ES2628074T3 - Procedimiento de producción de líneas celulares continuas - Google Patents

Abstract

Un procedimiento de producción de una línea celular de ave continua que comprende irradiar células de ave vivas con una dosis eficaz de luz UV, y seleccionar células capaces de proliferar tras al menos 20 pases como células de una línea celular de ave continua sin la introducción de genes víricos exógenos.

Description

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DESCRIPCION

Procedimiento de produccion de lmeas celulares continuas Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a procedimientos para producir lmeas celulares. Antecedentes de la invencion

Las lmeas celulares se han convertido en una valiosa herramienta para la fabricacion de vacunas. La produccion de algunas vacunas importantes y vectores vmcos aun se realiza en huevos de gallina embrionados o en fibroblastos de embrion de gallina primarios. El tejido de ave primario para la multiplicacion de virus se proporciona mediante plantas de produccion SPF (libres de patogenos espedficos). Los tejidos SPF derivados son costosos y la calidad del material de suministro es a menudo diffcil de controlar. Por lo tanto, la inconsistencia y la escasez de suministro son las desventajas mas predominantes de las tecnologfas basadas en huevos SPF. Esto mismo se aplica a planteamientos en los que se usan cultivos de monocapa de fibroblastos primarios. Para multiplicar las lmeas celulares de manera indefinida, se necesita inmortalizar las celulas. La mayona de lmeas celulares inmortalizadas actualmente en uso son descendientes de celulas cancerosas o de celulas de hibridomas fusionadas. Sin embargo, la ultima tecnologfa se limita a fusionar con celulas de mieloma. No existe tecnologfa general que pueda generar celulas inmortalizadas de distintos tipos.

Rhim J. S., Annals of the New York Academy of Sciences 2000, Vol. 919, paginas 16-25, describe que pueden inmortalizarse distintos tipos de celulas en diferentes condiciones de inmortalizacion.

Sumario de la invencion

Es un objeto de la presente invencion producir una celula continua a partir de material celular discontinuo. En particular, el fin era proporcionar lmeas celulares continuas que tengan el potencial para proliferar sin la introduccion de genes vmicos exogenos.

Por lo tanto, la presente invencion proporciona un procedimiento para la produccion de lmeas celulares de ave continuas que comprende proporcionar celulas vivas de un animal o un ser humano, irradiar dichas celulas con luz UV, proliferar dichas celulas y seleccionar celulas capaces de proliferar tras al menos 20 pases como celulas de una lmea celular continua sin la introduccion de genes vmicos exogenos.

Tal lmea celular continua es cultivo celular que puede propagarse y usarse para la expresion recombinante de biomoleculas tales como protemas, o para la fabricacion de productos vmcos tales como antfgenos vmcos o una poblacion de virus completa, en particular, para fines de vacunacion.

Por lo tanto, la presente invencion tambien proporciona un procedimiento para producir virus que comprende producir una lmea celular de ave continua de acuerdo con el procedimiento inventivo, infectar dichas celulas con dicho virus, propagar dicho virus en dichas celulas y recoger dicho virus.

En otro aspecto de la invencion se proporciona un procedimiento para producir un producto de gen recombinante que comprende producir una lmea de ave continua mediante el procedimiento inventivo, transfectar las celulas con un acido nucleico que codifica dicho producto genico, expresar dicho producto genico y, opcionalmente, recoger dicho producto genico.

Tambien se desvela una lmea celular continua que puede obtenerse mediante el procedimiento de proporcionar celulas vivas de un animal o un ser humano, irradiar dichas celulas con una dosis eficaz de luz UV, hacer proliferar dichas celulas y seleccionar celulas capaces de proliferar tras al menos 20 pases como celulas de dicha lmea celular continua.

Breve descripcion de los dibujos

La Fig. 1 muestra el esquema del procedimiento de tratamiento UV.

La Fig. 2 muestra cultivos celulares de codorniz continuos.

La Fig. 3 muestra el arbol filogenetico y la via de tratamiento para producir una lmea celular de codorniz continua. La Fig. 4 muestra una correlacion de la dosis de UV al tiempo de irradiacion con la preparacion usada para producir celulas continuas.

Descripcion detallada de la invencion

La presente invencion proporciona un procedimiento para la produccion de una lmea celular de ave continua a traves del tratamiento UV de celulas.

Una lmea celular es una poblacion de celulas formada mediante uno o mas subcultivos de un cultivo celular primario. Cada ronda de subcultivo se denomina como un pase. Cuando las celulas se subcultivan, se denomina que se han

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sometido a pases. Una poblacion de celulas espedfica, o una lmea celular, puede caracterizarse por el numero de veces que se ha sometido a pases. El cultivo primario es el primer cultivo tras el aislamiento de celulas del tejido. Tras el primer subcultivo, las celulas se describen como un cultivo secundario (pase uno). Despues del segundo subcultivo, las celulas se convierten en un cultivo terciario (pase 2), etc. Los expertos en la materia entenderan que puede haber muchos duplicados de poblaciones durante el periodo de pases; por lo tanto, el numero de duplicados de poblaciones de un cultivo es mayor que el numero de pases. La expansion de celulas (es decir, el numero de duplicados de poblaciones) durante el periodo entre pases depende de muchos factores, que incluyen, pero no se limitan a, la densidad de siembra, sustrato, medio, condiciones de crecimiento y tiempo entre pases. El cultivo puede realizarse mediante la inoculacion de un medio celular, dejando que las celulas crezcan hasta que se forme un cultivo celular confluente o una pelmula continua por las celulas e inoculando un nuevo medio celular con una parte de las celulas confluentes. No obstante, el sometimiento a pases es una herramienta para evaluar la capacidad de propagacion. Normalmente, las celulas, entre las que se incluyen celulas sin irradiar, aisladas de un tejido que puede someterse a pases aproximadamente 10-20 veces hasta que alcanzan un estado en el que no se produce ninguna propagacion o duplicado celular adicional. Las celulas entran a continuacion en un estado de senescencia a partir del cual no pueden obtenerse subcultivos adicionales. Al contrario del mismo, las lmeas celulares continuas son capaces de propagarse despues de mas de 20 pases, tal como despues de 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 55, 60, 65, 70, 75 u 80 pases. Los inventores han descubierto ahora que tal lmea celular continua que puede someterse a pases multiples veces despues del 20° pase, en celulas inmortalizadas en particular, puede obtenerse a traves de la alteracion de celulas mediante tratamiento UV, es decir, irradiando dichas celulas con una dosis eficaz de luz UV. Los terminos "dosis eficaz de luz UV" de acuerdo con la presente invencion debe ser la cantidad de irradiacion necesaria para transformar las lmeas celulares discontinuas en lmeas celulares continuas. La dosis eficaz de luz UV va desde la dosis minima necesaria para tales transformaciones hasta la dosis maxima que estas celulas toleran sin consecuencias letales para el cultivo celular en su conjunto. Esta claro que por encima o por debajo de los lfmites de dosis eficaz no pueden obtenerse lmeas celulares continuas. El experto en la materia puede determinar facilmente las dosis eficaces optimas para cada lmea celular basandose en la informacion y orientacion contenida en el presente documento con optimizacion rutinaria. Las celulas pueden ser celulas primarias o celulas capaces de propagarse tras unos pocos pases. El cultivo de lmeas celulares puede realizarse con tecnicas de cultivo celular convencionales, tales como en sistemas de matraz T o sistemas de frasco rotatorio, o en un tanque con agitacion u otros formatos de biorreactores. En varias realizaciones de la invencion, el cultivo se adapta a y mantiene en condiciones libres de suero.

En la presente solicitud la expresion "luz UV" significa radiacion ultravioleta que tiene una longitud de onda de desde 10 a 400 nm, en particular 100 a 400 nm. La luz UV puede seleccionarse del grupo que consiste en UV C (100 a 280 nm), UV B (280 a 320 nm) y UV A (320 a 400 nm). En algunas realizaciones de la invencion, la longitud de onda es de entre 200 y 300 nm. Pueden usarse agentes fotosensibilizantes tales como aquellos que se intercalan en el ADN y que se activan mediante luz UV para aumentar el efecto de alteracion de la radiacion UV, aunque no son necesarios en todas las realizaciones de la invencion. En una realizacion de la presente invencion la luz Uv es UV C y tiene una longitud de onda de desde aproximadamente 100 a aproximadamente 280 nm. En otra realizacion de la presente invencion la luz UV tiene una longitud de onda de desde aproximadamente 240 a aproximadamente 290 nm. En otra realizacion de la presente invencion aproximadamente el 85 % o mas de la luz UV tiene una longitud de onda de aproximadamente 254 nm.

Sin estar sujeto a ninguna teona se cree que la luz UV altera el material genetico de una celula, lo que introduce mutaciones. Aunque tales alteraciones pueden repararse generalmente mediante los mecanismos de reparacion de celulas, algunas alteraciones pueden permanecer. Estas alteraciones pueden introducir mutaciones letales y tambien alteraciones que dan como resultado la inmortalizacion celular. A partir de experimentos de irradiacion Uv puede seleccionarse una dosis optima lo que da como resultado que una parte significativa de celulas se inmortalice y pueda cultivarse. Tras el sometimiento a pases, se cree que unicamente se seleccionan las celulas viables que son capaces de multiplicarse, que se espera que tengan unicamente alteraciones mmimas con al menos una alteracion lo que da como resultado la inmortalizacion. Una parte significativa de las celulas irradiadas no se inmortalizaran sino que conseguiran distintas alteraciones, dando lugar a celulas apoptoticas o necroticas. Sin embargo, en principio, es suficiente unicamente una celula con la alteracion que induce la inmortalizacion para obtener un cultivo celular continuo, ya que esta celula continuara propagandose y sobrevivira a traves de las multiples rondas de pases como se describe en el presente documento.

La emision de luz UV puede ser una emision de luz UV de forma continua, por ejemplo, tecnologfa de lampara de mercurio, o luz UV pulsada, por ejemplo, tecnologfa de laser monocromatico. La intensidad de UV deseada puede generarse mediante la combinacion de dos o mas lamparas. Al menos dos procedimientos de irradiacion pueden combinarse con una pausa entre ellos. La materia objeto de la invencion abarca cualquier dosis eficaz de luz UV, es decir, cualquier dosis de luz UV que altere una celula para que prolifere continuamente. La dosis eficaz puede depender de una diversidad de factores que se conocen generalmente en el ambito, por ejemplo, los parametros ffsicos de las camaras de irradiacion UV, tales como el tamano y diametro de la lampara y la camara, la distancia entre el medio que contiene las celulas y la fuente de luz UV, las propiedades de absorcion y reflejo de la luz del material de la camara. En realizaciones particulares de la invencion, las celulas se irradian en una monocapa, una capa celular sobre una superficie. Del mismo modo, la intensidad de onda e intensidad de la luz UV asf como el tiempo de contacto que la celula esta expuesta a la luz UV son tambien cnticas para la dosis eficaz. Ademas, la

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dosis eficaz tambien se ve influenciada por la celula misma, el medio que contiene el virus y sus propiedades de absorcion de la luz. En diversas realizaciones de la invencion, la dosis eficaz es suficiente para alterar al menos un 20 % 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90 % o 100 % de las celulas contenidas en la muestra, y en otras realizaciones la dosis eficaz es suficiente para alterar las celulas a un nivel en el que al menos el 10% de las celulas se ven alteradas tambien para crecer continuamente. Del 10 % al 90 % de las celulas moriran por la irradiacion. En ciertas realizaciones de la invencion, una muestra que contiene las celulas se expone a una dosis eficaz de al menos aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 o 70 mJ/cm2 En algunas realizaciones la dosis eficaz es hasta aproximadamente 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 180, 150, 130 o 105 mJ/cm2 En realizaciones particulares de la invencion, la dosis de UV es de entre aproximadamente 70 y 105 mJ/cm2 En algunas realizaciones, estas dosis se emplean mediante luz UV C. El termino "aproximadamente" se refiere a la propiedad de lamparas UV comunes que no proporcionan una luz UV aislada a una unica longitud de onda (como en los laseres) sino que tienen un espectro en forma de gauss que tambien emite luz en longitudes de onda cercanas. En realizaciones que usan algunas de estas lamparas, "aproximadamente" se refiere a la desviacion del valor de longitud de onda del 10%.

Antes o despues de la irradiacion o el sometimiento a pases, la lmea celular puede seleccionarse adicionalmente para cumplir los criterios de control de calidad tales como esterilidad, ausencia de contaminacion por micoplasma, ausencia de contaminacion vmca accidental, y/o pasar la prueba de F-Pert para la presencia de actividad transcriptasa inversa, asf como otros criterios de control de calidad usados en la tecnica para seleccionar lmeas celulares para usos de biotecnologfa medica. En este sentido "ausencia de" debe entenderse como que las contaminaciones se ven reducidas por debajo del lfmite de deteccion de los procedimientos de pruebas de calidad actuales. Ya que la tecnologfa actual puede generar lmeas celulares continuas sin el uso de vectores vmcos o la introduccion de retrovirus, las lmeas celulares inventivas a menudo no tienen ninguna actividad retrovmca, como puede probarse mediante un ensayo para actividad transcriptasa inversa. Sin embargo, tal actividad retrovmca puede introducirse de forma espedfica en lmeas celulares de la invencion mediante tecnicas de ingeniena molecular para fines de, por ejemplo, produccion de virus o protemas en las lmeas celulares.

La lmea celular puede ser de cualquier celula eucariota, particularmente de un organismo superior, tal como en celulas de pez, de ave, de reptil, de anfibio o de mamffero e incluso celulas de insecto o de planta. Algunas realizaciones usan celulas de mamffero tales como de hamster, raton, rata, perro, caballo, vaca, primate o ser humano; otras realizaciones usan celulas de aves tales como de gallina, pato, canario, loro, codorniz, avestruz, emu, pavo o ganso. En general, cualquier especie de ave puede ser una fuente de celulas de ave para su uso en la invencion. En algunas realizaciones, es ventajoso utilizar una especie menos frecuentemente domesticada (tal como una codorniz o un emu) para evitar la posible contaminacion de tejidos de reserva con virus prevalentes en especies mas comunmente domesticadas (tales como gallinas).

Las celulas irradiadas pueden ser de cualquier tipo de tejido. En algunas realizaciones el tejido se obtiene de un embrion. En muchas realizaciones, se usa un cultivo mezclado de mas de un tipo de tejido, como puede obtenerse mediante la desintegracion de tejido o de varios tejidos. En realizaciones adicionales las celulas son del cordon umbilical de un embrion. Las celulas irradiadas puede ser o el/los tejido(s) puede(n) ser o incluir, por ejemplo, celulas endoteliales, celulas epiteliales, celulas madre pluripotentes o totipotentes, celulas madre embrionarias, celulas neuronales, celulas renales, celulas hepaticas, celulas musculares, celulas de colon, leucocitos, celulas pulmonares, celulas de ovario, celulas cutaneas, celulas de bazo, celulas estomacales, celulas tiroidales, celulas vasculares, celulas pancreaticas y/o celulas precursoras de las mismas y combinaciones de las mismas.

En muchas realizaciones las celulas se unen a una superficie durante la irradiacion o durante el cultivo. El cultivo sobre una superficie es especialmente adecuado para celulas endoteliales, en el que las celulas pueden seleccionarse adicionalmente para cumplir criterios de calidad adicionales tales como su capacidad para formar monocapas, que puede verse obstaculizado si la dosis de UV introduce demasiada alteracion perjudicial. Sobre tal superficie las celulas pueden formar monocapas. En particular las celulas se cultivan o irradian en un microportador. De modo alternativo, las celulas tambien pueden irradiarse o cultivarse o ambos en suspension. Las celulas que se han irradiado o cultivado inicialmente sobre una superficie pueden adaptarse a continuacion para crecer en cultivo en suspension.

En otro aspecto de la presente invencion se proporciona un procedimiento para producir un virus que comprende proporcionar celulas de una lmea celular continua que se puede obtener mediante el procedimiento inventivo, infectar dichas celulas con dicho virus, propagar dicho virus en dichas celulas y recoger dicho virus.

En la presente invencion, los virus para producir se seleccionan de virus de ADN o ARN con envoltura o sin envoltura, con genomas monocatenarios o bicatenarios (ADN), sentido o antisentido, continuos o segmentados. Los virus pueden seleccionarse del grupo que consiste en baculovirus, poxvirus, adenovirus, papovavirus, parvovirus, hepadnavirus, coronavirus, flavivirus, togavirus, astrovirus, picornavirus, retrovirus, ortomixovirus, filovirus, paramixovirus, rabdovirus, arenavirus y bunyavirus. En algunas realizaciones de la invencion, los virus se seleccionan del grupo de virus con envoltura, entre los que se incluye, flavivirus, togavirus, retrovirus, coronavirus, filovirus, rabdovirus, bunyavirus, ortomixovirus, paramixovirus, arenavirus, hepadnavirus, herpesvirus y poxvirus. En otras realizaciones, los virus son virus con envoltura tales como gripe, entre los que se incluye gripe A, B o C, virus del Nilo Occidental, virus de vaccinia, virus de vaccinia modificado o virus del no Ross. En otras realizaciones de la

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invencion, los virus se seleccionan del grupo de virus de ARN con envoltura, entre los que se incluye, flavivirus, togavirus, retrovirus, coronavirus, filovirus, rabdovirus, bunyavirus, ortomixovirus, paramixovirus y arenavirus. En realizaciones particulares el virus es MVA (virus vaccinia Ankara modificado), virus TBE (encefalitis transmitida por garrapatas), virus de la fiebre amarilla, virus del Nilo Occidental, virus de Nueva Caledonia o un virus de la gripe.

Tras la etapa de recoleccion, el virus puede desactivarse mediante cualquier medio conocido para la desactivacion de virus, por ejemplo, como se desvela en el numero de publicacion de EE.UU. 2006/0270017 A1, la cual se incorpora en el presente documento por referencia. En particular, puede realizarse desactivacion mediante tratamiento de formaldehudo y/o irradiacion UV, solo o en combinacion.

En general, sustancias de suero o derivadas de suero, tales como, por ejemplo, albumina, transferrina o insulina, pueden comprender agentes no deseados que pueden contaminar los cultivos celulares y los productos biologicos obtenidos de los mismos. Ademas, los aditivos derivados de suero humano deben probarse para todos los virus conocidos, incluyendo virus de hepatitis y VIH que pueden transmitirse via suero. Por lo tanto, de acuerdo con algunas realizaciones del procedimiento inventivo, las celulas de la lmea celular se adaptan para crecer en un medio sin suero, por ejemplo, se seleccionan por su capacidad de crecer en un medio sin suero. El medio puede estar sin suero o fracciones de suero, o tambien en general sin componentes sangumeos. El medio para estas realizaciones de la invencion se selecciona a partir de F12 de DMEM/HAM, RPMI, MEM, BME, medio de Waymouth, en particular un medio sin oligopeptidos o protemas tal como se describe en el documento US 2007/0212770 que se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad, o una combinacion de los mismos. Dicho medio sin oligopeptidos puede estar sin protemas sangumeas u oligopeptidos con un tamano superior a 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5 o 4 aminoacidos pero puede comprender glutation. El medio sin protemas esta sustancialmente sin protemas pero puede contener protemas producidas por las lmeas celulares o proteasas. En particular, el medio tambien puede comprender una poliamida como agente promotor del crecimiento y/o ser un medio definido qmmicamente tal como se describe en el documento US 2007/0212770. La expresion "definido qmmicamente" significa que el medio no comprende ningun suplemento no definido, tales como, por ejemplo, extractos de componentes animales, organos, glandulas, plantas o levadura. Por consiguiente, cada componente de un medio definido qmmicamente se define con precision. Los medios definidos qmmicamente estan sustancialmente sin protemas, o hidrolizados celulares, pero pueden contener protemas producidas por la lmea celular o proteasas. Ejemplos de tales medios se proporcionan en "A guide to Serum-Free Cell Culture", GIBCO cell culture (2003) disponible la WWW en
www.invitrogen.com/content/sfs/brochures/332-032442_SFMBrochure.pdf).

Estos medios, incluyendo el medio sin suero, el medio sin oligopeptidos o el medio definido qmmicamente, tambien comprenden glutation y/o proteasas, en particular tripsina tal como tripsina porcina o recombinante antes o despues de la inoculacion de virus (Klenk y col. (1975) Virology, 68: 426-439). Tales proteasas tambien pueden necesitarse durante el cultivo de las lmeas celulares ya que las celulas unidas a una superficie muestran desde una fuerte a muy ligera adherencia. Pueden separarse celulas unidas fuertemente por poteasas y/o agentes quelantes tales como EDTA (Doyle y col. Capttulo 4: Core Techniques, en: Cell & Tissue Culture: Laboratory Procedures, ECACC, John Wiley & Sons, Chichester (1996)). Adicionalmente el medio, en particular el medio sin protemas, puede comprender hidrolizados de planta o levadura antes o despues de la inoculacion. Por supuesto se espera que el medio comprenda protemas o productos metabolicos producidos por las lmeas celulares inventivas.

Las lmeas celulares que se pueden obtener mediante el procedimiento inventivo son generalmente no tumorigenicas y/o no cancengenas. En algunas realizaciones las celulas de las lmeas celulares se prueban y seleccionan para pasar la prueba de calidad tal como la prueba de F-pert.

En un aspecto adicional de la invencion se proporciona un procedimiento para producir un producto de gen recombinante que comprende proporcionar celulas de una lmea celular continua que puede obtenerse mediante el procedimiento inventivo, transfectar las celulas con un acido nucleico que codifica dicho producto genico, expresar dicho producto genico y opcionalmente recoger dicho producto genico. El acido nucleico puede ser ADN, ARN o APN. Ademas del gen, el acido nucleico puede comprender promotores para la expresion en la celula y marcadores de seleccion.

En un aspecto adicional de la invencion se proporciona una lmea celular continua que puede obtenerse mediante el procedimiento de proporcionar celulas vivas de un animal o un ser humano, irradiar dichas celulas con una dosis eficaz de luz UV, hacer proliferar dichas celulas y seleccionar celulas capaces de proliferar tras al menos 20 pases como celulas de dicha lmea celular continua. Las lmeas celulares inventivas tambien incluyen la descendencia de tales lmeas celulares producidas. En particular, la lmea celular se define como obtenible mediante las realizaciones del procedimiento descrito en el presente documento. Las lmeas celulares continuas obtenibles pueden tener rasgos caractensticos tales como actividad telomerica de cariotipos espedficos asociados con la irradiacion UV necesaria para producir la lmea celular continua. En realizaciones particulares de la invencion, las celulas de la lmea celular son no tumorigenicas y/o no cancengenas y, en particular, tambien pasan pruebas de calidad tales como la prueba F-pert.

En realizaciones particulares la lmea celular es una lmea celular depositada en la ECACC con el numero de acceso de deposito 08020602, 08020603 o 08020604 que corresponden a las referencias de solicitud QOR/RE07-169, QOR1 CJ07 y CORECB/SF08-06, respectivamente. Lmeas celulares inventivas adicionales tienen los rasgos

caractensticos, como capacidad de propagacion, patron de ciclo celular, actividad telomerasa, cariotipo, patron de cromosoma o longitud de los telomeros como dichas lmeas celulares depositadas y por supuesto ser una lmea celular continua.

La presente invencion se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos sin quedar limitados a los mismos. 5 Ejemplos

Ejemplo 1: Radiacion temporalmente distinta de celulas Vero con luz UV para producir mutantes

Materiales:

Medio de TC de Vero Tampon N1 Tripsina (dilucion 1:10)

Inhibidor de tripsina

placas de6pocillos, Corning Cat. N.° 3516 25cm2 de matraz T, Nunc Cat. N.°: 163371 lampara UV, VL 50C, Rejilla tubular 240 nm, 50 W, empresa Vilber- Lourmet

Procedimiento:

La preparacion se realiza en placas de 6pocillos con 1x106 celulas/pocillos y 5 ml de volumen de medio (en 10 preparacion doble). Se preparan un total de 7 placas (cada vez 2 pocillos/placa).

Despues de 24 h habfa un buen cultivo de monocapa.

Los 5 ml de medio se drenaron a 1 ml y las placas abiertas se irradiaron con luz UV (distancia de las placas de la lampara UV = 9 cm)

placa A:

15 min

placa B:

30 min

placa C:

45 min

placa D:

60 min

placa E:

90 min

placa F:

120min

placa G:

control,

sin irradiacion

Tras la irradiacion, las celulas de ambos pocillos se tripsinizan (1 ml de tripsina + 0,5 ml de inhibidor de 15 tripsina/pocillo), en el que las celulas del 1er pocillo se usan para determinar el recuento celular (CC) y viabilidad, y las celulas del 2° pocillo se someten a pases en 25 cm2 de roux con 10ml de medio.

Prueba n.°

Tiempo de irradiacion TCC/pocillo [x106l Burker-Turk viab. [%]

A

15 min 1,50 60,8

B

30 min 1,25 27,9

C

45 min. 1,15 5,6

D

60 min 0,95 23,6

E

90 min 0,55 no determinado

F

120min 0,30 no determinado

G

control 1,25 94,2

Se tripsinizo, el contenido del matraz T 25 el TCC y la viabilidad se determinan usando Cedex:

Prueba n.°

TCC/Roux [x106] Viab. [%] Imagen de microscopfa

A

0,80 23,2 celulas esferoidales, sin adherencia

B

0,60 18,8 celulas en el sobrenadante, sin adherencia

C

0,60 34,4 celulas individuales en el sobrenadante, sin adherencia

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(continuacion)

Prueba n.°

TCC/Roux [x106] Viab. [%] Imagen de microscopfa

D

0,50 25,0* solo restos celulares restantes

E

0,50 22,7* solo restos celulares restantes

F

0,40 11.1* solo restos celulares restantes

G

1,80 96,6 buena monocapa, 95-100 %

* jlos valores reales son inferiores ya que el recuento celular en el Cedex es demasiado bajo para la determinacion de recuento celular correcto!

Ejemplo 2: Irradiacion UV de celulas de ave

El objeto de este estudio era investigar el uso potencial de tratamiento con luz UV como herramienta para la generacion de lmeas celulares continuas adecuadas para la produccion de vacunas.

Embriones de gallina y de codorniz primarios se usaron como material de partida para la produccion de cultivos de monocapa primarios iniciales. Se usaron cultivos celulares de calidad controlada derivados de los mismos para el procedimiento de derivacion basado en la exposicion a luz UV.

Exposicion de celulas primarias a luz UV (254 nm). La lmea celular continua se desarrollo a partir de celulas primarias de embriones de codorniz cotrn o gallinas por medio de irradiacion UV.

El recorrido detallado de desarrollo de la lmea celular derivada a partir de celulas primarias de embriones de codorniz hasta la produccion de bancos de seguridad se ilustra en la fig. 3 en forma de un arbol filogenetico.

Como material de partida para la irradiacion UV, en cada caso se descongelo una ampolla de los bancos celulares de la primera evaluacion (gallina, codorniz japonesa y codorniz cotrn) que se origina a partir de la preparacion celular

de los embriones de la gallina, embriones de la codorniz japonesa y de la codorniz cotrn (cultivo mezclado de

embriones completos desintegrados).

La preparacion para la irradiacion UV se realizo en placas de 6pocillos con una siembra de celulas de 1x106

celulas/pocillo y 5 ml de volumen de medio. El medio TBE (FSME) con un 5 % de FBS y antibioticos (penicilina,

estreptomicina y gentamicina) se usaron como medio. Se preparo un total de 7 placas con 2 pocillos/placa cada una. Tras 24 h., se pudo observar en los pocillos un cultivo de monocapa uniforme. Para la irradiacion de las celulas, los 5 ml de medio se drenaron a 1 ml y las placas abiertas se irradiaron con luz UV en el banco de flujo laminar del siguiente modo. La distancia de las placas de la lampara UV era de 9 cm. Se uso una lampara UV de la empresa Vilber-Lourmet (VL 50C, Rejilla tubular 240 nm, 50 W) como fuente de luz UV.

placa A:

0,5 min

placa B:

1 min

placa C:

2 min

placa D:

3 min

placa E:

4 min

placa F:

5 min

placa G:

control, sin irradiacion

Tras la irradiacion, las celulas se tripsinizaron en los pocillos (1 ml de tripsina 1:10 diluida con tampon N1), en los que 1 ml de la suspension celular (un total de 6 ml) se uso para determinar el CC y viabilidad, y las celulas restantes se sometieron a pases con 5 ml de medio en 25 cm2 de roux. Los resultados se resumen en la tabla de este ejemplo.

Durante el primer periodo de cultivo (aproximadamente 25-35 dfas) unicamente hubo intercambios de medio y la morfologfa y adherencia de las celulas se evaluo opticamente en las pruebas individuales. Unicamente cuando se observo la formacion de islas de las celulas que crecen de forma adherente en los matraces T-25, las celulas de las pruebas A-E se tripsinizaron y transfirieron a placas de 6 pocillos (superficie mas pequena que los matraces T-25) para estimular una colonizacion celular homogenea y adherente. A partir de este punto en el tiempo, aproximadamente K40-K50, las celulas que llegaron a una confluencia del 80-100 % se sometieron a pases adicionales en matraces T-25 y T-75 cada 6-9 dfas y se prepararon en 1-2 ampollas de seguridad que sirvieron como material de partida para producir los bancos celulares de evaluacion (aproximadamente 10 ampollas). La tripsinizacion y sometimiento a pase de dichas poblaciones celulares se describe en el ejemplo 3.

Preparaciones usadas

Medio: - Medio TBE (FSME) + FBS 5 % + mezcla de antibioticos (penicilina/estreptomicina 100 mg/l y 50 mg/l de gentamicina)

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- Medio TBE (FSME) + FBS 10 %

- Medio de TC de Vero + FBS 10 %

- Tampon N1

- Tripsina gamma

- DMSO abreviaturas de la empresa Sigma: CC... recuento celular, matraces T de T-25/75/175...25/75/175cm2,

Tabla: Recuentos celulares y viabilidades de las pruebas individuals tras la irradiacion

Prueba n.°

Tiempo de irradiacion CC/ml [x106] Burker- Turk viab. [%] TCC/pocillo [x106]

A

30 s 0,75 87,3 0,15

B

1 min 0,75 79,5 0,15

C

2 min 0,80 84,1 0,16

D

3 min 0,70 90,4 0,14

E

4 min 0,80 80,0 0,16

F

5 min 0,70 * 0,14

G

control 0,75 84,1 0,15

* no determinado

Debido a los valores de recuento celular similares y viabilidades de las preparaciones de prueba individuales A-G, no se pudo mostrar una diferencia significativa respecto al tiempo de irradiacion UV de las celulas. Esta es la razon por la cual la morfologfa y adherencia de los cultivos comparados se evaluaron casi diariamente para reconocer sus particularidades.

De todas las preparaciones de prueba A-F, la poblacion celular de la preparacion E mostro las mejores propiedades de una lmea celular continua, que crece de forma adherente, tal como una estructura celular homogenea, que se cultiva en diferentes matraces T, un crecimiento celular constante tras varios pases, capacidad de crioconservacion y adecuacion para la propagacion de virus (por ejemplo, virus MVA).

En el caso de celulas de codorniz, la poblacion celular de la preparacion F no se pudo cultivar con exito. Se pudo observar un crecimiento celular reducido con formacion de cesped celular no homogeneo (grandes agujeros) tras mas de 6 pases con las celulas (prueba G) que no se habfan irradiado con luz UV. Desde el pase 16, las celulas perdieron su capacidad de division y no se pudieron ya cultivar. En conjunto, se lograron resultados similares con las pruebas celulares de codorniz y gallina.

Ejemplo 3: Tripsinizacion y sometimiento a pases de celulas

La tripsinizacion y sometimiento a pases de las celulas de codorniz que crecen de forma adherente se realizo en un esquema de sometimiento a pases similar al que se usa normalmente para las celulas Vero. Tras verter el medio de cultivo, se llevo a cabo una etapa de lavado con un tampon N1, a continuacion, el cultivo se cubrio con capa(s) de la cantidad correspondiente de tripsina gamma, diluida 1:10, y se incubo a una temperatura (con placas de 6 pocillos y T-25 (matraces T T-25...25cm2) la temperatura ambiente es suficiente) de 37 °C hasta que las celulas se despegan del recipiente de cultivo (mediante golpes suaves). No es necesaria la adicion del inhibidor de tripsina para detener el efecto de la tripsina debido al FBS contenido en el medio de cultivo. Posteriormente, las celulas se transfieren a un nuevo medio de cultivo y se reparten en recipientes de cultivo adicionales en correspondencia con las separaciones respectivas y se dejan, de nuevo, crecer.

La siguiente tabla indica las cantidades usadas durante la tripsinizacion.

recipiente de cultivo

Tampon N1 Tripsina gamma (1:10 diluida con tampon N1)

placa de 6 pocillos

2 ml 1 ml

matraz T de 25 cm2

5 ml 1 ml

matraz T de 75 cm2

10 ml 1 ml

matraz T de 175cm2

20 ml 2 ml

Ejemplo 4: Dosimetria de UV-C para la inmortalizacion de celulas con la lampara UV VL 50C

Se midio la dosis para obtener lmeas celulares continuas con irradiacion UV. La preparacion de la dosimetna fue similar a la preparacion para el tratamiento celular. La radiacion con luz UV-C causa una transformacion de yoduro de potasio y yodato de potasio disueltos en solucion de tampon en triyoduro marron-amarillo. El triyoduro tiene su 5 maximo de absorcion a 352 nm y puede medirse cuantitativamente en un fotometro espectral. Este principio permite medir la dosis UV aplicada durante la exposicion de monocapa celular dependiendo del tiempo de exposicion. Por lo tanto, basandose en mediciones en placas de 6 pocillos, un tiempo de exposicion de desde 0,5 a 5 minutos corresponde a una dosis UV de desde 20 a 120 mJ/cm2 (figura 4).

La dosimetna se realiza de la forma mas precisa posible, como la prueba de lmea celular. En cada caso, 1 ml de las 10 soluciones modelo con coeficientes de absorcion (367 nm) de aproximadamente 2,5/cm, 4,5/cm y 7,5/cm se irradia en un pocillo de la placa de 6 pocillos. Cada solucion modelo se irradia 6 veces. Tiempos de irradiacion = 30 s, 1 min, 2 min, 3 min, 4 min y 5 min. Para averiguar la dosis exacta para el tiempo de irradiacion respectivo, se determina la DO (253,7 nm) del medio usado.

Materiales usados:

15 - lampara UV portatil, VL50C, 254 nm, 50 W, empresa Vilber-Lourmat

- Fotometro espectral, empresa Therma, Dispositivo n.°: PA5007-012MM

- placa de 6 pocillos

- Acido borico 99,9 %, empresa Riedel- de Haen, Lote n.°: 60460

- Sedimentos de NaOH, empresa Baxter, Lote n.°: 318608

20 - PVP K17 PF (polivinilpirrolidona K17 Collidon), empresa Basf, Lote n.°: 30408609T0

- Yoduro de potasio, empresa Sigma Aldrich, Lote n.°: P2963-500G

- Yodato de potasio, empresa Merck, Lote n.°: K32577451622

- Medio de TC de VERO (VT), Cargo: ORSFVTC0700401

- Agua WFI, empresa Baxter, PP2

25 Se preparan tres soluciones modelo en cantidades suficientes.

Tabla 1: Composicion de las soluciones modelo

Reactivo

Solucion modelo 1 Solucion modelo 2 Solucion modelo 3

Acido borico

6,18 g/l disuelto en agua destilada

sedimentos de NaOH

valor de pH deseado: 9,15; aproximadamente 2 g/l

PVP K17 PF

2,414 g/l

Yoduro de potasio mas puro

1,41 g/l 2,57 g/l 4,30 g/l

Yodato de potasio mas puro

0,3 g/l 0,55 g/l 0,92 g/l

Las soluciones modelo pueden almacenarse en un lugar oscuro hasta que se usen pero al menos hasta 47 dfas.

Se recogen 60 ml de cada una de las soluciones modelo 1, 2 y 3 para la produccion de una curva de calibracion. Protegidas de luz incidente, estas muestras se envfan a IBC que establece la curva de calibracion. Se transfieren 30 100 ml de cada una desde las soluciones modelo 1, 2 y 3 a matraces Schott y se protegen de luz incidente. La

lampara UV portatil VL 50C se coloca en un armazon. La distancia entre la placa de mesa y el lado inferior de la lampara UV portatil es 9 cm. La lampara UV portatil se ajusta tal que el filtro apunte a la placa de mesa (es decir, hacia abajo).

La lampara UV portatil se enciende 30 minutos antes de usarse.

35 Se preparan los 3 matraces Schott con los 100 ml de soluciones modelo 1, 2 y 3, pipetas, pipettboy, un matraz Schott vado y tres placas de 6 pocillos. 1 ml de solucion modelo 1 se pipetea en el pocillo superior izquierdo de una placa de 6 pocillos. Este pocillo se coloca debajo de la lampara UV portatil sin ninguna cobertura de tal modo que se coloca debajo del filtro. Tras una irradiacion de 30 segundos, el pocillo se retira rapidamente de su posicion debajo de la lampara UV portatil. 370|jl de la solucion de 1 ml irradiada se transfieren a una cubeta de sflice en capas finas 40 y el DO367nm se determina en 5 minutos. Se mide lo mismo tres veces y se registra. Se determina el valor medio de estos 3 valores. Si un valor medido esta mas alla de la region de calibracion del fotometro, correspondientemente, se usara una cubeta con un espesor de capa diferente. El sobrenadante en el pocillo se succiona y descarta.

Estas etapas se repiten para todos los tiempos de irradiacion. Basandose en las funciones de curva obtenidas y DO (253,7 nm) del medio VT, la dosis respectiva de UV [mJ/cm2] se calcula lejos de 30 segundos a 5 minutos. Los 45 resultados se presentan en la siguiente tabla.

basandose en las funciones de curva

Tabla: Dosis UV calculada

respectivas

tiempo de irradiacion

30 segundos funcion de curva potencial y = 21,767x-01945 A 253,7 medio VT (=x)

4,01

dosis UV [mJ/cm2]

tiempo de irradiacion 3 minutos

funcion de curva potencial y = 147,31x-05363 A 253,7 medio VT (=x)

4,01

dosis UV [mJ/cm2]

16,61

69,95

tiempo de irradiacion 1 minuto

funcion de curva potencial y = 56,953x-04709 A 253,7 medio VT (=x)

4,01

dosis UV [mJ/cm2]

29,61

tiempo de irradiacion 4 minutos

funcion de curva potencial y = 212,7x-05159 A 253,7 medio VT (=x)

4,01

dosis UV [mJ/cm2]

103,90

tiempo de irradiacion

2 minutos

funcion de curva potencial y = 98,154x-04322 A 253,7 medio VT (=x)

4,01

dosis UV [mJ/cm2]

tiempo de irradiacion 5 minutos

funcion de curva potencial y = 2 64,53x-05377 A 253,7 medio VT (=x)

4,01

dosis UV [mJ/cm2]

53,86

125,36

Como puede observarse a partir de esta tabla, la funcion de curva de la dosis es y = 24,09x+ 4,3125. X es el tiempo de irradiacion en minutos e y es la dosis en mJ/cm2 (Fig. 4).

Ejemplo 5: Produccion de virus en celulas continuas

MVA, r-MVA, TBE y gripe se propagaron en celulas de codorniz continuas. Se establecieron cultivos de frasco 5 rotatorio de celulas de codorniz como se ha descrito anteriormente. Los cultivos se infectaron con (GMP) MVA, TroVax, TBE y virus de la gripe. Se escogio una MDI de acuerdo con el procedimiento de produccion de MVA actual. Se recogieron los productos vmcos despues de 3 a 4 dfas. Se uso un medio de cultivo AS de TC de Vero 10 % FBS durante la incubacion a una incubacion de 32 °C.

Infecc.: llevada a cabo con 10 ml despues de 1 h. a un volumen final (60 ml)

TBE:

50 Ml de

virus

MVA:

250 Ml de

virus

Nueva (NC):

Caledonia 50 pl

10 Abreviatura: KXX...dfa de cultivo XX

Recogida de muestras: muestra de 3x1 ml, NOVA, NaBr- con NC, HA, microfotograffa

TBE

dfa

glucosa glutamina lactato NH4 pH CO2 tftulo de virus TBE-Elisa CPE TBE-HA

[g/l] [g/l] [g/l] [mg/l] [%] Ig ufp/ml |jg/ml % HAU/200 jl

1

x x x x x x x 0 x

2

2,83 0,31 0,33 21 7,36 5,8 neg 0,02 0 16

3

2,71 0,27 0,4 26 7,32 6 6,34 0,08 0 16

4

2,47 0,2 0,59 47 7,36 5,1 0,21 0 64

MVA

dfa

glucosa glutamina lactato NH4 pH CO2 TCID50 CPE

[g/l] [g/l] [g/l] [mg/l] [%] tftulo %

1

x x x x x x x x 0

2

2,64 0,31 0,44 20 7,31 6,1 x x 0

3

2,6 0,27 0,58 23 7,26 6,1 x x 0

4

2,36 0,21 0,74 43 7,35 4,9 7,02e8V/ml x 0

Nueva Caledonia

dfa

glucosa glutamina lactato NH4 pH CO2 NaBr HA CPE

[g/l] [g/l] [g/l] [mg/l] [%] mm %

1

x x x x x x x x 20

2

2,76 0,3 0,34 21 7,32 6,2 x 3 =8HAU 70

3

2,82 0,26 0,38 25 7,34 5,7 0 5 =32HAU 100

4

2,63 0,19 0,48 45 7,41 5 0,00E = +00 5 =32HAU 100

Control

dfa

glucosa glutamina lactato NH4 pH CO2 NaBr HA CPE

[g/l] [g/l] [g/l] [mg/l] [%] mm %

1

x x x x x x x x 0

2

1,78 0,16 1,24 31 7,03 6,3 x x 0

3

1,24 0,12 1,42 34 6,87 6,9 x x 0

4

1,52 0,11 1,61 53 6,94 4,9 x x 0

5 Titulacion de virus lograda para MVA y r-MVA cultivados en experimented de frasco rotatorio:

Virus TCID50/ml

MVA 8x108

r-MVA (TroVax) 9x108

Titulacion de virus lograda para TBE y gripe cultivados en experimented de frasco rotatorio:

Virus Tftulo (log ufp/ml) HA (HAU/50jl) CPE (%)

TBE 6,9 64 100

Nueva Caledonia no determinado 32 100

Ejemplo 6: Ensayo de F-Pert de distintos cultivos celulares

El ensayo de F-Pert permite detectar actividad transcriptasa inversa mediante PCR y es necesario para la validacion de seguridad. Se prepararon distintos cultivos (Vero (control neg.), gallina primaria (control pos.), celulas de codorniz y gallina continuas) de acuerdo con el mismo procedimiento. Se recogieron sobrenadantes de cultivo y se 5 procesaron para la prueba de control de calidad de F-Pert

Resultados de la prueba F-Pert

Cultivo celular

F-Pert

Vero (control)

CEC (celulas de gallina primaria) celulas de codorniz (4 cultivos distintos)

celulas de gallina (2 distintos cultivos)

negativo

positivo

negativo

negativo

Claims (15)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   REIVINDICACIONES

   1. Un procedimiento de produccion de una lmea celular de ave continua que comprende irradiar celulas de ave vivas con una dosis eficaz de luz UV, y seleccionar celulas capaces de proliferar tras al menos 20 pases como celulas de una lmea celular de ave continua sin la introduccion de genes vmcos exogenos.
2. 2. El procedimiento de la reivindicacion 1 en el que la longitud de onda de la luz UV esta entre 200 nm y 300 nm.
3. 3. El procedimiento de la reivindicacion 1 en el que la dosis de luz UV es de al menos 500 J/m2 (al menos 50

   mJ/cm2).
4. 4. El procedimiento de la reivindicacion 1 en el que la dosis de luz UV es de hasta 3000 J/m2 (hasta 300 mJ/cm2).
5. 5. El procedimiento de la reivindicacion 1 en el que la etapa de seleccion comprende seleccionar dichas celulas tras al menos 40 pases.
6. 6. El procedimiento de la reivindicacion 1 en el que las celulas de ave estan unidas a una superficie o estan en suspension.
7. 7. El procedimiento de la reivindicacion 1 en el que las celulas de ave son celulas de un embrion.
8. 8. El procedimiento de la reivindicacion 1 en el que las celulas de ave se mezclan en un cultivo de mas de un tipo de

   tejido.
9. 9. El procedimiento de la reivindicacion 1 en el que las celulas de ave estan en una monocapa.
10. 10. El procedimiento de la reivindicacion 1 en el que las celulas de la lmea celular de ave continua se adaptan para su cultivo en un medio sin suero, opcionalmente F12 de DMEM/HAM, RPMI, MEM, BME, medio de Waymouth, un medio sin oligopeptidos, un medio definido qmmicamente o una combinacion de los mismos.
11. 11. El procedimiento de la reivindicacion 1 en el que dichas celulas de la lmea celular de ave continua se seleccionan para ser no tumongenicas y/o no cancengenas.
12. 12. Un procedimiento de produccion de un virus que comprende las etapas de:

    (i) producir una lmea celular de ave continua de acuerdo con el procedimiento de la reivindicacion 1;

    (ii) infectar celulas de la lmea celular de ave continua con un virus en condiciones que permitan la proliferacion del virus; y

    (iii) recoger dicho virus.
13. 13. El procedimiento de la reivindicacion 12 en el que el virus se selecciona de baculovirus, poxvirus, adenovirus, papovavirus, parvovirus, hepadnavirus, coronavirus, flavivirus, togavirus, astrovirus, picornavirus, retrovirus, ortomixovirus, filovirus, paramixovirus, rabdovirus, arenavirus, bunyavirus, MVA, virus TBE, virus de la fiebre amarilla, virus del Nilo Occidental, virus de Nueva Caledonia o un virus de la gripe.
14. 14. Un procedimiento de produccion de un producto de gen recombinante que comprende las etapas de:

    (i) producir una lmea celular de ave continua de acuerdo con el procedimiento de la reivindicacion 1;

    (ii) transfectar celulas de la lmea celular de ave continua con un acido nucleico que codifica un producto genico recombinante en condiciones que permitan la produccion de dicho producto genico y

    (iii) opcionalmente, recoger dicho producto genico.
15. 15. Una lmea celular depositada en el ECACC con el numero de acceso de deposito 08020602, 08020603 o 08020604.