CN111467570A - 一种负载microRNA组织工程支架及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种负载microRNA组织工程支架及其制备方法。该方法包括：配置凝胶溶液，利用计算机辅助设计软件构建植入体的三维数字模型，用快速成型设备制备得到具有可控几何外形及内部规则大孔的三维支架；将支架浸泡在交联剂中交联，冷冻干燥得到干态支架。随后将支架浸泡在microRNA溶液中，通过凝胶的吸水溶胀特性吸附microRNA，得到所述负载microRNA组织工程支架。该具有诱导活性的三维多孔支架在组织工程与再生医学领域有应用前景。该方法使用先进的快速成型技术制备组织工程支架，可根据修复部位对植入体的几何外形进行个性化设计，实现精确匹配的目的，达到更好地修复效果。

Description

一种负载microRNA组织工程支架及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物医用材料制备技术领域，特别涉及一种负载microRNA组织工程支架及其制备方法。
背景技术
由创伤或病变引起的组织器官缺损或功能障碍是当今威胁人类健康和寿命的重大医学难题。目前临床采用的器官移植来源主要包括自体移植、同种异体移植和异种移植。虽然这些治疗方法已取得一定的疗效，但是仍存在来源有限、免疫排斥反应、伦理等限制，难以满足临床治疗的需求。为了解决这一难题，组织工程得以诞生和发展。简而言之，组织工程可定义为“体外构建、体内重组”，其核心思想为将细胞和生物活性因子选择性的整合到一个可降解的三维支架材料上，体外构建或原位诱导组织再生。诱导干细胞长入支架内部并分化成为特定类型的细胞是实现组织再生的关键。如何更好地将生物活性因子和三维支架协同整合，对调控干细胞行为以及诱导组织再生重建至关重要。
在空间结构上，三维支架要具有与缺失部位相匹配的几何外形，以及可支持细胞长入的内部连通孔隙结构。传统的支架制备方法，如乳液法、粒子粒滤法、相分离法、静电纺丝法等，很难满足上述需求。快速成型技术能够实现支架几何外形及内部孔隙结构的精确调控，更利于植入体的移植以及组织血管的长入。
微小RNA(microRNA)是一类近十年来新发现的进化上高度保守且具有良好稳定性的内源性非编码小分子RNA，具有转录后水平调控基因表达的功能。大量研究表明microRNA在调控机体发育和干细胞分化方面发挥着重要的作用，且特定功能的miRNA可调控干细胞向特定类型分化。相比于目前普遍使用的生长因子，microRNA结构简单、易于合成及操作、不易失活、且能特异性地从基因水平调控细胞的行为，使其成为近十年来医药领域最热门的研究方向之一。将其作为生物活性因子，负载于组织工程3D打印支架上，既能保证支架在三维空间上的空隙结构，同时还能实现生物活性因子对细胞的调控，对构建具有诱导活性的再生修复材料具有重要意义。
目前大部分miRNA用于组织再生修复的研究都还是集中在细胞水平二维层面上诱导干细胞向成骨分化，在组织水平三维层面上miRNA应用到骨组织工程中的研究还较少报道。近来，第四军医大学的陈吉华教授和密歇根大学的Peter Ma教授等人共同发表在Nature Communications的工作(Zhang X.；Li Y.；Chen Y.E.；Chen J.；Ma P.X.,Cell-free 3D scaffold with two-stage delivery of miRNA-26a to regenerate critical-sized bone defects.Nature Communication 2016,7:10376.)，他们开发了一种复合microRNA纳米颗粒的PLGA微球支架，这种携带microRNA的聚合物微球能够启动细胞的修复和骨骼生成机制，诱导创伤附近的现有细胞修补破损的骨骼，药效可以持续一个月以上，证实了负载microRNA的三维支架将来用于骨修复的巨大潜力。然而此系统中所采用的是人工合成的聚合物，相比于天然高分子，这类聚合物有力学强度不足、降解过快、降解产物为酸性产物等缺点。天然高分子由于其一般水溶性较好，可以无需与溶剂溶解的黏结剂结合，具备较好的药物负载和释放能力，能较好的保留药物活性，具有生物相容性好，利于细胞黏附、增殖和分化等优点，被开发做组织工程支架更有潜力。
发明内容
本发明的目的在于针对现有组织工程支架三维结构和诱导活性方面的不足，提供一种负载microRNA组织工程支架及其制备方法。
本发明将快速成型技术和microRNA技术相结合，制备一种新型具有诱导活性的组织工程支架。该支架不仅具有精确可控的外形和内部连通孔结构，有利于营养物质和代谢废物的运输，促进细胞的黏附和长入；同时还具有良好的载药释药性能，有利于microRNA的负载与释放，使其充分发挥调控基因表达及细胞行为的功能，提高组织工程支架的诱导活性和修复能力。
本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。
一种负载microRNA组织工程支架，所述支架具有规则三维连通大孔结构，并具有负载microRNA的载药性能；所述的规则三维连通孔结构基体利用快速成型技术制备；microRNA的负载通过支架材料——水凝胶的吸水溶胀特性实现。
本发明提供的负载microRNA组织工程支架的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)制备具有规则三维连通孔结构的支架基体：
首先，利用医学成像技术获得病患缺损部位的几何外形，并利用计算机辅助设计软件(CAD)进行重建，获得与缺损部位几何外形精确匹配的植入体的三维数字模型(CAD模型)，进一步利用三维建模软件将三维数字模型转化为快速成型设备可识别的STL等格式文件。通过分层软件对模型进行分层处理，设计打印每层的层厚。随后用快速成型设备的系统软件设计挤出纤维的间距、每层纤维的排列方式等参数，这些参数决定的了支架的内部孔结构及孔隙率。将湿态凝胶材料加入带有针头的打印料筒中，加热到适当温度保温，通过控制系统将打印喷头系统调至打印平台；在系统控制软件中设置挤出压力、打印速度、接收平台温度等参数，随后启动快速成型设备将数字模型逐层打印成型，加入交联剂交联凝胶，得到湿态凝胶三维多孔支架。
(2)microRNA在支架基体上的负载：
将上述湿态凝胶三维多孔支架冷冻干燥，得到干态支架。将miRNA溶解于无RNA酶的介质中，逐滴滴加在干态支架上，利用干态凝胶的吸水溶胀特性，通过物理吸附作用将microRNA负载于三维支架上。
所述CAD模型为根据病患不同修复部位个性化设计的与缺损部位外形尺寸相契合的三维结构模型。
本发明提供的一种负载microRNA组织工程支架的制备方法，包括如下步骤：
(1)将湿态凝胶材料加入带有针头的打印料筒中，预热，然后进行3D打印处理，得到3D打印产物；将所述3D打印产物浸泡在交联剂中进行交联凝胶，得到湿态凝胶三维多孔支架；
(2)将步骤(1)所述湿态凝胶三维多孔支架冷冻干燥，得到脱水后的支架；
(3)将步骤(2)所述脱水后的支架灭菌处理，然后在无菌环境下将microRNA溶液滴加在灭菌后的支架上，静置，得到所述负载microRNA组织工程支架。
进一步地，步骤(1)所述湿态凝胶材料为明胶、海藻酸钠、壳聚糖、透明质酸、脱细胞胶原、GelMA、纤维素中的一种以上。
进一步地，步骤(1)所述预热的温度为25-45℃。
进一步地，步骤(1)所述打印料筒的针头直径为200-500μm；所述3D打印处理的每层层厚的为打印料筒针头直径的70％-85％；所述3D打印处理的挤出纤维间距为纤维直径的0.8-2.5倍；所述3D打印处理的挤出纤维间距为150-1000μm。
进一步地，步骤(1)所述3D打印处理的接收平台温度为-20～30℃；3D打印处理的挤出压力为0.2-4bar；3D打印处理的速率为0.2-2.3mm/s。
进一步地，步骤(1)所述交联剂为氯化钙溶液、戊二醛溶液、京尼平溶液中的一种以上.
进一步地，步骤(2)所述冷冻干燥的时间为48h±24h。
进一步地，步骤(3)所述灭菌处理为辐射灭菌。
进一步地，步骤(3)所述microRNA溶液的溶剂为超纯水、PBS(磷酸缓冲盐溶液)或Opti-MEM(减血清培养基)；所述microRNA溶液的浓度为6μmol/L；所述灭菌后的支架与microRNA溶液的质量体积比为60:1-40:1g/L；所述静置的时间为12-48小时(干态凝胶支架基体吸附microRNA的时间)。
所述microRNA的种类可根据特定的修复部位进行选择。
本发明提供一种由上述的制备方法制得的负载microRNA组织工程支架。
所述负载microRNA组织工程支架可作为组织工程领域任何部位植入体的研究，包括软骨和骨等硬组织，以及肝脏、肾脏等软组织。
本发明公开了一种负载microRNA组织工程支架及其制备方法。该方法包括以下步骤：配置凝胶溶液，利用计算机辅助设计软件(CAD)构建植入体的三维数字模型，用快速成型设备制备得到具有可控几何外形及内部规则大孔的三维支架。将支架浸泡在交联剂中交联，冷冻干燥得到干态支架。随后将支架浸泡在含microRNA水溶液中，通过凝胶的吸水溶胀特性吸附microRNA。可根据修复部位的具体情况选择特定功能的microRNA。该具有诱导活性的三维多孔支架在组织工程与再生医学领域有巨大的应用前景。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
(1)本发明提供的制备方法，使用先进的快速成型技术制备组织工程支架，可根据修复部位对植入体的几何外形进行个性化设计，实现精确匹配的目的，达到更好地修复效果；
(2)本发明提供的制备方法，通过快速成型技术设计并制备的三维多孔支架具有复杂精细的内部连通孔结构，有利于营养物质和代谢废物的运输、以及细胞、血管的长入和组织生成；
(3)本发明中使用的凝胶材料均为天然生物组织提取材料，具有良好的生物相容性，无免疫排斥反应；
(4)本发明中利用凝胶材料的吸水溶胀特性，可简单高效的负载microRNA，保证microRNA的高活性，同时赋予支架在分子水平调控细胞行为的特性；
(5)本发明中，可根据特定组织器官缺损选择具有特定修复功效的一种或多种microRNA，因此这种负载microRNA的组织工程支架具有广泛的应用范围及前景。
附图说明
图1为本发明实施例负载microRNA组织工程支架具体制备流程示意图；
图2为本发明的实施例1应用于骨再生修复的负载microRNA组织工程支架的光学显微镜照片；
图3为本发明的实施例1应用于骨再生修复的负载microRNA组织工程支架内部孔径分布图；
图4为本发明的实施例1体内异位成骨4周后的micro-CT扫描的材料和新生骨情况结果图；
图5为本发明的实施例4体内角膜移植2周后的角膜组织的组织学切片图。
具体实施方式
以下结合附图和实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。
实施例1
一种应用于骨再生修复、负载miR-29b组织工程支架制备方法，包括以下步骤(参照图1所示)：
(1)称取0.6g海藻酸钠粉体，加入20mL超纯水，室温磁力搅拌7小时，得到质量分数为3％的海藻酸钠溶胶溶液；
(2)在步骤(1)所得的溶液中加入4g明胶粉体，60℃水浴加热，磁力搅拌12小时溶解，得到明胶(20％w/v)-海藻酸钠(3％w/v)混合溶胶溶液；
(3)将步骤(2)中的混合溶胶溶液加入料筒中，将骨缺损部位的三维重建数据转化为快速成型设备(德国Envision TEC公司,3D-BioplotterTM)可识别的STL格式文件。在快速成型设备的系统控制软件中设置料筒温度为37℃、接收平台温度为10℃、挤出压力0.5bar、打印速度3.7mm/s。随后启动3D打印机将数字模型逐层打印成型，得到湿态凝胶三维多孔支架；
(4)将步骤(3)中的湿态凝胶三维多孔支架浸泡在质量分数5％的氯化钙溶液中，交联10分钟；
(5)将步骤(4)中的支架浸泡在体积分数1％的戊二醛溶液中，交联30分钟；
(6)将步骤(5)中的支架透析1天，除去多余的戊二醛；
(7)将步骤(6)中的支架放入-20℃冰箱冷冻，然后冷冻干燥48小时，得到脱水后的干态支架；
(8)将步骤(7)中的支架辐照灭菌，随后在无菌环境下将含miR-29b的水溶液(6μmol/L)滴加与支架上，辐射灭菌后的支架与将含miR-29b的水溶液的质量体积比为43.5:1g/L，4℃静置12小时，让miR-29b充分吸附并渗透于支架内部，得到一种可应用于骨再生修复、负载miR-29b的组织工程支架。miR-29b可有效诱导并促进干细胞向成骨分化。
(9)体内诱导成骨实验：
设置空白组(无负载miR-29b的3D打印支架，其制备方法与实验组的负载miR-29b的3D打印支架基本相同，唯一不同之处在于步骤(8)中没有加入含miR-29b的水溶液)和实验组(负载miR-29b的3D打印支架)。培养和扩增人骨髓间充质干细胞(hMSCs)至需要的数量(2×105个)，消化离心，分别接种于空白组及实验组的支架上，置于37℃、5％CO2、95％湿度的培养箱中培养2周后准备植入动物体内。
配制质量分数为2％wt的戊巴比妥钠溶液，过滤灭菌后，按1.5mL/100g的剂量腹腔注射麻醉裸鼠。待麻药生效后，裸鼠背部消毒，使用钝器解剖法在裸鼠背部皮下切出3个肌袋缺口，按照实验分组，分离两侧肌间隙，在竖脊肌浅层肌袋内随机植入实验材料，在植入点做好标记。术后缝合伤口，每隔8小时皮下注射丁丙诺啡(0.05mg/kg)，共注射3次。分笼正常喂养。植入4周后处死裸鼠，在无菌条件下剪取植入背部皮下肌袋的支架材料，将样本浸泡于质量体积分数为10％的多聚甲醛溶液中固定。随后进行HE染色切片，置于光学显微镜下进行组织学观察并拍照，micro-CT扫描重建观察新骨生成情况。
实施例1制备的负载microRNA组织工程支架制备流程图如图1所示。图2为实施例1负载microRNA组织工程支架内部结构的上表面三维显微镜图片，可观察到结构完好的三维贯通水平孔和垂直孔结构。图3为实施例1负载microRNA组织工程支架的孔隙率及孔径分布表征。基于以上参数制备的支架具有100％三维贯通孔结构，孔隙率约为50％。图4为实施例1体内异位成骨4周后的micro-CT扫描结果图。由图4可见，与不含micro RNA的支架相比，负载microRNA的组织工程支架产生出更多的新生骨组织，说明microRNA的引入，使得组织工程支架有更好的促进新生骨生成的能力。
实施例2
一种应用于骨组织再生修复、基于3D打印技术的负载miR-29b组织工程支架制备方法，包括以下步骤：
(1)称取0.6g海藻酸钠粉体，加入20mL超纯水，室温磁力搅拌7小时，得到质量分数为3％的海藻酸钠溶胶溶液；
(2)在步骤(1)所得的溶液中加入2g脱细胞胶原，室温磁力搅拌12小时至完全溶解，得到海藻酸钠(3％w/v)-脱细胞胶原(10％w/v)混合溶胶溶液；
(3)将步骤(2)中的混合溶胶溶液加入料筒中，将骨缺损部位的三维重建数据转化为3D打印机(德国Envision TEC公司,3D-BioplotterTM)可识别的STL格式文件。在3D打印机的系统控制软件中设置料筒温度为室温、接收平台温度为0℃、挤出压力0.3bar、打印速度5.6mm/s。随后启动3D打印机将数字模型逐层打印成型，得到湿态凝胶三维多孔支架。
(4)将步骤(3)中的湿态凝胶三维多孔支架浸泡在质量分数5％的氯化钙溶液中，交联10分钟；
(5)将步骤(4)中的支架浸泡在体积分数1％的戊二醛溶液中，交联30分钟；
(6)将步骤(5)中的支架透析1天，除去多余的戊二醛；
(7)将步骤(6)中的支架放入-20℃冰箱冷冻，然后冷冻干燥48小时，得到脱水后的干态支架；
(8)将步骤(7)中的支架辐照灭菌，随后在无菌环境下将含miR-29b的水溶液(6μmol/L)滴加与支架上，辐射灭菌后的支架与将含miR-29b的水溶液的质量体积比为50:1g/L，4℃静置12小时，让miR-29b充分吸附并渗透于支架内部，得到一种可应用于骨再生修复、负载miR-29b的组织工程支架。miR-29b可有效诱导并促进干细胞向成骨分化。
实施例3
一种应用于皮肤再生修复、基于3D打印技术的负载miR-203组织工程支架制备方法，包括以下步骤：
(1)称取0.6g海藻酸钠粉体，加入20mL超纯水，室温磁力搅拌7小时，得到质量分数为3％的海藻酸钠溶胶溶液；
(2)在步骤(1)所得的溶液中加入2g脱细胞胶原，室温磁力搅拌12小时至完全溶解，得到海藻酸钠(3％w/v)-脱细胞胶原(10％w/v)混合溶胶溶液；
(3)将步骤(2)中的混合溶胶溶液加入料筒中，将骨缺损部位的三维重建数据转化为3D打印机(德国Envision TEC公司,3D-BioplotterTM)可识别的STL格式文件。在3D打印机的系统控制软件中设置料筒温度为室温、接收平台温度为0℃、挤出压力0.3bar、打印速度5.6mm/s。随后启动3D打印机将数字模型逐层打印成型，得到湿态凝胶三维多孔支架。
(4)将步骤(3)中的湿态凝胶三维多孔支架浸泡在质量分数5％的氯化钙溶液中，交联10分钟；
(5)将步骤(4)中的支架浸泡在体积分数1％的戊二醛溶液中，交联30分钟；
(6)将步骤(5)中的支架透析1天，除去多余的戊二醛；
(7)将步骤(6)中的支架放入-20℃冰箱冷冻，然后冷冻干燥48小时，得到脱水后的干态支架；
(8)将步骤(7)中的支架辐照灭菌，随后在无菌环境下将含miR-203的水溶液滴加与支架上，辐射灭菌后的支架与将含miR-203的水溶液的质量体积比为40:1g/L，4℃静置12小时，让miR-203充分吸附并渗透于支架内部，得到一种可应用于骨再生修复、负载miR-203的组织工程支架。miR-203具有促进皮肤再生的功能。
实施例4
一种应用于角膜再生修复、基于3D打印技术的负载miR-133b组织工程支架制备方法，包括以下步骤：
(1)称取0.6g海藻酸钠粉体，加入20mL超纯水，室温磁力搅拌7小时，得到质量分数为3％的海藻酸钠溶胶溶液；
(2)在步骤(1)所得的溶液中加入2g脱细胞胶原，室温磁力搅拌12小时至完全溶解，得到海藻酸钠(3％w/v)-脱细胞胶原(10％w/v)混合溶胶溶液；
(3)将步骤(2)中的混合溶胶溶液加入料筒中，将骨缺损部位的三维重建数据转化为3D打印机(德国Envision TEC公司,3D-BioplotterTM)可识别的STL格式文件。在3D打印机的系统控制软件中设置料筒温度为室温、接收平台温度为0℃、挤出压力0.3bar、打印速度5.6mm/s。随后启动3D打印机将数字模型逐层打印成型，得到湿态凝胶三维多孔支架。
(4)将步骤(3)中的支架浸泡在质量分数5％的氯化钙溶液中，交联10分钟；
(5)将步骤(4)中的支架浸泡在体积分数1％的戊二醛溶液中，交联30分钟；
(6)将步骤(5)中的支架透析1天，除去多余的戊二醛；
(7)将步骤(6)中的支架放入-20℃冰箱冷冻，然后冷冻干燥48小时，得到脱水后的干态支架；
(8)将步骤(7)中的支架辐照灭菌，随后在无菌环境下将含miR-133b的水溶液滴加与支架上，辐射灭菌后的支架与将miR-133b的水溶液的质量体积比为50:1g/L，4℃静置12小时，让miR-133b充分吸附并渗透于支架内部，得到一种可应用于角膜再生修复、负载miR-133b的组织工程支架。miR-133b具有促进角膜基质修复的功能。
(9)体内角膜修复实验：
设置空白组(无负载miR-133b的3D打印支架，其制备方法与实验组的负载miR-29b的3D打印支架基本相同，唯一不同之处在于步骤(8)中没有加入含miR-29b的水溶液)和实验组(负载miR-133b的3D打印支架)。
选用12周龄，体重2.5-3kg的新西兰兔进行体内动物实验，使用3％戊巴比妥钠对动物进行麻醉，手术前先用紫外灯对样品进行照射灭菌，灭菌后在无菌操作环境下将样品放入无菌的样品包装中后封口。手术使用时先将样品取出，浸泡在无菌的生理盐水溶液中1h后，用5mm的环钻裁成圆形植片。在兔角膜中央用4.5mm环钻钻取深度为150-200μm的植床，用10-0的手术缝线进行缝合。在术后2个月，通过静脉注射过量3％戊巴比妥钠溶液处死新西兰兔。处死后将眼球取下，用10％中性福尔马林溶液室温固定24h。随后进行裁取、石蜡包埋、切片、苏木精伊红染色并在光学显微镜下观察。
图5为实施例4制备的负载miR-133b组织工程支架体内角膜移植2周后的角膜组织的组织学切片图。不含microRNA的组织工程支架实施体内角膜移植2周后，角膜组织基质层较为不规则，新生的角膜组织较为松散，不规整，相比于不含microRNA的组织工程支架，负载microRNA的组织工程支架体内角膜移植2周后，角膜组织基质层较为致密、规则，说明microRNA的引入，使得组织工程支架具有促进角膜基质修复的能力。
以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种负载microRNA组织工程支架的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将湿态凝胶材料加入带有针头的打印料筒中，预热，然后进行3D打印处理，得到3D打印产物；将所述3D打印产物浸泡在交联剂中进行交联凝胶，得到湿态凝胶三维多孔支架；
（2）将步骤（1）所述湿态凝胶三维多孔支架冷冻干燥，得到脱水后的支架；
（3）将步骤（2）所述脱水后的支架灭菌处理，然后在无菌环境下将microRNA溶液滴加在灭菌后的支架上，静置，得到所述负载microRNA组织工程支架。
2.根据权利要求1所述的负载microRNA组织工程支架的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述湿态凝胶材料为明胶、海藻酸钠、壳聚糖、透明质酸、脱细胞胶原、GelMA、纤维素中的一种以上。
3.根据权利要求1所述的负载microRNA组织工程支架的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述预热的温度为25-45℃。
4.根据权利要求1所述的负载microRNA组织工程支架的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述打印料筒的针头直径为200-500μm；所述3D打印处理的每层层厚为打印料筒针头直径的70%-85%；所述3D打印处理的挤出纤维间距为纤维直径的0.8-2.5倍；所述3D打印处理的挤出纤维间距为150-1000μm。
5.根据权利要求1所述的负载microRNA组织工程支架的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述3D打印处理的接收平台温度为-20~30℃；3D打印处理的挤出压力为0.2-4 bar；3D打印处理的速率为0.2-2.3 mm/s。
6.根据权利要求1所述的负载microRNA组织工程支架的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述交联剂为氯化钙溶液、戊二醛溶液、京尼平溶液中的一种以上。
7.根据权利要求1所述的负载microRNA组织工程支架的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述冷冻干燥的时间为48 h ± 24 h。
8.根据权利要求1所述的负载microRNA组织工程支架的制备方法，其特征在于，步骤（3）所述灭菌处理为辐射灭菌。
9.根据权利要求1所述的负载microRNA组织工程支架的制备方法，其特征在于，步骤（3）所述microRNA溶液的溶剂为超纯水、PBS或Opti-MEM；所述microRNA溶液的浓度为6 μmol/L；所述灭菌后的支架与microRNA溶液的质量体积比为60:1-40:1 g/L；所述静置的时间为12-48小时。
10.一种由权利要求1-9任一项所述的制备方法制得的负载microRNA组织工程支架。
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