CN107019815B - 静电纺丝膜及其制备方法与在制备生物补片中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医学材料领域，尤其涉及静电纺丝膜及其制备方法与在制备生物补片中的应用。本发明提供的静电纺丝膜由壳聚糖、明胶、细胞外基质制得，其中还可包括抗排斥药物。其可直接由纺丝制得，或经纺丝、交联后制得。在静电纺丝膜表面修饰生长因子，制得生物补丁。本发明提供的静电纺丝膜具有网格状的空间结构，纺丝粗细均匀，与羊膜结构相似。且其表面修饰生长因子后，能够促进细胞的生长，有利于细胞的吸附且能够为细胞生长提供更加适宜的环境，从而达到更好的修复作用，能够用于皮肤、眼表等部位，具有良好的抗菌、消炎效果。
Description
技术领域
本发明涉及医学材料领域，尤其涉及静电纺丝膜及其制备方法与在制备生物补片中的应用。
背景技术
羊膜作为一种异体来源的生物敷料目前已被广泛的应用于眼科、皮肤科修复、抗瘢痕化等外科常见的疾病。其中，羊膜眼科的应用主要包括：一、眼表疾病的化学烧伤、热烧伤引起的眼表疾病；二、感染性及非感染性角膜溃疡的治疗；三、原发性或复发性翼状胬肉；四、其他结膜疾病某些眼部或全身系统性疾病所致的结膜囊狭窄；五、青光眼手术联合羊膜植入巩膜瓣下有效的抑制巩膜增生。羊膜在皮肤修复中的应用主要包括：组织工程皮肤在修复皮肤烧伤、溃疡等疾病中具有其不可取代的地位。还可以减少瘢痕形成，减轻疼痛，使创面渗出液减少。羊膜作为生物辅料广泛的应用，但是羊膜的来源有限并且羊膜处理、保存程序繁琐，同时羊膜可能引起人体免疫排斥反应。所以目前迫切需要开发新产品用于替代羊膜于临床上的应用。
静电纺丝技术（electrostatic spinning，ES）是一种简单易行的新型组织工程多孔支架制备方法，静电纺丝材料具有独特的微观结构和适当的力学性能，为生物组织工程支架、缓释材料等的研发提供理想的平台。静电纺丝技术创建的时间较早，但直到20世纪90年代，静电纺丝才被广泛的研究，利用静电将聚合物拉成的细丝“纺织成布”。目前人们利静电纺丝技术成功的合成了人造皮肤、人造血管等生物材料，利用PLLA，壳聚糖，胶原，PLGA等生物材料制备外伤辅料止血、皮肤再生、定向药物缓释等功能的医用产品。以静电纺丝技术制备生物补片，可以克服羊膜来源有限、保存不易的困难。但目前的静电纺丝膜的对组织修复的效果不能够令人满意。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供静电纺丝膜及其制备方法与在制备生物补片中的应用，本发明提供的静电纺丝膜具有良好的抗炎、抑菌作用，将其作为生物补片能够为细胞生长的提供支架，从而促进组织的修复。
本发明提供的静电纺丝膜，由以下原料制得；所述原料包括：壳聚糖、明胶和细胞外基质。
通过调节静纺丝膜中壳聚糖与明胶的比例可以调节壳聚糖静电纺膜与体内的降解时间，根据应用的不同要求制备具有不同降解时间点的可聚糖静电纺丝溶液。在本发明中，壳聚糖与明胶的质量比为（3~5）：（1~5）。
细胞外基质 (extracellular matrixc,ECM)，是由动物细胞合成并分泌到胞外、分布在细胞表面或细胞之间的大分子，主要是一些多糖和蛋白，或蛋白聚糖。创面愈合过程中，由迁移增生的平滑肌细胞和成纤维细胞分泌的细胞外基质起到重要作用，它可以为细胞提供移动的网络和向导，把细胞粘附在一起，对组织的愈合起到骨架作用，并且影响各种生长因子生物活性及其调节作用。本发明将细胞外基质添加入静电纺丝膜中，使其存在于静电纺丝膜的立体结构中，所得静电纺丝膜作为敷料能够具有保湿抑菌，促进伤口愈合的作用。
本发明添加的细胞外基质选自纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白或硫酸乙酰肝素蛋白。
在本发明中，细胞外基质的质量分数为0.5%~1%。
为了避免静电纺丝膜使用时发生免疫排斥反应，在其中添加抗排斥药物。
添加的抗排斥药物选自硫唑嘌呤、强的松或环磷酰胺。
在本发明中，抗排斥药物的质量分数为0.2‰~2‰。
在本发明中，抗排斥药物的质量分数为1‰。
在一些实施例中，静电纺丝膜由壳聚糖、明胶、细胞外基质制得。
其中，壳聚糖、明胶、细胞外基质的质量比为10:2:1。
其中，细胞外基质为纤维粘连蛋白。
在一些实施例中，静电纺丝膜由壳聚糖、明胶、细胞外基质和抗排斥药物制得。
其中，壳聚糖、明胶、细胞外基质、抗排斥药物的质量比为10:2:1:0.01。
其中，细胞外基质为纤维粘连蛋白和层黏连蛋白；抗排斥药物为强的松。
在另一些实施例中，壳聚糖、明胶、细胞外基质、抗排斥药物的质量比为10:4:1:0.01。
其中，细胞外基质为IV型胶原蛋白；抗排斥药物为硫唑嘌呤。
在另一些实施例中，壳聚糖、明胶、细胞外基质、抗排斥药物的质量比为10:5:1:0.01。
其中，细胞外基质为硫酸乙酰肝素蛋白；抗排斥药物为环磷酰胺。
本发明利用静电纺丝技术将壳聚糖和明胶制成静电纺丝膜，并且加入细胞外基质和抗排斥的药物，增加了所得静电纺丝膜的生物学功能。本发明利用的为天然生物多糖为原料不仅来源广泛，避免了应用伦理性问题，同时降低生物污染、病毒传播、免疫排斥反应等。
本发明提供的静电纺丝膜可以仅经过纺丝工艺制得（本发明称为静电纺丝膜），也可于纺丝工艺后经过交联步骤（本发明称为交联静电纺丝膜），形成网格状空间结构，该结构与羊膜的结构相似。
本发明提供的静电纺丝膜的制备方法，以三氟乙酸和二氯甲烷的混合物为溶液，将壳聚糖、明胶、细胞外基质溶解，制得静电纺丝溶液后经纺丝制得静电纺丝膜。
在一些实施例中，三氟乙酸和二氯甲烷的体积比为7:3~9:1。
作为优选，氟乙酸和二氯甲烷的体积比为9:1。
在一些实施例中，静电纺丝溶液中：壳聚糖的浓度为50 g/L；明胶的浓度为10g/L~25g/L；细胞外基质的浓度为5 g/L。
在本发明的实施例中，溶液中还溶解抗排斥药物。
所述静电纺丝液中抗排斥药物的浓度为0.05g/L。
在本发明的实施例中，所述纺丝的针头直径为0.7mm；正负电极之间距离为7~12cm；正负电压差为20~35kv。
作为优选，所述纺丝的针头直径为0.7mm；正负电极之间距离为7cm；正负电压差为30kv。
在本发明的实施例中，纺丝设备接收器的转速设定为100~120转/min。
作为优选，纺丝设备接收器的转速设定为120转/min。
壳聚糖静电纺丝针头的平移速度为0.2~0.5mm/s。
作为优选，壳聚糖静电纺丝针头的平移速度为0.2mm/s。
纺丝空间温度为70~90℃，湿度为40RH。
作为优选，纺丝空间温度为80℃。
连续纺丝120~180min。作为优选，连续纺丝150min。
以本发明提供的制备方法制得的静电纺丝膜。
以本发明提供的制备方法制得的静电纺丝膜在制备敷料中的应用。
壳聚糖、明胶和细胞外基质的混合物以三氟乙酸和二氯甲烷溶解后，经过纺丝形成了膜状结构，将其用贴附伤口表面，能够形成一层粘稠的壳聚糖薄膜，具有保湿抑菌的作用。与经过交联的静电纺丝膜相比，不经交联的静电纺丝膜遇水能够溶解，空间结构消失，但是能够更好的附着于伤口表面。
本发明提供的静电纺丝膜的另一种制备方法需要经过交联。具体为：
交联静电纺丝膜的制备方法，以三氟乙酸和二氯甲烷的混合物为溶液，将壳聚糖、明胶、细胞外基质，制得静电纺丝溶液后，经纺丝、交联制得交联静电纺丝膜。
在一些实施例中，三氟乙酸和二氯甲烷的体积比为7:3~9:1。
作为优选，氟乙酸和二氯甲烷的体积比为9:1。
在一些实施例中，静电纺丝溶液中：壳聚糖的浓度为50 g/L；明胶的浓度为10g/L~25g/L；细胞外基质的浓度为5 g/L。
在本发明的实施例中，溶液中还溶解抗排斥药物。
所述静电纺丝液中抗排斥药物的浓度为0.05g/L。
在本发明的实施例中，所述纺丝的针头直径为0.7mm；正负电极之间距离为7~12cm；正负电压差为20~35kv。
作为优选，所述纺丝的针头直径为0.7mm；正负电极之间距离为7cm；正负电压差为30kv。
在本发明的实施例中，纺丝设备接收器的转速设定为100~120转/min。
作为优选，纺丝设备接收器的转速设定为120转/min。
壳聚糖静电纺丝针头的平移速度为0.2~0.5mm/s。
作为优选，壳聚糖静电纺丝针头的平移速度为0.2mm/s。
纺丝空间温度为70~90℃，湿度为40RH。
作为优选，纺丝空间温度为80℃。
连续纺丝120~180min。作为优选，连续纺丝150min。
在本发明的实施例中，交联的交联剂为戊二醛；交联时间为1~3h。
交联具体为，将经纺丝的静电纺丝膜与交联体系置于密闭的干燥器皿中，利用戊二醛水溶液自然挥发蒸汽进行交联。在一些实施例中，交联体系中包括水和交联剂，其中交联剂的体积分数为10~25%。
经交联的，还经过干燥的步骤，干燥的条件为真空干燥，温度为70~90℃，时间为2~3h。
在经过干燥的步骤后，还经过碱处理，以进一步的稳定静电纺丝膜的空间结构。具体为，以氢氧化钠的乙醇溶液浸泡经交联和干燥的交联静电纺丝膜。所述氢氧化钠的乙醇溶液中，氢氧化钠的浓度为0.5mol/L，浸泡的时间为1~3h。
在经过碱处理后，将交联静电纺丝膜以蒸馏水清洗后，干燥。所述干燥的温度为70~100℃，干燥的条件为真空干燥。
以本发明提供的制备方法制得的交联静电纺丝膜。
以本发明提供的制备方法制得的交联静电纺丝膜在制备生物补片中的应用。
壳聚糖、明胶和细胞外基质的混合物以三氟乙酸和二氯甲烷溶解后，经过纺丝形成了网格状的立体结构，经过交联和碱处理后，该结构更加的稳固，纺丝粗细均匀，空间结构完整与羊膜的结构类似。经检测，经交联的静电纺丝膜厚度为0.1mm~0.5mm，应力值为1.07N~2.2N。该静电纺丝膜的空间结构有利于细胞附着在静电纺丝膜上，从而为细胞的生长提供了与体内更加相似的环境，将其制成生物补片，能够促进伤口的愈合，并且能够起到良好的抗菌作用。因而，本发明提供了一种生物补片，由经交联的静电纺丝膜和生长因子制得。
本发明提供的生物补片由以下原料制得，所述原料包括壳聚糖、明胶、细胞外基质和生长因子。
在一些实施例中，所述细胞外基质的质量分数为2.5%；所述生长因子的质量分数为0.1 ‰。
生长因子是指具有刺激细胞生长活性的细胞因子。是一类通过与特异的、高亲和的细胞膜受体结合，调节细胞生长与其他细胞功能等多效应的多肽类物质。本发明利用静电纺丝膜表面的氨基与蛋白因子中的羧基进行缩合反应，将生长因子修饰在静电纺丝膜的表面。本发明制得的生物补丁具有网格状的空间结构，纺丝粗细均匀。其内部含有细胞外基质成分，表面修饰有生长因子，因此，其能够促进细胞的生长。根据不同患者的需求，可将不同的生长因子修饰在静电纺丝膜的表面。也可以根据不同患者的需求，在生物补片表面接种不同种类的干细胞，然后将其用于受损组织的修复；或者直接利用静电纺膜对受损组织进行修复。因此，本发明提供的生物补片可用于眼科、皮肤科、隔膜修复。能够用于治疗胬肉、眼表损伤、抗增殖、皮肤损伤、脏器损伤，或进行牙齿修复。
本发明提供的生物补片中还包括抗排斥药物，所述抗排斥药物的质量分数为0.2‰。
在本发明的实施例中，生长因子选自成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、重组人角质细胞生长因子、胰岛素样生长因子、人肝细胞生长因子、转化生长因子或血管内皮生长因子。
在一些实施例中，生物补片由壳聚糖、明胶、细胞外基质和生长因子制得。
其中，壳聚糖、明胶、细胞外基质、生长因子的质量比为10:2:1:0.01。
其中，细胞外基质为纤维粘连蛋白。
其中，生长因子为成纤维细胞生长因子和表皮生长因子。
其中，成纤维细胞生长因子和表皮细胞生长因子的质量比为1：1。
实验表明，此实施例制得静电纺丝膜的降解时间为25天。
在一些实施例中，静电纺丝膜由壳聚糖、明胶、细胞外基质、生长因子和抗排斥药物制得。
其中，壳聚糖、明胶、细胞外基质、生长因子和抗排斥药物的质量比为10:4:1:0.01。
其中，细胞外基质为纤维粘连蛋白和层黏连蛋白；抗排斥药物为强的松。生长因子为成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子。
其中，成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子的质量比为1：1。
实验表明，此实施例制得静电纺丝膜的降解时间为23天。
在另一些实施例中，壳聚糖、明胶、细胞外基质、生长因子和抗排斥药物的质量比为10:5:1：0.01：0.01。
其中，细胞外基质为IV型胶原蛋白；抗排斥药物为硫唑嘌呤；生长因子为表皮生长因子和胰岛素样生长因子。
其中，表皮生长因子和胰岛素样生长因子的质量比为1：1。
实验表明，此实施例制得静电纺丝膜的降解时间为 21天。
在另一些实施例中，壳聚糖、明胶、细胞外基质、生长因子和抗排斥药物的质量比为10:5:1：0.01：0.01。
其中，细胞外基质为硫酸乙酰肝素蛋白；抗排斥药物为环磷酰胺；生长因子为表皮生长因子和血管内皮生长因子。
其中，表皮生长因子和血管内皮生长因子的质量比为1：1。
实验表明，此实施例制得静电纺丝膜的降解时间为21天。
本发明提供的生物补片是在静电纺丝膜上修饰生长因子制得，所述静电纺丝膜可参照本发明提供的方法制备，也可于市场购得本发明制备的静电纺丝膜。
本发明提供的生物补片的制备方法，包括：
步骤1：以三氟乙酸和二氯甲烷的混合物为溶液，将壳聚糖、明胶和细胞外基质溶解，制得静电纺丝溶液后，经纺丝、交联制得交联静电纺丝膜；
步骤2：在所述交联静电纺丝膜表面修饰生长因子反应，制得生物补片。
步骤2具体为，将静电纺丝膜活化后，在DMAP和NHS存在条件下，与生长因子反应，制得生物补片。
在一些实施例中，三氟乙酸和二氯甲烷的体积比为7:3~9:1。
作为优选，氟乙酸和二氯甲烷的体积比为9:1。
在一些实施例中，静电纺丝溶液中：壳聚糖的质量分数为5%；明胶的质量分数为2.5%；细胞外基质的质量分数为1%。
在本发明的实施例中，溶液中还溶解抗排斥药物。
所述静电纺丝液中抗排斥药物的质量分数为0.2‰。
在本发明的实施例中，所述纺丝的针头直径为0.7mm；正负电极之间距离为7~12cm；正负电压差为20~35kv。
作为优选，所述纺丝的针头直径为0.7mm；正负电极之间距离为7cm；正负电压差为30kv。
在本发明的实施例中，纺丝设备接收器的转速设定为100~120转/min。
作为优选，纺丝设备接收器的转速设定为120转/min。
壳聚糖静电纺丝针头的平移速度为0.2~0.5mm/s。
作为优选，壳聚糖静电纺丝针头的平移速度为0.2mm/s。
纺丝空间温度为70~90℃，湿度为40RH。
作为优选，纺丝空间温度为80℃。
连续纺丝120~180min。作为优选，连续纺丝150min。
在一些实施例中，活化的时间为12~24h；与生长因子反应的温度为0~4℃，反应时间为20~30h。
在一些实施例中，活化为将静电纺丝膜以PBS缓冲液浸泡。
作为优选，活化的时间为24h；与生长因子反应的温度为4℃，反应时间为24h。
作为优选，DMAP与NHS的质量比 1:1。
在一些实施例中，静电纺丝膜与生长因子的质量比为（3~4）：0.01。
作为优选，静电纺丝膜与生长因子的质量比为 3：0.01。
与生长因子反应后，生物补片还经过冻干和灭菌。
作为优选，灭菌采用环氧乙烷熏蒸。
实验表明，本发明提供的生物补片能够具有良好的抑菌效果，且可以作为细胞支架用于伤口的修复，或作为生物海绵吸附干细胞悬液进行伤口的修复。
因此，本发明提供的生物补片在伤口的修复中的应用。
本发明提供了静电纺丝膜及其制备的生物补片。本发明提供的静电纺丝膜由壳聚糖、明胶、细胞外基质制得，其中还可包括抗排斥药物。其可直接由纺丝制得，或经纺丝、交联后制得。在静电纺丝膜表面修饰生长因子，制得生物补丁。本发明提供的静电纺丝膜具有网格状的空间结构，纺丝粗细均匀，与羊膜结构相似。且其表面修饰生长因子后，其能够促进细胞的生长，有利于细胞的吸附且能够为细胞生长提供更加适宜的环境，从而达到更好的修复作用，能够用于皮肤、眼表等部位，具有良好的抗菌、消炎效果。
附图说明
图1-a示实施例5制得的静电纺丝膜的电镜图；
图1-b示生物羊膜的静电纺丝膜的电镜图；
图2示红外图谱；其中，线1示壳聚糖的红外光谱；线2示明胶的红外光谱；线3示实施例5制得静电纺丝膜的红外光谱；线4示实施例9制得的生物补片的红外光谱；
图3-a示光镜下实施例9制得的生物补片，25×；
图3-b示市售壳聚糖静电纺丝膜与间充质干细胞共同培养的效果，25×；
图3-c示生物羊膜与间充质干细胞共同培养的效果，25×；
图3-d示实施例5制得的静电纺丝膜与间充质干细胞共同培养的效果，25×；
图3-e示实施例9制得的生物补片与间充质干细胞共同培养的效果，25×；
图4-a示A组实验动物4天后球结膜病理检测，40×；
图4-b示A组实验动物8天后球结膜组织病理检测，40×；
图4-c示A组实验动物14天后球结膜组织病理检测，40×；
图4-d示A组实验动物28天后球结膜组织病理检测，40×；
图4-e示B组实验动物4天后球结膜病理检测，40×；
图4-f示B组实验动物8天后球结膜组织病理检测，40×；
图4-g示B组实验动物14天后球结膜组织病理检测，40×；
图4-h示B组实验动物28天后球结膜组织病理检测，40×；
图4-i示C组实验动物4天后球结膜病理检测，40×；
图4-j示C组实验动物8天后球结膜组织病理检测，40×；
图4-k示C组实验动物14天后球结膜组织病理检测，40×；
图4-l示C组实验动物28天后球结膜组织病理检测，40×。
具体实施方式
本发明提供了静电纺丝膜及其制备方法与在制备生物补片中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试剂、试材、仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
壳聚糖10g、明胶2g、纤维粘连蛋白1g，溶解于0.2 L三氟乙酸与二氯甲烷（体积比为9:1）溶液中；充分搅拌混合溶解，待完全溶解后加入0.01g的硫唑嘌呤溶解待用。
采用KH-1103型静电纺丝设备对壳聚糖静电纺丝溶液进行纺丝。壳聚糖静电纺丝溶液装填于注射器中，注射器前端的针头直径为0.7mm，将壳聚糖注射器的针头连接静电纺丝机正电极，滚筒状接收器静电纺丝机负电极，调节静电纺丝机正负电极之间的距离为7cm，正负电压差子在30kv，接收器的转速设定为120转/min，壳聚糖静电纺丝针头的平移速度为0.2mm/s，纺丝空间温度为80℃，湿度为40RH。连续纺丝150min，制得静电纺丝膜 5 g。
实施例2
壳聚糖10 g、明胶4 g、纤维粘连蛋白0.5 g、层黏连蛋白0.5 g、溶解于 0.2L三氟乙酸与二氯甲烷（体积比为7:3）溶液中；充分搅拌混合溶解，待完全溶解后加入强的松0.01 g，溶解待用。
采用KH-1103型静电纺丝设备对壳聚糖静电纺丝溶液进行纺丝。壳聚糖静电纺丝溶液装填于注射器中，注射器前端的针头直径为0.7mm，将壳聚糖注射器的针头连接静电纺丝机正电极，滚筒状接收器静电纺丝机负电极，调节静电纺丝机正负电极之间的距离为10cm，正负电压差子在20kv，接收器的转速设定为100转/min，壳聚糖静电纺丝针头的平移速度为0.3mm/s，纺丝空间温度为70℃，湿度为40RH。连续纺丝120min，制得静电纺丝膜 5.5g。
实施例3
壳聚糖10g、明胶5 g、IV型胶原蛋白1g溶解于0.2 L三氟乙酸与二氯甲烷（体积比为4:1）溶液中；充分搅拌混合溶解，待完全溶解后加入硫唑嘌呤0.01 g，溶解待用。
采用KH-1103型静电纺丝设备对壳聚糖静电纺丝溶液进行纺丝。壳聚糖静电纺丝溶液装填于注射器中，注射器前端的针头直径为0.7mm，将壳聚糖注射器的针头连接静电纺丝机正电极，滚筒状接收器静电纺丝机负电极，调节静电纺丝机正负电极之间的距离为12cm，正负电压差子在35kv，接收器的转速设定为110转/min，壳聚糖静电纺丝针头的平移速度为0.5mm/s，纺丝空间温度为90℃，湿度为40RH。连续纺丝180min，制得静电纺丝膜5.4g。
实施例4
壳聚糖10 g、明胶5 g、乙酰肝素蛋白1 g溶解于0.2 L三氟乙酸与二氯甲烷（体积比为9:1）溶液中；充分搅拌混合溶解，待完全溶解后加入环磷酰胺 0.01 g，溶解待用。
采用KH-1103型静电纺丝设备对壳聚糖静电纺丝溶液进行纺丝。壳聚糖静电纺丝溶液装填于注射器中，注射器前端的针头直径为0.7mm，将壳聚糖注射器的针头连接静电纺丝机正电极，滚筒状接收器静电纺丝机负电极，调节静电纺丝机正负电极之间的距离为8cm，正负电压差子在25kv，接收器的转速设定为120转/min，壳聚糖静电纺丝针头的平移速度为0.4mm/s，纺丝空间温度为85℃，湿度为40RH。连续纺丝160min，制得静电纺丝膜5.2 g。
实施例5
将实施例1制得的静电纺丝膜 2g与 0.025 L戊二醛水溶液（体积分数25%）置于密闭的干燥器皿中，利用戊二醛水溶液自然挥发蒸汽进行壳聚糖静电纺丝膜的交联1h。
90℃真空条件下干燥2h。
0.5mol/L的氢氧化钠乙醇溶液浸泡壳聚糖静电纺丝膜1h，进一步保持静电纺丝膜的空间结构。
蒸馏水反复清洗去掉多余的氢氧化钠等物质，100℃真空干燥，制得交联静电纺丝膜。
实施例6
将实施例2制得的静电纺丝膜2 g与0.025 L戊二醛水溶液（体积分数10%）置于密闭的干燥器皿中，利用戊二醛水溶液自然挥发蒸汽进行壳聚糖静电纺丝膜的交联3h。
70℃真空条件下干燥3h。
0.5mol/L的氢氧化钠乙醇溶液浸泡壳聚糖静电纺丝膜3 h，进一步保持静电纺丝膜的空间结构。
蒸馏水反复清洗去掉多余的氢氧化钠等物质，70℃真空干燥，制得交联静电纺丝膜。
实施例7
将实施例3制得的静电纺丝膜2 g与0.025L戊二醛水溶液（体积分数15%）置于密闭的干燥器皿中，利用戊二醛水溶液自然挥发蒸汽进行壳聚糖静电纺丝膜的交联2h。
80℃真空条件下干燥2.5h。
0.5mol/L的氢氧化钠乙醇溶液浸泡壳聚糖静电纺丝膜2h，进一步保持静电纺丝膜的空间结构。
蒸馏水反复清洗去掉多余的氢氧化钠等物质，80℃真空干燥，制得交联静电纺丝膜。
实施例8
将实施例4制得的静电纺丝膜 2g与0.025 L戊二醛水溶液（体积分数20%）置于密闭的干燥器皿中，利用戊二醛水溶液自然挥发蒸汽进行壳聚糖静电纺丝膜的交联3h。
80℃真空条件下干燥3h。
0.5mol/L的氢氧化钠乙醇溶液浸泡壳聚糖静电纺丝膜2h，进一步保持静电纺丝膜的空间结构。
蒸馏水反复清洗去掉多余的氢氧化钠等物质，100℃真空干燥，制得交联静电纺丝膜。
实施例9
将实施例5制得的交联静电纺丝膜1.5g，浸泡于PBS溶液中（pH值7.4）24h，使其表面的氨基充分活化。加入4-二甲氨基吡啶（DMAP） 0.12 g与N-羟基丁二酰亚胺（NHS） 0.12g。充分溶解后加入成纤维细胞生长因子0.005g、表皮生长因子0.005 g。利用壳聚糖静电纺丝膜表面的氨基与蛋白因子中的羧基进行缩合反应，4℃ 反应24h，将生长因子修饰在静电纺丝膜表面后，冷冻干燥、进行环氧乙烷熏蒸灭菌，制得生物补片。
实施例10
将实施例6制得的交联静电纺丝膜2g，浸泡于PBS溶液中（pH值7.4）12 h，使其表面的氨基充分活化。同时加入4-二甲氨基吡啶（DMAP）0.15 g与N-羟基丁二酰亚胺（NHS）0.15g。充分溶解后加入成纤维细胞生长因子 0.007g、血管内皮生长因子 0.007g。利用壳聚糖静电纺丝膜表面的氨基与蛋白因子中的羧基进行缩合反应，2℃ 反应20h，将生长因子修饰在静电纺丝膜表面后，冷冻干燥、进行环氧乙烷熏蒸灭菌，制得生物补片。
实施例11
将实施例7制得的交联静电纺丝膜1g，浸泡于PBS溶液中（pH值7.4）20 h，使其表面的氨基充分活化。同时加入4-二甲氨基吡啶（DMAP）0.1g与N-羟基丁二酰亚胺（NHS）0.1g。充分溶解后加入表皮生长因子 0.003g、胰岛素样生长因子0.003g。利用壳聚糖静电纺丝膜表面的氨基与蛋白因子中的羧基进行缩合反应，0℃ 反应30 h，将生长因子修饰在静电纺丝膜表面后，冷冻干燥、进行环氧乙烷熏蒸灭菌，制得生物补片。
实施例12
将实施例8制得的交联静电纺丝膜1g，浸泡于PBS溶液中（pH值7.4）18 h，使其表面的氨基充分活化。同时加入4-二甲氨基吡啶（DMAP）0.1g与N-羟基丁二酰亚胺（NHS）0.1g。充分溶解后加入 表皮生长因子0.003 g、 血管内皮生长因子0.003 g。利用壳聚糖静电纺丝膜表面的氨基与蛋白因子中的羧基进行缩合反应4℃ 反应24 h，将生长因子修饰在静电纺丝膜表面后，冷冻干燥、进行环氧乙烷熏蒸灭菌，制得生物补片。
实施例13
扫描电镜的检测：
取实施例1~12制得的静电纺丝膜样品，表面喷金、固定，以钨灯丝扫描电子显微镜（S-3800，日立公司）观察静电纺丝膜纤维表面形貌。其中，对实施例5制得的静电纺丝膜的电镜图如图1-a所示，其他实施例制得的静电纺丝膜的空间结构与此相似。可见，本发明实施例制得的静电纺丝膜具有空间立体网状结构，与生物羊膜空间结构（图1-b）相似，纺丝直径均匀（0.1~0.5μm）纳米纤维。
实施例14
红外图谱检测：
对实施例5~8制得的交联静电纺丝膜和实施例9~12制得的生物补片进行红外图谱检测。其中，对实施例5制得静电纺丝膜和实施例9制得的生物补片的红外图谱如图2红外图谱所示，其中，线1示壳聚糖的红外光谱，线2示明胶的红外光谱，线3示实施例5制得静电纺丝膜的红外光谱（实施例6~8制得的静电纺丝膜的红外光谱与此相似）；线4示实施例9制得的生物补片的红外光谱（实施例10~12制得的生物补片的红外光谱与此相似）。如线4，细胞因子与壳聚糖上的氨基进行缩合反应形成酰胺键。
检测结果表明，壳聚糖在3413cm-1、2875 cm-1、1655 cm-1、1376cm-1、1049 cm-1等处具有明显的吸收峰。3400 cm-1、2862 cm-1为壳聚糖环上的碳氢键、羟基的吸收峰，本研究用的壳聚糖的脱乙酰度为95%左右，在红外图谱上可以观察到酰胺键的吸收峰在1646 cm-1、1382 cm-1处,1049 cm-1处的吸收峰为糖环上的碳氧键吸收峰。
本发明制得的生物补片在3413cm-1、2875 cm-1、1648 cm-1、1378cm-1、1070 cm-1处具有明显的吸收峰。保持与壳聚糖明胶的基础吸收峰，并且酰胺键的吸收峰变得扁平，峰面积较大，可以断定生物因子与壳聚糖进行的缩合反应形成酰胺键。
实施例15
琼脂扩散抑菌实验，以实施例5制得的静电纺丝膜与生物羊膜（直径5mm）探讨生物膜膜片对大肠杆菌与金黄色葡萄球菌的抑制作用。结果如表1所示：
注：--示未见抑菌效果
结果显示，本发明实施例制得的生物补片或静电纺丝膜皆具有良好的抑菌效果。
实施例16
静电纺丝膜干细胞培养：
实施例5~12制得的静电纺丝膜，实验以市售壳聚糖静电纺丝膜为对照。分别将膜平铺于6cm培养皿底部，加入2mL无血清DMED培养，细胞培养箱孵育48h，接种间充质干细胞前2h去掉浸泡培养基。间充质干细胞制备成4×108L-1的细胞悬液，2mL的细胞悬液缓慢滴加于培养皿静电纺丝膜的表面，孵育2h的后添加3mL10%小牛血清的DMEM培养基继续培养，每天更换10%小牛血清的DMEM培养基连续培养10天，每天对静电纺丝陪细胞培养进行观察。结果如图3所示：光镜下，实施例9制得的生物补片具有网格状的空间结构，纺丝粗细均匀(图3-a)，市售壳聚糖静电纺丝膜上生长的干细胞数量较少（图3-b），经统计为7×105 个/cm2，生物羊膜上细胞附着数量丰富，生长状态良好（图3-c），经统计为 8.3×105个/cm2；实施例5制得的静电纺丝膜上细胞数量较丰富，生长状态良好（图3-d），经统计为9.8×105个/cm2；实施例9制得的生物补片上细胞数量丰富（图3-e），经统计为9×105个/cm2，且生长状态良好，与生物羊膜效果相当。
实施例17
选择健康无眼病新西兰白兔作为实验对象，体重2.5~3kg，30只，雌雄不限，由中国北方眼科疾病动物平台（辽宁何氏医学院）提供，右眼选为实验眼，以0.2 ml/kg的剂量肌肉注射速眠新Ⅱ进行麻醉，盐酸奥布卡因滴眼液表面麻醉，碘伏冲洗结膜囊，手术切除外直肌与上直肌间约1/4项限4mm×5mm巩膜缘组织，其前界达到角膜透明区内0.5-1mm，后界达到角巩膜沟后1.0~1.5mm，深0.2~0.4mm，棉签蘸取0.5mol/L的氢氧化钠溶液（1ml）处理角膜缘透明区域，制备球结膜损伤实验动物模型。
A组模型动物空白组；常规手术方法切除4mm×5mm巩膜缘组织，缝合四角结膜与浅巩膜固定球结膜损伤处，作为伤口的标记；
B组冻干羊膜治疗组；实验方法与A组相同，术中冻干羊膜5mm×6mm平铺于伤口处，膜四周垫付于结膜下，缝合四角结膜、生物羊膜与浅层巩膜固定冻干羊膜（生物羊膜由上善医疗器械有限公司提供）；
C组本发明生物补片治疗组。实验方法与A组相同，术中采用实施例9制备的生物补片5mm×6mm平铺于手术伤口处，膜的四周垫付于结膜下，四角缝合结膜、静电纺丝膜与浅层巩膜固定静电纺丝膜。
如图4所示，术后4、8、14、28天分别取材进行常规病理检测：A组实验动物可以观察到球结膜术后，球结膜于眼球后部缓慢向角膜方向生长，28天后角膜缘附近生有大量的瘢痕组织（HE，×40）（图4-a~图4-d）；B组实验动物可以观察到球结膜术后，球结膜修复快速，球结膜上皮生长不完整，修复速度较单纯手术恢复的快，同时瘢痕化较轻（HE，×40）（图4-e~图4-h）；C组实验动物可以观察到球结膜术后，球结膜修复迅速，大量的组织沿着生物补片生长，28天后球结表面较为光洁，很大程度上促进球结膜的修复，抗瘢痕化作用强（HE，×40）（图4-i~图4-l）。
说明：本发明制备的生物补片具有支撑组织生长的能力，促进球结膜术后快速修复，为修复提供良好的细胞支架，修复组织较平整，瘢痕化增殖较少，为球结膜的修复提供一种良好的组织敷料。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (12)
1.用于制备生物补片的静电纺丝膜，其特征在于，由壳聚糖、明胶和细胞外基质制得；所述壳聚糖与明胶的质量比为（3~5）：（1~5）；所述细胞外基质的质量分数为0.5%~1%；
所述静电纺丝膜具有空间立体网状结构，其制备方法为：
以三氟乙酸和二氯甲烷的混合物为溶液，将壳聚糖、明胶和细胞外基质溶解，制得静电纺丝溶液后，经纺丝、交联制得交联静电纺丝膜；
所述纺丝的针头直径为0.7mm；正负电极之间距离为7cm~12cm；正负电压差为20kv~35kv。
2.根据权利要求1所述的静电纺丝膜，其特征在于，所述原料还包括抗排斥药物，所述抗排斥药物的质量分数为0.2‰~2‰。
3.权利要求1所述静电纺丝膜的制备方法，其特征在于，
以三氟乙酸和二氯甲烷的混合物为溶液，将壳聚糖、明胶和细胞外基质溶解，制得静电纺丝溶液后，经纺丝、交联制得交联静电纺丝膜；
所述纺丝的针头直径为0.7mm；正负电极之间距离为7cm~12cm；正负电压差为20kv~35kv。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述静电纺丝溶液中：
壳聚糖的浓度为50 g/L；
明胶的浓度为10g/L~25g/L；
细胞外基质的浓度为5 g/L。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述交联的交联剂为戊二醛；所述交联时间为1~3h。
6.权利要求1或2所述的静电纺丝膜在制备生物补片中的应用。
7.一种生物补片，其特征在于，由权利要求1所述的静电纺丝膜表面修饰生长因子制得。
8.根据权利要求7所述的生物补片，其特征在于，所述细胞外基质的质量分数为0.5%~1%；所述生长因子的质量分数为1‰~3‰。
9.根据权利要求8所述的生物补片，其特征在于，其中还包括抗排斥药物，所述抗排斥药物的质量分数为0.2‰~2‰。
10.权利要求7~9任一项所述的生物补片的制备方法，其特征在于，包括：
步骤1：以三氟乙酸和二氯甲烷的混合物为溶液，将壳聚糖、明胶和细胞外基质溶解，制得静电纺丝溶液后，经纺丝、交联制得交联静电纺丝膜；
步骤2：在所述交联静电纺丝膜表面修饰生长因子，制得生物补片。
11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，步骤2具体为，将交联静电纺丝膜活化后，在DMAP和NHS存在条件下，与生长因子反应，制得生物补片。
12.权利要求7~9任一项所述的生物补片在制备伤口修复材料中的应用。
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| CN101804218A (zh) * | 2010-04-13 | 2010-08-18 | 王艳 | 含有云南白药或者云南白药提取物的人体可吸收外伤敷料 |
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