CN104693277A - 一种自组装短肽及其在细胞三维培养中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种自组装短肽,其氨基酸序列为:Tyr Val Asn Lys Pro Arg Cys Cys Ala Ala Ala Ala Ala Ala,其中,第一至第六位氨基酸为D型氨基酸。本发明所述自组装短肽能够自组装形成纳米纤维支架并能够与纳米金结合,支撑多种细胞生长,可以在纳米生物医学领域,作为细胞三维培养的基质材料。

Description

一种自组装短肽及其在细胞三维培养中的应用
技术领域
本发明属于纳米生物医学领域,具体涉及一种自组装短肽及其在细胞三维培养中的应用。
背景技术
分子自组装指的是分子在不受外力介入的情况下,能够进行自我组织,自我聚集形成一种规则的结构,即能够从一个杂乱无序的状态转变成一个有序的状态。在最近的十几年里,分子自组装系统(如氨基酸)已经成为分子生物学、化学以及材料学等学科的交汇点,尤其是手性自组装短肽,已经发展成为了一类新兴的纳米生物材料。由它们构成的纳米纤维,作为细胞三维培养的基质材料,能模拟生物体内的三维基质微环境,具有高纯度、可降解及无免疫反应的突出优点,已被成功应用于细胞工程、组织工程及生物医学工程等领域。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型的自组装短肽,增加自组装短肽的种类,使之可在细胞三维实时分析培养中使用。
本发明的技术方案为:一种自组装短肽,其氨基酸序列为:Tyr Val Asn Lys Pro Arg Cys Cys Ala Ala Ala Ala Ala Ala,短肽碳端酰胺化其中,第一至第六位氨基酸为D型氨基酸,命名为GFS-15。
GFS-15,其分子量为1407.68。其自组装原理是通过分子之间非共价键相互作用,形成结构明确且稳定,并具有某些理化性质的超分子结构或分子聚集体。
实验表明,本发明所述短肽在金属盐离子、细胞培养基等环境下,能进行自组装形成纳米纤维。
实验表明,本发明所述自组装短肽形成的纳米纤维,细胞能在其上进行三维黏附、生长,所以,此自组装短肽可应用到动、植物细胞三维培养中。
上述细胞三维培养是指自组装短肽在制备细胞三维培养修饰纳米支架材料中的应用。
本发明具有以下有益效果:
1、提供了一种新型自组装短肽,增加自组装短肽类型。
2、提供了一种新型的自组装纳米生物医学材料,这种新型生物医学材料能够广泛的应用到纳米生物医学工程、细胞工程及生物工程及等领域,并具有明显的经济及其社会效益。
3、提供了一种细胞三维培养纳米支架材料,可广泛应用于生物医学领域。
附图说明
图1是本发明的自组装短肽GFS-15的分子结构示意图。
图2是本发明所述自组装短肽GFS-15高效液相(HPLC)色谱图。
图3是本发明所述自组装短肽GFS-15质谱(MS)图。
图4是本发明所述自组装短肽GFS-15的圆二色谱图,新型短肽GFS-15常温下的二级结构特征是在216nm处有一强负峰,在195nm处有一强正峰,峰形完好。
图5是本发明所述自组装短肽GFS-15的原子力显微图(AFM),图中:A表示0h时短肽GFS-15自组装形成细而短的纳米纤维丝;B表示24h后纳米纤维的长度增加,数量增多,形成三维的纳米纤维网络支架。
图6是本发明所述自组装短肽修饰金电极表面的电化学图,循环伏安图,把打磨好干净的金电极放入100uM的短肽溶液中浸泡48小时后,用电化学工作站测其循环伏安,发现48小时后的氧化还原峰减小,证明该短肽在金电极表面上形成了一层膜。
图7是本发明所述组装短肽GFS-15与纳米金混合24h形成纳米纤维丝并与纳米金包裹链接在的透射电镜扫描图(TEM),其中A图的放大倍数×(4000)倍图。B图的放大倍数×(8000)。
图8是本发明所述自组装短肽GFS-15形成水凝胶光学图片,刚果红染色,5mg/mL的短肽GFS-15盐离子溶液自组装24h(图8中A)后形成肉眼可见的透明胶状物质,形成松散的片层状薄膜;36h(图8中B)薄膜的厚度及大小都有所增加,但还是处于松散的状态;48h(图8中C)薄膜片层连接在一起,形成整个一层较为致密的膜片;72h(图8中D)该膜片没有明显的变化。
图9是本发明所述自组装短肽GFS-15的红细胞裂解实验数据图。
图10是用本发明所述自组装短肽GFS-15添加纳米金的三维培养细胞,细胞Caski的二维三维细胞培养图(图10中A为二维1day的40倍镜;图10中B为二维7day的40倍镜;图10中C为三维1day的40倍镜;图10中D为7day的40倍镜)可以该细胞在三维体系中可以生长,细胞圆球形,边界清楚,调节显微镜能看到模糊的细胞核界限,连续培养7d,细胞仍可以在本发明所述自组装短肽GFS-15形成的三维支架材料中生长。
具体实施方式
实施例1:由L-氨基酸构成的自组装短肽GFS-15的制备
1、材料
Fmoc-D-Tyr-OH(9-芴甲氧羰酰基-D-酪氨酸)、Fmoc-D-Val-OH(9-芴甲氧羰酰基-D-缬氨酸)、Fmoc-D-Asp(OtBu)-OH(芴甲氧羰酰基D-天冬氨酸-ε-叔丁氧羰酰基)、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH(9-芴甲氧羰酰基-D-赖氨酸-ε-叔丁氧羰酰基)、Fmoc-D-Pro-OH(9-芴甲 氧羰酰基-D-脯氨酸)、Fmoc-D-Arg(pbf)-OH(9-芴甲氧羰酰基-D-精氨酸-γ-叔丁氧羰酰基)、Fmoc-D-Cys-OH(9-芴甲氧羰酰基-D-半胱氨酸)、Fmoc-L-Ala-OH(9-芴甲氧羰酰基-L-丙氨酸)、HBTU(O-苯并三唑-1-基-N、N、N、N-四甲基尿六氟磷酸脂)和HOBT(1-羟基苯并三氮唑);哌啶,乙酸酐,溶剂:DMF(N、N-二甲基甲酰胺)、TFA(三氟乙酸)、DCM(二氯甲烷)、NMM(N-甲基吗啉)。
2、制备方法 
采用Fmoc(芴甲氧羰基)保护的固相合成法,工艺步骤如下:
(1)称取0.5mmol/g Rink amide resin 20g于肽合成器中,用200mlDCM浸泡树脂30分钟后,再用400mlDMF分三次清洗树脂,每次清洗时间为3min,抽滤干洗涤液。经过10-20分钟用100ml 20%哌啶/DMF震荡反应30分,反应结束后,抽滤干洗涤液,用400mlDMF清洗树脂5次,每次清洗3min,洗完后取少许树脂做茚三酮检查,树脂呈阳性,然后向反应器中加入原料:
加入后震荡反应30分钟,用400mlDMF清洗5次,每次清洗3min,取少许树脂做茚三酮检查,树脂呈阴性。
上述原料加完后,反应40min,抽滤,用30mlDMF洗涤树脂4次,每次3分钟,取少许树脂做茚三酮检查,树脂呈阴性。
(2)向合成器皿中加入5ml 20%哌啶/DMF震荡反应30分钟,反应结束后,抽滤出反应液,再用40mlDMF分4次洗涤树脂,然后在取少许树脂做茚三酮检查,树脂呈阳性,向反应器皿中加入以下原料:
上述原料加完后,震荡反应40分钟,反应结束后,用30mlDMF分4次洗涤,每次3分钟,取少许树脂做茚三酮检查,树脂呈阴性。
变换步骤(2)中(a)原料,(b)(C)(d)原料及加入量不变,重复步骤(2)的操作:步 骤(2)中(a)原料依次替换为):Fomc-L-Ala-OH(4.455g×4次)。
Fomc-D-Cys-OH(12.12g×2次)Fmoc-D-Arg(pbf)-OH(8.71g)Fmoc-D-Pro-OH(5.755g)Fmoc-D-Lys(Boc)-OH(7.31g)Fmoc-D-Asp(OtBu)-OH(6.605g)Fmoc-D-Val-OH(5.855g)Fmoc-D-Tyr-OH(9.06g)。
再重复一次(1)(2)(3)步骤的操作,各步骤的原料及用量不变;最后一个结束后,脱出Fmoc-保护基,20%哌啶/DMF(体积浓度)反应30分钟,洗净树脂,加入160ml 50%乙酸酐/DMF(乙酸酐的体积浓度)反应30分钟,用40mlDMF洗净树脂,再用甲醇洗涤树脂4次,抽滤干,真空干燥8小时。将50ml 90%TFA/DCM(TFA的体积浓度)加入盛有肽树脂的容器中,反应3小时,抽滤,浓缩滤液,向残留液中加乙醚,析出白色固体,抽滤固体,即得到粗肽,通过HPLC(高效液相色谱法)纯化,经冷冻干燥即得本发明所述短肽GFS-15,氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO.1所述。
实施例2:短肽GFS-15的高效液相色谱和质谱检测与三维分子模型绘制
对实施例1制备的短肽GFS-15采用普通画图软件(Hyperchem 7.5,www.hyper.com)绘制得到分子结构示意图,见图1,由图可看出氨基酸的空间分布。
将实施例1制备的短肽GFS-15利用高效液相色谱(HPLC)检测,参见图2,由图2中的谱峰面积可计算其纯度已达到95%。将实施例1制备的短肽GFS-15采用质谱(MS)检测,参见图3,说明其分子量为1407.68是正确的。
实施例3:自组装短肽GFS-15的圆二色性检测和原子力显微镜(AFM)检测
用去离子水配制100μM短肽GFS-15溶液,圆二色谱仪(AVIV 400 CD spectrometer)对短肽GFS-15进行CD检测,参数设置:扫描波长为190-260nm,光径为2mm。本发明短肽GFS-15常温下的二级结构特征是在216nm处有一强负峰,在195nm处有一强正峰,峰形完好(见图4)。这一结果表明,新型短肽GFS-15具有稳定的β-sheet二级结构,在特定的条件下发生自组装,形成纳米纤维。
用生理盐水配制500μM的短肽GFS-15溶液,在室温下让短肽自组装48小时,分别在0和24h时制作样本。在新撕开的云母片上滴加10μl短肽溶液,静置60s,再用1ml去离子水冲洗3次,吸干云母片上的水分,将含有检测样品的云母片置于超净的工作台上,自然晾干后,用原子力显微镜观察,扫描模式为敲打模式。0h时短肽GFS-15自组装形成细而短的纳米纤维丝;24h后纳米纤维的长度增加,数量增多,形成三维的纳米纤维网络支架(见图6)。
实施例4:自组装短肽GFS-15与纳米金混合后自组装24h的透射电镜显微镜(TEM)检查
用去离子水配制成50μL,600μM的短肽GFS-15,再加入25L的纳米金溶液和25的PBS 溶液混合,放置24h后取样,用透射电镜观察并在不同的放大倍数下观察拍照(见图7)。
实施例5:短肽修饰金电极表面的循环伏安法
用CHI600A(USA)工作站进行循环伏安实验,采用三电极体系:金电极(d=2mm)为工作电极;铂电极为对电极;饱和甘汞为参比电极,支持电解液为5.0mM[Fe(CN)6]3-和0.1M KCl溶液,扫描速度为0.05mVS-1.电压范围从-0.2到+0.5V.先把金电极打磨成镜面,然后放入然后分别在硝酸、乙醇、水中超声,在0.5M硫酸中扫描活化金电极得到标准峰后。洗净金电极浸入100uM的短肽中放置48h,拿出待干后测其循环伏安图。发现48小时后的氧化还原峰比裸金电极减小,证明该短肽在金电极表面上形成了一层膜,阻止了电子的转移。
实施例6:用短肽GFS-15的刚果红染色实验及自组装形态和效果
用生理盐水配制5mg/ml短肽GFS-15溶液,在25℃下孵育24到72小时。取10μl水凝胶涂抹在载玻片上,用刚果红液染色30s,在光镜下观察(结果见图7)。5mg/mL的短肽GFS-15盐离子溶液自组装24小时后形成肉眼可见的透明胶状物质,形成松散的片层状薄膜;36h薄膜的厚度及大小都有所增加,但还是处于松散的状态;48h薄膜片层连接在一起,形成整个一层较为致密的膜片;72h该膜片没有明显的变化。72h后自组装短肽GFS-15形成的水凝胶含水量可高达99%,成透明状的胶体,离心管倒置后,该凝胶不会下滑。
实施例7:用自组装短肽GFS-15对细胞裂解实验
(1)分别用生理盐水和去离子水配制不同浓度(1、10、100μg/ml)的短肽溶液。
(2)取Sprague Dawleg(SD)大鼠(200-250g,雌雄随机,重庆医科大学动物中心提供,手术过程遵守动物实验国家标准)新鲜冻存血液(EDTA抗凝),1500r离心20min,将白细胞层及其血浆层全部移除,用生理盐水洗2-3次,取红细胞4滴,加入100ml生理盐水中,配制成4%红细胞溶液(RBC)。
(3)取100μl短肽溶液和400μlRBC,400μl生理盐水,加入离心管中,在37℃条件下孵化1小时后,5000r离心15min,取上清液。
(4)用分光光度计在570nm波长下检测吸光度。
(5)阳性对照组加入红细胞裂解液,阴性对照组加入生理盐水。
数据表明,3种不同浓度的短肽溶液对红细胞的裂解度相近,与阳性对照组比较相差0.340左右,与阴性对照组相差0.015左右,且裂解度都不超过0.060(<0.100)(见图8)。这一结果说明3种不同浓度的短肽GFS-15溶液对细胞膜都不具有裂解作用,且自组装24h以后的短肽溶液与未组装前对细胞膜的作用相似。
实施例8:用短肽GFS-15对细胞三维培养
分别配制所需浓度的自组装短肽溶液与ECA109细胞(重庆医科大学分子与肿瘤医学实验 室赠送)悬液,取等体积的短肽溶液、细胞悬液混合均匀,按照每孔400μl的方式滴加到24孔板中,其中24孔板里放入喷金后的细胞爬片静置10min,再加入培养基连续培养1周。细胞增殖实验用CCK-8检测,采用酶标仪测试。
细胞三维培养的操作如下:
(1)将实施1制备的自组装短肽GFS-15配制成各浓度溶液(2.5、3.5、4.5、5.5、6.5、7.5mg/ml),取适量(100-300μl)移入离心管中备用;
(2)培养好的ECA109细胞用0.25%胰酶消化,再移入离心管中,1000rmp/min离心沉淀细胞10min,弃上清液,加入蔗糖溶液(质量浓度为20%)记数到细胞5×105个/ml,分别取300μl备用;
(3)在离心管中快速混合(1)和(2)中的溶液,得短肽和细胞的混合液;
(4)取(3)中的混合液400μl滴加到24孔板中;
(5)滴加RPMI-1640完全培养基200μl,自组装5-10min;
(6)滴加RPMI-1640完全培养基1500μl,放在细胞培养箱培养30-60min;
(7)取出一半的细胞培养孔板液体,加入等体积的新鲜的RPMI-1640的完全培养基,换液完毕后,置于细胞培养箱继续培养2-5天。
经典二维细胞培养作为阴性对照,倒置显微镜显示Caski细胞呈不规则形态,边界清晰,外观近似梭形。运用GFS-15自组装形成的纳米纤维作为三维支架材料培养细胞,发现细胞Caski可以在该三维体系中生长,细胞圆球形,边界清楚,调节显微镜能看到模糊的细胞核界限(见图9)。当短肽GFS-15浓度为5.5mg/mL时,Caski细胞24-72h时生长较缓慢,72h后细胞增长加快;在GFS-15三维支架中,细胞初期的生长速度不及正常二维细胞培养组(阴性对照)。连续培养7d,仍可见细胞在GFS-15形成的三维支架材料中生长,且形态良好(见图9)。该结果表明Caski细胞可在GFS-15形成的三维支架中生长,且生长形态良好。
以上所述实施例仅表达了本申请的具体实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本申请技术方案构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本申请的保护范围。

Claims (3)

1.一种自组装短肽,其特征在于,其氨基酸序列为:Tyr Val Asn Lys Pro Arg Cys Cys AlaAla Ala Ala Ala Ala,短肽碳端酰胺化,其中,第一至第六位氨基酸为D型氨基酸。
2.根据权利要求1所述的一种自组装短肽在细胞三维培养中的应用。
3.根据权利要求2所述的一种自组装短肽在细胞三维培养中的应用,其特征在于,所述细胞三维培养是指制备细胞三维培养纳米支架材料。
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