TWI823252B - 連續型細胞生產系統及方法 - Google Patents
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Abstract
申請提供一種連續型細胞生產系統，包括：一培養容器；及一高分子混摻層，設置於該培養容器內表面；其中，該高分子混摻層係酸鹼應答型高分子混摻耐綸。另外，提供一種使用本申請之系統進行連續型細胞生產的方法。
Description
本申請涉及一種利用高分子混摻層於連續型細胞生產系統以及其連續型細胞生產的方法，特別是以酸鹼應答型高分子混摻耐綸。
在過去的十多年，利用環境pH值應答型的高分子材料於生物材料之領域已有許多的應用，包含藥物/基因的釋放、組織工程學、以及分離程序之應用等。但由於環保意識的興起，研發者除了在追求性能上的卓越之外，也回歸到自然，希冀能尋找可永續再利用同時兼顧其性能的天然材質。
一般而言，依據動物細胞生長型態可將動物細胞分成三類，懸浮型細胞(如血液細胞、淋巴組織細胞、造血幹細胞)、貼附型細胞(如：間質幹細胞、上皮細胞)及介於該兩種類型間之細胞，其中貼附型細胞因需貼附於物體上方能生長，因此，若要將其與物體表面分離，則需經過特別之處理。然，常見之處理程序通常過為繁雜，抑或於分離之過程中，會破壞細胞之結構，進而造成其死亡，影響後續之研究。
對此，中華民國專利公告號I432577揭露了利用酸鹼應答型高分子(例如chitosan)作為培養皿底材或塗佈於培養皿，並藉由調控細胞培養基的pH值，來控制細胞之貼附或脫離，使細胞在不使用酵素或大量清洗的情況下，即可輕易的脫附，避免細胞損傷或死亡。
中華民國專利公告號I558813亦揭露了混摻酸鹼應答型高分子(例如chitosan)以及高分子聚合物(例如PCL)，作為培養皿底材或塗佈於培養皿，進行細胞培養。藉由調控細胞培養基的pH值，除了控制細胞之貼附或脫離，更能依據不同種類高分子混摻及其各自比例來控制貼脫附之效率(細胞貼/脫附量)及速度(細胞貼/脫附速率)，進一步達到細胞純化或分選的效果。
然而，雖然先前技術解決了細胞培養中脫附細胞的問題，但在學術研究或產業利用上，對於充足數量及良好品質之細胞的需求是持續性的，因此在收集細胞後，仍須稀釋、重新種入、再次培養，重新使細胞貼附生長後再次脫附收集，反覆操作以達成持續性能有細胞收集而供使用。惟其步驟繁瑣，且反覆的貼附、脫附並不利細胞生長，同時幹細胞培養時的有效擴張與否以及原生幹性表現與細胞質量有關，重新種入的細胞也可能因質量問題導致無法貼附、無法擴張或活性不佳等，因此仍需要有新的細胞培養技術能在細胞數量與質量上提供學術研究及產業有效的實質助益。
鑒於先前技術所存在的問題，本申請提供一種連續型細胞生產系統，包括：一培養容器；及一高分子混摻層，設置於該培養容器內表面；其中，該高分子混摻層係酸鹼應答型高分子混摻耐綸。
在一實施例中，該連續型細胞生產系統包含一培養基及/或一細胞。
在一實施例中，該酸鹼應答型高分子係選自由具胺基之高分子、幾丁聚醣、聚離胺酸、聚丙烯胺、聚丙烯醯胺、聚己二胺、聚丙二胺、聚丁二胺、聚戊二胺及其組合所組成之群組。
在一實施例中，該酸鹼應答型高分子混摻耐綸之重量比例為1：1至10：1。
在一實施例中，該高分子混摻層係將酸鹼應答型高分子與耐綸之溶液均勻混合，並塗佈於該容器內表面烘乾後所製得。在另一實施例中，該高分子混摻層係在該酸鹼應答型高分子的塗佈層上具有複數個耐綸區域。
另外，本申請亦提供一種連續型細胞生產的方法，包含，(1)提供如本申請所述之系統；(2)控制該培養基之pH值範圍為6.9-7.4以培養該細胞；及(3)調整該培養基之pH值範圍至7.5-8.5使該細胞脫附。
在一實施例中，重複執行前述步驟(2)及步驟(3)。較佳地，可重複執行前述步驟(2)及步驟(3)三次以上。
在一實施例中，該細胞係選自由幹細胞，較佳地為脂肪幹細胞(adipose-derived stem cell)、間葉幹細胞或皮膚幹細胞；纖維母細胞(fibroblast cell)，較佳地為包皮纖維母細胞或胚胎纖維母細胞；上皮細胞(epithelial cell)，較佳地為近端腎小管上皮細胞；癌細胞，較佳地為上皮性肺癌細胞；角質細胞；角膜間質細胞及表皮細胞所組成之群組。
本申請較佳地可利用幾丁聚醣-耐綸(chitosan-nylon)的高分子混摻層來，建立連續型細胞生產系統。由於幾丁聚醣具有酸鹼應答特性，能透過調整培養基酸鹼值來控制細胞貼、脫附，但其不利細胞生長，反之，耐綸雖不具酸鹼應答特性，但具良好細胞貼附及生長性，使培養基酸
鹼值在調整時仍能使細胞貼附，在培養基酸鹼值回到控制時，所貼附之細胞能繼續擴增。本申請之方法係先在適當pH值控制下讓細胞貼附於此混摻材料上，接著將培養基調整酸鹼值讓幾丁聚醣發揮作用使細胞脫附並收集，之後，再回到將培養基控制在初始pH值，殘存之細胞持續貼附在耐綸並繼續生長至滿盤，接著重複相同的動作使細胞脫附並收集之，如此週而復始運作，便是一連續型細胞生產系統及方法。
圖1為不同材料之系統培養細胞的試驗結果。
圖2為不同材料於各週期所提取之培養基培養細胞的細胞活性結果。
圖3為細胞在不同單一材料上培養的結果。
圖4為細胞在不同單一材料上培養的細胞活性結果。
圖5為不同細胞及混摻方式培養細胞的試驗結果。
本發明之優點及特徵以及達到其方法將參照例示性實施例及附圖進行更詳細地描述而更容易理解。然而，本發明可以不同形式來實現且不應該被理解僅限於此處所陳述的實施例。相反地，對所屬技術領域具有通常知識者而言，所提供的此些實施例將使本揭露更加透徹與全面且完整地傳達本發明的範疇，且本發明將僅為所附加的申請專利範圍所定義。如本文中所使用的，術語「及/或」包含任何及所有一或多相關所列物件的組合。
除非另外定義，所有使用於本文的術語(包含科技及科學術語)具有與本發明所屬該領域的技術人士一般所理解相同的意思。將更可理解的是，例如於一般所使用的字典所定義的那些術語應被理解為具有與相關領域的內容一致的意思，且除非明顯地定義於本文，將不以過度理想化或過度正式的意思理解。如本說明書所記載者，範圍數值係作為說明在該範圍內的各個及每一個數值的簡略表示，在該範圍內的任何數值可被選作為該範圍的端值。
本發明提供一種連續型細胞生產系統，包括：一培養容器；及一高分子混摻層，設置於該培養容器內表面；其中，該高分子混摻層係酸鹼應答型高分子混摻耐綸。
在一實施例中，該連續型細胞生產系統包含一培養基及/或一細胞。
在一實施例中，該酸鹼應答型高分子係選自由具胺基之高分子、幾丁聚醣、聚離胺酸、聚丙烯胺、聚丙烯醯胺、聚己二胺、聚丙二胺、聚丁二胺、聚戊二胺及其組合所組成之群組。
在一實施例中，該酸鹼應答型高分子混摻耐綸之重量比例為1：1至10：1。
在一實施例中，該高分子混摻層係將酸鹼應答型高分子與耐綸之溶液均勻混合，並塗佈於該容器內表面烘乾後所製得。在另一實施例中，該高分子混摻層係在該酸鹼應答型高分子的塗佈層上具有複數個耐綸區域。
另外，本申請亦提供一種連續型細胞生產的方法，包含，(1)提供如本申請所述之系統；
(2)控制該培養基之pH值範圍為6.9-7.4以培養該細胞；及(3)調整該培養基之pH值範圍至7.5-8.5使該細胞脫附。
在一實施例中，重複執行前述步驟(2)及步驟(3)。較佳地，可重複執行前述步驟(2)及步驟(3)三次以上。
在一實施例中，該細胞係選自由幹細胞，較佳地為脂肪幹細胞(adipose-derived stem cell)、間葉幹細胞或皮膚幹細胞；纖維母細胞(fibroblast cell)，較佳地為包皮纖維母細胞或胚胎纖維母細胞；上皮細胞(epithelial cell)，較佳地為近端腎小管上皮細胞；癌細胞，較佳地為上皮性肺癌細胞；角質細胞；角膜間質細胞及表皮細胞所組成之群組。
以下列舉數個實施例作為例示，說明本申請之實施方式；熟習此技藝者可經由本說明書之內容輕易地了解本創作所能達成之優點與功效，並且於不悖離本創作之精神下進行各種修飾與變更，以施行或應用本創作之內容。
實施例1-連續型細胞生產系統的製備
本申請之一種態樣為均勻混摻。首先，將酸鹼應答型高分子(以幾丁聚醣為例)與耐綸(nylon-6,6)以重量比1：1至10：1的比例(以重量比5：1為例)溶於共熔劑(以甲酸或乙酸為例)中，在室溫下攪拌均勻。接著，將配製好的溶液倒入TCPS培養皿，於60℃烘箱O/N烘乾，再以0.5N NaOH中和後，用去離子水潤洗乾淨，最後於UV燈下殺菌一小時後即可使用。
另一種態樣是島狀混摻，其係先將酸鹼應答型高分子(以幾丁聚醣為例)溶液塗佈於TCPS培養皿並烘乾，再分別於不同位置滴上耐綸溶液(幾丁聚醣與耐綸重量比1：1至10：1)，使其表面形成複數個島狀的耐綸區域，後續同樣進行烘乾、中和、潤洗並殺菌後即可使用。
實施例2-不同材料之系統培養細胞的試驗
本試驗以5種培養系統分別進行連續型細胞培養，分別是：
1. CS(AA)：以乙酸(acetic acid)作為溶劑，單使用幾丁聚醣(Chitosan)塗佈於TCPS培養皿。
2. CS(FA)：以甲酸(formic acid)作為溶劑，單使用幾丁聚醣(Chitosan)塗佈於TCPS培養皿。
3. PCL/CS：以乙酸(acetic acid)作為共溶劑，將聚己內酯(PCL)和幾丁聚醣以重量比1：5均勻混摻，塗佈於TCPS培養皿。
4. NL/CS：以甲酸(formic acid)作為溶劑，將耐綸(nylon)和幾丁聚醣以重量比1：5均勻混摻，塗佈於TCPS培養皿。
5. GLTN/CS：以乙酸(acetic acid)作為共溶劑，將明膠(gelatin)和幾丁聚醣以重量比1：5均勻混摻，塗佈於TCPS培養皿。
本實施例使用Hs68細胞株進行連續型培養的試驗，先使用pH 6.99的培養基將細胞種於上述培養系統，使其貼附生長48小時(擴張期)，接著去除原培養基並加入pH 7.65的培養基維持1小時，使細胞完成脫附並收集之(收穫期)，以上作業為一個培養週期，重複加入pH 6.99的培養基培養48小時再調整為pH 7.65維持1小時後收集細胞的步驟，連續4個週期。
試驗結果如圖1所示，單使用幾丁聚醣(CS)完全無法達到連續生產細胞的目的，在第1個週期使細胞脫附後，細胞在第2個週期根本無法繼續生長與擴張，且無關乎溶劑(乙酸或甲酸)的選擇；而在PCL/CS及GLTN/CS上，在第1個週期調高培養基pH值雖有細胞脫附，但隨後於第2週期繼續培養48小時，細胞生長和擴張的程度已明顯看出降低許多，並且隨循環數增加而逐漸降低，使得最後呈現萎靡狀態，在第3個週期已
近乎完全無法繼續生長；反之，在NL/CS上，細胞在每個週期中都可明顯看出細胞生長/擴張與細胞脫附的效果，並可達到至少3~4個週期以上，顯示使用酸鹼應答型高分子混摻耐綸，可用於連續型細胞生產，不若傳統的細胞培養方式，在收集細胞後還要再稀釋，重新種入進行培養。實施例3-不同材料對於細胞培養之分析
考量到在反覆操作過程下可能會有材料溶出產生毒性，使得部分混摻材料組別的細胞走向萎靡，因此本試驗另收集實施例2中，各材料於各週期於擴張期培養48小時後的細胞培養基(提取之培養基)，同樣使用Hs68細胞株，將其以3500細胞/孔種入96孔TCPS盤中，分別加入上述各週期所提取之培養基培養48小時候收集細胞，並以MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-dephenyltetrazolium bromide)分析法進行細胞活性分析。由圖2可知，此疑慮是可以被排除的，使用不同材料各週期所提取之培養基培養之細胞其活性皆相當，沒有因材料可能溶出產生毒性而造成活性降低。
另外，本試驗進一步探討細胞在單一材料下的生長情況與活性。本試驗將TCPS盤的底部塗佈上單一材料聚己內酯(PCL)、耐綸(NL)或明膠(GLTN)，同樣種入Hs68細胞株，在培養24小時及48小時的時候觀察細胞生長情況，並以MTT分析法進行細胞活性分析。由圖3可知，TCPS盤和塗佈有不同單一材料的細胞培養結果皆相當，不論在哪種材料上，細胞皆能很好的貼附並生長至滿盤。同時，從圖4的細胞活性分析結果更可得知，各材料培養之細胞的細胞活性並沒有顯著的差異，甚至在PCL上培養之細胞的活性還略優於其他材料，然而PCL/CS混摻在實施例2已證實無法連續進行多個週期的細胞培養，顯示NL/CS混摻可用於連續型細胞生產的原因，並非單純只是耐綸本身材料對細胞的特性。
由本實施例可得知，細胞於NL/CS高分子混摻層上能完成連續細胞生產一事，並非耐綸能提高細胞培養之活性，也非其他高分子材料溶出毒性使細胞活性降低，其蓋因耐綸與酸鹼應答型高分子混摻後彼此相輔相成，其他先前技術使用的混摻高分子材料(如PCL)，雖然能使細胞脫附，但無法連續培養多個週期。
實施例4-不同細胞及混摻方式培養細胞的試驗
本試驗將Hs68(纖維母細胞)、脂肪幹細胞(adipose-derived stem cell，ADSC)及人類近端腎小管上皮細胞(human renal proximal tubular epithelial cell，hRPTEC)，培養於塗佈有NL/CS(1：5)均勻混摻的培養皿；另外，將Hs68(纖維母細胞)及人類近端腎小管上皮細胞(human renal proximal tubular epithelial cell，hRPTEC)培養於塗佈有NL/CS(1：5)島狀混摻的培養皿。培養條件及方式同實施例2。
試驗結果如圖5所示，不論是培養Hs68、ADSC還是hRPTEC，抑或是使用均勻混摻或島狀混摻的系統，都可藉由調整培養基的pH值達到非常良好的生長/擴增與脫附效果，並以連續型方式進行細胞生產至少4個週期以上。綜上揭露之發明技術與試驗結果，本申請揭露之連續型細胞生產系統及方法，可連續以週期性帶動複數次的細胞生產循環，提供學術研究及產業利用非常實質的幫助及效益。
Claims (10)
- 一種連續型細胞生產系統，包括：一培養容器；及一高分子混摻層，設置於該培養容器內表面；其中，該高分子混摻層係酸鹼應答型高分子混摻耐綸。
- 如請求項第1項所述之系統，其中包含一培養基及/或一細胞。
- 如請求項第1項所述之系統，其中該酸鹼應答型高分子係選自由具胺基之高分子、幾丁聚醣、聚離胺酸、聚丙烯胺、聚丙烯醯胺、聚己二胺、聚丙二胺、聚丁二胺、聚戊二胺及其組合所組成之群組。
- 如請求項第1項所述之系統，其中該酸鹼應答型高分子混摻耐綸之重量為1：1至10：1。
- 如請求項第1項所述之系統，其中該高分子混摻層係將酸鹼應答型高分子與耐綸之溶液均勻混合，並塗佈於該容器內表面烘乾後所製得。
- 如請求項第1項所述之系統，其中該高分子混摻層係在該酸鹼應答型高分子的塗佈層上具有複數個耐綸區域。
- 一種連續型細胞生產的方法，包含，(1)提供如請求項第2項所述之系統；(2)控制該培養基之pH值範圍為6.9-7.4以培養該細胞；及(3)調整該培養基之pH值範圍至7.5-8.5使該細胞脫附。
- 如請求項第7項所述之方法，其中重複執行步驟(2)及步驟(3)。
- 如請求項第8項所述之方法，其中可重複執行步驟(2)及步驟(3)三次以上。
- 如請求項第2項所述之系統，其中該細胞係選自由幹細胞，較佳地為脂肪幹細胞(adipose-derived stem cell)、間葉幹細胞或皮膚幹細胞；纖維母細胞(fibroblast cell)，較佳地為包皮纖維母細胞或胚胎纖維母細胞；上皮細胞(epithelial cell)，較佳地為近端腎小管上皮細胞；癌細胞，較佳地為上皮性肺癌細胞；角質細胞；角膜間質細胞及表皮細胞所組成之群組。
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