CN105233336A - 丝胶蛋白神经导管及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种丝胶蛋白神经导管及其制备方法与应用。本发明提供的丝胶蛋白神经导管成分为丝胶蛋白，其制备方法包括：采用丝素缺失型突变品种家蚕的蚕茧作为原料，将其粉碎并经紫外线或乙醇灭菌，然后使用LiBr或LiCl水溶液进行丝胶蛋白的提取，将提取物制成浓度为0.5～20wt％的丝胶蛋白水溶液；在丝胶蛋白水溶液中加入共价交联剂，混匀后注入模具中成型，得到丝胶蛋白神经导管半成品，共价交联剂的使用量为每1毫升丝胶蛋白水溶液加入2～500μL浓度为0.1～50wt％的共价交联剂；将丝胶蛋白神经导管半成品冷冻干燥，得到丝胶蛋白神经导管。本发明提供的丝胶蛋白神经导管具有良好生物活性和生物相容性，可在体内自然降解并促进长距离损伤的外周神经再生。

Description

丝胶蛋白神经导管及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种丝胶蛋白神经导管及其制备方法与应用，属于医学生物材料领域。

背景技术

外周神经损伤是较为常见的疾病，通常由交通事故、自然灾害、战争等导致的创伤以及肿瘤切除、先天畸形等原因造成，约有2.8％的创伤病可导致外周神经损伤，造成神经断裂。外周神经损伤通常导致病人的感觉和运动功能障碍，致残率高，严重影响病人的生活质量，给家庭、社会带来巨大的经济负担。

外周神经损伤治疗原则是尽可能早地恢复神经的连续性，目前的治疗方法主要有自体神经移植、异体神经移植、断端无张力直接缝合和组织工程方法。其中，自体神经移植修复效果较好，但有以下弊端：Ⅰ)截取供体神经既带来副损伤，又会导致供体神经支配的区域感觉缺失；Ⅱ)供体限制取材的长度；Ⅲ)在截取供体神经的位置还可能因此形成神经瘤而需要再次手术。异体神经移植存在免疫排斥反应等问题。而断端无张力直接缝合的治疗方法通常会导致神经瘤或瘢痕组织的形成从而阻碍神经的修复，并且仅局限于<5mm的短距离外周神经损伤。

相比之下，运用组织工程方法修复外周神经损伤是较理想的治疗方法，也是目前外周神经损伤与再生的研究重点。组织工程方法主要是利用神经导管连结损伤神经的两个断端，并促使神经细胞在神经导管上粘附、增殖、迁移和定向排列，从而诱导神经再生，达到恢复神经连续性的目的。

制备神经导管的材料可使用如聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚L-乳酸(PLLA)、聚苯醚(PPE)、聚乙交己内酯(PGCL)和聚甲基丙烯酸羟乙酯-甲基丙烯酸甲酯(PHEMA-MMA)等人工合成材料。然而，采用人工合成材料制备神经导管的工艺比较复杂，产品价格昂贵，且部分材料降解产物对人体具有毒副作用(如PLGA等降解产物为酸性)。

或者，也可以采用如海藻酸盐、壳聚糖、胶原和丝素等等的天然材料制备神经导管，其具有良好的生物相容性，对人体无毒副作用。但这类材料性能不稳定，因宿主酶环境的变化而不易其调节降解性能，且其机械加工性能较差，难以实现规模化生产；此外，上述天然材料制作的神经导管对于短距离的神经损伤(利用大鼠作为动物模型，10mm及以下的神经损伤)具有较好的恢复效果，而对于长距离神经损伤(利用大鼠作为动物模型，超过15mm的神经损伤)在结构和功能方面的恢复均不够理想，难以达到与自体神经移植相当的水平。

发明内容

本发明提供一种丝胶蛋白神经导管，具有良好生物活性和生物相容性，能促进神经细胞粘附、增殖、迁移和定向排列，可以在体内自然降解并促进长距离损伤的外周神经再生，同时所述丝胶蛋白神经导管具有优良的物理机械性能。

本发明还提供一种上述丝胶蛋白神经导管的制备方法，工艺简单，成本低廉，同时有利于产品的质量控制以及大规模生产。

本发明还提供了上述丝胶蛋白神经导管在制备神经移植物中的应用。

本发明首先提供一种丝胶蛋白神经导管，其成分为丝胶蛋白。丝胶蛋白是包裹在丝素纤维表层的一种天然大分子蛋白，具有良好的生物相容性和生物降解性，可在修复完成后完全降解，且降解产物为氨基酸(主要为丝氨酸、天冬氨酸和甘氨酸)，降解产物不仅对机体无毒，能被机体代谢，且具有神经营养作用。本发明人研究发现丝胶蛋白具有支持神经细胞的黏附、增殖、迁移与生长等特性，是用于神经修复的理想生物材料。

进一步地，本发明提供的丝胶蛋白神经导管是采用丝素缺失型突变品种家蚕的蚕茧作为原料提取丝胶蛋白，并经共价交联剂交联成型后获得的。其中，家蚕丝素缺失型突变品种蚕茧可以购自中国农业科学院蚕业研究所，该类品种资源保存于中国农业科学院蚕业研究所国家蚕资源保存中心。

由于丝胶蛋白优异的生物相容性和生物活性，该丝胶蛋白神经导管尤其可应用于长距离外周神经损伤的修复与再生。例如该丝胶蛋白神经导管的尺寸可为：内径1～3mm，管壁厚0.5～1mm，长度15～30mm。

本发明还提供了一种上述丝胶蛋白神经导管的制备方法，包括以下步骤：

采用丝素缺失型突变品种家蚕的蚕茧作为原料，将其粉碎并经紫外线或乙醇灭菌，然后使用LiBr或LiCl水溶液进行丝胶蛋白的提取，将提取物制成浓度为0.5～20wt％的丝胶蛋白水溶液；

在所述丝胶蛋白水溶液中加入共价交联剂，混匀后注入模具中成型，得到丝胶蛋白神经导管半成品，所述共价交联剂的使用量为每1毫升丝胶蛋白水溶液加入2～500μL浓度为0.1～50wt％的共价交联剂；

将所述丝胶蛋白神经导管半成品冷冻干燥，得到所述丝胶蛋白神经导管。

其中，粉碎为可以采用剪刀将蚕茧剪碎或其他能使其破碎的方法。灭菌方法可采用紫外照射法，把蚕茧粉碎成1mm²左右，用紫外线分别照射正反面至少5min；或者采用乙醇浸泡法，将蚕茧粉碎成1mm²左右，用70％～80％体积浓度的乙醇至少浸泡5min，在3500r/min条件下离心5分钟，去掉乙醇；还可以将上述紫外照射法和乙醇浸泡法联合应用，先用紫外线照射正反面，再用乙醇浸泡，然后离心去掉乙醇。上述三种方法均可达到满意的灭菌效果。

进一步地，制取所述丝胶蛋白水溶液的方法包括：

1)采用丝素缺失型突变品种家蚕的蚕茧作为原料，将其粉碎并灭菌，在25～50℃，采用浓度为6～8mol/L的LiBr或LiCl水溶液，在25～50℃进行提取处理5～24小时，每克蚕茧碎片采用20～100mL6～8mol/L的LiBr或LiCl水溶液进行提取；

2)将步骤1)得到的提取物离心，去除不溶性物质，得到澄清溶液；

3)向步骤2)得到的澄清溶液中加入0.5-3mol/L、pH8.0～11.0的Tris-HCl缓冲液，并在超纯水中进行透析；

4)将步骤3)得到的透析液离心去除沉淀，浓缩得到浓度为0.5～20wt％的丝胶蛋白水溶液。在本发明的一个实施例中，可使所述丝胶蛋白水溶液的浓度为1.5～15.0wt％，以取得更好的交联效果

上述丝胶蛋白水溶液的制备过程在无菌环境中操作，所用原料和设备均经灭菌处理，例如，所用的超纯水、透析袋用前均采用高压灭菌，所用的LiBr水溶液、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)、交联剂均经过0.22um滤器过滤除菌，乙醇为经过亲水性0.22um滤器过滤后，用灭菌的超纯水配置而成。

上述共价交联剂可选择戊二醛、丙二醛和京尼平等中的一种或多种。例如，本发明的一个实施例中可使用浓度为0.1～25wt％的京尼平。

进一步地，在所述丝胶蛋白水溶液中加入所述共价交联剂，混匀后注入模具，在4～45℃下维持至少5秒使之成型，得到丝胶蛋白神经导管半成品。在一个具体实施方式中，可将其置于室温下5～15秒成型。在此过程中，丝胶蛋白在交联剂的作用下发生交联反应，得到丝胶蛋白神经导管半成品。

为了利于增加神经导管的孔隙度，可将丝胶蛋白神经导管半成品冷冻干燥之前，在零度以下冷冻成型，例如，置于-20℃至-190℃下(一般可以置于液氮中)冷冻至少4小时，可更有利于负载生长因子和药物等。

上述丝胶蛋白神经导管(尺寸可通过模具的选择而控制)，例如可以制成内径1～3mm，管壁厚0.5～1mm，长度为15～30mm的神经导管，以适应不同程度的外周神经损伤。获得的神经导管应在无菌条件下保存。

在一个具体实施方式中，丝胶蛋白神经导管的制备方法具体可包括以下步骤：

1)称取家蚕丝素缺失型突变品种蚕茧，并将其剪成1mm²碎片，清洗3次，去除水分，先把蚕茧铺在一个无菌平板上，用紫外线照射五分钟后，用另一个无菌平板覆盖在其上面，然后反过来，拿掉起始的无菌平板暴露出蚕茧碎片的另一面用紫外线再照射五分钟，或者可以用镊子将蚕茧碎片逐个翻面，实现用紫外线分别照射正反面各5分钟；

2)将步骤1)的蚕茧碎片浸泡于无菌的浓度为约6mol/L的LiBr或LiCl水溶液中(每克蚕茧碎片加入55mL的LiBr或LiCl水溶液)充分浸泡后(必要时进行搅拌)，置于35℃水浴24小时左右，使原料中的丝胶蛋白被提取并溶解于LiBr或LiCl水溶液；

3)然后将步骤2)中的提取物在3500r/min离心，分离去除不溶性物质，得到澄清的溶液；

4)向步骤3)得到的澄清溶液中加入四分之一体积无菌的1mol/L，pH9.0的Tris-HCl缓冲液，并将其进行透析，得到丝胶蛋白水溶液；

5)将步骤4)得到丝胶蛋白水溶液离心去除沉淀，浓缩得到为0.5～20wt％的丝胶蛋白水溶液，优选浓度为1.5～15wt％，置于4℃保存备用；

6)向步骤5)得到的丝胶蛋白水溶液中加入无菌京尼平，加入量为每1ml丝胶蛋白水溶液中加入0.33ml浓度为1wt％的京尼平，充分混匀后注入无菌模具中，置于室温30分钟，得到丝胶蛋白神经导管半成品；

7)将制成的丝胶蛋白神经导管半成品放入无菌平皿中，再置于-80℃冷冻4小时。

8)将7)中冷冻后导管，放入冷冻真空干燥机中，在零度以下过夜冻干，冻干后得到的导管从模具中取出。

本发明还提供上述丝胶蛋白神经导管在制备神经移植物中的应用。本发明提供的丝胶神经导管可用于制备体内可降解移植物，促进外周神经系统损伤修复与再生，可用于搭载细胞、药物以及细胞因子等，用于外周神经损伤修复与再生，尤其适用于长距离(≧15mm)外周神经损伤的修复。

本发明有益效果在于：

1、本发明提供的丝胶蛋白神经导管具有良好的生物相容性，能够支持神经细胞存活和增殖、促进神经细胞迁移和定向排列，从而可以引导神经再生，并促进外周神经损伤的修复，尤其适用于长距离(≧15mm)外周神经损伤的修复。

2、按照本发明方法制成的上述丝胶蛋白神经导管还具有孔隙多、比表面积大的特点，具有良好的药物或细胞因子缓释能力，丝胶蛋白神经导管可以搭载细胞因子或者药物，使其缓慢释放，以促进神经损伤的修复和再生。

3、本发明提供的丝胶蛋白神经导管在损伤神经修复完成后可以完全降解。降解产物为氨基酸，不仅对机体无毒无害，还能被代谢并具有神经营养作用。

4、本发明提供的上述丝胶蛋白神经导管还具有良好的机械性能，如强度和柔韧性，在体内不会对组织造成过度挤压，同时方便与神经断端进行手术缝合。

5、本发明提供的上述丝胶蛋白神经导管制备工艺简单，成本低廉，同时有利于产品的质量控制以及大规模生产。

6、本发明采用丝素缺失型突变品种家蚕的蚕茧作为原料提取丝胶蛋白，并经交联成型后获得丝胶蛋白神经导管，首次将纯丝胶蛋白应用于外周神经修复和再生领域。

附图说明

图1为无菌丝胶蛋白水溶液在LB培养基中的摇菌图。

图2为无菌丝胶蛋白水溶液在DMEM培养基中培养的效果图。

图3为无菌丝胶蛋白水溶液形成水凝胶效果图。

图4为本发明实施例制备的丝胶蛋白神经导管的外观图。

图5为本发明实施例制备的丝胶蛋白神经导管的横截面及外表面的扫描电镜图片。

图6为本发明实施例制备的丝胶蛋白神经导管吸水膨胀率随时间的变化曲线。

图7为本发明实施例制备的丝胶蛋白神经导管的傅氏转换红外线光谱分析。

图8为实验组和对照组中施万细胞的增殖情况对比。

图9A为实验组和对照组中施万细胞表达神经营养因子(NGF)的情况对比；图9B为实验组和对照组中施万细胞表达神经胶质细胞源性的神经营养因子(GDNF)的情况对比。

图10为大鼠坐骨神经离断模型第4周神经再生宏观图。

图11为大鼠坐骨神经离断模型第4周再生神经S100染色图，红色荧光为S100，蓝色荧光为DAPI，标尺为40微米。

图12为大鼠坐骨神经离断模型第4周再生神经β3-微管蛋白染色图，红色荧光为β3-微管蛋白，蓝色荧光为DAPI，标尺为40微米。

图13为大鼠坐骨神经离断模型第4周腓肠肌细胞直径统计。

图14为本发明实施例制备丝胶蛋白神经导管的流程示意图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明以家蚕丝素缺失型突变品种蚕茧为原料，首次应用无菌抽提的方法，采用溴化锂(LiBr)或氯化锂(LiCl)提取法成功提取纯丝胶蛋白，并利用化学交联和冷冻抽干的方式，成功地制备了具有较好的生物相容性和细胞粘附性能、多孔隙结构、良好的机械性能和稳定性、可降解性并且降解产物对机体无毒无害的能被机体代谢的具有神经营养作用的神经导管。

本发明提供的丝胶神经导管可用于制备体内的可降解的移植物促进外周神经系统损伤修复与再生。可用于搭载各种干细胞(如皮肤源性干细胞SKPs、骨髓间充质干细胞MSCs等)、神经细胞(如施万细胞)，亦可搭载药物以及细胞因子(神经生长因子NGF、脑源性神经营养因子BDNF等)，用于外周神经损伤修复与再生。

实施例1丝胶蛋白神经导管的制备

1、蚕茧的选择:

选用家蚕丝素缺失突变品种的蚕茧(购于中国农业科学院蚕业研究所，该家蚕丝素缺失突变品种保存于中国农业科学院蚕业研究所国家蚕资源保存中心，保藏编号(或商品编号)185Nd-s,140Nd-s,139Nd-s)为原材料，主要的化学成分为：丝胶蛋白。

2、丝胶的提取与分离

图14为本发明实施例制备丝胶蛋白神经导管的流程示意图，具体步骤为：

1)分别称取家蚕丝素缺失突变品种的蚕茧1g并剪成1mm²左右的碎片，置于6个洁净的烧杯中，作为样品A1、A2、A3、B1、B2、B3。将上述6个样品分别用超纯水清洗3次，3500r/min离心5分钟去除水分。

在无菌环境中，将样品A1、A2、A3分别经紫外照射正反面5分钟，10分钟，15分钟；将样品B1、B2、B3使用75％酒精分别浸泡5分钟，10分钟，15分钟，然后在3500r/min下离心5分钟去掉酒精后备用。

2)以下步骤对各样品(A1、A2、A3、B1、B2、B3)的处理相同。具体为，向灭菌后的样品A1、A2、A3、B1、B2、B3中分别加入55mL的浓度为6mol/L的LiBr水溶液，将烧杯放入恒温水浴锅内35℃水浴24小时，溶解丝胶蛋白；

3)将步骤2)得到的提取物转入离心管内3500r/min离心5分钟，去除不溶性物质，得到澄清的溶液；

4)向步骤3)得到的澄清溶液中加入四分之一体积的Tris-HCl缓冲液(1mol/L，pH9.0)；

5)将步骤4)中获得的溶液转入到预处理好的透析袋(MWCO3500)中，然后放置于含有超纯水的烧杯中；将该烧杯置于搅拌器上慢速搅拌透析，每隔2小时换一次水，共透析24小时；

6)将步骤5)中获得的透析液转到离心管中，3500r/min离心5分钟，去除沉淀；

7)将步骤6)获得的溶液再装入到透析袋中并将透析袋两端用夹子夹紧，再将透析袋置于质量百分浓度为20％的PEG6000溶液(使用前经高压灭菌)中浓缩，将丝胶蛋白水溶液浓缩到需要的浓度为止。

3、丝胶蛋白水溶液灭菌效果及成胶性能分析

1)37℃LB(Luria-Bertani)培养基摇菌实验

37℃条件下，将上述步骤7)中的丝胶蛋白水溶液置于LB培养基中摇菌24小时，培养基均澄清，如图1所示，未有细菌生长，说明紫外照射(样品A1、A2、A3)与乙醇浸泡(样品B1、B2、B3)均达到了杀灭细菌效果。

2)DMEM(Dulbecco'sModifiedEagle'sMedium)高糖培养基

将上述步骤7)中的丝胶蛋白水溶液置于DMEM高糖培养基，于37℃细胞培养箱培养1月，培养基澄清，如图2所示，未有细菌及真菌生长，说明紫外照射(样品A1、A2、A3)与乙醇浸泡(样品B1、B2、B3)的灭菌方法达到了杀灭细菌效果。

3)成胶实验

如图3所示，向上述步骤7)中的丝胶蛋白水溶液加入质量浓度为1％的京尼平水溶液，室温放置30分钟，形成水凝胶。说明无论是紫外照射法还是乙醇浸泡法提取的无菌丝胶蛋白水溶液都能够形成水凝胶。

4)实验结论：

采用紫外照射或者乙醇浸泡抽提丝胶的方法，能够得到无菌的丝胶蛋白水溶液，并且所提取的丝胶蛋白水溶液均具有良好的成胶性能。

4、丝胶蛋白神经导管的制备

1)取上述无菌丝胶蛋白水溶液置于6个洁净烧杯中，两个为一组用超纯水分别调整到浓度13wt％、9wt％、5wt％；

2)每种浓度取一个样品加入京尼平水溶液，加入量为每1mL丝胶蛋白水溶液中加入0.33ml质量浓度为1％的京尼平水溶液，充分混匀后注入无菌模具中，在4～45℃下反应5秒～36小时，得到丝胶蛋白神经导管半成品，将2)中得到的丝胶蛋白神经导管半成品放入无菌培养皿中，放入-80℃冷冻4小时，再放入冷冻真空干燥机中过夜冻干，冻干后从模具中取出得到无菌丝胶蛋白神经导管，分别为样品D1，D2，D3，其外观如图4所示(标尺为5毫米)；

3)剩余三个烧杯分别加入0.01ml25％(v/v)的戊二醛溶液，与上述处理相同，分别得到样品C1，C2，C3，其外观如图4中所示(标尺为5毫米)。

由图4可知，应用京尼平和戊二醛两种交联剂均可以使不同浓度的丝胶蛋白水溶液液交联，并制备成适当规格的丝胶导管。

实施例2丝胶蛋白神经导管性能分析

对实施例1中制备的丝胶蛋白神经导管(样品D1)进行以下性能分析，具体为：

1、宏观结构

使用选定的模具，使得到的丝胶蛋白神经导管被制备成内径1.5mm，壁厚0.75mm，长度为20mm的中空导管结构。

2、微观结构。

在扫描电子显微镜(ULTRAPLUS-43-13，Zeiss,德国产)下观察丝胶蛋白神经导管。如图5所示，A和B为丝胶蛋白神经导管横截面的SEM图，标尺分别为500微米和100微米，导管内部为多空隙结构，孔径平均值为42.24μm，能够很好地支持细胞生长和促进营养物质和代谢物质的交换；图5中，C和D为丝胶蛋白神经导管表面的SEM图，标尺分别为200微米和100微米，可以看见其表面空隙较小，平均孔径为13.15μm，可以有效避免结缔组织长入导管中。

3、力学性能

利用微型万能测试机(Instron5848MicroTester，Instron,USA)在常温下测试丝胶蛋白神经导管的力学性能。测得丝胶蛋白神经导管的弹性模量为8.78±0.94MPa。与已报道的材料相比(例如乳酸己内酯共聚物的弹性模量为1.19±0.25MPa，聚甲基丙烯酸2-羟乙酯的弹性模量为191±7KPa)，该丝胶蛋白神经导管具有足够强的机械性能能够支持神经的再生。

4、膨胀率

将丝胶蛋白神经导管冻干后，浸泡于与体内pH近似的磷酸盐缓冲溶液(pH7.4)中，在不同时间点取出，按以下公式测定其吸水膨胀率(其中W_s为膨胀状态下的重量，W_d为干重)。

实验结果如图6所示，由图6可知，在浸入PBS溶液24小时之后，丝胶蛋白神经导管膨胀了12.4倍，48小时之后趋于稳定，在15倍左右，能够适用于体内环境。

5、孔隙率

将丝胶蛋白神经导管冻干后称重记为M₀，测量其体积记为V_m，浸泡到无水乙醇中24小时后，称重记为M_t，根据以下公式计算丝胶蛋白神经导管的孔隙率(无水乙醇密度ρ＝0.789g/cm³)

实施例1中制备的丝胶蛋白神经导管孔隙率为84.82％，含有比较多的孔径，有利于细胞因子的包埋以及细胞的搭载。

6、红外光谱分析

利用傅里叶变换红外光谱仪(Nexus,ThermalNicolet,USA)分别测定交联前后的丝胶蛋白在4000–650cm^-1的特征峰，谱图如图7所示。

图7中可见交联前丝胶蛋白独特的酰胺Ⅰ峰(1600-1690cm^-1)、酰胺Ⅱ峰(1480-1575cm^-1)和酰胺Ⅲ峰(1229–1301cm^-1)；交联后，丝胶蛋白的酰胺Ⅰ峰从1654cm^-1转换到1648cm^-1，即交联后丝胶蛋白的二级结构大部分没有改变，仅发生了从α螺旋到无规则卷曲的转变，交联后的丝胶蛋白保持了原有的生物活性和生物相容性，有利于神经损伤的修复。

实施例3丝胶蛋白支持神经细胞存活和增值能力的评估

实验组：使用实施例1中提取的无菌丝胶蛋白水溶液直接加到细胞孔板中，在-80℃下冷冻4小时，然后放入真空冷冻干燥机中冻干，得到冻干的丝胶蛋白支架；将从细胞培养瓶收集的大鼠施万细胞(RSC96)经悬浮，吹散，种植于铺有冻干丝胶支架的细胞培养板上。细胞培养所用培养基为DMEM(Dulbecco'sModifiedEagle'sMedium)培养基，细胞放于细胞培养箱(37℃，CO₂浓度为5％，湿度为100％)中培养。

对照组为直接将细胞种植于普通孔板上。

如图8所示，在种植后，采用CCK-8方法检测细胞在种植1，3，5和7天后细胞的增殖情况。由图8可知，大鼠施万细胞(RSC96)的数量随时间增长，因此冻干的丝胶蛋白支架能够支持RSC96细胞存活和增殖，其效果与成熟的细胞培养方式(对照组)较为接近，并优于现有技术中的生物医学材料支持RSC96细胞存活和增殖的效果。

在种植后24小时和48小时后，用Triozl裂解细胞做实时荧光聚合酶链反应，通过mRNA水平来检测施万细胞表达神经营养因子的情况。图9A为实验组和对照组中施万细胞表达神经营养因子(NGF)的情况对比。图9B为实验组和对照组中施万细胞表达神经胶质细胞源性的神经营养因子(GDNF)的情况对比。

如图9A和9B所示，与对照组相比，实验组的GDNF与NGF两种细胞因子mRNA表达情况显著上调，说明丝胶蛋白有促进施万细胞表达GDNF与NGF两种神经营养因子的能力。

因此，丝胶支架具有支持RSC96细胞存活和增殖的能力，促进施万细胞表达GDNF和NGF，从而能够促进神经的再生。

实施例4丝胶蛋白神经导管修复神经能力的评估

选取30只200-250g的SD大鼠，平均分成三个组：自体神经移植组、丝胶蛋白神经导管移植组和硅胶导管移植组。按照每100g注射0.3ml10％水合氯醛的剂量将30只大鼠麻醉后，取右侧卧位，暴露右后肢坐骨神经，并将坐骨神经离断20mm。自体神经组移植截取下来的20mm坐骨神经，丝胶蛋白神经导管组移植丝胶蛋白神经导管，硅胶导管组移植硅胶导管，然后用7-0尼龙线进行缝合。其中，丝胶蛋白神经导管与硅胶导管都是内径1.5mm，壁厚0.75mm，长20mm。

图10为大鼠坐骨神经离断模型第4周神经再生宏观图，左图是硅胶导管移植组，没有神经连接两端；中图和右图是丝胶蛋白神经导管移植组和自体神经移植组，均有神经长出连接两端。

在移植神经导管和自体神经移植4周之后，丝胶蛋白神经导管移植组和自体神经移植组做S100和β3-微管蛋白免疫组化染色，S100为成熟施万细胞表面标志，β3-微管蛋白为神经轴突微管的标志，结果分别如图11和图12所示。自体神经移植组和丝胶蛋白神经导管组再生神经都出现大量施万细胞和神经轴突微管结构，说明自体神经移植组和丝胶蛋白神经导管移植组都能促进神经再生。

在移植神经导管和自体神经移植4周之后，取坐骨神经支配的腓肠肌做马松染色统计肌纤维直径，评估肌纤维萎缩情况。如图13所示，自体移植组肌纤维直径最大，丝胶蛋白神经导管组次之，硅胶导管组最小，说明丝胶蛋白神经导管移植组和自体神经移植组均成功的再生神经减小腓肠肌细胞的萎缩。

综上，在大鼠坐骨神经离断20mm模型中，丝胶蛋白神经导管移植组的大鼠坐骨神经离断后第4周神经成功再生，说明丝胶蛋白神经导管能够促进坐骨神经的再生。第4周时再生的神经具有大量的施万细胞，并且有神经微管的形成，说明丝胶蛋白神经导管具有良好的诱导长距离损伤外周神经再生的能力。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (11)

1.一种丝胶蛋白神经导管，其成分为丝胶蛋白。

2.根据权利要求1所述的丝胶蛋白神经导管，其是采用丝素缺失型突变品种家蚕的蚕茧作为原料提取丝胶蛋白，并经交联成型后获得的。

3.根据权利要求1或2所述的丝胶蛋白神经导管，其内径为1～3mm，管壁厚为0.5～1mm，长度为15～30mm。

4.权利要求1-3任一项所述的丝胶蛋白神经导管的制备方法，其包括以下步骤：

采用丝素缺失型突变品种家蚕的蚕茧作为原料，将其粉碎并经紫外线或乙醇灭菌，然后使用LiBr或LiCl水溶液进行丝胶蛋白的提取，将提取物制成浓度为0.5～20wt％的丝胶蛋白水溶液；

在所述丝胶蛋白水溶液中加入共价交联剂，混匀后注入模具中成型，得到丝胶蛋白神经导管半成品，所述共价交联剂的使用量为每1毫升丝胶蛋白水溶液加入2～500μL浓度为0.1～50wt％的共价交联剂；

将所述丝胶蛋白神经导管半成品冷冻干燥，得到所述丝胶蛋白神经导管。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其中，制取所述丝胶蛋白水溶液的方法包括：

1)采用丝素缺失型突变品种家蚕的蚕茧作为原料，将其粉碎并灭菌，在25～50℃，采用浓度为6～8mol/L的LiBr或LiCl水溶液，在25～50℃进行提取处理5～24小时，每克蚕茧碎片采用20～100mL6～8mol/L的LiBr或LiCl水溶液进行提取；

2)将步骤1)得到的提取物离心，去除不溶性物质，得到澄清溶液；

3)向步骤2)得到的澄清溶液中加入0.5-3mol/L、pH8.0～11.0的Tris-HCl缓冲液，并在超纯水中进行透析；

4)将步骤3)得到的透析液离心去除沉淀，浓缩得到浓度为0.5～20wt％的丝胶蛋白水溶液。

6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其中，使所述丝胶蛋白水溶液的浓度为1.5～15.0wt％。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其中，将粉碎后的蚕茧原料采用紫外线照射至少5min或使用浓度为70～80wt％的乙醇浸泡至少5min进行灭菌。

8.根据权利要求4所述的制备方法，其中，所述共价交联剂为戊二醛、丙二醛和京尼平中的一种或多种。

9.根据权利要求4-8任一项所述的制备方法，其中，在所述丝胶蛋白水溶液中加入所述共价交联剂，混匀后注入模具，在4～45℃下维持至少5秒使之成型，得到丝胶蛋白神经导管半成品。

10.根据权利要求4-8任一项所述的制备方法，其中，将所述丝胶蛋白神经导管半成品冷冻干燥之前，还包括将其置于零度以下冷冻成型。

11.权利要求10所述的丝胶蛋白神经导管在制备神经移植物中的应用。