CN114377202A - 适用于软骨再生的功能化自组装miRNA/多肽复合水凝胶及其制备方法 - Google Patents

适用于软骨再生的功能化自组装miRNA/多肽复合水凝胶及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种适用于软骨再生的功能化自组装miRNA/多肽复合水凝胶及其制备方法。制备方法包括步骤：(1)配制功能多肽水溶液；(2)通过衰老、具有关节炎的动物和人体标本测序来源获取原始miRNA，并通过荧光定量PCR技术、蛋白质免疫印迹对于关节炎和衰老的表型进行进一步选择，包括Sox9、Acan、Col2a1、Mmp3、Mmp13、P16INK4a、P21、Adamts4、Adamts5，确定具有抗衰老、促进软骨修复功能的miRNA；(3)用所述功能多肽水溶液溶解步骤(2)确定的具有抗衰老、促进软骨修复功能的miRNA得到复合溶液；(4)将所述复合溶液置于交联条件中原位交联，得到适用于软骨再生的功能化自组装miRNA/多肽复合水凝胶。

Description

适用于软骨再生的功能化自组装miRNA/多肽复合水凝胶及其 制备方法
技术领域
本发明涉及生物医用材料技术领域，具体涉及一种适用于软骨再生的功能化自组装miRNA/多肽复合水凝胶及其制备方法。
背景技术
关节软骨缺损的修复仍然是一个巨大的临床挑战，因为软骨组织的内在愈合潜力很差。大多数患有全层关节软骨缺损的患者可能会发生退行性改变，最终发展为骨关节炎，这是世界范围内导致残疾的主要原因。目前关节软骨缺损的治疗标准包括疼痛缓解和全关节置换；前者仅限于缓解症状和改善关节功能，后者与感染和其他相关病有关。然而，目前还没有有效的疾病改良疗法可以预防或抑制骨性关节炎的发展。
关节软骨是高度分化的组织，缺乏营养供应的血管，导致内在修复能力有限。因此，软骨中强健软骨细胞的保存对关节健康至关重要。软骨细胞通过合成细胞外基质(ECM)维持软骨内环境稳定，从而保持软骨的结构和功能完整性。然而，在老化和异常的机械应力刺激下，软骨细胞失去了维持软骨完整性和存活的能力。此外，它们转化为分泌基质降解酶的分解代谢细胞，如基质金属蛋白酶(MMPs)和具有血栓反应蛋白基序的去整合素和金属蛋白酶(ADAMTs)，包括必需的分解代谢MMP13和ADAMT5。这些有害的基质变化进一步导致机械完整性降低和软骨润滑减少，随后加速软骨磨损和破坏。这些风险因素导致软骨细胞的细胞衰老，软骨细胞衰老是导致骨关节炎期间基质代谢失衡的关键细胞事件。因此，改善局部微环境，从根本上治疗衰老将是治疗软骨缺损的一个有希望的策略。
一些靶向软骨修复相关基因的关键miRNA，如基质降解酶和促炎细胞因子已被确定在指导软骨修复中发挥关键作用。因此，我们建议鉴定并提供一种新的与衰老相关的miR-29b、miR-125、miR-1247以及miR-429等，以减轻软骨缺损的进展。然而，miRNA在体内外稳定性差、分布非特异性和非靶向效应限制了治疗性miRNA在临床上的应用。为了提高miRNA的治疗效率，已经开发了多种载体，如病毒、脂质体、阳离子聚合物、细胞外小泡和工程外小体，用于输送miRNA。然而，病毒载体的生物毒性、细胞免疫反应性和致瘤性限制了其在体内的应用。非病毒载体因其合成简单、免疫应答低、生物相容性好、安全性高而受到广泛关注。特别是，agomir，一种胆固醇修饰的miRNA模拟物，可以形成胶束并被细胞有效地内化，从而改善软骨退变。
除了抑制细胞衰老外，整个关节的再生以及进一步促进软骨修复对于通过人工合成的层粘连蛋白、纤维粘连蛋白、钙粘着蛋白、血管内皮生长因子和招募干细胞分化为新的年轻软骨细胞来对抗进行性软骨破坏是必要的。比如干细胞招募多肽的应用，由于软骨和滑膜之间有着非常密切的胚胎学联系，滑膜来源的骨髓间充质干细胞(SMSCs)已被证明能改善软骨修复。然而，考虑到人类膝关节的巨大体积间隙，滑膜来源的骨髓间充质干细胞不太可能长距离迁移到损伤部位。我们的功能多肽设计包括但不局限于，例如我们将自组装肽(SAP)，它被骨髓归巢肽(BMHP)基序SKPPGTSS功能化，以调节MSC归巢。这种功能肽可促进微骨折后软骨缺损的修复，对SMSCs也有同样的作用。
当骨关节中的透明质酸水平较低时，仅液体疗法不能改善滑液的润滑性能，这通常会导致软骨表面的磨损增加。因此，具有良好润滑性能的可注射水凝胶更适合在修复软骨缺损的同时保护关节和减轻疼痛。宏观生物聚合物水凝胶，如海藻酸钠和胶原，已被报道可提供局部和持续的siRNA递送。在这里，我们提出了一种新的策略，通过使用多肽水凝胶传递与衰老相关的miRNA，生成再生的关节内微环境，该水凝胶抑制软骨基质的异常代谢，并通过功能多胎释放各种生长因子促进软骨缺损的修复。合成肽的自组装可以产生一系列定义明确的纳米结构，这些纳米结构对于许多生物医学应用(如药物递送)来说是非常有吸引力的纳米材料。在生理环境中，SAP，Ac-(RADA)4-NH2可以自组装并凝胶成具有良好生物相容性和优异力学性能的水凝胶。该水凝胶具有模仿天然ECM的多孔结构，因此可作为药物释放和细胞递送的有希望的介质。
发明内容
本发明提供了一种适用于软骨再生的功能化自组装miRNA/多肽复合水凝胶及其制备方法。该材料具有仿生软骨的多级定向的结构，同时具备特定功能的miRNA和多肽片段针对性地促进软骨的再生。本发明可以克服现有用于软骨损伤修复的材料和填充材料生物活性的不足、及目前生长因子使用的安全性差性价比低等问题，提供一种miRNA与功能多肽复合水凝胶，可用于软骨组织损伤的修复治疗。它是用于软骨组织缺损修复的新型复合材料。该材料具有诱导缺损处软骨修复的微观结构，同时实现功能多肽片段的控制释放，起到类似生长因子的作用，促进软骨组织再生。
具体技术方案如下：
一种适用于软骨再生的功能化自组装miRNA/多肽复合水凝胶，其制备方法包括步骤：
(1)配制功能多肽水溶液；
(2)通过衰老、具有关节炎的动物和人体标本测序来源获取原始miRNA，并通过荧光定量PCR技术、蛋白质免疫印迹对于关节炎和衰老的表型进行进一步选择，包括Sox9、Acan、Col2a1、Mmp3、Mmp13、P16INK4a、P21、Adamts4、Adamts5，确定具有抗衰老、促进软骨修复功能的miRNA；
(3)用所述功能多肽水溶液溶解步骤(2)确定的具有抗衰老、促进软骨修复功能的miRNA得到复合溶液；
(4)将所述复合溶液置于交联条件中原位交联，得到适用于软骨再生的功能化自组装miRNA/多肽复合水凝胶。
本发明的功能化自组装miRNA/多肽复合水凝胶是以具有生物功能的miRNA和功能多肽为原料制备，由纳米纤维和纳米颗粒结构组成。具有特定功能的miRNA与功能多肽通过静电相互作用和亲疏水作用力以非共价键的形式结合，再经过多种交联方式使两者稳定结合，形成具有缓慢释放miRNA功能的复合水凝胶。本发明的复合水凝胶是一种高含水量的水凝胶材料，其组成、结构高度仿生软骨组织的细胞外基质，含有模拟生长因子等功能的多肽片段以及释放特定功能的miRNA，具有优异的促进软骨细胞以及周围干细胞黏附、生长，诱导软骨的再生的作用，可应用于衰老、关节炎以及外伤损伤的关节软骨的再生修复。
在一优选例中，步骤(1)中，所述功能多肽水溶液中的功能多肽为一种或多种接枝有至少一种功能活性短肽的自组装多肽；
所述功能活性短肽选自：
层粘连蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；
纤维粘连蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；
钙粘着蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；
血管内皮生长因子，氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；
招募因子，氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示；
所述自组装多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。
片段由本实验室自己设计，经过材料学、细胞和动物的验证。
接枝的方式可以是将上述功能活性短肽水溶液和自组装多肽水溶液混合。
多肽片段可采用Fmoc固相合成法，由C端到N端逐步依次将氨基酸连接上。开始，将第一个氨基酸通过一段对酸敏感的连接物连接在不溶性的支撑物的树枝上，用六氢吡啶将Fmoc保护剂去掉后，第二个Fmoc保护的氨基酸被连接上去，连接方法有预活化或“一锅煮”等。目标序列连接完毕后，用TFA将肽链从树枝上洗脱得到粗品。分离提纯后，配制功能多肽水溶液。
在一优选例中，步骤(1)中，所述功能多肽水溶液中功能多肽的质量分数为0.5％～2％。
步骤(2)中，所述具有抗衰老、促进软骨修复功能的miRNA可以对关节炎和衰老的特定某一个或者多个表型进行控制，包括但不局限于Sox9、Acan、Col2a1、Mmp3、Mmp13、P16INK4a、P21、Adamts4、Adamts5等。
在一优选例中，步骤(2)中，所述具有抗衰老、促进软骨修复功能的miRNA包括但不局限于miR-29b、miR-125、miR-1247、miR-429中的至少一种。
步骤(2)中，所述具有抗衰老、促进软骨修复功能的miRNA也可以是改性、修饰的，如agomir等。
在一优选例中，步骤(3)中，所述复合溶液中miRNA的摩尔浓度为20nM～200μM。
在一优选例中，步骤(4)中，采用以下一种或多种交联方法：
1)37℃控温交联，使分子自组装形成水凝胶；
2)磷酸盐缓冲溶液(PBS)溶液交联；
3)谷氨酰胺转氨酶催化酰基转移反应的酶交联方法，如10～30Units/mL谷氨酰胺转氨酶的PBS溶液交联等；
4)EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺)/NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)催化纤维蛋白与功能多肽片段形成酰胺键的化学交联方法，如10～60mmol/L EDC+3～30mmol/LNHS+50mmol/L磷酸二氢钾溶液交联等；
5)采用戊二醛、京尼平化学交联。
在一优选例中，所述适用于软骨再生的功能化自组装miRNA/多肽复合水凝胶中，以功能多肽和具有抗衰老、促进软骨修复功能的miRNA的总质量为100％计，功能多肽的质量含量X为0％＜X＜100％，具有抗衰老、促进软骨修复功能的miRNA的质量含量Y为0％＜Y＜100％。
在一优选例中，所述适用于软骨再生的功能化自组装miRNA/多肽复合水凝胶具有多级取向性结构，由纳米纤维丝束构成，所述纳米纤维丝束构成微米纤维丝束，再由所述微米纤维丝束构成宏观水凝胶束。
进一步优选，所述纳米纤维丝束的直径为100～500nm，所述微米纤维丝束的直径为10～100μm。
本发明与现有技术相比，主要优点包括：
本发明适用于软骨再生的功能化自组装miRNA/多肽复合水凝胶是一种高含水量的水凝胶材料，由具有高度模拟软骨组织的纳米纤维构成，更重要的是同时具备生物化学活性的功能多肽片段以及抑制衰老的miRNA，能够有效促进软骨生长和再生。在这里，协同效应体现在两个方面。首先，miRNA和多肽水凝胶的影响是互补的。累积的DNA损伤和受损软骨的强生长信号共同导致细胞周期停滞，导致软骨细胞衰老和代谢失衡，从而导致软骨退变不断加剧。miRNA可在一定程度上恢复DNA损伤引起的基因改变模式，并下调P16、P21和MMPs，抑制基质分解代谢和进一步的软骨损伤。多肽水凝胶的功能如募集的干细胞可以补充丢失的衰老软骨细胞，修复软骨损伤，从而降低生长信号，抑制进一步衰老引起的一系列变化。如果没有来自干细胞的新软骨细胞的补充，来自受损软骨的强生长信号可能会导致持续衰老。而如果没有miRNA，则不能抑制代谢失衡来阻止软骨损伤。另一方面，miRNA和多肽水凝胶的结合导致了比个体更多的遗传调控。与细胞衰老、粘附、迁移和软骨发育相关的基因表达，这与体外和体内结果一致。然而，没有研究利用这种协同机制来设计软骨治疗策略。因此，我们的策略是通过miRNA和多肽水凝胶的协同组合提供有效的治疗。
附图说明
图1为实施例miR-29b-5p的蛋白质免疫印迹功能图；
图2为实施例载有miR-29b-5p的SKP多肽水凝胶实物照片；
图3为实施例载有miR-29b-5p的SKP多肽水凝胶的扫描电镜照片；
图4为实施例载有miR-29b-5p的SKP多肽水凝胶的透射电镜照片；
图5为实施例载有miR-29b-5p的SKP多肽水凝胶胶接种小鼠鼠软骨细胞3天后的细胞染色结果图；
图6为实施例术后一天的小鼠组织切片以及小鼠组织透明化技术图片。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的操作方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
本实施例的适用于软骨再生的功能化自组装miRNA/多肽复合水凝胶，采用小鼠miR-29b-5p和自组装多肽链接招募因子(SKP，SKPPGTSS，氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示)片段，其制备方法包括步骤：
1、将自组装多肽链接招募因子(SKP，SKPPGTSS)溶解于纯水中，超声分散后得到四组功能多肽溶液1，所述功能多肽溶液1的质量分数为分别为0.5％、1％、1.5％、2％，置于4℃待用。
2、将自组装多肽非功能多肽粉RADA(RADARADARADARADA，氨基酸序列如SEQ IDNO：6所示)溶解于纯水中，超声分散后得到四组功能多肽溶液2，所述功能多肽溶液2的质量分数分别为0.5％、1％、1.5％、2％，置于4℃待用。
3、将具有相同质量分数的功能多肽溶液1和功能多肽溶液2按体积比1:1进行混合，得到具有功能片段的RAD-SKP多肽水溶液。
4、特定miRNA的选择，通过衰老、关节炎等动物和人体标本测序来源获取原始miRNA,并通过荧光定量PCR技术、蛋白质免疫印迹等对于关节炎和衰老的表型进行进一步选择，包括Sox9、Acan、Col2a1、Mmp3、Mmp13、P16INK4a、P21、Adamts4、Adamts5等，确定具有抑制衰老和关节炎的miR-29b-5p，碱基序列如SEQ ID NO：7所示。miR-29b-5p的蛋白质免疫印迹结果如图1所示。
5、将具有功能片段的RAD-SKP多肽水溶液与miR-29b-5p混合平衡后静置20min，得到物理结合的miR-29b-5p与RAD-SKP功能多肽复合溶液。复合溶液中miRNA的摩尔浓度设置为三个梯度，分别为20nM、200nM、200μM。
6、将物理结合的miR-29b-5p与RAD-SKP功能多肽复合溶液置于交联条件中原位交联，得到交联后的纤维蛋白复合功能多肽的定向纤维水凝胶，即适用于软骨再生的功能化自组装miRNA/多肽复合水凝胶，记为载有miR-29b-5p的SKP多肽水凝胶，上述交联条件为磷酸盐缓冲溶液(PBS)溶液交联。
以都具有1％质量分数的功能多肽溶液1和功能多肽溶液2、复合溶液中miRNA的摩尔浓度为20nM的条件最终制得的载有miR-29b-5p的SKP多肽水凝胶为例进行表征和测试。
上述载有miR-29b-5p的SKP多肽水凝胶外观如图2所示。
上述载有miR-29b-5p的SKP多肽水凝胶具有多级取向性结构，由纳米纤维丝束构成，所述纳米纤维丝束构成微米纤维丝束，再由所述微米纤维丝束构成宏观水凝胶束。
如图3所示，上述载有miR-29b-5p的SKP多肽水凝胶，在扫描电镜下观察多肽纤维排列，呈现多级纳米纤维的特点。
如图4所示，上述载有miR-29b-5p的SKP多肽水凝胶，在透射电镜下观察miRNA与功能多肽互穿复合水凝胶，功能多肽互穿网络复合水凝胶呈现纳米级的纤维直径。
图5为上述载有miR-29b-5p的SKP多肽水凝胶胶接种小鼠软骨细胞3天后的细胞染色结果图，细胞在水凝胶上生长良好，可以看到miR-29b-5p进入细胞，并且在细胞内部稳定的表达。
在术后1天的切片和组织透明化技术中，我们可以明显看到小鼠关节内部有水凝胶的分布以及miR-29b-5p有进去关节，如图6所示。
此外应理解，在阅读了本发明的上述描述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 方向前
诸进晋
<120> 适用于软骨再生的功能化自组装miRNA/多肽复合水凝胶及其制备方法
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ile Lys Val Ala Val
1 5
<210> 2
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Arg Gly Asp
1
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
His Ala Val Asp Ile
1 5
<210> 4
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Lys Leu Thr Trp Gln Glu Leu Tyr Gln Leu Lys Tyr Lys Gly Ile
1 5 10 15
<210> 5
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Ser Lys Pro Pro Gly Thr Ser Ser
1 5
<210> 6
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
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<210> 7
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
uuagauucgg ugguacacuu ugguc 25

Claims (9)

1.一种适用于软骨再生的功能化自组装miRNA/多肽复合水凝胶，其特征在于，其制备方法包括步骤：
(1)配制功能多肽水溶液；
(2)通过衰老、具有关节炎的动物和人体标本测序来源获取原始miRNA，并通过荧光定量PCR技术、蛋白质免疫印迹对于关节炎和衰老的表型进行进一步选择，包括Sox9、Acan、Col2a1、Mmp3、Mmp13、P16INK4a、P21、Adamts4、Adamts5，确定具有抗衰老、促进软骨修复功能的miRNA；
(3)用所述功能多肽水溶液溶解步骤(2)确定的具有抗衰老、促进软骨修复功能的miRNA得到复合溶液；
(4)将所述复合溶液置于交联条件中原位交联，得到适用于软骨再生的功能化自组装miRNA/多肽复合水凝胶。
2.根据权利要求1所述的适用于软骨再生的功能化自组装miRNA/多肽复合水凝胶，其特征在于，步骤(1)中，所述功能多肽水溶液中的功能多肽为一种或多种接枝有至少一种功能活性短肽的自组装多肽；
所述功能活性短肽选自：
层粘连蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；
纤维粘连蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；
钙粘着蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；
血管内皮生长因子，氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；
招募因子，氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示；
所述自组装多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。
3.根据权利要求1或2所述的适用于软骨再生的功能化自组装miRNA/多肽复合水凝胶，其特征在于，步骤(1)中，所述功能多肽水溶液中功能多肽的质量分数为0.5％～2％。
4.根据权利要求1所述的适用于软骨再生的功能化自组装miRNA/多肽复合水凝胶，其特征在于，步骤(2)中，所述具有抗衰老、促进软骨修复功能的miRNA包括但不局限于miR-29b、miR-125、miR-1247、miR-429中的至少一种。
5.根据权利要求1或4所述的适用于软骨再生的功能化自组装miRNA/多肽复合水凝胶，其特征在于，步骤(3)中，所述复合溶液中miRNA的摩尔浓度为20nM～200μM。
6.根据权利要求1所述的适用于软骨再生的功能化自组装miRNA/多肽复合水凝胶，其特征在于，步骤(4)中，采用以下一种或多种交联方法：
1)37℃控温交联，使分子自组装形成水凝胶；
2)磷酸盐缓冲溶液溶液交联；
2)谷氨酰胺转氨酶催化酰基转移反应的酶交联方法
3)EDC/NHS催化纤维蛋白与功能多肽片段形成酰胺键的化学交联方法；
4)采用戊二醛、京尼平化学交联。
7.根据权利要求1所述的适用于软骨再生的功能化自组装miRNA/多肽复合水凝胶，其特征在于，以功能多肽和具有抗衰老、促进软骨修复功能的miRNA的总质量为100％计，功能多肽的质量含量X为0％＜X＜100％，具有抗衰老、促进软骨修复功能的miRNA的质量含量Y为0％＜Y＜100％。
8.根据权利要求1所述的适用于软骨再生的功能化自组装miRNA/多肽复合水凝胶，其特征在于，所述适用于软骨再生的功能化自组装miRNA/多肽复合水凝胶具有多级取向性结构，由纳米纤维丝束构成，所述纳米纤维丝束构成微米纤维丝束，再由所述微米纤维丝束构成宏观水凝胶束。
9.根据权利要求8所述的适用于软骨再生的功能化自组装miRNA/多肽复合水凝胶，其特征在于，所述纳米纤维丝束的直径为100～500nm，所述微米纤维丝束的直径为10～100μm。
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