CN105669870A - 自组装多肽d-RADA16-RGD及其制备方法和应用 - Google Patents

自组装多肽d-RADA16-RGD及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105669870A
CN105669870A CN201610149054.3A CN201610149054A CN105669870A CN 105669870 A CN105669870 A CN 105669870A CN 201610149054 A CN201610149054 A CN 201610149054A CN 105669870 A CN105669870 A CN 105669870A
Authority
CN
China
Prior art keywords
rgd
rada16
self
polypeptide
ala
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201610149054.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105669870B (zh
Inventor
蒋电明
何彬
陈硕
周敖
赵维康
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University
Original Assignee
First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University filed Critical First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University
Priority to CN201610149054.3A priority Critical patent/CN105669870B/zh
Publication of CN105669870A publication Critical patent/CN105669870A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105669870B publication Critical patent/CN105669870B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/54—Biologically active materials, e.g. therapeutic substances
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/20—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices containing or releasing organic materials
    • A61L2300/252—Polypeptides, proteins, e.g. glycoproteins, lipoproteins, cytokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/40—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a specific therapeutic activity or mode of action
    • A61L2300/412—Tissue-regenerating or healing or proliferative agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/02—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of bones; weight-bearing implants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/582—Recycling of unreacted starting or intermediate materials

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明公开了一种自组装多肽d-RADA16-RGD及其制备方法和应用，多肽序列为：Ac-(Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala)2-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-CONH2。本发明的自组装多肽d-RADA16-RGD，多肽经功能基序RGD修饰，来源于氨基酸的合成，所形成的三维支架具有良好的组织相容性和生物活性。它不但能作为缓慢释放生长因子、药物的载体，而且功能基序(functional？motif，FM)如RGD应用于短肽修饰，能显著提高其骨诱导性和成骨能力。制备方法简单，使用方便，骨修复效果好，对骨修复具有重要促进作用，能广泛应用于临床骨缺损病症。

Description

自组装多肽d-RADA16-RGD及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物材料技术领域，具体地说，涉及一种自组装多肽d-RADA16-RGD及其制备方法和应用。
背景技术
骨缺损是指由于外伤、感染、肿瘤切除或先天性疾病等导致的骨质缺如，破坏了骨骼的连续性和完整性而形成较大的间隙。随着建筑、交通事故以及人口老龄化的增加，骨缺损患者日趋增多，对患者的生活质量及社会的卫生事业投入有重要的影响。大段骨缺损无法自行愈合，其修复需要有天然或者人造的材料支架提供结构支撑和骨诱导作用。如何选择或者制备既有良好生物活性又有适当生物力学性能的可推广的天然或者人造骨修复材料是加快骨形成和提高骨愈合质量的前提，也是生物医学工程和临床工作者研究的热点和难点。
目前应用于临床或者在研的骨修复材料众多，但均难以兼有良好生物活性和适当生物力学性能。自体骨材料移植是骨缺损移植的金标准，成骨能力强，成骨迅速。但是自体骨移植难以在临床推广，主要面临的挑战是：1)以创伤修复创伤，取骨量有限；2)供骨区形成新的骨缺损，易发生骨区疼痛、伤口感染等并发症；3)移植骨与骨缺损的形态、大小等方面难以很好的匹配等。而同种异体骨或异种异体骨面临着新骨替代缓慢、生物力学性状差、骨来源受限等问题，还可引起免疫排异反应、疾病传播等风险。人造骨材料主要有生物陶瓷(如羟基磷灰石、磷酸三钙和生物活性玻璃)和骨水泥(如磷酸钙骨水泥和丙烯酸酯类骨水泥)等，其来源广泛，具有较好的生物相容性，但吸收及降解缓慢甚至不降解、需二次手术取出，骨诱导及成骨能力较差，导致骨修复时间延长和愈合质量降低。鉴于这些现状，研究出既有自体骨的优点，又可批量化生产的复合生物活性材料用于骨移植是当今治疗骨缺损研究的热点。
Zhang等发现第一条自组装短肽(Self-assemblypeptide，SAP)，命名为Zuotin，肽序列为n-AEAEAKAKAEAEAKAK-c(EAK16-II)，其中A为丙氨酸，E为谷氨酸，K为赖氨酸。在水溶液或者人体内的体液环境中，EAK16-II带有疏水端残基(丙氨酸构成)和亲水端残基(带正电荷的赖氨酸和带负电荷的谷氨酸构成)。依靠其化学互补性和结构的兼容性，自组装短肽在适当的条件下，能自发地形成β-sheet二级结构，再组装成有序排列的纳米纤维，继而相互交织成三维支架。后大量的科学实验致力于研究自组装短肽的设计、制备以及生物学应用，包括RAD16-I(n-RADARADARADARADA-c),RAD16-II(n-RARADADARARADADA-c)，EAK16-I(n-AEAKAEAKAEAKAEAK-c)，EAK16-II(n-AEAEAKAKAEAEAKAK-c)等。纳米纤维的直径在10-20nm之间，而交织后形成的三维支架孔径波动在5-200nm之间，其形成的微环境与细胞外基质非常相似。自组装多肽来源于氨基酸的合成，所形成的三维支架具有良好的组织相容性、生物活性和可降解性。更重要的是，它不但能作为缓慢释放生长因子、药物的载体，而且功能基序(functionalmotif,FM)如RGD，IKVAV，YIGSR和PHSRN应用于多肽修饰，能显著提高其生物活性。
自组装短肽可分为左旋短肽和右旋短肽，目前多数研究主要集中在左旋自组装短肽，并发现其在骨、软骨、心肌、神经和创伤修复等方面有重要应用前景。而右旋自组装短肽研究甚少。有研究证实右旋氨基酸组成的肽键较左旋氨基酸组成的肽键更加稳定，对抵制体内生物蛋白酶的降解和作为生物材料移植可能有一定的价值。已有研究发现右旋自组装短肽在止血和创伤修复的潜力。
发明内容
有鉴于此，本发明所要解决现有自组装短肽多为左旋，右旋自组装短肽研究较少的问题，提供一种自组装多肽d-RADA16-RGD及其制备方法和应用。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种自组装多肽d-RADA16-RGD，所述多肽序列为：
Ac-(Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala)2-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-CONH2。
进一步的，组成所述多肽的氨基酸均为右旋氨基酸。
本发明还公开了一种自组装多肽d-RADA16-RGD的制备方法，肽链合成采用Fmoc/PyBOP方法，在合成仪上将RinkAmide树脂置于反应容器，加入芴甲氧羰基-氨基酸进行反应，一个氨基酸拼接完成后，再拼接下一个氨基酸，所述芴甲氧羰基-氨基酸的加入顺序按照所述多肽序列从C端的顺序加入，每个芴甲氧羰基-氨基酸加入同时，加入与所述芴甲氧羰基-氨基酸等量的六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)试剂、1-羟基苯并三唑(HOBT)试剂和甲基吗啉(NMM)试剂。
进一步的，包括以下步骤：
1)用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)浸泡反应容器中的RinkAmide树脂，浸泡洗涤后加入相同摩尔的第一个氨基酸Fmoc-Ser(tBu)-OH、所述PyBOP试剂、HOBT试剂和NMM试剂，反应20分钟；
2)然后用DMF洗涤，再加入配制好的六氢吡啶溶液，此步用来脱除树脂上的芴甲氧羰基保护基团，浸泡大约10分钟，在脱除芴甲氧羰基后，用DMF或二氯甲烷洗涤所述RinkAmide树脂，把六氢吡啶清洗干净，以确保下一步反应的顺利进行(六氢吡啶显强碱性，不利于接肽反应)；
3)取反应的第二个氨基酸Fmoc-Asp(OtBu)-OH和相同摩尔的所述PyBOP试剂、NMM试剂和HOBT试剂，然后一起加入到已经脱掉芴甲氧羰基基团的Lys-Merrifieldresin中，反应20分钟；
4)重复步骤2)；
5)选择合适的芴甲氧羰基-氨基酸，重复步骤3)和步骤4)，总计进行22个循环；
6)接完多肽的所述RinkAmide树脂用甲醇清洗后干燥，然后加入无水甲醇并冰浴到-20℃时缓慢的通入氨气，使其温度保持在0℃以下，通入氨气时间为90分钟，然后密封振摇24小时取出，过滤收集滤液并浓缩抽干(这一步是将多肽从树脂上切下并酰胺化)，再加入事先配好并预冷的切肽试剂，25℃下搅拌反应3小时，取出过滤，收集滤液；所述RinkAmide树脂用少量三氟乙酸洗涤，将洗涤液与所述滤液合并，浓缩后冷却，然后加入冷乙醚使多肽沉淀，离心收集沉淀，真空干燥，得粗品。
7)将所述粗品用高效液相色谱法纯化后即得。
进一步的，所述切肽试剂包括：三氟乙酸(TFA)、苯硫基甲烷(thioanisole)、苯酚(phenol)、水(water)、甲乙硫醚(EDT)和1三异丙基硅烷(TIS)。
进一步的，所述切肽试剂以质量百分比计包括：三氟乙酸(TFA)81.5％、苯硫基甲烷(thioanisole)5％、苯酚(phenol)5％、水(water)5％、甲乙硫醚(EDT)2.5％和三异丙基硅烷(TIS)1％。
进一步的，所述六氢吡啶溶液为30％六氢吡啶的DMF溶液。
本发明还公开了上述自组装多肽d-RADA16-RGD在制备组织工程材料中的应用。
进一步的，所述多肽序列为：
Ac-(Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala)2-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-CONH2。
进一步的，所述组织工程材料包括人造骨修复材料。
与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
1)本发明设计并合成了自组装多肽d-RADA16-RGD:多肽序列Ac-(Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala)2-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-CONH2，所有组成的氨基酸为右旋氨基酸，且多肽经功能基序RGD修饰。
2)本发明的自组装多肽d-RADA16-RGD来源于氨基酸的合成，所形成的三维支架具有良好的组织相容性和生物活性。更重要的是，它不但能作为缓慢释放生长因子、药物的载体，而且功能基序(functionalmotif，FM)如RGD应用于短肽修饰，能显著提高其骨诱导性和成骨能力。
3)本发明的自组装多肽d-RADA16-RGD，制备方法简单，使用方便，易于操作，骨修复效果好，对骨修复具有重要促进作用，能广泛应用于临床骨缺损病症。
当然，实施本发明的任一产品必不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为本发明自组装多肽d-RADA16-RGD实施例中的圆二色谱图。
图2为本发明自组装多肽d-RADA16-RGD实施例中的透射电镜图。
图3为本发明自组装多肽d-RADA16-RGD实施例中的流变仪分析图。
图4A为本发明自组装多肽d-RADA16-RGD应用实施例中股骨外侧髁缺损修复术l-RADA16水凝胶处理组，8周后micro-CT三维重建图；
图4B为本发明自组装多肽d-RADA16-RGD应用实施例中股骨外侧髁缺损修复术d-RADA16水凝胶处理组，8周后micro-CT三维重建图；
图4C为本发明自组装多肽d-RADA16-RGD应用实施例中股骨外侧髁缺损修复术d-RADA16-RGD水凝胶处理组，8周后micro-CT三维重建图；
图4D为本发明自组装多肽d-RADA16-RGD应用实施例中股骨外侧髁缺损修复术PBS对照组，8周后micro-CT三维重建图；图4A-图4D中黑色方框标记为骨缺损修复处。
图5为本发明自组装多肽d-RADA16-RGD应用实施例中股骨外侧髁缺损修复术后8周后micro-CT骨再生分析相对骨量(BV/TV)图。
图6为本发明自组装多肽d-RADA16-RGD应用实施例中股骨外侧髁缺损修复术后8周后micro-CT骨再生分析骨密度(BMD)图。
图7为本发明自组装多肽d-RADA16-RGD应用实施例中股骨外侧髁缺损修复术后8周后micro-CT骨再生分析骨小梁厚度(Tb.Th)图。
图8为本发明自组装多肽d-RADA16-RGD应用实施例中股骨外侧髁缺损修复术后8周(A-D)和12周(E-H)HE染色图：图中(A)、(E)为l-RADA16水凝胶处理组；(B)、(F)为d-RADA16水凝胶处理组；(C)、(G)为d-RADA16-RGD水凝胶处理组；(D)、(H)为PBS对照组。
具体实施方式
以下将配合附图及实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
实施例
一、自组装多肽d-RADA16-RGD的合成和纯化
自组装多肽d-RADA16-RGD由右旋的氨基酸组成，多肽序列是Ac-(Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala)2-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-CONH。上海波泰生物科技有限公司采用多肽固相合成技术(SPPS)合成多肽序列，用高效液相色谱法(HPLC)分析纯化合成的多肽，通过质谱仪确认分子量。多肽d-RADA16-RGD的纯度是98.58％。
1.1.1试剂
芴甲氧羰基(FMOC)-氨基酸为美国SIAM公司产品；PyBOP、rinkamind树脂、六氢吡啶、二甲基吡啶为Merck公司产品；二甲基甲酰胺(DMF)为日本进口(使用前先经茚三酮浸泡和分子筛脱水，并测定无游离氨基)；三氟乙酸(TFA)为GEELBELGIUM公司产品；甲醇为上海振兴化工一厂产品；HPLC甲醇为Merck公司产品；四氢呋喃为上海化学试剂站中心化工厂产品。
1.1.2仪器
431A型多肽合成仪为Appliedbiosystems产品，高效液相色谱为安捷伦1100色谱仪，制备色谱仪为WATERS600E；冷冻干燥机(FREEZEDRYER18)为LABCONCO产品；质谱仪为FinniganLCQ。
1.2.1肽链的合成：
肽链的合成采用Fmoc/PyBOP方法。Fmoc保护基团的脱除用30％六氢吡啶的DMF溶液；肽链从树脂上的切落用切肽试剂(三氟乙酸/结晶苯酚/水/乙二硫醇/甲乙硫醚/三异丙基硅烷＝81.5/5/5/5/2.5/1)。
接肽前树脂处理：
接肽在431A自动合成仪上进行，称取100mgrinkamind树脂到砂芯过滤反应器中，然后按下列量在合成仪中依次加入各种FMOC-氨基酸。反应过程中加入的FMOC-氨基酸并不是一次全部加入反应容器，而是按照多肽的序列顺序从C端逐渐加入，每一个氨基酸反应周期时间为40分钟，在加入氨基酸的同时要加入相同摩尔的PyBOP试剂、HOBT试剂和NMM试剂。
以下是序列中需要加入氨基酸的量：
合成仪的第一步反应是用DMF浸泡反应容器中的树脂(即本条多肽rinkamind树脂)，浸泡洗涤5遍后加入第一个氨基酸Fmoc-Ser(tBu)-OH、PyBOP试剂、HOBT试剂、NMM试剂，反应20分钟后，经DMF洗涤5遍，然后加入配制好的六氢吡啶，此步用来脱除树脂上的FMOC保护基团，浸泡大约10分钟，在脱除FMOC后，用DMF或二氯甲烷洗涤树脂6-9次，把六氢吡啶清洗干净，以确保下一步反应的顺利进行(六氢吡啶显强碱性，不利于接肽反应)；
第二步，加入反应的第二个氨基酸Fmoc-Asp(OtBu)-OH和相同摩尔的PyBOP试剂、NMM试剂和HOBT试剂，然后一起加入到已经脱掉FMOC基团的Lys-Merrifieldresin中，反应20分钟后继续第一步，清洗掉多余的氨基酸试剂，然后加入六氢吡啶脱除保护基，进行22步循环后即可完成多肽的接肽反应，随着循环系数的增加而改变氨基酸的种类，其它试剂(PyBOP试剂、NMM试剂和HOBT试剂)的量保持不变。
接完多肽的树脂经过甲醇清洗后干燥。然后全部转移至玻璃茄形瓶中，加入60毫升无水甲醇并冰浴到-20℃时缓慢的通入氨气，使其温度保持在0℃以下，通入氨气时间为90分钟，然后密封振摇24小时取出，过滤收其滤液并浓缩抽干(这一步是将多肽从树脂上切下并酰胺化)，再加入事先配好并预冷的切肽试剂3ml(81.5％TFA+5％thioanisole+5％phenol+5％water+2.5％EDT+1％TIS)。25℃下搅拌反应3小时。取出过滤，收集滤液；树脂用少量三氟乙酸洗3次，将洗涤液与滤液合并，浓缩后冷却，然后加入10ml冷乙醚使多肽沉淀，离心收集沉淀，真空干燥。得粗品约82.40mg。
1.2.2纯化：视多肽的纯度而选用不同的梯度来分离，一般情况下采用以下方法
先用分析柱确定目标肽(安捷伦1100色谱仪分析系统)：
使用C18反相柱子，条件为：A相为95％的水(甲醇配比)，B相为95％的甲醇(甲醇配比)，然后各加0.1％的TFA，常规条件：在上样品之前先用A相平衡柱子15分钟，然后上样，从A相到B相为25分钟梯度。检测波长:220nm，流速:1ml/min，先用A溶液平衡柱子，上样后从A到B溶液梯度洗脱25min，收集目标肽，然后做质谱鉴定。再根据目标多肽的出峰时间来确定本条多肽的最佳洗脱梯度。
多肽制备(Waters600E)：
使用C18反相制备柱子，条件为：A相为95％的水(乙腈配比)，B相为95％的甲醇(乙腈配比)，然后各加0.1％的TFA，常规条件：从A相到B相为70分钟梯度。检测波长:220nm，流速:36ml/min，先用A溶液平衡柱子，上样后从A到B溶液梯度洗脱，收集多肽洗脱峰，然后与分析仪器配合确定样品的目标峰，然后冻干。(也可根据分析条件来确定最佳梯度)
质谱(FinniganLCQ)：
将冻干后得到的多肽用质谱仪检测分子量。质谱仪采用电喷雾离子源，喷雾电压5.02kV，喷雾电流0.14μA，鞘气流速35，辅气流速0，毛细管电压14.85V，毛细管温度250℃。最终测得多肽的分子量为2242.28。
二、圆二色谱法分析
用去离子水溶解多肽d-RADA16-RGD粉末达1.0mg/ml，再取适量用20mmol/LCaCl2进一步稀释达100μmol/L。25℃，37℃和60℃的多肽溶液分别测量圆二色谱图(JASCOCorporation,J-810,Japan)，测量波长190到290nm。如图1所示，25℃时，d-RADA16-RGD多肽园二色谱图在218nm时出现最高椭圆率，在198.5nm时出现最低椭圆率；37℃时，d-RADA16-RGD多肽园二色谱图在218.5nm时出现最高椭圆率，在199nm时出现最低椭圆率；60℃时，d-RADA16-RGD多肽园二色谱图在218.5nm时出现最高椭圆率，在200nm时出现最低椭圆率。且温度对多肽园二色谱图波形影响不大，说明当温度从37℃升高到60℃，d-RADA16-RGD多肽具有稳定的β-sheet二级结构。
三、透射电镜观察
采用PBS(pH＝7.4)溶解自组装多肽d-RADA16-RGD粉末，达浓度5mg/ml。待48小时，取5ml的多肽溶液到铜网，滤纸去除多余的液体。再用10ml醋酸双氧铀负染30秒，干燥，200kV透射电镜(PhilipsTecnaiG2F20)观察。如图2所示，d-RADA16-RGD多肽自组装成纳米纤维丝，继而相互交织成网状结构。纤维丝长度约145～650nm，直径5-30nm，其相互交织形成的网状结构孔径波动在30nm到250nm之间。
四、流变仪分析
d-RADA16-RGD多肽粉末用去离子水溶解达10.0mg/ml，再用PBS(pH＝7.4)稀释至5mg/ml。4℃保存24小时，150-200μl多肽溶液在25℃条件下流变仪(HaakeMARS，Germany)分析，20mm直径，1°锥板。如图3所示，在频率为10rad/s时，2.5和5.0mg/mld-RADA16-RGD多肽水凝胶储备模量均大于16Pa，且随着浓度的增加，多肽水凝胶储备模量增加，说明d-RADA16-RGD多肽水凝胶均有较好的结构稳定性。
五、股骨外侧髁缺损的修复
5.1大体图修复情况
目前有l-RADA16水凝胶对骨缺损修复有良好的促进作用，本研究以l-RADA16水凝胶材料、PBS空白组作对照，设计并合成了d-RADA16水凝胶和d-RADA16-RGD水凝胶材料修复SD大鼠股骨外侧髁缺损，缺损直径2mm，深3mm。8周和12周后d-RADA16水凝胶和l-RADA16水凝胶促进骨再生作用相当，而与d-RADA16水凝胶相比，d-RADA16-RGD水凝胶经过RGD功能化修饰更加能促进骨缺损的愈合。
5.2micro-CT分析
术后8周取股骨外侧髁标本进行分析，经micro-CT(VivaCT40，ScancoMedicalAG，Bassersdorf，Switzerland)扫描，结果如图4所示：图4A为l-RADA16水凝胶处理组；图4B为d-RADA16水凝胶处理组；图4C为d-RADA16-RGD水凝胶处理组；图4D为PBS对照组；黑色方框标记为骨缺损修复处。CT三维重建显示d-RADA16水凝胶、l-RADA16水凝胶和d-RADA16-RGD水凝胶材料组均有明显的骨小梁再生，尤其是d-RADA16-RGD水凝胶材料组骨再生最突出。如图5-7所示，BV/TV、BMD和Tb.Th分析表明与d-RADA16水凝胶材料组相比，d-RADA16-RGD水凝胶材料组更能提高再生骨组织的相对骨量和骨密度，具有统计学意义。
5.3组织学分析
股骨外侧髁再生骨组织，术后8周和12周HE染色结果如图8所示，图中(A)、(E)为l-RADA16水凝胶处理组；(B)、(F)为d-RADA16水凝胶处理组；(C)、(G)为d-RADA16-RGD水凝胶处理组；(D)、(H)为PBS对照组。提示d-RADA16水凝胶、l-RADA16水凝胶和d-RADA16-RGD水凝胶材料组均有明显的骨组织再生，尤其是d-RADA16-RGD水凝胶材料组骨再生最显著，与micro-CT分析结果一致，综合表明RGD功能化的自组装短肽d-RADA16-RGD水凝胶材料对骨修复有重要促进作用。
本发明设计并合成了自组装多肽d-RADA16-RGD:多肽序列Ac-(Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala)2-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-CONH2，所有组成的氨基酸为右旋氨基酸，且多肽经功能基序RGD修饰。本发明的自组装多肽d-RADA16-RGD来源于氨基酸的合成，所形成的三维支架具有良好的组织相容性和生物活性。更重要的是，它不但能作为缓慢释放生长因子、药物的载体，而且功能基序(functionalmotif，FM)如RGD应用于短肽修饰，能显著提高其骨诱导性和成骨能力。制备方法简单，使用方便，易于操作，骨修复效果好，对骨修复具有重要促进作用，能广泛应用于临床骨缺损病症。
如在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定成分或方法。本领域技术人员应可理解，不同地区可能会用不同名词来称呼同一个成分。本说明书及权利要求并不以名称的差异来作为区分成分的方式。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。“大致”是指在可接收的误差范围内，本领域技术人员能够在一定误差范围内解决所述技术问题，基本达到所述技术效果。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明本发明的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的商品或者系统不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种商品或者系统所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的商品或者系统中还存在另外的相同要素。
上述说明示出并描述了本发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种自组装多肽d-RADA16-RGD，其特征在于，所述多肽序列为：Ac-(Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala)2-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-CONH2。
2.如权利要求1所述的自组装多肽d-RADA16-RGD，其特征在于，组成所述多肽的氨基酸均为右旋氨基酸。
3.一种自组装多肽d-RADA16-RGD的制备方法，其特征在于，肽链合成采用Fmoc/PyBOP方法，在合成仪上将RinkAmide树脂置于反应容器，加入芴甲氧羰基-氨基酸进行反应，一个氨基酸拼接完成后，再拼接下一个氨基酸，所述芴甲氧羰基-氨基酸的加入顺序按照所述多肽序列从C端的顺序加入，每个芴甲氧羰基-氨基酸加入同时，加入与所述芴甲氧羰基-氨基酸等量的六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷试剂、1-羟基苯并三唑试剂和甲基吗啉试剂。
4.如权利要3所述的自组装多肽d-RADA16-RGD的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
1)用N,N-二甲基甲酰胺浸泡所述反应容器中的RinkAmide树脂，浸泡洗涤后加入相同摩尔的第一个氨基酸Fmoc-Ser(tBu)-OH、所述六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷试剂、1-羟基苯并三唑试剂和甲基吗啉试剂，反应20分钟；
2)然后用N,N-二甲基甲酰胺洗涤，再加入六氢吡啶溶液，浸泡，再用N,N-二甲基甲酰胺或二氯甲烷洗涤所述RinkAmide树脂；
3)取反应的第二个氨基酸Fmoc-Asp(OtBu)-OH和相同摩尔的所述六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷试剂、1-羟基苯并三唑试剂和甲基吗啉试剂，一起加入到已经脱掉芴甲氧羰基基团的Lys-Merrifieldresin中，反应20分钟；
4)重复步骤2)；
5)选择芴甲氧羰基-氨基酸，重复步骤3)和步骤4)，进行22个循环；
6)接完多肽的所述RinkAmide树脂用甲醇清洗后干燥，然后加入无水甲醇并冰浴到-20℃，通入氨气，保持温度低于0℃，通入氨气时间为90分钟，然后密封振摇24小时取出，过滤收集滤液并浓缩抽干，再加入配好并预冷的切肽试剂，25℃下搅拌反应3小时，取出过滤，收集滤液；所述RinkAmide树脂用三氟乙酸洗涤，将洗涤液与所述滤液合并，浓缩后冷却，然后加入冷乙醚使多肽沉淀，离心收集沉淀，真空干燥，得粗品。
7)将所述粗品用高效液相色谱法纯化后即得。
5.如权利要4所述的自组装多肽d-RADA16-RGD的制备方法，其特征在于，所述切肽试剂包括：三氟乙酸、苯硫基甲烷、苯酚、水、乙二硫醇和三异丙基硅烷。
6.如权利要5所述的自组装多肽d-RADA16-RGD的制备方法，其特征在于，所述切肽试剂以质量百分比计包括：81.5％的三氟乙酸、5％的苯硫基甲烷、5％的苯酚、5％的水、2.5％的乙二硫醇和1％的三异丙基硅烷。
7.如权利要6所述的自组装多肽d-RADA16-RGD的制备方法，其特征在于，所述六氢吡啶溶液为30％六氢吡啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液。
8.一种自组装多肽d-RADA16-RGD在制备组织工程材料中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述多肽序列为：Ac-(Arg-Ala-Asp-Ala-Arg-Ala-Asp-Ala)2-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-CONH2。
10.如权利要求8或9任一项所述的应用，其特征在于，所述组织工程材料包括人造骨修复材料。
CN201610149054.3A 2016-03-16 2016-03-16 自组装多肽d-RADA16-RGD及其制备方法和应用 Expired - Fee Related CN105669870B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610149054.3A CN105669870B (zh) 2016-03-16 2016-03-16 自组装多肽d-RADA16-RGD及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610149054.3A CN105669870B (zh) 2016-03-16 2016-03-16 自组装多肽d-RADA16-RGD及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105669870A true CN105669870A (zh) 2016-06-15
CN105669870B CN105669870B (zh) 2020-01-10

Family

ID=56214982

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610149054.3A Expired - Fee Related CN105669870B (zh) 2016-03-16 2016-03-16 自组装多肽d-RADA16-RGD及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105669870B (zh)

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106397545A (zh) * 2016-09-30 2017-02-15 暨南大学 一种水凝胶材料及其制备方法和应用
CN106831948A (zh) * 2017-02-21 2017-06-13 东南大学 一种神经肽及其合成方法和应用
CN109260516A (zh) * 2018-10-16 2019-01-25 罗忠礼 一种自组装短肽在骨组织损伤中快速修复的应用
CN111848741A (zh) * 2020-07-22 2020-10-30 中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院 一种肽、肽修饰的dbm支架及其制备方法和应用
CN114377202A (zh) * 2021-12-16 2022-04-22 方向前 适用于软骨再生的功能化自组装miRNA/多肽复合水凝胶及其制备方法
CN115887768A (zh) * 2022-11-18 2023-04-04 东莞宜安科技股份有限公司 一种生物医用钛合金的自组装多肽涂层及其制备方法
CN116082453A (zh) * 2023-03-03 2023-05-09 四川大学 一种用于明胶酶酶切响应的多肽及含多肽的骨缺损修复支架
WO2023222057A1 (zh) * 2022-05-19 2023-11-23 江苏奥赛康药业有限公司 一种固相片段缩合制备自组装肽rada16的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008039483A2 (en) * 2006-09-26 2008-04-03 Massachusetts Institute Of Technology Modified self-assembling peptides
CN104324364A (zh) * 2014-11-10 2015-02-04 四川大学华西医院 一种复合成纤维细胞生长因子1的生物材料及在制备治疗下肢缺血性疾病的药物中的应用
CN104356402A (zh) * 2014-10-10 2015-02-18 孙念峰 功能性自组装纳米多肽水凝胶

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008039483A2 (en) * 2006-09-26 2008-04-03 Massachusetts Institute Of Technology Modified self-assembling peptides
CN104356402A (zh) * 2014-10-10 2015-02-18 孙念峰 功能性自组装纳米多肽水凝胶
CN104324364A (zh) * 2014-11-10 2015-02-04 四川大学华西医院 一种复合成纤维细胞生长因子1的生物材料及在制备治疗下肢缺血性疾病的药物中的应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIN HE等: "《Designer functionalised self-assembling peptide nanofibre scaffolds for cartilage tissue engineering》", 《EXPERT REVIEWS IN MOLECULAR MEDICINE》 *

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106397545A (zh) * 2016-09-30 2017-02-15 暨南大学 一种水凝胶材料及其制备方法和应用
CN106397545B (zh) * 2016-09-30 2019-06-21 暨南大学 一种水凝胶材料及其制备方法和应用
CN106831948A (zh) * 2017-02-21 2017-06-13 东南大学 一种神经肽及其合成方法和应用
CN109260516A (zh) * 2018-10-16 2019-01-25 罗忠礼 一种自组装短肽在骨组织损伤中快速修复的应用
CN111848741A (zh) * 2020-07-22 2020-10-30 中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院 一种肽、肽修饰的dbm支架及其制备方法和应用
CN111848741B (zh) * 2020-07-22 2021-06-15 中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院 一种肽、肽修饰的dbm支架及其制备方法和应用
CN114377202A (zh) * 2021-12-16 2022-04-22 方向前 适用于软骨再生的功能化自组装miRNA/多肽复合水凝胶及其制备方法
WO2023222057A1 (zh) * 2022-05-19 2023-11-23 江苏奥赛康药业有限公司 一种固相片段缩合制备自组装肽rada16的方法
CN115887768A (zh) * 2022-11-18 2023-04-04 东莞宜安科技股份有限公司 一种生物医用钛合金的自组装多肽涂层及其制备方法
CN116082453A (zh) * 2023-03-03 2023-05-09 四川大学 一种用于明胶酶酶切响应的多肽及含多肽的骨缺损修复支架
CN116082453B (zh) * 2023-03-03 2023-11-21 四川大学 一种用于明胶酶酶切响应的多肽及含多肽的骨缺损修复支架

Also Published As

Publication number Publication date
CN105669870B (zh) 2020-01-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105669870A (zh) 自组装多肽d-RADA16-RGD及其制备方法和应用
KR100676285B1 (ko) 동물의 다양한 조직으로부터의 콜라겐 분리방법 및 콜라겐 용액의 제조방법 그리고 이를 이용하여 생산한 매트릭스
Hu et al. Exogenous stromal derived factor-1 releasing silk scaffold combined with intra-articular injection of progenitor cells promotes bone-ligament-bone regeneration
Olbrich et al. Surfaces modified with covalently-immobilized adhesive peptides affect fibroblast population motility
Hou et al. A composite demineralized bone matrix–self assembling peptide scaffold for enhancing cell and growth factor activity in bone marrow
US20160194378A1 (en) Peptides and uses thereof
US20100311640A1 (en) Self-assembling peptide incorporating modifications and methods of use thereof
JP7152311B2 (ja) 血管新生化組織修復のための操作されたスキャフォールド
EP1636250A2 (en) Self-assembling peptides incorporating modifications and methods of use thereof
US20130210736A1 (en) Peptide having the ability to regenerate bone tissue and for binding to apatite
CA2328463A1 (en) Matrix binding factor
CN1972722A (zh) 促进目标分析物附着的ifbm's
US10836795B2 (en) Dual functional novel peptide having cell permeability and bone tissue regeneration ability, and use thereof
Bryan et al. Derivation and performance of an entirely autologous injectable hydrogel delivery system for cell-based therapies
EP3281946B1 (en) Peptide having zirconia-binding capacity
Lee et al. Comparison of three different methods for effective introduction of platelet-rich plasma on PLGA woven mesh
WO2007094570A1 (en) Self-assembly nano-composites comprising hydrophilic bioactive peptides and hydrophobic materials
CN110072877B (zh) 具有钛结合能力的肽
CN106573019A (zh) 骨形成促进材料
Zhuang et al. A novel leptin receptor binding peptide tethered-collagen scaffold promotes lung injury repair
Vazquez-Portalatin The Use of Biopolymers for Tissue Engineering
Jehle Tracking self-assembly of hierarchically structured soft matter
CN101054418B (zh) 一种融合多肽及其在制备烫伤药物中的应用
Portalatin The use of Biopolymers for Tissue Engineering
Vrehen et al. Collagen type I mimicking peptide additives to functionalize synthetic supramolecular hydrogels

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20200110

Termination date: 20210316

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee