CN104826126A - 一种制备高机械强度的三组分荧光水凝胶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种制备高机械强度的三组分荧光水凝胶的方法。本发明解决的技术问题是提供一种机械强度高，荧光性强又兼具良好生物兼容性的三组分水凝胶的制备方法。一种制备高机械强度的三组分荧光水凝胶的方法，包括如下工序：1）设计分子结构并合成出凝胶因子； 2)筛选适当的条件以获得三组分水凝胶；3)对此凝胶进行形貌、结构及性能的表征；4）测试凝胶对不同刺激物的响应性，探索期应用价值。本发明通过自组装方法制备了机械强度高，荧光性强又兼具良好生物兼容性的三组分水凝胶，并且该凝胶具有刺激-响应性。
Description
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种制备高机械强度的三组分荧光水凝胶的方法。
背景技术
分子自组装是一种新颖的材料的制备方法，利用分子间的非共价作用如氢键、范德华力、静电力、疏水作用力、π-π堆积作用等形成具有特定排列顺序的分子聚集体，从而可以得到具有新奇功能和特性的自组装材料如纳米管、纳米纤维、纳米微囊、纳米缎带。这些材料在分子器件、化学生物传感器、生物医药等方面具有十分重要的应用前景。
作为生命体的基本构筑单元，氨基酸以其良好的生物兼容性和生物可降解性，以及其潜在的可开发性引起了人们的关注。氨基酸可以一种或多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合成多肽。由于多肽链段上氨基酸残基具有不同的化学结构，多肽可以利用其肽键间氢键作用以及氨基酸残基之间的氢键作用、静电作用、疏水性作用以及π-π堆积作用等有效实现分子自组装。氨基酸也可以以共价键与有机分子结合以有机-氨基酸共价化合物的形式作为自组装聚集体的构筑单元，这样可以将氨基酸与有机分子的性质有机的融合，从而呈现出氨基酸和有机分子所不具备的新的性质。
氨基酸无论是缩聚成多肽还是与有机分子接合形成构筑单元，得到的纳米材料大部分都具有良好的生物兼容性。这使得此类生物材料在药物缓释，生物传感器，生物医药以及细胞培养方面均具有良好的应用前景。
然而目前利用自组装方法制备多组分（大于2种组分）功能性材料存在一定困难，原因在于自组装的不可控性与自组装材料的低机械性能。探索一种制备多组分较高机械强度的多功能水凝胶，具有重要意义。
发明内容
（1）要解决的技术问题
本发明为了克服小分子凝胶机械强度小的缺点，本发明解决的技术问题是提供一种机械强度高，荧光性强又兼具良好生物兼容性的三组分水凝胶的制备方法。
（2）技术方案
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种制备高机械强度的三组分荧光水凝胶的方法，包括以下工序：
1）设计分子结构并合成出凝胶因子；
2）筛选适当的条件以制备凝胶；
3）对此凝胶进行形貌、结构及性能的表征；
4）测试凝胶对不同刺激物的响应性，探索其应用价值。
在所述工序1）中设计分子结构包括如下步骤：
a ) 本专利用氨基酸衍生物N, N’-二谷氨酸-苝四甲酸二酰亚胺作为主体分子，由于此分子为平面共轭结构，能在分子与分子之间形成较强的π-π堆积作用，同时在溶液状态下也具有较强的荧光；然而，若仅有单组份主体分子自组装得到的材料功能较少，应用范围不广；为了弥补以上所述的欠缺，我们尝试加入客体分子核黄素与三聚氰胺加强或增加材料的功能的多样性，核黄素别名维生素B2，是人体不可缺少的一种营养素，同时也是一种药物，三聚氰胺则具有独特的分子结构，适当条件下容易与核黄素形成三重氢键，可以增加凝胶的机械强度；以水为溶剂，超声处理0.1-1.0小时，客体分子核黄素与三聚氰胺通过三重氢键结合，主体分子再与客体分子核黄素形成氢键，主体分子与主体分子发生π-π堆积，如此循环便形成凝胶;
在所述工序1）中合成出凝胶因子包括如下步骤：
a )将1.0 mmol 3,4,9,10-苝四甲酸二酐，1.5-2.5 mmol谷氨酸和2.0 g咪唑加入圆底烧瓶中，在氮气保护下加热6 h，并控制反应温度在120-128℃，形成热溶液；
b ) 然后往该热的溶液中倒入25 ml的已制得的无水乙醇，回流6 h,将其静置过夜。然后将该产物用旋转蒸发仪旋干，加入1 mol/L HCl使之酸化，过滤，得沉淀物，烘干，得深紫红色固体N, N’-二谷氨酸-苝四甲酸二酰亚胺0.51-0.60 g，产率为78-92%；
在所述工序2）中，制备方法包括如下步骤：
a ) 称取0.01 mmol N, N’-二谷氨酸-苝四甲酸二酰亚胺， 0.005-0.02 mmol核黄素和0.001-0.02 mmol 三聚氰胺于带塞透明试管，加入1-3 ml 蒸馏水；
b ) 迅速剧烈震荡，而后放入超声仪中超声一小时，使该混合物先溶解，再继续超声，使之发生胶凝化，得到凝胶体系；
在所述工序3）中，操作方法包括如下步骤：
a ) 以水为溶剂，用工序2）的方法将此凝胶配制成浓度为10-5 mol/L溶液， LS55荧光光谱仪测定其发射信号；
b ) 以水为溶剂，用工序2）的方法将此凝胶配制成浓度为5×10-3 -10-4 mol/L溶液，再将溶液滴于粘在导电胶上的硅片上，自然干燥，并于FEI QUANTA 450型扫描电子显微镜上获得其组装形貌图，加速电压为15.0 kV；
c ) 将上述b)中浓度为10-4 mol/L溶液滴于玻璃培养皿中，干燥后于OLYMPUS 公司生产的FV 1000型共聚焦激光扫描显微镜下成像，以488 nm为激发波长，得到共聚焦激光扫描显微镜图；
d ) 将新制备的浓度为5×10-3-10-2 mol/L水凝胶于HAAKE RheoStress 6000型流变仪中加以测试，观察弹性模量和粘性模量的变化，探索两模量之间的关系；
工序3）中该凝胶生物兼容性测定方法如下：
a ) 将赫拉细胞置于含10% FBS的DMEM培养基的96孔细胞培养板中，密度为105个细胞每个孔，培养过夜；
b ) 培养后的细胞用PBS溶液洗涤后的在含不同浓度凝胶稀释成的溶液(10, 20, 50, 100 μmol/L)的培养液中培养24 h；
c ) 将b )中细胞用PBS溶液洗涤后，加入噻唑蓝在37℃下孵育4 h；
d ) 处理后于SpectraMax M5中在490 nm处测定吸光度；
e ) 将结果换算和作图则得到细胞存活率。按以下公式计算细胞的存活率：
细胞存活率（%）=（实验组吸光度值/对照组吸光度值）×100
实验结果由三组平行实验数据求平均值和标准偏差得到；
在所述工序4）中测试凝胶对不同刺激物的响应性包括如下步骤：
a ) 以水为溶剂，用工序2）的方法制成浓度为10-3 mol/L凝胶；
b ) 向该凝胶中加入乙酸，pH=1.0-4.0的HCl溶液，pH=1.0-3.0的NaCl溶液或0.1-1 mol/L NaOH溶液，观察现象；
工序4）中凝胶的应用操作步骤如下:
a ) 以PBS缓冲液为溶剂，配置浓度分别为0, 6.0，12.0, 15.0, 18.0, 24.0μg/mL 的核黄素，在444 nm处测定其吸收值,得到标准曲线；
b ) 以水为溶剂，用工序2）的方法制成三份体积为1.0 mL浓度为10-2 mol/L凝胶；
c ) 将凝胶转移到100 mL锥形瓶中，缓慢加入100.0 mL PBS缓冲液，于水浴下进行药物核黄素的缓释，开始计时；每2 h 取一次样，稀释后于UV-2700中在444 nm处测定其吸收值，得到释放浓度；
优选地，在所述工序1）中合成出凝胶因子步骤a)中反应最佳温度为120℃；优选地，N, N’-二酪氨酸-苝四甲酸二酰亚胺的合成方法同所述工序1）中凝胶因子的合成；
优选地，在所述工序2）中，制备方法中步骤a)中最佳方案为称取N, N’-二谷氨酸-苝四甲酸二酰亚胺0.01 mmol，核黄素为0.02 mmol和0.01 mmol 三聚氰胺于带塞透明试管，加入2 mL 蒸馏水；
优选地，在所述工序3）中步骤b)中最佳浓度为10-4 mol/L;
优选地，在所述工序3）中步骤d)中最佳浓度为5×10-3 mol/L；
优选地，在所述工序3）中步骤d)中凝胶制备过程中超声时间需保持一小时。
优选地，在所述工序4）中测试凝胶对不同刺激物的响应性步骤b)中 HCl溶液的最佳pH为1.0，NaCl溶液的最佳pH为1.0， NaOH溶液的最佳浓度为1 mol/L。
优选地，在工序4）中凝胶的应用操作步骤c）中最佳缓释温度为37℃。
通过设计合成主体分子N, N’-二谷氨酸-苝四甲酸二酰亚胺，引入核黄素和三聚氰胺客体分子，通过自组装的方法，得到了机械强度高，荧光性强又兼具良好生物兼容性的三组分水凝胶。
利用荧光光谱仪测定荧光发射光谱，利用激光共聚焦显微镜测试凝胶荧光成像，利用扫描电子显微镜测试凝胶的组装形貌，实现了通过自组装方法制备机械强度高，荧光性强又兼具良好生物兼容性的三组份水凝胶的方法。
（3）有益效果
（a）本发明通过设计合成氨基酸衍生物N, N’-二谷氨酸-苝四甲酸二酰亚胺为主体分子，引入药物核黄素和三聚氰胺作为客体分子，通过自组装方法制备了机械强度高，荧光性强又兼具良好生物兼容性的三组分水凝胶。
（b）目前为止，三组分凝胶非常罕见，还没有高机械强度的三组分荧光水凝胶的制备方法，所以此三组分水凝胶非常具有新颖性和创造性。
（c）本发明中此三组分水凝胶是载药凝胶，同时载入的药物核黄素是形成凝胶必不可少的成份，且在缓释过程中能将客体分子核黄素缓释出来，这种情况在载药凝胶方面比较罕见，高机械强度的三组分荧光水凝胶的制备方法还，因此具有新颖性和创造性。
（d）本发明利用荧光光谱仪测试凝胶荧光发射光谱，能够有效地确定凝胶的荧光性能。
（e）本发明利用激光共聚焦显微镜测试凝胶荧光成像，表明此凝胶具有纤维状结构，且具有较强的荧光性。
（f）本发明利用流变仪测试凝胶的机械强度，结果表明此凝胶有很强刚性，机械强度很大。
（g）本发明利用细胞毒性试验测试凝胶对细胞的毒性大小，结果表明此凝胶毒性很小，生物兼容性非常好。
（h）本发明对凝胶进行缓释，结果表明在PBS缓冲液中核黄素可缓慢释放。
（i）本发明对凝胶进行调控，结果表明此凝胶对酸碱产生响应性。
附图说明
图1是N, N’-二谷氨酸-苝四甲酸二酰亚胺：核黄素：三聚氰胺=1：2：2凝胶的SEM图：(a)凝胶在大范围的SEM图（插入部分为宏观的光学图片）；(b)凝胶在小范围的SEM图。
图2是N, N’-二谷氨酸-苝四甲酸二酰亚胺：核黄素：三聚氰胺=1：2：2和1:1:0.1凝胶稀释成的溶液的荧光发射光谱(10-5 mol/L溶液) 。
图3是N, N’-二谷氨酸-苝四甲酸二酰亚胺：核黄素：三聚氰胺=1：2：2凝胶的共聚焦荧光(a)、明场(b)和叠加(c)图，共聚焦显微镜激发波长为488 nm。
图4是N, N’-二谷氨酸-苝四甲酸二酰亚胺：核黄素：三聚氰胺=1：2：2凝胶的：(a)应力扫描图，(b)频率扫描图，(c)时间扫描图。
图5是N, N’-二谷氨酸-苝四甲酸二酰亚胺：核黄素：三聚氰胺=1：2：2, 1:2:0.1, 1:1:0.1凝胶的：(a)细胞毒性实验结果，(b)核黄素的缓释曲线。
图6是 N, N’-二谷氨酸-苝四甲酸二酰亚胺：核黄素：三聚氰胺=1：2：2和1:1:0.1凝胶对外界刺激-响应性的光学图片从左至右：乙酸调节(1); 1.0 mol/L盐酸溶液调节(2)；pH=1 NaCl (wt%, 0.9)调节(3)；1.0 mol/L NaOH调节 (4)。
图7是 N, N’-二谷氨酸-苝四甲酸二酰亚胺：核黄素：三聚氰胺=1：2：2和1:1:0.1凝胶对外界刺激-响应性的SEM图：(a) 乙酸调节；(b) 1.0 mol/L盐酸溶液调节；(c) pH=1 NaCl (wt%, 0.9)调节；(d) 1.0 mol/L NaOH调节。
图8是N, N’-二谷氨酸-苝四甲酸二酰亚胺：核黄素：三聚氰胺=1：1：0.1凝胶的SEM和激光共聚焦图:(a)凝胶在大范围的SEM图；(b)凝胶在小范围的SEM图。
图9是N, N’-二谷氨酸-苝四甲酸二酰亚胺：核黄素：三聚氰胺=1：1：0.1凝胶的(a)应力扫描图，(b)频率扫描图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
1. 设计分子结构并合成出凝胶因子：
1）所使用物质的结构：（1）N, N’-二谷氨酸-苝四甲酸二酰亚胺，（2）N, N’-二酪氨酸-苝四甲酸二酰亚胺，（3）三聚氰胺，（4）核黄素，如下式所示：
2）凝胶因子的合成：a )将1.0 mmol 3,4,9,10-苝四甲酸二酐，2.5 mmol氨基酸谷氨酸和2.0 g咪唑加入圆底烧瓶中，在氮气保护下加热6 h，并控制反应温度在120℃，形成热溶液；
b ) 然后往该热的溶液中倒入25 mL的已制得的无水乙醇，回流6 h，将其静置过夜。然后将该产物用旋转蒸发仪旋干，加入1 mol/L HCl使之酸化，过滤，得沉淀物，烘干，得深紫红色固体N, N’-二谷氨酸-苝四甲酸二酰亚胺0.59 g，产率为91%；
2. 筛选适当的条件以制备凝胶：称取0.01 mmol N, N’-二谷氨酸-苝四甲酸二酰亚胺， 0.02 mmol核黄素，0.02 mmol 三聚氰胺 于带塞透明试管，加入2.0 mL 蒸馏水。迅速剧烈震荡，而后放入超声仪中超声0.1-1.0小时，使该混合物先溶解，再发生胶凝化，得到N, N’-二谷氨酸-苝四甲酸二酰亚胺：核黄素：三聚氰胺=1：2：2酒红色凝胶（如图1所示）。作为对照，相同条件下，任意单组分或二组分均无法得到凝胶。另外，相同条件下，N, N’-二酪氨酸-苝四甲酸二酰亚胺：核黄素：三聚氰胺=1：2：2体系无法得到凝胶。
3. 对此凝胶进行形貌、结构及性能的表征：(a)检测凝胶的表面形貌。利用扫描电子显微镜（SEM）对材料表面进行表面结构识别，并检测该凝胶为纤维状纳米结构，纤维直径在200-700 nm左右，如图1所示。
(b)检测凝胶的荧光性。荧光光谱（电压自动，狭缝宽度3.0），激光共聚焦显微镜等手段检测结果表明，该材料具有较强的荧光强度（如图2，图3所示）。
(c)检测凝胶的机械性能。将新制备的浓度为10-2 mol/L水凝胶于流变仪中加以测试，观察弹性模量和粘性模量的变化，探索两模量之间的关系。结果如图4所示，凝胶的弹性模量比粘性模量高一个数量级，表明凝胶的弹性较好刚性强，且在较长时间内凝胶结构保持良好，并未坍塌。
(d)检测凝胶的生物兼容性。将赫拉细胞置于含10% FBS的DMEM培养基的96孔培养基板中，密度为105个细胞每个孔，培养过夜。将用PBS溶液洗涤后的培养后的细胞在含不同浓度凝胶稀溶液 (10, 20, 50, 100 μmol/L)的培养液中培养24 h。将上述细胞用PBS溶液洗涤后，加入噻唑蓝在37℃下孵育4 h。处理后于SpectraMax M5中在490 nm处测定吸光度。之后将结果换算和作图则得到细胞存活率。如图5(a)所示，细胞存活率仍大于85%, 结果表明凝胶生物兼容性良好。
4. 测试凝胶对不同刺激物的响应性，探索其应用价值：a)向该凝胶中加入乙酸和1.0 mol/L盐酸溶液，宏观上如图6左（1）（2）所示，凝胶发生解聚，凝胶变成略浑浊的溶液状态；此溶液在微观上如图7a, b所示，由纤维状结构变成方块状结构。
b) 以PBS缓冲液为溶剂，配置浓度分别为0, 6.0，12.0, 15.0, 18.0, 24.0 μg/mL的核黄素，在444 nm处测定其吸收值,得到标准曲线。以水为溶剂，制成三份体积为1.0 mL浓度为10-2 mol/L凝胶；将凝胶转移到100 mL锥形瓶中，缓慢加入100.0 mL PBS缓冲液，于37℃恒温水域条件下进行核黄素的缓释并开始计时；每2 h 取一次样，稀释后于UV-2700中在444 nm处测定其吸收值，得到释放浓度。缓释结果如图5（b）所示，在12 h之后，缓释率达到80%，这表明凝胶的缓释率良好，有希望应用于药物缓释领域。
实施例2
1. 设计分子结构并合成出凝胶因子：
1）设计分子结构：所使用物质的结构为（1）N, N’-二谷氨酸-苝四甲酸二酰亚胺，（2）N, N’-二酪氨酸-苝四甲酸二酰亚胺，（3）三聚氰胺，（4）核黄素，如下式所示：
2）凝胶因子的合成：a )将1.0 mmol 3,4,9,10-苝四甲酸二酐，2.5 mmol谷氨酸和2.0 g咪唑加入圆底烧瓶中，在氮气保护下加热6 h，并控制反应温度在120℃，形成热溶液；
b ) 然后往该热的溶液中倒入25 mL的已制得的无水乙醇，回流6 h，将其静置过夜。然后将该产物用旋转蒸发仪旋干，加入1 mol/L HCl使之酸化，过滤，得沉淀物，烘干，得深紫红色固体N, N’-二谷氨酸-苝四甲酸二酰亚胺0.57 g，产率为88%；
2. 筛选适当的条件以制备凝胶：称取0.01 mmol N, N’-二谷氨酸-苝四甲酸二酰亚胺， 0.01 mmol核黄素，0.001 mmol 三聚氰胺于带塞透明试管，加入1.0 mL 蒸馏水。迅速剧烈震荡，而后放入超声仪中超声一小时，使该混合物先溶解，再发生胶凝化，得到酒红色N, N’-二谷氨酸-苝四甲酸二酰亚胺：核黄素：三聚氰胺 =1：1：0.1凝胶。作为对照，任意单组份或二组份均无法得到凝胶。另外，相同条件下N, N’-二酪氨酸-苝四甲酸二酰亚胺：核黄素：三聚氰胺 =1：1：0.1体系无法得到凝胶。
3. 对N, N’-二谷氨酸-苝四甲酸二酰亚胺：核黄素：三聚氰胺 =1：1：0.1凝胶进行形貌、结构及性能的表征：(a) 检测凝胶的表面形貌。利用扫描电子显微镜（SEM）对材料表面进行表面结构识别，并检测该凝胶为纤维状纳米结构，纤维直径在150-670 nm左右（图8a, b）。
(b)检测凝胶的荧光性。荧光光谱（电压自动，狭缝宽度5.0），激光共聚焦显微镜等手段检测结果表明，该材料具有较强的荧光强度（如图2，图8c所示）。
(c)检测凝胶的机械性能。将新制备的浓度为10-2 mol/L水凝胶于流变仪中加以测试，观察弹性模量和粘性模量的变化，探索两模量之间的关系。结果如图9所示，凝胶的弹性模量比粘性模量高一个数量级，表明凝胶的弹性较好刚性强，由于此凝胶比例为N, N’-二谷氨酸-苝四甲酸二酰亚胺：核黄素：三聚氰胺 =1：1：0.1，核黄素与三聚氰胺比例下降，其中三聚氰胺的亮急剧减少，导致形成凝胶过程中，三重氢键所占比例减少，从而导致凝胶机械强度降低。
(d)检测凝胶的生物兼容性。将赫拉细胞置于含10% FBS的DMEM培养基的96孔培养基板中，密度为105个细胞每个孔，培养过夜。将用PBS溶液洗涤后的培养后的细胞在含不同浓度凝胶稀溶液 (10, 20, 50, 100 μmol/L)的培养液中培养24 h。将上述细胞用PBS溶液洗涤后，加入噻唑蓝在37℃下孵育4 h。处理后于SpectraMax M5中在490 nm处测定吸光度。之后将结果换算和作图则得到细胞存活率。如图5(a)所示，N, N’-二谷氨酸-苝四甲酸二酰亚胺：核黄素：三聚氰胺 =1：1：0.1凝胶对细胞毒性最小，培养过后细胞存活率仍大于87%, 结果表明凝胶生物兼容性良好。
4. 测试凝胶对不同刺激物的响应性，探索其应用价值：a) 向该凝胶中加入pH=1 NaCl (wt%, 0.9)和 1.0 mol/L NaOH溶液。宏观上如图6左（3）（4）所示，凝胶发生解聚，凝胶变成较清亮的溶液状态；此溶液在微观上如图7c, d所示，图7c中，纤维状结构消失；图7d中纤维状结构变成雪花状结构。
b) 以PBS缓冲液为溶剂，配置浓度分别为0, 6.0，12.0, 15.0, 18.0, 24.0 μg/mL的核黄素，在444 nm处测定其吸收值,得到标准曲线。以水为溶剂，制成三份体积为1.0 mL浓度为10-2 mol/L凝胶；将凝胶转移到100 mL锥形瓶中，缓慢加入100.0 mL PBS缓冲液，于37℃恒温水域条件下进行核黄素的缓释并开始计时；每2 h 取一次样，稀释后于UV-2700中在444 nm处测其吸收值，得到释放浓度。缓释结果如图5（b）所示，在12 h之后，缓释率达到80%，这表明凝胶的缓释率良好，有希望应用于药物缓释领域。
以上所述实施例仅表达了本发明的优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形、改进及替代，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (2)
1.一种制备较高机械性能的三组分荧光水凝胶的方法，其特征在于，包括以下工序：
1）设计分子结构并合成出凝胶因子；
2）筛选适当的条件以制备水凝胶；
3）对此凝胶进行形貌、结构及性能的表征；
4）测试凝胶对不同刺激物的响应性，探索其应用价值；
根据权利要求1所述的一种制备较高机械性能与生物兼容性的三组分荧光水凝胶的方法，其特征在于，在所述工序1）中设计分子结构包括如下步骤：
a )利用氨基酸衍生物N, N’-二谷氨酸-苝四甲酸二酰亚胺作为主体分子，核黄素与三聚氰胺作为客体分子；以水为溶剂，超声处理0.1-1.0小时，客体分子核黄素与三聚氰胺通过三重氢键结合，主体分子再与客体分子核黄素形成氢键，主体分子与主体分子发生π-π堆积，如此循环便形成凝胶；分子结构如式所示： 。
2.根据权利要求1所述的一种制备较高机械性能与生物兼容性的三组分荧光水凝胶的方法，其特征在于，在所述工序1）中合成出凝胶因子包括如下步骤：
a )将1.0 mmol 3,4,9,10-苝四甲酸二酐，1.5-2.5 mmol谷氨酸和2.0 g咪唑加入圆底烧瓶中；在氮气保护下加热6 h，并控制反应温度在115-125℃，形成热溶液；
b) 然后往该热的溶液中倒入25 mL的已制得的无水乙醇，回流6 h，将其静置过夜；然后将该产物用旋转蒸发仪旋干，加入1 mol/L HCl使之酸化，过滤，得沉淀物，烘干，得深紫红色固体N, N’-二谷氨酸-苝四甲酸二酰亚胺0.51-0.60 g，产率为78-92%；
在所述工序2）中，制备方法包括如下步骤：
a ) 称取0.01 mmol N, N’-二谷氨酸-苝四甲酸二酰亚胺， 0.005-0.02 mmol核黄素和0.001-0.02 mmol 三聚氰胺于带塞透明试管，加入1-3 mL 蒸馏水；
b ) 迅速剧烈震荡，而后放入超声仪中超声0.1-1.0小时，使该混合物先溶解，再继续超声，使之发生胶凝化，得到凝胶体系；
在所述工序3）中，操作方法包括如下步骤：
a ) 以水为溶剂，用工序2）的方法将得到的凝胶体系配制成浓度为10-5 mol/L溶液， 用LS55荧光光谱仪测定其发射信号；
b ) 以水为溶剂，用工序2）的方法将得到的凝胶体系配制成浓度为5×10-3 -10-4 mol/L溶液，再将溶液滴于粘在导电胶上的硅片上，自然干燥，并于FEI QUANTA 450型扫描电子显微镜上获得其组装形貌图，加速电压为15.0 kV；
c ) 将上述b)中浓度为10-4 mol/L溶液滴于玻璃培养皿中，干燥后于OLYMPUS 公司生产的FV 1000型共聚焦激光扫描显微镜下成像，以488 nm为激发波长，得到共聚焦激光扫描显微镜图；
d ) 将新制备的浓度为5×10-3-10-2 mol/L水凝胶于HAAKE RheoStress 6000型流变仪中加以测试，观察弹性模量和粘性模量的变化，探索两模量之间的关系；
工序3）中该凝胶生物兼容性测定方法如下：
a ) 将赫拉细胞置于含10% FBS的DMEM培养基的96孔细胞培养板中，密度为105 个细胞每个孔，培养过夜；
b ) 培养后的细胞用PBS溶液洗涤后的在含不同浓度凝胶稀释成的溶液(10, 20, 50, 100 μmol/L)的培养液中培养24 h；
c ) 将b )中细胞用PBS溶液洗涤后，加入噻唑蓝在37℃下孵育4 h；
d ) 处理后于SpectraMax M5中在490 nm处测定吸光度；
e ) 将结果换算和作图则得到细胞存活率：按以下公式计算细胞的存活率：
细胞存活率（%）=（实验组吸光度值/对照组吸光度值）×100
实验结果由三组平行实验数据求平均值和标准偏差得到；
在所述工序4）中测试凝胶对不同刺激物的响应性包括如下步骤：
a ) 以水为溶剂，用工序2）的方法制成浓度为10-3 mol/L凝胶；
b ) 向该凝胶中分别加入乙酸，pH=1.0-3.0的NaCl溶液和0.1-1 mol/L NaOH溶液，观察现象；
工序4）中凝胶的应用操作步骤如下:
a ) 以PBS缓冲液为溶剂，配置浓度分别为0, 6.0，12.0, 15.0, 18.0, 24.0 μg/mL的核黄素，在444 nm处测定其吸收值，得到标准曲线；
b ) 以水为溶剂，用工序2）的方法制成三份体积为1.0 mL浓度为10-2 mol/L凝胶；
c ) 将凝胶转移到100 mL锥形瓶中，缓慢加入100.0 mL PBS缓冲液，于恒温水浴下进行药物核黄素的缓释，开始计时；每2 h 取一次样，稀释后于UV-2700中在444 nm处测定其吸收值，得到释放浓度。
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