CN108676769B - 一种促进肝细胞生长的无纺布支架材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种促进肝细胞生长的无纺布支架材料及其制备方法，该无纺布支架材料包含0.1～1.5wt％的促肝细胞生长素。它是通过静电纺丝技术制备获得的。本发明操作简便，生产条件温和，易于工业化生产，所制备的纳米纤维无纺布，采用的是明胶作为主要载体，明胶生物相容性优异，所得无纺布最大程度模仿天然细胞外基质，使肝细胞在生物材料上生长的微环境和体内相差无异。本发明制备的纳米纤维无纺布采用促肝细胞生长素改性，促肝细胞生长素促进了肝细胞在无纺布上的粘附、生长和增殖。在增加了硝酸纤维素之后，本发明的无纺布，纤维分布均匀，且纤维丝粗细更加一致，能够较大的改进无纺布的均一性，使肝细胞在无纺布上的生长分布更均匀。
Description
技术领域
本发明涉及生物材料技术领域，具体地指一种促进肝细胞生长 的无纺布支架材料及其制备方法。
背景技术
生物反应器是生物人工肝的核心部件，为肝细胞提供生长和代 谢的场所，生物反应器中，肝细胞直接生长在生物相容性优异的载 体材料上面。现有的肝细胞体外培养采用的载体多样，如中空纤维、 凝胶，聚合物微囊膜等等，但是存在各种缺陷，如凝胶培养的细胞 数额有限不利于工业化生产，中空纤维培养的细胞易分布不均，细 胞团块易堵塞半透膜孔隙影响物质交换；微囊培养细胞长势不佳 等。
无纺布又称不织布，是由定向的或随机的纤维而构成，广泛应 用于医疗技术领域。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的供肝细胞体外培养用的促进 肝细胞生长的无纺布支架材料，具有比表面积大、孔隙率高的特点， 与细胞外基质的组成和结构非常相似，可作为肝细胞生长的组织工 程支架材料。
为实现上述目的，本发明所设计的促进肝细胞生长的无纺布支 架材料，包含0.1～1.5wt％的促肝细胞生长素。
优选地，所述无纺布支架材料还包含0.1～0.5wt％的硝酸纤维 素。
优选地，所述无纺布支架材料还包含0.1～0.5wt％的聚氧化乙 烯。在制备无纺布的静电纺丝过程中增加聚氧化乙烯可以提高其可 纺性。
本发明还提供了一种上述促进肝细胞生长的无纺布支架材料 的制备方法，其步骤如下：
1)在明胶溶液中加入聚氧化乙烯、促肝细胞生长素，明胶溶 液的终浓度为5～15wt％，促肝细胞生长素的终浓度为0.1～1.5wt％， 获得静电纺丝液；
2)利用静电纺丝液进行静电纺丝，设定静电纺丝参数，电压 5～20kv，静电纺丝液流速0.5～2mL/h，正负极间接收距离5～20cm， 收集无纺布；
3)对收集的无纺布进行戊二醛蒸汽交联处理，获得所述促进 肝细胞生长的无纺布支架材料。
优选地，所述步骤1)在明胶溶液中还添加有0.1～0.5wt％的硝 酸纤维素。
优选地，所述步骤1)在明胶溶液中还添加有0.1～0.5wt％的聚 氧化乙烯。
可选地，所述戊二醛蒸汽交联处理时采用的戊二醛是体积百分 比25％的戊二醛水溶液。
可选地，所述戊二醛蒸汽交联处理的时间为0.5～24小时。
本发明的有益效果：
1)本发明操作简便，生产条件温和，易于工业化生产。
2)本发明制备的纳米纤维无纺布，采用的是明胶作为主要载 体，明胶生物相容性优异，采用静电纺丝技术制备，所得无纺布最 大程度模仿天然细胞外基质，使肝细胞在生物材料上生长的微环境 和体内相差无异。
3)本发明制备的纳米纤维无纺布采用促肝细胞生长素改性， 促肝细胞生长素促进了肝细胞在无纺布上的粘附、生长和增殖。
4)在增加了硝酸纤维素之后，本发明的无纺布，纤维分布均 匀，且纤维丝粗细更加一致，能够较大的改进无纺布的均一性，使 肝细胞在无纺布上的生长分布更均匀。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述。
以下实施例中采用的促肝细胞生长素是从新鲜乳猪肝脏中提 取分离纯化制备而成的多肽类活性物质，具体来说为pHGF，它来 源于人类和哺乳类动物的胚胎肝和再生肝，正常成年肝脏和身体其 他组织都未检测出pHGF活性。研究结果证明pHGF是一种小分子 量蛋白多肽类物质，在紫外扫描图谱中存在两个吸收峰，分别为 200nm及260nm左右，在紫外280nm检测波长下的反相高效液相 色谱分析图中有6.7个组分峰，和LaBreeque报道的物质相似： 梁登等对牛肝细胞再生刺激因子(eHSS)的研究发现至少含有13种 游离氨基酸，其中6种为必须氨基酸；张宜俊等测定肝细胞生长素 (HGF)制剂中含有18种游离氨基酸；姚志强测定纯化人胎肝pHGF 由16种氨基酸组成，含量最高者为甘氨酸，最低者为酪氨酸：侯 淦泉测定胎牛肝再生因子中含有17种游离氨基酸。pHGF不属于糖 蛋白，耐热(95℃，15min不失活)，易溶于0.9％NaCl，可被乙醇沉 淀，在pH2～9范围内稳定，pH值低于2时失活，pHGF水溶液在 室温很快失活。
应该理解的是，其他能够促进肝细胞体外生长的活性物质都可 以作为促肝细胞生长素应用于本发明。
实施例促进肝细胞生长的无纺布支架材料的制备方法
利用静电纺丝技术制备促进肝细胞生长的无纺布支架材料，步 骤如下：
1、配制质量分数为5～15wt％的明胶溶液，搅拌后备用
2、在明胶溶液中加入聚氧化乙烯(PEO)，聚氧化乙烯的质量 分数为0.1～0.5wt％。
3、在明胶溶液中加入促肝细胞生长素及硝酸纤维素，促肝细 胞生长素的添加量为0.1～1.5wt％，硝酸纤维素添加量为 0.1～0.5wt％。
4、将上述由明胶、聚氧化乙烯、促肝细胞生长素组成的共混 液作为静电纺丝液
5、将上述静电纺丝液注入静电纺丝机的微量进样器中
6、设定静电纺丝参数，电压5～20kv，纺丝液流速0.5～2mL/h， 正负极间接收距离5～20cm。
7、启动静电纺丝机，一段时间后收集负极接收板上的无纺布
8、对所得无纺布进行25％戊二醛蒸汽交联处理
9、上述戊二醛蒸汽交联处理时间为0.5h～24h，得到无纺布支 架材料。
试验例1
按照实施例的方法，制备一组促进肝细胞生长的无纺布支架材 料(无硝酸纤维素)，其中促肝细胞生长素质量分数的添加量分别 为0、0.1wt％、0.2wt％、0.3wt％、0.4wt％、0.5wt％、0.6wt％、 0.7wt％、0.8wt％、0.9wt％、1wt％、1.1wt％、1.2wt％、1.3wt％、 1.5wt％，并且不添加硝酸纤维素，编号样品0～15。
样品1～15的无纺布裁剪成3mmx3mm的大小，使其浸泡于生 理盐水中，完全浸湿后放入96孔板中，待其在无菌环境中干燥， 同时做好标记，备用。将含有不同含量生长因子的无纺布的96孔 板分别与加入同等数量的细胞进行培养，同时设置两组空白对照试 验一起，一组空白对照试验只单独培养细胞，无细胞因子和无纺布 (标记为对照组1)，另一组空白对照试验只有无纺布，无细胞培养 (标记为对照组2)。实验组和对照组一共18组，且每组至少做6 次重复试验，每次试验的细胞数量及培养基数量一致。培养3天， 所有实验的培养液配方完全相同，观察每天的细胞状态，待第三天 后测OD值。
通过观察，发现含有无纺布的实验组细胞贴壁时间比对照组的 要早，5小时左右即可贴壁，而对照组则需要6～8小时，12h后镜 下观察各组细胞未肉眼可见差别，24h观察细胞，发现含有质量分 数0.7～1.5wt％的生长因子的无纺布上细胞明显较0～0.6wt％生长因 子及空白对照组多，48h后更加明显，即0.3～1.5wt％的生长因子的 无纺布上细胞明显较0～0.2wt％生长因子及空白对照组多，72h观察 所有添加生长因子的无纺布上细胞都明显高于0wt％及空白对照 组，并同时用台酚蓝染色，检测OD值，将每组每次试验结果汇总处理后如下：
表1.促肝细胞生长素对肝细胞生长的影响
将实验组分别减去对照组2中的OD值后，在于对照组1中的 OD值进行比较，可以发现，随着生长因子的加入，细胞生长明显， 并且，生长因子浓度与细胞数量成正相关，但是到了生长因子浓度 1wt％之后则没有相关性。
试验例2
1)选取试验例1中表现较佳的无纺布支架材料样品10和14， 与样品10同等成分仅增加0.1wt％硝化纤维素的纤维素样10，与样 品14同等成分仅增加0.3wt％硝化纤维素的纤维素样14，将添加了 纤维素和缺少纤维素的进行理化性质对比，在高倍显微镜下观察纤维形貌，每张照片用Photoshop图形处理软件随机测量50根纤维直 径，取平均值，统计数据如下：
表2.促硝化纤维素对无纺布性质的影响
实验结果表明，添加纤维纤维素后，无纺布纤维直径分布更均 匀，且纤维丝粗细更加一致，能够较大的改进无纺布的均一性。
试验例3
将试验例2中的样品10、样品14、纤维素样10、纤维素样14 分成4组进行肝细胞培养实验，每组至少做6次重复实验，将以上 两种无纺布分别减成1cmx1cm灭菌处理后放入12孔板，每孔加入 相同完全培养基及相等数量的肝细胞，统一培养三天，显微镜观察 细胞生长状态。8小时后镜下观察，两组细胞已经贴壁。24小时后 镜下观察到两组细胞已经呈正常肝细胞形态。
48小时后镜下观察，可发现添加硝化纤维素无纺布组细胞密度 分布较另一组更均匀。
72小时后将12孔板用PBS轻轻清洗两遍，用无菌镊子轻取出 无纺布，分别放在干净玻璃片上用台酚蓝染色，镜下观察发现添加 硝化纤维素无纺布组较另一组细胞染色更均匀，细胞状态更好。同 时将其12孔板用台酚蓝染色，镜下观察发现添加纤维素无纺布组未有细胞，而无添加硝化纤维素无纺布组有少量细胞留在孔板内。
以上结果表明：添加硝化纤维素的无纺布较未添加硝化纤维素 的无纺布上细胞生长更密集，密度更均匀。
Claims (4)
1.一种促进肝细胞生长的无纺布支架材料，其特征在于，该无纺布支架材料包含0.1～1.5wt％的促肝细胞生长素，0.1～0.5wt％的硝酸纤维素，0.1～0.5wt％的聚氧化乙烯，5～15wt％的明胶。
2.权利要求1所述促进肝细胞生长的无纺布支架材料的制备方法，其步骤如下：
1)在明胶溶液中加入聚氧化乙烯、促肝细胞生长素、硝酸纤维素，明胶溶液的终浓度为5～15wt％，聚氧化乙烯的终浓度为0.1～0.5wt％，促肝细胞生长素的终浓度为0.1～1.5wt％，硝酸纤维素的终浓度为0.1～0.5wt％，获得静电纺丝液；
2)利用静电纺丝液进行静电纺丝，设定静电纺丝参数，电压5～20kv，静电纺丝液流速0.5～2mL/h，正负极间接收距离5～20cm，收集无纺布；
3)对收集的无纺布进行戊二醛蒸汽交联处理，获得所述促进肝细胞生长的无纺布支架材料。
3.根据权利要求2所述促进肝细胞生长的无纺布支架材料的制备方法，其特征在于：所述戊二醛蒸汽交联处理时采用的戊二醛是体积百分比25％的戊二醛水溶液。
4.根据权利要求2所述促进肝细胞生长的无纺布支架材料的制备方法，其特征在于：所述戊二醛蒸汽交联处理的时间为0.5～24小时。
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