3〜4日後に採集した。AS培養培地TC−ベロ10%FBSを、32℃のインキュベーションでのインキュベーションの間に用いた。
感染:1時間後に10mlを用いて最終容量(60ml)にて行った。
TBE:50μlウイルス
MVA:250μlウイルス
ニューカレドニア(NC):50μl
略語:KXX...培養第XX日目
試料の採取:3×1ml試料、NOVA、NCを含むNaBr−、HA、顕微鏡写真
Figure 0005653223
ローラーボトル実験で成長させたMVAおよびr−MVAについて達成されたウイルス力価:
Figure 0005653223
ローラーボトル実験で成長させたTBEおよびインフルエンザについて達成されたウイルス力価:
Figure 0005653223
(実施例6)異なる細胞培養物のF−Pertアッセイ
F−Pertアッセイは、PCRにより逆転写酵素活性を検出することを可能にし、安全性検証のために必要である。異なる培養物(ベロ細胞(陰性対照)、初代ニワトリ細胞(陽性対照)、連続ウズラ細胞および連続ニワトリ細胞)を、同じ手順に従って調製した。培養上清を採集し、F−Pert品質管理試験のために処理した。
F−Pert試験の結果
Figure 0005653223

Claims (20)

  1. 鳥類の生細胞に有効量のUV光を照射する工程と、少なくとも20回の継代の後に増殖(proliferate)できる細胞を、連続細胞系の細胞として選択する工程とを含む連続細胞系の生成方法。
  2. 前記UV光の波長が200nm〜300nmの間である、請求項1に記載の方法。
  3. 前記UV光の照射量が少なくとも50mJ/cmである、請求項1に記載の方法。
  4. 前記UV光の照射量が300mJ/cmまでである、請求項1に記載の方法。
  5. 前記選択する工程が、少なくとも40回の継代の後に前記細胞を選択することを含む、請求項1に記載の方法。
  6. 前記細胞が、表面に接着しているか、または懸濁されている、請求項1に記載の方法。
  7. 前記細胞が胚の細胞である、請求項1に記載の方法。
  8. 前記細胞が、1を超える型の組織の混合培養物である、請求項1に記載の方法。
  9. 前記細胞が内皮細胞である、請求項1に記載の方法。
  10. 前記細胞が単層にある、請求項1に記載の方法。
  11. ウイルス増殖(proliferation)を許容する条件下で、前記選択された細胞にウイルスを感染させる工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
  12. 前記ウイルスが、バキュロウイルス、ポックスウイルス、アデノウイルス、パポバウイルス、パルボウイルス、ヘパドナウイルス、コロナウイルス、フラビウイルス、トガウイルス、アストロウイルス、ピコルナウイルス、レトロウイルス、オルソミクソウイルス、フィロウイルス、パラミクソウイルス、ラブドウイルス、アレナウイルスおよびブニヤウイルスから選択される、請求項1に記載の方法。
  13. 前記ウイルスが、MVA、TBEウイルス、黄熱病ウイルス、ウエストナイルウイルス、ニューカレドニアウイルスまたはインフルエンザウイルスから選択される、請求項1に記載の方法。
  14. 前記選択された細胞に、組換え遺伝子産物をコードする核酸を、前記組換え遺伝子産物の生成を許容する条件下で形質移入する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
  15. 前記細胞系の細胞が、無血清培地中での成長に適応されている、請求項1に記載の方法。
  16. 前記培地が、DMEM/HAM's F12、RPMI、MEM、BME、ウェイマウ
    ス培地、オリゴペプチド非含有培地、既知組成培地またはそれらの組み合わせから選択される、請求項1に記載の方法。
  17. 前記細胞系の細胞が、非腫瘍原性および/または非癌原性であることについて選択される、請求項1に記載の方法。
  18. ECACCに寄託受託番号08020602、08020603または08020604で寄託された細胞系。
  19. 前記ウイルスを回収する工程をさらに含む、請求項11に記載の方法。
  20. 前記遺伝子産物を回収する工程をさらに含む、請求項14に記載の方法。
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