CN114685571B - 一种寡糖荧光标记物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种寡糖荧光标记物及其制备方法与应用，涉及生物技术领域。本发明所述的制备方法，包括以下步骤，将寡糖与荧光剂在还原剂作用下，在溶剂中发生反应，得到所述寡糖荧光标记物。本发明所述的寡糖荧光标记物利用荧光剂中的氨基可与寡糖还原端的半缩醛基发生缩合反应，形成亚胺或者席夫碱，再利用还原剂将其还原成相对稳定的仲胺，从而实现对寡糖末端的荧光标记，末端标记的荧光基团对寡糖的生物活性影响小，且该标记物可在生理条件下具有较强的荧光强度并可稳定存在。本发明所述的寡糖荧光标记物对细胞基本没有毒性，且寡糖荧光标记物能被少突胶质前体细胞细胞选择性摄取，适用于显微成像分析。

Description

一种寡糖荧光标记物及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种寡糖荧光标记物及其制备方法与应用。

背景技术

硫酸软骨素(Chondroitin sulfate，CS)属于糖胺聚糖的一种，参与软骨再生、炎症反应、神经系统发育和损伤修复等多种生物学功能，还参与各类生命活动，如细胞的生长、分化、衰老、免疫应答以及癌变等，其与人类的健康和疾病息息相关，因此研究寡糖的分子结构和作用机理具有十分重要的意义。近年来，以寡糖作为活性成分或者生物材料的研究取得了巨大进展。然而，由于寡糖在体内的药代动力学研究严重不足，限制了寡糖作为活性药物以及生物材料的进一步的开发和应用。迄今为止，荧光标记寡糖已成为体内追踪寡糖最有前途的方法之一，目的是检测和鉴定寡糖、监测它们在体内的新陈代谢、跟踪其在细胞内的分布情况以及研究内源性和合成糖脂的生物活性。

荧光标记寡糖技术表现出灵敏度高、可视化、检测信号强度高等优势，意义在于研究标记分子在生物体内的代谢及定位，以及与细胞、多肽、蛋白质之间的相互作用，有望成为研究糖类物质作用机理和作用机制的有效途径。目前该项技术在核酸和蛋白质的分析检测中已经普遍使用，成为生物大分子在生物学研究中用于分析定位的高灵敏度工具。

目前寡糖荧光标记常用的衍生试剂为2-氨基吖啶酮(AMAC)、2-氨基吡啶(2-PA)等，但该类衍生标记试剂受量子产率和荧光强度的限制，仅用于糖类物质在色谱中的分离分析，不可用于显微荧光成像研究。

发明内容

为此，本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术中寡糖缺乏荧光基团，在体内无法示踪的问题，并克服标记过程对糖生物学活性的影响。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种寡糖荧光标记物及其制备方法与应用。本发明采用合成的含有氨基的荧光剂作为荧光试剂，利用其带有的氨基与寡糖还原端的醛基或酮基在酸性条件下发生还原胺化反应，通过不影响寡糖活性实现寡糖的荧光标记。

本发明的第一个目的是提供一种寡糖荧光标记物的制备方法，包括以下步骤，将寡糖与荧光剂在还原剂作用下，在溶剂中发生反应，得到所述寡糖荧光标记物。

在本发明的一个实施例中，所述寡糖的结构如下：

其中，R₁、R₂、R₃、R₄独立地选自-OH或-SO₃H，n为0-3的整数。

在本发明的一个实施例中，所述荧光剂为7-二乙基氨基-3-(4-氨基苯基)香豆素、菲并咪唑、4-硝基-1,8-萘酰亚胺和1-氨基芘中的一种或多种。

所述7-二乙基氨基-3-(4-氨基苯基)香豆素结构为

所述菲并咪唑结构为

所述4-硝基-1,8-萘酰亚胺结构为

所述1-氨基芘结构为

在本发明的一个实施例中，所述寡糖荧光标记物的结构如下：

其中，R₁、R₂、R₃、R₄独立地选自-OH或-SO₃H，n为0-3的整数。

在本发明的一个实施例中，所述还原剂为2-甲基吡啶硼烷、硼氢化钠和氰基硼氢化钠中的一种或多种。

在本发明的一个实施例中，所述溶剂为乙酸和有机溶剂；所述有机溶剂为二甲基亚砜、乙腈和N,N-二甲基甲酰胺中的一种或多种。

在本发明的一个实施例中，所述反应的温度为40-80℃，反应的时间为2-10h。

在本发明的一个实施例中，所述荧光剂、寡糖和还原剂的摩尔比为0.5-4：1：0.5-4。

在本发明的一个实施例中，还包括从反应液中分离所述的寡糖荧光标记物的步骤，具体包括：离心后加入二氯甲烷萃取得到水相，水相多次加水旋蒸后冻干。

本发明的第二个目的是提供一种所述方法制备的寡糖荧光标记物。

在本发明的一个实施例中，所述寡糖荧光标记物可以制备成纳米材料，所述纳米材料在细胞相容性分析应用中，浓度为0.25-1.00mg/mL时无细胞毒性。

本发明的第三个目的是提供一种所述的寡糖荧光标记物在细胞显微成像分析中的应用，所述应用中寡糖荧光标记物的摩尔浓度为1-50μM。

本发明的技术方案相比现有技术具有以下优点：

(1)本发明所述的寡糖荧光标记物利用荧光剂中的氨基可与寡糖还原端的半缩醛基发生缩合反应，形成亚胺或者席夫碱，再利用还原剂将其还原成相对稳定的仲胺，从而实现对寡糖末端的荧光标记，末端标记的荧光基团对寡糖的生物活性影响小，且该标记物可在生理条件下具有较强的荧光强度并可稳定存在。

(2)本发明所述的寡糖荧光标记物对细胞基本没有毒性，因不同硫酸化模式的硫酸软骨素对神经细胞的作用机制尚不明确，因此通过对寡糖进行荧光标记，实现其在少突胶质前体细胞和星形胶质细胞中的检测、跟踪和可视化，且寡糖荧光标记物能被少突胶质前体细胞细胞选择性摄取，适用于显微成像分析。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚地理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中：

图1为本发明实施例1的寡糖荧光标记物的合成路线图。

图2为本发明实施例1的寡糖荧光标记物的荧光光谱图。

图3为本发明实施例1的软骨素四糖、荧光剂的四糖荧光标记物的红外和紫外分析图；其中，a为红外图谱，b为紫外图谱。

图4为本发明实施例1的四糖荧光标记物的荧光性能分析；其中，a为荧光强度分析图，b为荧光稳定性分析图。

图5为本发明实施例1的四糖荧光标记物对星形胶质细胞的细胞毒性分析图。

图6为本发明实施例1的四糖荧光标记物在星形胶质细胞中的活细胞成像图。

图7为本发明实施例1的四糖荧光标记物在少突胶质前体细胞中的活细胞成像图。

图8为本发明实施例2的四糖荧光标记物在星形胶质细胞中的活细胞成像图。

图9为本发明实施例1的四糖荧光标记物的纳米材料在少突胶质前体细胞和星形胶质细胞共培养中的活细胞成像图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

在本发明中，除非另有说明，目标化合物中R₁、R₂、R₃、R₄基团均为-OH，且n为0。

实施例1

参照图1所示，一种寡糖荧光标记物及其制备方法，具体包括以下步骤：

(1)7-二乙基氨基-3-(4-氨基苯基)香豆素荧光剂的合成

称取386mg 4-二乙氨基-水杨醛，293mg硝基乙酸乙酯，30μL哌啶，60μL冰乙酸充分溶解在50mL的正丁醇中，将混合物混匀后放置在100℃油浴锅中回流加热12h，冰浴冷却后形成橙色针状物，抽滤后所得固体用10mL正丁醇和10mL石油醚洗涤，然后放在真空干燥箱中干燥，得到初产物橙色固体。

取无水氯化亚锡194mg和6mL的浓盐酸加入到100mL的圆底烧瓶中，然后将上一步的产物300mg缓慢加入到100mL圆底烧瓶中，且边加入边混匀直到能充分反应，再将混合溶液在室温条件下避光搅拌反应6h，反应结束后用1M NaOH溶液调节pH至13，然后用三倍体积的无水乙醚萃取，上层的有机溶液用无水硫酸钠对其干燥，抽滤后置于真空干燥箱内40℃干燥并得到终产物红褐色固体即7-二乙基氨基-3-(4-氨基苯基)香豆素荧光剂。

(2)四糖荧光标记物的制备

取30mg软骨素四糖(实验室制备)，加入3mL 1M的7-二乙基氨基-3-(4-氨基苯基)香豆素荧光剂(该荧光剂溶解在DMSO：乙酸＝7：3溶液中)，置于振荡器上反应30min，然后加入等体积的1M溶解在乙腈中的2-甲基吡啶硼烷，60℃水浴中避光反应6h。反应结束后14000g，20min离心处理，离心后加入二氯甲烷萃取除去有机相，水相多次加水旋蒸后冻干得四糖荧光标记物。

实施例2

一种寡糖荧光标记物及其制备方法，具体包括以下步骤：

(1)菲并咪唑荧光剂的合成

称取583mg菲醌，393mg对硝基苯甲醛，6g乙酸铵溶解在30mL的冰醋酸中，将混合物混匀后放置在100℃油浴锅中回流加热12h，抽滤后所得固体用水和己烷洗涤，然后放在真空干燥箱中干燥，得到初产物橙色固体。

取无水氯化亚锡180mg和6mL的浓盐酸加入到100mL的圆底烧瓶中，然后将上一步的产物400mg缓慢加入到100mL圆底烧瓶中，且边加入边混匀直到能充分反应，再将混合溶液在室温条件下避光搅拌反应6h，反应结束后用1M NaOH溶液调节pH至13，然后用三倍体积的无水乙醚萃取，上层的有机溶液用无水硫酸钠对其干燥，抽滤后置于真空干燥箱内40℃干燥并得到终产物红褐色固体即菲并咪唑荧光剂。

(2)四糖荧光标记物的制备

取30mg软骨素四糖(实验室制备)，加入2mL 1M的菲并咪唑荧光剂(该荧光剂溶解在DMF：乙酸＝7：3溶液中)，置于振荡器上反应30min，然后加入等体积的1M溶解在乙腈中的氰基硼氢化钠，40℃水浴中避光反应10h。反应结束后14000g，20min离心处理，离心后加入二氯甲烷萃取除去有机相，水相多次加水旋蒸后冻干。

实施例3

一种寡糖荧光标记物及其制备方法，具体包括以下步骤：

(1)4-硝基-1,8-萘酰亚胺荧光剂的合成

取770mg苊与3mL醋酸混合，再加4mL硝酸，80℃反应1h，冷却后,析出黄色晶体，加入Na₂Cr₂O₇·2H₂O于100℃，反应3h，抽滤后所得固体用30mL水洗涤，加30mL Na₂CO₃后过滤，滤液用盐酸调节pH为2后过滤,并水洗至中性，真空干燥箱中120℃干燥，得到初产物浅黄色固体。

在250mL三口瓶中，加入500mg 4-硝基萘酐，搅拌下将2.4g Na₂S·9H₂O及1.3gNaHCO₃制成的10mL溶液滴加到反应瓶中(15min加完)，加完后控制温度在80℃继续反应40min。反应完毕，将溶液煮沸，以除去生成的H₂S后过滤，滤液先用盐酸调节pH值到5左右，放置于冰浴中，冷却析出浅黄色针状晶体，过滤，干燥得4-硝基-1,8-萘酰亚胺荧光剂。

(2)四糖荧光标记物的制备

取30mg软骨素四糖(实验室制备)，加入3mL 1M的4-硝基-1,8-萘酰亚胺荧光剂(该荧光剂溶解在DMSO：乙酸＝7：3溶液中)，置于振荡器上反应30min，然后加入等体积的1M溶解在乙腈中的2-甲基吡啶硼烷，80℃水浴中避光反应2h。反应结束后14000g，20min离心处理，离心后加入二氯甲烷萃取除去有机相，水相多次加水旋蒸后冻干。

实施例4

一种寡糖荧光标记物及其制备方法，具体包括以下步骤：

(1)1-氨基芘荧光剂的合成

取1g芘溶解在10mL醋酸中，20℃条件下开始滴加，缓慢滴加68％浓硝酸11mL，1h内滴完，回流加热2h。反应结束后，将10mL水加入到反应体系中，得到棕红色沉淀，抽滤后加醋酸重结晶，放在真空干燥箱中干燥得到棕红色粉末。

取上一步反应产物800mg，加入Pd/C催化剂500mg，乙醇10mL，缓慢加热至回流，并在回流状态下滴加1mL水合肼，3h内滴完。反应完成后热过滤，滤液冷却至室温，过滤得到黄色晶体即1-氨基芘荧光剂。

(2)四糖荧光标记物的制备

取40mg软骨素四糖(实验室制备)，加入3mL 1M的1-氨基芘荧光剂(该荧光剂溶解在DMF：乙酸＝7：3溶液中)，置于振荡器上反应30min，然后加入等体积的1M溶解在乙腈中的硼氢化钠，60℃水浴中避光反应10h。反应结束后14000g，20min离心处理，离心后加入二氯甲烷萃取除去有机相，水相多次加水旋蒸后冻干。

对比例1

(1)7-二乙基氨基-3-(4-氨基苯基)香豆素荧光剂的合成

称取386mg 4-二乙氨基-水杨醛，293mg硝基乙酸乙酯，30μL哌啶，60μL冰乙酸充分溶解在50mL的正丁醇中，将混合物混匀后放置在100℃油浴锅中回流加热12h，冰浴冷却后形成橙色针状物，抽滤后所得固体用10mL正丁醇和10mL石油醚洗涤，然后放在真空干燥箱中干燥，得到初产物橙色固体。

取无水氯化亚锡194mg和6mL的浓盐酸加入到100mL的圆底烧瓶中，然后将上一步的产物300mg缓慢加入到100mL圆底烧瓶中，且边加入边混匀直到能充分反应，再将混合溶液在室温条件下避光搅拌反应6h，反应结束后用1M NaOH溶液调节pH至13，然后用三倍体积的无水乙醚萃取，上层的有机溶液用无水硫酸钠对其干燥，抽滤后置于真空干燥箱内40℃干燥并得到终产物红褐色固体即7-二乙基氨基-3-(4-氨基苯基)香豆素荧光剂。

(2)四糖荧光标记物的制备

取30mg软骨素四糖(实验室制备)，加入3mL 1M的7-二乙基氨基-3-(4-氨基苯基)香豆素荧光剂(该荧光剂溶解在DMSO中)，置于振荡器上反应30min，然后加入等体积的1M溶解在乙腈中的2-甲基吡啶硼烷，60℃水浴中避光反应6h。反应结束后14000g，20min离心处理，离心后加入二氯甲烷萃取除去有机相，水相多次加水旋蒸后冻干，因为未加入乙酸，所得产物无荧光。

对比例2

(1)7-二乙基氨基-3-(4-氨基苯基)香豆素荧光剂的合成

称取386mg 4-二乙氨基-水杨醛，293mg硝基乙酸乙酯，30μL哌啶，60μL冰乙酸充分溶解在50mL的正丁醇中，将混合物混匀后放置在100℃油浴锅中回流加热12h，冰浴冷却后形成橙色针状物，抽滤后所得固体用10mL正丁醇和10mL石油醚洗涤，然后放在真空干燥箱中干燥，得到初产物橙色固体。

取无水氯化亚锡194mg和6mL的浓盐酸加入到100mL的圆底烧瓶中，然后将上一步的产物300mg缓慢加入到100mL圆底烧瓶中，且边加入边混匀直到能充分反应，再将混合溶液在室温条件下避光搅拌反应6h，反应结束后用1M NaOH溶液调节pH至13，然后用三倍体积的无水乙醚萃取，上层的有机溶液用无水硫酸钠对其干燥，抽滤后置于真空干燥箱内40℃干燥并得到终产物红褐色固体即7-二乙基氨基-3-(4-氨基苯基)香豆素荧光剂。

(2)四糖荧光标记物的制备

取30mg软骨素四糖(实验室制备)，加入3mL 1M的7-二乙基氨基-3-(4-氨基苯基)香豆素荧光剂(该荧光剂溶解在DMSO：乙酸＝7：3溶液中)，置于振荡器上反应30min，然后加入等体积的1M溶解在乙腈中的2-甲基吡啶硼烷，60℃水浴中避光反应6h。反应结束后14000g，20min离心处理，产物通过Sephadex G-25进行纯化，荧光吸附在柱子上，缩短了四糖荧光标记物寿命。

测试例1

对实施例1制备的荧光剂和四糖荧光标记物进行荧光光谱分析：

配置0.25、0.5、1、2、4μg/mL的荧光剂和0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL四糖荧光标记物溶液，荧光分光光度计通过激发波长380nm，发射波长400-650nm范围内，激发光和发射光带宽为5nm的条件下检测其荧光强度，结果如图2所示。结果表明，四糖荧光标记物是以522nm为中心发射带，与荧光剂以490nm为中心发射带相比，具有一定的蓝移，因为与四糖结合的荧光团改变了荧光团的吸光度和发射。根据荧光剂的标准曲线和标记物的荧光强度计算得四糖荧光标记物的平均标记率为3.64％。

测试例2

对实施例1制备的软骨素四糖(4mer)、7-二乙基氨基-3-(4-氨基苯基)香豆素荧光剂(B)、四糖荧光标记物(4mer-B)进行红外分析和紫外分析：

真空冷冻干燥后的样品软骨素四糖(4mer)、7-二乙基氨基-3-(4-氨基苯基)香豆素荧光剂(B)、四糖荧光标记物(4mer-B)分别放置在红外光谱探头下，下移探头至样品压实，检测其样品的红外光谱。结果如图3a所示，表明4mer-B的红外光谱在1616cm^-1处出现明显的特征吸收峰，该处是由软骨素四糖的还原性末端与荧光剂上氨基通过还原胺化反应形成C-N键的伸缩振动峰，表明软骨素四糖成功修饰上荧光剂。

取100μg/mL的软骨素四糖、荧光剂、四糖荧光标记物置于紫外比色皿中，测定800-200nm范围内的紫外可见分光光谱。结果如图3b所示，软骨素四糖、四糖荧光标记物均在232nm处有一定的吸收值，同时荧光标记物在350nm处出现了吸收峰，与荧光剂在水溶液中的吸收峰相同，因此UV-Vis结果进一步证明软骨素四糖成功修饰上荧光剂。

测试例3

对实施例1制备的四糖荧光标记物(4mer-B)进行pH值对荧光强度、荧光稳定性的影响分析：

取四糖荧光标记物分别溶解在pH为2-12的缓冲液中，终浓度为10μg/mL，采用荧光分光光度计测定不同pH值条件下合成的四糖荧光标记物的荧光强度，并考察pH值对荧光强度的影响，测定条件为激发波长380nm，发射波长522nm，并设置激发光和发射光带宽为5nm。样品室温避光储存5d，每隔24h测各个样品的荧光强度，观察随放置时间的延长，不同pH值条件下样品荧光强度的变化，如图4a所示，结果表明该标记物对pH较敏感，生理条件下荧光强度较高。其荧光稳定性如图4b所示，在室温存放5d后荧光强度略有降低但幅度有限。

测试例4

对实施例1制备的四糖荧光标记物进行细胞相容性分析：

将软骨素四糖荧光标记物与星形胶质细胞共孵育，通过MTT法检测细胞的存活率，结果见图5。结果表明四糖及四糖荧光标记物在0-300μg/mL的浓度范围内，星型胶质细胞的细胞活力均在80％以上，说明四糖及四糖荧光标记物对星形胶质细胞的毒性较低，不会对实验结果造成影响，可以用于研究细胞摄取情况。

测试例5

(1)对实施例1制备的四糖荧光标记物进行激光共聚焦成像分析：

取生长状态良好的星形胶质细胞，用适量胰酶消化分散5min制备成细胞悬液，以5×10⁴个/mL的密度铺在PLL包被过夜的共聚焦皿中，置于37℃，5％CO₂培养箱中，培养24h，待细胞贴壁后除去上层培养基，加入100μg/mL的四糖7-二乙基氨基-3-(4-氨基苯基)香豆素荧光标记物，培养24h后吸除原有的培养基，并加入4％多聚甲醛固定液固定细胞30min，PBS清洗三次，其中100μg/mL的四糖标记物加入适量DAPI染色15-20min，PBS清洗三次，置于激光共聚焦显微镜下拍照采集数据。结果如图6所示，表明四糖荧光标记物发出强烈的绿色荧光且能有效地被星形胶质细胞内化。

取生长状态良好的少突胶质前体细胞，用适量胰酶消化分散5min制备成细胞悬液，以5×10⁴个/mL的密度铺在PLL包被过夜的共聚焦皿中，置于37℃，5％CO₂培养箱中，培养24h，待细胞贴壁后除去上层培养基，加入100μg/mL的四糖荧光标记物，培养24h后吸除原有的培养基，并加入4％多聚甲醛固定液固定细胞30min，PBS清洗三次，其中100μg/mL的四糖标记物加入适量DAPI染色15-20min，PBS清洗三次，置于激光共聚焦显微镜下拍照采集数据，结果如图7所示，因少突胶质前体细胞表面有丰富的糖结合蛋白受体，可增强与标记的软骨素四糖结合能力，并进一步被细胞摄取。

(2)对实施例2制备的四糖荧光标记物进行激光共聚焦成像分析：

取生长状态良好的星形胶质细胞，用适量胰酶消化分散5min制备成细胞悬液，以5×10⁴个/mL的密度铺在PLL包被过夜的共聚焦皿中，置于37℃，5％CO₂培养箱中，培养24h，待细胞贴壁后除去上层培养基，加入100μg/mL的四糖菲并咪唑荧光标记物，培养24h后吸除原有的培养基，并加入4％多聚甲醛固定液固定细胞30min，PBS清洗三次，其中100μg/mL的四糖标记物加入适量DAPI染色15-20min，PBS清洗三次，置于激光共聚焦显微镜下拍照采集数据，结果如图8所示，表明四糖荧光标记物发出强烈的蓝色荧光且能有效地被星形胶质细胞内化。

测试例6

取8mg实施例1的四糖荧光标记物，42mg EDC和60mg NHS溶解于5mL Tris溶液，调节pH＝5.5，活化50min。调整pH＝7.4，加入氨基化纤维素纳米晶须混悬液(20mg/mL，1mL)，避光搅拌24h。离心洗涤10000r/min 10min，透析并冻干后获得产物功能化纤维素纳米晶须(N4B)。

(2)四糖荧光标记物纳米粒子的细胞相容性分析

96孔板用0.05mg/mL PLL包被8h，PBS洗3次备用；将少突胶质前体细胞和星形胶质细胞的混合细胞悬液以10万/mL接种于96孔板中；配置含有0.1mg/mL、0.25mg/mL、0.50mg/mL、0.75mg/mL和1.00mg/mLN4B的混合细胞培养液，每孔添加100uL相应混合细胞培养液；培养1天、3天后移除培养基，每孔加100μL MTT溶液，恒温培养箱37℃孵育4h；移除MTT，加100μL DMSO，于摇床37℃孵育30min；用酶标仪检测570nm处吸光度。结果表明，浓度范围在0.25-1.00mg/mL的N4B无细胞毒性。

(3)四糖荧光标记物纳米粒子的激光共聚焦成像分析

用0.05mg/mL PLL包被共聚焦皿，8h后吸除PLL溶液并用PBS清洗干净共聚焦皿；将少突胶质前体细胞和星形胶质细胞的混合细胞悬液以10万/mL接种到共聚焦皿上；配置含有1.00mg/mL N4B的混合细胞培养液，每个共聚焦皿中添加1mL培养液，在37℃5％CO₂恒温培养箱中培养24h。吸除培养基，用4％多聚甲醛溶液固定10min，并用PBS清洗干净，向共聚焦皿中添加100μL PBS待检测。如图9所示，结果表明孵育24h后，细胞基本保持正常形态，说明N4B具有一定的生物相容性。在同等情况下，因少突胶质前体细胞表面有丰富的糖结合蛋白受体，可增强与标记的软骨素四糖结合能力，四糖荧光标记物纳米粒子并选择性被少突胶质前体细胞摄取。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (8)

1.一种寡糖荧光标记物，其特征在于，所述寡糖荧光标记物的结构如下：

其中，R₁、R₂、R₃、R₄独立地选自-OH或-SO₃H，n为0-3的整数。

2.权利要求1所述的寡糖荧光标记物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤，将寡糖与荧光剂在还原剂作用下，在溶剂中发生反应，得到所述寡糖荧光标记物，所述寡糖的结构如下，

其中，R₁、R₂、R₃、R₄独立地选自-OH或-SO₃H，n为0-3的整数；

所述荧光剂为7-二乙基氨基-3-(4-氨基苯基)香豆素。

3.根据权利要求2所述的寡糖荧光标记物的制备方法，其特征在于，所述还原剂为2-甲基吡啶硼烷、硼氢化钠和氰基硼氢化钠中的一种或多种。

4.根据权利要求2所述的寡糖荧光标记物的制备方法，其特征在于，所述溶剂为乙酸和第二有机溶剂。

5.根据权利要求4所述的寡糖荧光标记物的制备方法，其特征在于，所述第二有机溶剂为二甲基亚砜、乙腈和N,N-二甲基甲酰胺中的一种或多种。

6.根据权利要求2所述的寡糖荧光标记物的制备方法，其特征在于，所述反应的温度为40-80℃，反应的时间为2-10h。

7.根据权利要求2所述的寡糖荧光标记物的制备方法，其特征在于，所述荧光剂、寡糖和还原剂的摩尔比为0.5-4：1：0.5-4。

8.权利要求1所述的寡糖荧光标记物在制备细胞显微成像分析试剂中的应用，其特征在于，所述应用中寡糖荧光标记物的摩尔浓度为1-50μM。

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