CN109260516A

CN109260516A - 一种自组装短肽在骨组织损伤中快速修复的应用

Info

Publication number: CN109260516A
Application number: CN201811203241.0A
Authority: CN
Inventors: 罗忠礼; 文静; 张慧楠; 兰世建; 吴书祎; 黄岚; 张宇
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2018-10-16
Filing date: 2018-10-16
Publication date: 2019-01-25

Abstract

本发明公开了一种自组装短肽在骨组织损伤中快速修复的应用，属于纳米生物再生医学领域，所述自组装短肽的氨基酸序列为：Arg Leu Glu Cys Lys Ala Asp Ala Arg Leu Glu Val Lys Ala Asp Ala‑NH₂。本发明对已有的自组装短肽拓宽了新的应用领域，拓展了该自组装短肽的使用范围类型，提高了该自组装短肽的研发价值，并为骨组织损伤修复提供了切实可行的研究方向，拓宽了组织修复的研究领域。

Description

一种自组装短肽在骨组织损伤中快速修复的应用

技术领域

本发明属于纳米生物再生医学领域，具体涉及一种自组装短肽在骨组织损伤中快速修复的应用。

背景技术

分子自组装指的是分子在不受外力介入的情况下，能够进行自我组织，自我聚集形成一种规则的结构，即能够从一个杂乱无序的状态转变成一个有序的状态。近几年来，手性自组装短肽，已经发展成为了一类新兴的纳米生物材料。它是一种仿ECM的生物支架纳米材料，能够模仿ECM的部分功能，从而影响细胞迁移、增殖、分化等生物学行为，可以作为细胞三维培养的基质材料，同时它在创伤修复、组织损伤修复等方面均有一定的作用。

在公开号为CN104650192A、申请号为201510134840.1的专利申请中，公开了一类自组装短肽，其在子宫和心肌修复上具有良好的效果，但其在其他组织修复中的作用还未可知，对于该类自组装短肽的进一步开发还具有较大的研发价值和前景。

骨有成骨和软骨之分，通常认为骨组织是一种坚硬的结缔组织，也是由细胞、纤维和基质构成的；纤维为骨胶纤维，基质含有大量的固体无机盐。软骨即软骨组织，由软骨细胞和细胞间质组成。为区分和论述，本专利处所述概念特别界定:骨组织特指成骨组织和软骨组织。

骨组织损伤的修复，特别是软骨的修复，是一个世界性的医学难题，在基础医学和临床医学中有很多重要问题需要突破。在骨组织中，关节软骨是人体最重要的承重组织，具有低摩擦，抗压和拉伸性能。它是一种特殊的结缔组织，由软骨细胞及细胞外基质构成，以蛋白多糖和二型胶原为主。而关节软骨损伤是临床骨科常见的疾病，由于关节软骨缺乏血管，细胞结构单一，一旦损伤，其自身愈合能力很低。有研究表明，直径大于4mm的全层软骨损伤，即缺损超过钙化层，则不能自行修复。因此，一旦发生关节软骨损伤，最终可能导致骨关节炎的发生，严重影响患者的生活质量。

软骨细胞的再生有很多因素影响，例如细胞因子，生长因子(PDGF-BB、BMP-2等)，以及细胞外基质(ECM)等。有研究表明，PDGF-BB和BMP-2能够促进软骨细胞的DNA合成。ECM是以胶原、糖蛋白、透明质酸、蛋白聚糖、粘多糖和弹性蛋白为基本成分的分子复合物，生长因子和细胞因子通过多种方式与ECM相互作用，ECM分子与细胞的相互作用也调节细胞的增殖。

另外，本专利所述骨组织比较子宫和心肌有很大的不同，主要体现在于：1)属于不同的组织和器官；2)各组织和器官在机体中结构不同；3)各组织和器官在机体中赋予的功能不同；4)各组织和器官在机体中赋予的用途不同；5)各组织和器官中的在机体中赋予的动态行为不同；6)受损伤后，修复中涉及的的细胞类型、部分蛋白、修复机制(如相关的信号通路，蛋白的上调和下调，病理学及病理生理学)等存在不同；7)其它等。故而在医学上，很难想到将骨组织修复与子宫和心肌组织修复使用的药物合并研究。

发明内容

本发明提供一种自组装短肽在骨组织损伤中快速修复的应用，以解决现有医学骨组织难以修复的技术问题。

本发明采用的技术方案如下：

一种自组装短肽在骨组织损伤中快速修复的应用，所述自组装短肽的氨基酸序列为：Arg Leu Glu Cys Lys Ala Asp Ala Arg Leu Glu Val Lys Ala Asp Ala-NH₂。本申请将该自组装短肽命名为Sciobio-II，该序列是专利申请号为201510134840.1的专利文件中提供的三条短肽中的一条短肽(GFS-5)，其制备过程和短肽结构如该专利所述，本申请不再赘述。

本专利处所述概念特别界定:骨组织特指成骨组织和软骨组织。

实验表明，本发明所述自组装短肽Sciobio-II形成的纳米纤维支架，支持软骨细胞能在其上进行黏附、生长；所以，自组装短肽能使用于骨组织中细胞方面的三维培养。

实验表明，本发明所述自组装短肽Sciobio-II所构建的三维培养的细胞，部分蛋白的表达在二维和三维中有显著不同。软骨细胞三维培养中的重要蛋白逐渐增加，表明本发明短肽启动了骨组织细胞中的某些信号通路中的重要蛋白的上调或者下调。

实验表明，本发明所述自组装短肽Sciobio-II形成的纳米纤维支架，能支持修复骨损伤(兔股骨缺损)修复。

实验表明，本发明所述自组装短肽Sciobio-II形成的纳米纤维支架，还能加快修复骨损伤(兔股骨缺损)的修复速度，修复速度较比对照组快约1.3倍，修复质量较对照好，Sciobio-II骨修复完成时，对照兔成骨修复愈合仅完成约75％。

实验表明，本发明所述自组装短肽Sciobio-II形成的纳米纤维支架，HE染色显示能支持软骨损伤(兔膝关节)修复。

实验表明，本发明所述自组装短肽Sciobio-II形成的纳米纤维支架，还能加快修复软骨损伤(兔膝关节)的修复速度，修复速度较比对照组快约2.6倍，修复质量较对照好(核磁共振图)。

综上，本发明所述自组装短肽Sciobio-II，支持骨组织细胞生长，调节重要蛋白的表达，能支持骨组织损伤修复，能加速修复骨组织损伤，修复质量好，可应用到骨组织(骨、软骨)组织创伤修复等相关领域。

上述细胞三维培养是指自组装短肽在制备细胞三维培养修饰纳米支架材料中的应用；骨组织损伤修复是指自组装短肽作为生物医学纳米材料的应用。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

(1)本发明为骨组织损伤修复提供了切实可行的研究方向，拓宽了组织修复的研究领域；

(2)本发明对已有的自组装短肽拓宽了新的应用领域，拓展了该自组装短肽的使用范围类型，提高了该自组装短肽的研发价值；

(3)本发明涉及的自组装短肽能够目的性的修复骨(骨、软骨)损伤组织，修复速度快，修复质量好；

(4)提供了一种新型的自组装纳米生物医学材料，这种新型生物医学材料能够广泛的应用到纳米生物医学工程、细胞工程及生物工程及等领域，并具有明显的经济及其社会效益；

(5)提供了一种细胞三维培养纳米支架材料，可广泛应用于生物医学领域。

附图说明

图1是本发明所述组装短肽Sciobio-II与纳米金混合24h形成纳米纤维丝并与纳米金包裹链接在的透射电镜扫描图(TEM)，放大倍数×(20000)倍图。

图2是本发明所述自组装短肽Sciobio-II形成水凝胶光学图片，刚果红染色,5mg/mL的短肽Sciobio-II盐离子溶液在0h(图2中A)时，三个组的短肽结构都较松散，相互之间不成膜；在4h(图2中B)时，薄膜的厚度及大小都有所增加，但还是处于松散的状态；24h(图2中C)后，短肽溶液和加入生长因子的短肽溶液均形成结构稳定，均一的膜片状结构。

图3是用本发明所述自组装短肽Sciobio-II的三维培养细胞图，(图3中A为二维3day的20倍镜；图3中B为三维3day的20倍镜)人正常软骨细胞(c28i2)在二维环境中呈贴壁生长，分布均匀，细胞饱满为菱形；在三维培养下，细胞透亮为球形，表现为多层生长，细胞生长状态较好。

图4是本发明所述自组装短肽Sciobio-II在分别培养c28i2细胞1day、3day、5day、7day后，cck-8检测细胞增殖，二维组细胞经过7天培养后，细胞数减少，细胞出现死亡情况；三维组细胞较二维组细胞生长较慢，但经过7天培养后，细胞数仍有所增长。

图5是本发明所述自组装短肽Sciobio-II用于c28i2细胞二维和三维培养时的live/dead活死细胞染色图(10×物镜)。

图6是本发明所述自组装短肽Sciobio-II用于c28i2细胞二维和三维培养时的DAPI染色图(10×物镜)。

图7是本发明所述自组装短肽Sciobio-II在c28i2细胞二维和三维培养时的流式细胞周期图。经过7day培养后，三维组S+G2期大于二维组，三维组处于增殖状态的细胞多于二维组。

图8是用本发明所述自组装短肽Sciobio-II所构建的三维培养的细胞及二维的RNA表达量情况，三维组细胞RNA表达量在7day后逐渐增加。

图9是本发明所述自组装短肽Sciobio-II分别兔股骨外侧髁骨缺损的修复情况术中，术后45天、术后90天的骨组织损伤愈合对比图，其中图9右侧数据统计图是描述Sciobio-II和生理盐水组的修复对照差异。

图10是本发明所述自组装短肽Sciobio-II分别对兔膝关节软骨损伤修复1月、2月、3月后的对比图。自组装短肽Sciobio-II对兔膝关节软骨修复作用快，在第二个月是已基本完成修复。自组装短肽Sciobio-II和生长因子BMP-2对兔膝关节软骨的修复作用没有明显差异。

图11是本发明所述自组装短肽Sciobio-II对兔膝关节软骨损伤修复1个月后的HE染色组织学观察。空白组(图11中A)：软骨缺损处凹陷明显，修复区无软骨细胞和软骨凹陷产生，无新生血管生成；短肽Sciobio-II组(图11中B)和生长因子BMP-2组(图11中C)：基底部分及边缘可以看到少许排列不规则的软骨细胞及软骨凹陷；短肽加生长因子BMP-2组(图11中D)：修复区以纤维细胞为主，可见少量不规则排列的软骨细胞及软骨陷窝。

图12是本发明所述自组装短肽Sciobio-II对兔膝关节软骨损伤修复2个月后的核磁共振图。短肽组的修复速度比空白对照组约快2.6倍，加入生长因子BMP-2组和短肽组无明显差异。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的描述，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，并不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域的普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的其他所用实施例，都属于本发明的保护范围。

实施例1：自组装短肽Sciobio-II与纳米金混合后自组装24h的透射电镜显微镜(TEM)检查

PBS配置浓度为5mg/mL的短肽溶液，室温下组装48小时。取5μL短肽溶液负载在碳包覆铜网上，用10μL的醋酸双氧铀处理30s，自然干燥，过夜。放置24h后取样，用透射电镜观察并拍照(见图1)。表明，该物质为纳米纤维。

实施例2：用短肽Sciobio-II的刚果红染色实验及自组装形态和效果

用生理盐水配制5mg/ml短肽Sciobio-II溶液，在37℃下孵育24小时。取10μl水凝胶涂抹在载玻片上，用刚果红液染色30s，在光镜下观察(见图2)。5mg/mL的短肽Sciobio-II盐离子溶液自组装0时，三个组的短肽结构都较松散，相互之间不成膜；在4h时，薄膜的厚度及大小都有所增加，但还是处于松散的状态；24h后，短肽溶液和加入生长因子的短肽溶液均形成结构稳定，均一的膜片状结构。24h后自组装短肽Sciobio-II形成的水凝胶含水量可高达99％，成透明状的胶体，离心管倒置后，该凝胶不会下滑。符合形成可以使用的水凝胶实体。

实施例3：用短肽Sciobio-II对细胞三维培养

为考察短肽Sciobio-II对骨组织细胞的生长情况，选取人正常软骨细胞c28i2作为本专利骨组织细胞的代表模型，作为研究对象，考察相关的生物学行为等。细胞三维培养的准备过程与细胞的二维培养相同，操作如下：

将人正常软骨细胞c28i2从液氮中取出，置于37℃水浴锅中迅速溶解，加入DMEM高糖(Hyclone)完全培养基，其主要成分为1％双抗溶液(青链霉素)、10％胎牛血清(cellbox)，离心细胞，加入新的培养液重悬细胞后接种于25cm²培养瓶中。把培养瓶置于37℃、体积分数为5％CO₂培养箱中，每隔1～2天换一次液。待细胞密度大于80％时，即可传代。传代时先将培养液用吸管吸出，培养瓶内加入0.25％的胰酶消化细胞，镜下观察见大部分细胞游离时即可加入DMEM高糖完全培养基终止消化。800转/分，4分钟离心沉淀细胞，弃去上清液，加入新鲜培养液重悬细胞，分瓶接种。

细胞三维培养的操作如下：

(1)将实施1制备的自组装短肽Sciobio-II用18.2KΩ/cm²的水配制成浓度1％的溶液，取适量(100-300μl)移入离心管中备用；

(2)将上述培养好的c28i2细胞用0.25％胰酶消化，再移入离心管中，800rmp/min离心沉淀细胞4min，弃上清液，加入蔗糖溶液(质量浓度为20％)记数到细胞5×10⁵个/ml，分别取200μl备用；

(3)在离心管中快速混合(1)和(2)中的溶液，得短肽Sciobio-II和细胞的混悬液；

(4)取(3)中的混合液50μl滴加到96孔板中，培养；

(5)换液，取出一半的细胞培养孔板液体,加入等体积的新鲜的DMEM高糖完全培养基，换液完毕后，置于细胞培养箱继续培养2-5天。

用本发明所述自组装短肽Sciobio-II的三维培养细胞图，(图3中A为二维3day的20倍镜；图3中B为三维3day的20倍镜)人正常软骨细胞(c28i2)在二维环境中呈贴壁生长，分布均匀，细胞饱满为菱形；在三维培养下，细胞透亮为球形，表现为多层生长，细胞生长状态较好。表明该序列，能支持骨细胞的代表(人正常软骨细胞c28i2)生长。

实施例4：用短肽Sciobio-II对细胞进行CCK-8检测

取处于对数生长期的细胞，用0.25％胰酶消化细胞，镜下观察直至大部分细胞脱落，加入DMEM高糖完全培养基终止消化，离心弃上清，加入1mL培养液重悬细胞，并进行细胞计数。调整细胞浓度到5×10⁴个/ml，96孔板中分别进行二维和三维培养。同时设置二维和三维对照组，分别在第1,3,5,7天时检测细胞的增殖情况。提前取出cck-8试剂平衡至室温，避光向每孔中加入10μL CCK-8溶液，培养箱中避光孵育2～4h后，在450nm处用酶标仪进行检测。实验结果表明，经过7day培养后，三维组的细胞仍有增多(见图4)，说明c28i2细胞可以在短肽Sciobio-II构建的三维环境中生长，短肽Sciobio-II对细胞生长无毒性和抑制作用。

实施例5：用短肽Sciobio-II对细胞进行live/dead活死细胞染色

取对数生长期的细胞，消化离心，弃上清后加入1mL培养液重悬，计数。96孔板中每孔加入2×10³个细胞，分别进行二维和三维培养。分别在第1,3,5天时进行细胞染色。染色前取出live/dead染色试剂盒，室温下平衡30min，避光取1.25μL PI溶液溶于5mL PBS溶液中，混匀，取2.5μL AM溶液溶于上述溶液中，使终浓度为PI 4μM，AM 2μM。染色前用PBS轻轻洗细胞一次，随后每孔加入50μL染料，避光染色30min，PBS清洗一次，在倒置荧光显微镜下观察，拍照。

钙黄素(AM)和碘化丙啶(PI)进入细胞后，活细胞会被染为绿色，而凋亡细胞呈现红色荧光。在第1天至第3天时，细胞生长状态较好，凋亡较少。5天后，二维组细胞出现接触抑制，凋亡细胞增多，而三维组细胞生长空间大，细胞长势良好，凋亡细胞较少(见图5)。说明c28i2细胞在短肽Sciobio-II所构建的三维微环境中长势良好，生长空间更大。

实施例6：用短肽Sciobio-II对细胞进行DAPI染色

取生长良好的细胞，消化离心后，重悬细胞，用96孔板进行二维和三维培养，并在第1，3，5天染色。舍弃培养基后用4％的多聚甲醛固定细胞，PBS清洗一次，避光条件下每孔加入20μL DAPI染液，染色15min后，PBS清洗细胞一次，吸出PBS，倒置荧光显微镜下观察拍照。

由染色结果可以看出，DAPI染色中细胞核呈圆形，染色均匀(图6)，表明c28i2细胞可以在短肽Sciobio-II构建的三维环境下生长且状态良好，未观察到对细胞的毒性作用。

实施例7：用短肽Sciobio-II对c28i2细胞进行流式细胞术分析细胞周期

取对数生长期的细胞，消化离心，弃上清后加入1mL培养液重悬，计数，6孔板中每孔加入6×10⁵个细胞，分别进行二维和三维培养。二维培养中每孔加入2mL培养液；三维培养时，将细胞调整到6×10⁵个，调整浓度等过程，使短肽终浓度为1mg/mL，放入孵箱孵育2～5min后，取出补加培养液到2mL。分别在第1,3,5,7天时，取出6孔板，进行细胞固定。

(1)二维组细胞直接用0.25％胰酶消化细胞；三维组细胞用0.25％胰酶消化细胞后，离心，重悬细胞，弃上清液等，直至胶全部洗干净；

(2)细胞消化下来后，PBS清洗两次；

(3)加入100μL PBS重悬细胞，再缓慢加入300μL75％的冷酒精，边加边震荡；

(4)随后放入4℃冰箱，固定过夜。

由(图7)可以看出，经过7day后，三维组S+G2期大于二维组，表明经过7day后，三维组处于增殖状态的细胞要多于二维组，细胞在短肽Sciobio-II构建的三维微环境中的生长空间大，生长状态好。

实施例8：短肽Sciobio-II所构建的三维与二维细胞q-PCR检测

总RNA的提取：

1)收集c28i2细胞(1天、3天、5天和7天)，加入1ml Trizol RNA抽提试剂，室温静置10min；

2)加入200μl三氯甲烷(氯仿)，用漩涡混匀器震荡15s，室温静置3min后，12000rpm/min，4℃离心10min；

3)轻轻吸取上层水相置于新的无酶EP管中，加入等体积的异丙醇，室温放置20℃后，12000rpm/min，4℃离心10min，弃上清；

4)加入用DEPC水配置的浓度为75％乙醇，洗涤，12000rpm/min，4℃离心5min，弃上清；

5)室温晾干5-10min，加入30μl RNase-free H2O，吹打均匀；

6)吸取1μl RNA，用NanoDrop检测RNA浓度和纯度，要保证A260/A280在1.8-2.0之间，可符合后续实验要求。

逆转录合成cDNA：

参照逆转录试剂盒说明书(PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser)合成cDNA。

1)第一步：去除混杂DNA

42℃反应2min

2)第二步：合成cDNA

37℃，15min；85℃，5s

荧光定量PCR

设计合成引物，序列如下：

合成得到的cDNA用NanoDrop检测浓度，用超纯水稀释到终浓度为100ng/μl。反应体系如下：

从本实施例可以看出，采用本序列培养的细胞，在此微环境下，q-PCR显示其相关的表达在二维和三维中存在差异。其中，BMP-2在二维培养中其含量逐渐减小，二在三维培养中，逐渐升高(图8A)；而R-col也是在二维培养中其含量逐渐减小，在三维培养中，逐渐升高(图8B)；这两种重要的蛋白在该纳米三维环境中的表达存在中差异，对骨组织(骨、软骨)修复具有重要意义。实验进一步表明，三维培养的细胞，部分蛋白的表达在二维和三维中有显著不同。细胞三维培养中的重要蛋白逐渐增加，也表明或许启动了其细胞中的某些信号通路中的重要蛋白的上调或者下调。

实施例9：短肽Sciobio-II对兔股骨外侧髁骨缺损的修复情况

为考察短肽Sciobio-II对骨的修复情况，选取新西兰大白兔的股骨外侧髁作为成骨组织部分的成骨损伤修复模型，作为研究对象，考察它对骨损伤的修复情况。

本实施例中，实验用动物重量在2.5kg左右的成年新西兰大白兔，随机分布，12只，由重庆医科大学动物实验中心提供。

新西兰大白兔分为2组，进行下面的实验：

(1)取成年新西兰大白兔，用3％的戊巴比妥钠对兔进行耳缘静脉注射麻醉；

(2)待完全麻醉后，碘酒消毒膝关节，铺巾；

(3)手术剪剪开股骨下端外侧皮肤约3.5cm，逐层剥离皮肤及皮下组织，直至充分股骨外侧髁，用电动手钻在股骨外侧髁钻出直径为5mm，深度为6mm的全层骨缺损损伤模型；

(4)取适量骨蜡止血后，分别向2个组中加入生理盐水、短肽Sciobio-II填满软骨缺损伤口；

(5)用4-0丝线这层缝合伤口，术后用生理盐水冲洗伤口2次，碘伏消毒；

(6)做好标记，待其麻醉苏醒后，放回动物房；

(7)术后连续一周每天注射8万单位青霉素/只，以防伤口感染；

(8)分别在45天、90天时处死实验动物，截取股骨下端，置于4％多聚甲醛溶液中，过夜；

(9)测量骨缺损修复后直径，分析骨缺损修复情况；

从本实施例可以看出，采用新西兰大白兔12只(符合统计学要求)，随机分布，实验数据具有统计学意义。图9左是本发明所述自组装短肽Sciobio-II分别对兔股骨缺损修复45天、90天后的对比图。自组装短肽Sciobio-II对兔骨修复作用快，在第二个月是已基本完成修复。进一步分析伤口的数据(图9右)，发现，45天时，Sciobio-II兔成骨修复愈合完成约50％，而对照兔成骨修复愈合完成约37％，Sciobio-II修复速度较对照快1.33倍；90天时，Sciobio-II兔成骨修复愈合完成约100％，而对照兔成骨修复愈合仅完成约75％，Sciobio-II修复速度较对照快有非常明显的速度优势；同时，观察修复创面，使用Sciobio-II修复成骨损伤，界面较对照整齐，修复质量较对照好。表明Sciobio-II对骨组织中成骨组织的损伤修复的速度和质量等都具有显著提高。

实施例10：短肽Sciobio-II对兔膝关节软骨损伤的修复情况

为考察短肽Sciobio-II对骨(软骨)损伤的修复及生长情况，选取新西兰大白兔的膝关节软骨作为骨组织中软骨组织部分的软骨损伤修复模型，作为研究对象，考察它对软骨损伤的修复情况等。

本实施例中，实验用动物重量在2.5kg左右的成年新西兰大白兔，随机分布，6只，由重庆医科大学动物实验中心提供。

新西兰大白兔分为4组，进行下面的实验：

(1)取成年新西兰大白兔，用3％的戊巴比妥钠对兔进行腹腔注射；

(2)待完全麻醉后，碘酒消毒膝关节，铺巾；

(3)手术剪剪开膝关节内侧皮肤约2cm，逐层剥离皮肤及皮下组织，直至充分暴露关节囊，将实验动物膝关节伸直，用手推动髌骨使其向外侧脱位，充分暴露兔膝关节内侧踝关节面，用电动手钻在膝关节软骨正中心钻出直径为4mm，深度为5mm的全层软骨损伤模型；

(4)取适量骨蜡止血后，分别向四个组中加入生理盐水、短肽Sciobio-II、生长因子BMP-2、短肽+BMP-2溶液，填满软骨缺损伤口；

(5)将膝关节复位，用7-0丝线这层缝合伤口，术后用生理盐水冲洗伤口2次，碘伏消毒；

(6)做好标记，待其麻醉苏醒后，放回动物房；

(7)术后连续一周每天注射8万单位青霉素，以防伤口感染；

(8)分别在1月，2月，3月时处死实验动物，截取膝关节，置于4％多聚甲醛溶液中，过夜；

(9)取第2个月时实验动物做核磁共振，分析软骨损伤修复情况；

(10)用10％的EDTA脱钙液进行软骨脱钙处理，脱钙完成后，流水冲洗24h，常规石蜡包埋切片，HE染色后镜下拍片。

从本实施例可以看出，采用新西兰大白兔6只(符合统计学要求)，随机分布，实验数据具有统计学意义。图10是本发明所述自组装短肽Sciobio-II分别对兔膝关节软骨损伤修复1月、2月、3月后的对比图。自组装短肽Sciobio-II对兔膝关节软骨修复作用快，在第二个月是已基本完成修复。自组装短肽Sciobio-II和生长因子BMP-2对兔膝关节软骨的修复作用没有明显差异。

而图11为HE染色结果图，术后4周HE染色结果表明：

空白组(图11A)：软骨缺损处凹陷明显，修复区无软骨细胞和软骨凹陷产生，无新生血管生成；短肽Sciobio-II组(图11B)和生长因子BMP-2(图11C)组：基底部分及边缘仅见少许排列不规则的软骨细胞及软骨凹陷；短肽和加生长因子BMP-2组：修复区以纤维细胞为主，可见少量不规则排列的软骨细胞及软骨陷窝(图11D)。可以看出，独立的短肽组的修复质量较对照修复质量好。

图12为本发明所述自组装短肽Sciobio-II对兔膝关节软骨损伤修复2个月后的核磁共振图。短肽组的修复速度比空白对照组约快2.6倍，修复质量较对照好，而加入生长因子BMP-2组和短肽组无明显差异。

也表明Sciobio-II对骨组织中软骨组织的损伤修复的速度和质量等都具有显著提高。

以上所述实施例仅表达了本申请的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 罗忠礼

<120> 一种自组装短肽在骨组织损伤中快速修复的应用

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 16

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223> 端基保护

<400> 1

Arg Leu Glu Cys Lys Ala Asp Ala Arg Leu Glu Val Lys Ala Asp Ala

1 5 10 15

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> PCR扩增引物

<400> 2

5’-GAAGGTGAAG GTCGGAGTC -3’ 19

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> PCR扩增引物

<400> 3

5’-GAAGATGGTG ATGGGATTTC C -3’ 21

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> PCR扩增引物

<400> 4

5’-GCCAAACACA AACAGCGGA -3’ 19

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> PCR扩增引物

<400> 5

5’-GCAGTAAAAG GCGTGATACC CC -3’ 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> PCR扩增引物

<400> 6

5’-GTGGAAGAGC GGAGACTACT GG -3’ 22

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> PCR扩增引物

<400> 7

5’-TTGGGGTAGA CGCAAGACTC G -3’ 21

Claims

1.一种自组装短肽在骨组织损伤中快速修复的应用，所述自组装短肽的氨基酸序列为：Arg Leu Glu Cys Lys Ala Asp Ala Arg Leu Glu Val Lys Ala Asp Ala-NH₂。

2.如权利要求1所述的一种自组装短肽在骨组织损伤中快速修复的应用，其特征在于：所述骨组织为成骨组织或软骨组织。