CN115926787B - 一种基于适配体修饰二氧化硅@石墨烯量子点的双光子信号放大探针的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于适配体修饰二氧化硅@石墨烯量子点的双光子信号放大探针的制备方法及应用，该方法采用分步骤、表面修饰法制备二氧化硅@石墨烯量子点复合纳米颗粒，再将CCRF‑CEM细胞特异性适配体Sgc8c交联接枝在二氧化硅@石墨烯量子点复合纳米颗粒表面制得靶向复合双光子纳米探针SiO2@GQDs‑Sgc8c。本发明不仅操作简便、易纯化分离，而且二氧化硅作为功能纳米信号放大载体的存在，提供了“一对多”的信号转导模式，用于对靶细胞的特异性识别和高灵敏实时成像检测。
Description
技术领域
本发明属于纳米功能材料和生物传感探针技术领域，具体涉及一种基于适配体修饰二氧化硅@石墨烯量子点的双光子信号放大探针的制备方法及其靶向双光子成像应用。
背景技术
在精准医学时代，与肿瘤作战更讲究“关口前移”。探索一种肿瘤早期诊断及预后监测新方法，特别是通过细胞和活体水平上的非侵入式、原位、实时成像与表征揭示其发生发展过程中的规律和机制，对于患者治愈率和生存率的提高具有十分重要的意义。核酸适配体（aptamer）作为一类新型靶向识别分子，不但具有与抗体分子相当甚至更强的靶标（如：金属离子、蛋白质、细胞等）识别能力，而且还具有分子量小、合成修饰简单、耐热、无免疫原性等独特优势。因此，以aptamer为靶向识别元件，结合其它信号检测技术，构建一种灵敏度高、可实时、原位成像的荧光检测方法，能够为肿瘤的早期诊断提供强有力的工具。
双光子荧光显微成像技术兼具近红外激发、自发荧光和自吸收低、三维空间分辨率和图像对比度高、组织穿透能力强等优良特性，为疾病临床早期诊断提供了更加准确的方法。石墨烯量子点（GQDs）是一类平均粒径小于10nm的准零维荧光碳纳米材料。作为双光子纳米材料中的一种，石墨烯量子点实现双光子吸收的同时还具有化学惰性、低毒性、易于功能化等特点，已被广泛应用于生物成像、光催化以及荧光传感等领域。然而，已报道的石墨烯量子点存在双光子吸收截面小、荧光量子产率低以及发射光谱范围窄等问题，在生物成像领域中的应用受到了很大的限制；在实际应用中需要采取高强度激光激发高浓度荧光探针的方法来获取较强的信号，从而限制了其在生物医学成像中的进一步应用。此外，现有的石墨烯量子点荧光纳米探针多数是一对一的信号转换模式，灵敏度不高。因此，探索一种“一对多”的提高信号传导部位转换效率的技术，能够增强双光子探针的吸收截面和光学信号响应灵敏度，对于复杂体系中靶标的检测和成像分析，以及癌症的早期诊断极具价值。
信号放大技术是近年来发展的一种利用核酸工具酶和核酸体外扩增、功能化材料等手段，结合光学（如荧光、比色、拉曼）和电化学等检测手段建立起来的高灵敏检测方法。纳米材料由于具有独特的光学、电学效应以及高比表面积等优良特性，是绝佳的用于信号放大的材料，由此发展了基于功能纳米材料的信号放大技术。其中，二氧化硅纳米粒子（SiO2）作为一种常用的纳米基质材料，具有生物学相容性好、易官能化、无毒、尺寸可控及结构稳定等优势，已被用于原位法制备复合荧光纳米探针的构建中。但是所制得的复合硅球的性状不统一、粒径不均匀，且荧光量子产率不高，限制了其高灵敏、实时成像检测应用。
通常的双光子石墨烯量子点纳米探针多数双光子吸收截面小、荧光量子产率低、以及一对一信号转换模式的灵敏度低，本发明将功能化纳米材料信号放大技术引入到荧光探针的信号识别转导过程中，构建出“一对多”的信号转导模式。若将功能纳米材料信号放大策略与双光子成像技术进行创新结合，并引入特异性识别元件，在高效靶向识别和高灵敏成像检测方面具有较大的发展前景和研究价值。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供了一种基于适配体修饰二氧化硅@石墨烯量子点的双光子信号放大探针的制备方法及应用，该方法采用分步骤、表面修饰法制备二氧化硅@石墨烯量子点（SiO2@GQDs）复合纳米颗粒，不仅操作简便、易纯化分离，而且二氧化硅作为功能纳米信号放大载体的存在，提供了“一对多”的信号转导模式，用于对靶细胞的特异性识别和高灵敏实时成像检测。
本发明为实现上述目的采用如下技术方案，一种基于适配体修饰二氧化硅@石墨烯量子点的双光子信号放大探针的制备方法，其特征在于：所述基于适配体修饰二氧化硅@石墨烯量子点的双光子信号放大探针由石墨烯量子点、二氧化硅纳米颗粒和适配体Sgc8c复合而成，其中石墨烯量子点作为双光子荧光信号单元，是以氧化石墨烯为碳源，利用N,N-二甲基甲酰胺（DMF）溶剂热法制备所得；二氧化硅纳米颗粒作为功能纳米材料信号放大载体，是由反相微乳法制备所得，并通过共价键作用与石墨烯量子点结合制得二氧化硅@石墨烯量子点（SiO2@GQDs）复合纳米颗粒，再将CCRF-CEM细胞特异性适配体Sgc8c交联接枝在二氧化硅@石墨烯量子点复合纳米颗粒表面制得靶向复合双光子纳米探针SiO2@GQDs-Sgc8c。
本发明所述的基于适配体修饰二氧化硅@石墨烯量子点的双光子信号放大探针的制备方法，其特征在于具体步骤为：
步骤S1：以氧化石墨烯为碳源，于150~250℃利用N,N-二甲基甲酰胺溶剂热法合成发射绿色荧光的羧基化GQDs；
步骤S2：利用反相微乳法合成氨基化二氧化硅纳米颗粒（NH2-SiO2），通过EDC-NHS反应与羧基化GQDs表面的-COOH共价偶联，形成SiO2@GQDs复合荧光纳米颗粒；
步骤S3：将CCRF-CEM细胞特异性适配体Sgc8c交联接枝在SiO2@GQDs复合荧光纳米颗粒表面，形成目标产物靶向复合双光子纳米探针SiO2@GQDs-Sgc8c。
进一步限定，步骤S1的具体过程为：将氧化石墨烯粉末加至N,N-二甲基甲酰胺中，超声并且搅拌溶解完全，将溶液转移至反应釜中，再置于烘箱中于200℃进行溶剂热反应4.5h，待反应结束后取出反应釜中的反应液冷却至20~30℃，然后将反应液过滤并收集滤液，装入透析袋，在超纯水中透析，透析后的产物经冷冻干燥后得到淡黄色的石墨烯量子点粉末。
进一步限定，步骤S1中所述氧化石墨烯与N,N-二甲基甲酰胺的投料配比2mg:1mL，将氧化石墨烯加入到N,N-二甲基甲酰胺中，在15~25℃、150W条件下超声处理30min，使其混合均匀并完全溶解。
进一步限定，步骤S1中所述过滤过程使用孔径为0.22μM的微孔滤膜过滤除去氧化石墨烯残渣，所述透析过程是将滤液在8000Da的透析袋中透析24h，所述冷冻干燥温度为-50~-40℃，真空度为9~10Pa，冷冻干燥时间为12h。
进一步限定，步骤S2的具体过程为：以环己烷、正己醇、曲拉通X-100和水组成反相微乳液体系，以APTES为氨基硅烷化试剂，反应制得NH2-SiO2纳米颗粒分散液；将步骤S1得到的石墨烯量子点分散在PBS缓冲溶液中，再加入缩合剂进行活化，其中缩合剂为N-羟基硫代琥珀酰亚胺（Sulfo-NHS）和1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺（EDC）的混合物，混匀超声分散5~20s，振荡反应10~20min；再向反应体系中加入制得的NH2-SiO2纳米颗粒分散液进行反应，反应完全后离心，依次用超纯水和无水乙醇洗涤，得到SiO2@GQDs复合荧光纳米颗粒，该SiO2@GQDs复合荧光纳米颗粒的平均粒径为60nm，其在水中的悬浮液在紫外光照射下发射绿色荧光。相比于纯GQDs，SiO2@GQDs复合荧光纳米颗粒的荧光发射强度明显增加，且荧光量子产率由纯GQDs的0.12增加至0.49。
进一步限定，步骤S2中所述环己烷、正己醇与曲拉通X-100的体积比为7.5:1.6:1.8，所述缩合剂中N-羟基硫代琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺的质量比为1:1。
进一步限定，步骤S3的具体过程为：将步骤S2得到的SiO2@GQDs复合荧光纳米颗粒分散在PBS缓冲溶液中，再加入缩合剂进行活化，其中缩合剂为N-羟基硫代琥珀酰亚胺（Sulfo-NHS）和1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺（EDC）的混合物，混匀超声分散5~20s，振荡反应10~20min；再向反应体系中加入氨基化适配体NH2-Sgc8c，该氨基化适配体NH2-Sgc8c的序列为5’-NH2-TTTTTTTTTTATCTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGA-3’，然后于20~30℃在摇床中孵育1~3h，收集固相并用PBS至少清洗三次，最终得到适配体修饰二氧化硅@石墨烯量子点的双光子信号放大探针SiO2@GQDs-Sgc8c，该双光子信号放大探针SiO2@GQDs-Sgc8c在760nm双光子激发波长下，具有良好的双光子荧光特性，且能够对靶细胞高灵敏度、高分辨率3D成像。
进一步限定，步骤S3中所述缩合剂中N-羟基硫代琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺的质量比为1:1。
本发明所述的基于适配体修饰二氧化硅@石墨烯量子点的双光子信号放大探针在CCRF-CEM靶细胞的特异性识别和高灵敏实时成像中的应用。
纳米材料因为具有独特的光学、电学效应以及高比表面积，是绝佳的信号放大材料。其中，SiO2纳米颗粒由于具有硬度大、高比表面积、生物相容性好和表面易功能化等特点而成为一种绝佳的信号放大载体材料。通过在SiO2 纳米载体上修饰多个小粒径GQDs，来实现双光子荧光信号放大检测的目的。
本发明将SiO2@GQDs-Sgc8c、GQDs-Sgc8c、SiO2@GQDs分别和细胞在体积分数5%CO2，37℃恒温培养箱中培养1.5h，离心收集细胞，加入100μL培养液重悬后，滴加到载玻片上，在激发波长为760nm激发下，采用双光子激光共聚焦显微镜观察其细胞形态和荧光。
本发明制备的新颖高效的双光子荧光性能及信号放大成像的靶向复合纳米材料，是以GQDs为双光子信号单元，由其提供双光子吸收性能。SiO2纳米颗粒的表面负载能够保证整个颗粒的生物安全性以及信号放大的目的。此外，联合适配体的特异性识别能力，赋予复合颗粒靶向细胞成像能力。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
（1）本发明将功能化纳米材料信号放大策略引入到传感平台的设计中，不仅解决了传统GQDs制备过程易团聚、难纯化分离的问题，而且解决了GQDs存在双光子荧光信号较弱所造成的一对一信号转换模式的灵敏度低等问题。从而在一定程度上大大提高了检测和成像的灵敏度。
（2）本发明结合运用核酸适配体Sgc8c对靶细胞的特异性识别能力，构建了靶向双光子荧光信号放大纳米探针，为肿瘤的精准早期诊断提供了有价值的检测方法和技术支持。
（3）本发明提出了一种通用型的设计策略，通过选择合适的靶向基团构建出不同的靶向荧光纳米探针，进一步实现对多种目标物的高灵敏检测和成像研究。
附图说明
图1是羧基化GQDs（A）、SiO2纳米颗粒（B）和SiO2@GQDs复合纳米颗粒（C）的透射电镜图像。
图2是羧基化GQDs（b）和SiO2@GQDs复合纳米颗粒（a）的荧光发射光谱图和在365nm照射下的荧光照片。
图3是SiO2@GQDs-Sgc8c靶向复合纳米颗粒的透射电镜图像和双光子荧光发射光谱图。
图4是SiO2@GQDs-Sgc8c靶向复合纳米颗粒的细胞存活率分析。
图5是SiO2@GQDs（A）、GQDs-Sgc8c（B）和SiO2@GQDs-Sgc8c的双光子细胞成像图。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1
羧基化GQDs的制备
称取50mg GO分散于25mL DMF溶液中，150W超声30min。将超声分散均匀的GO溶液转移到聚四氟乙烯高压反应釜中，并置于200℃烘箱中加热4.5h。反应结束后，在空气中逐步冷却至室温。反应后有大片不溶于水的石墨烯残渣，抽滤过0.22μM的微孔滤膜过滤除去。收集黄色的滤液，减压蒸馏除去溶剂并加去离子水复溶。将GQDs粗产物置于截留分子量为8000Da的透析袋中透析24h除去大片杂质，收集袋外的溶液即可得到具有绿色荧光的羧基化GQDs，并经冷冻干燥后得到淡黄色的羧基化GQDs粉末。
实施例2
氨基化SiO2纳米颗粒的制备
配制反相微乳液，即在50mL圆底烧瓶中加入7.5mL环己烷、1.6mL正己醇和1.6mL曲拉通X-100，于30℃搅拌30min。再加一定量的水，继续搅拌2h，加入100μL氨水和100μLTEOS，继续搅拌24h。最后加入50μL APTES进行氨基化处理，纳米颗粒一旦生长到所需大小，便可丙酮破乳，离心纯化，烘干即可得到白色的氨基化SiO2纳米颗粒粉末。
实施例3
SiO2@GQDs复合纳米颗粒的制备
称取10mg羧基化GQDs溶解于20mM PBS缓冲溶液中，并加入10mg EDC和10mgSulfo-NHS，在25℃恒温振荡器中以转速100r/min共孵育 15min。所得产物用 PBS 缓冲液分离洗涤3次，然后再加入5mg NH2-SiO2纳米颗粒。反应2h后，离心，洗涤，所得沉淀烘干备用，即SiO2@GQDs复合纳米颗粒。
如图1所示为羧基化GQDs（A），SiO2纳米颗粒（B）和SiO2@GQDs复合纳米颗粒（C）的透射电镜表征图。结果显示，纯化后的羧基化GQDs为球形，平均粒径为3.0nm。合成的SiO2@GQDs复合纳米颗粒具有良好的单分散性、大小均一、呈近似球形，平均直径约为60nm。与纯SiO2纳米颗粒相比，SiO2@GQDs复合纳米颗粒的形貌和尺寸均未发生明显的改变。这主要是由于纯GQDs为粒径3.0nm左右的较小颗粒，不影响整体复合颗粒的表面特征。
如图2所示为羧基化GQDs和SiO2@GQDs复合纳米颗粒的发光对比。
利用荧光光谱仪对羧基化GQDs和SiO2@GQDs复合纳米颗粒水溶液的发射光谱进行测定光谱分析可知，在390nm最佳激发波长下，羧基化GQDs在515nm处具有最大荧光发射强度，荧光量子产率为0.12。
与纯GQDs的发光特征比较，SiO2@GQDs复合纳米颗粒在相同激发波长下荧光强度大幅度增加，荧光量子产率增加到0.49。进一步的，在365nm的紫外灯下呈明亮的绿色荧光。证实二氧化硅纳米载体的引入，起到了荧光信号放大的目的。
实施例4
SiO2@GQDs-Sgc8c靶向复合纳米颗粒的制备
称取10mg SiO2@GQDs复合纳米颗粒溶解于20mM PBS缓冲溶液中，并加入10mg EDC和10mg Sulfo-NHS，在25℃恒温振荡器中以转速100r/min共孵育 15min。所得产物用 PBS缓冲液分离洗涤3次，然后再加入5mg氨基化适配体NH2-Sgc8c。反应2h后，离心，洗涤，所得沉淀烘干备用，即SiO2@GQDs-Sgc8c靶向复合纳米颗粒。其中氨基化适配体NH2-Sgc8c的序列为5’-NH2-TTTTTTTTTTATCTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGA-3’。
如图3所示为SiO2@GQDs-Sgc8c靶向复合纳米颗粒的透射电镜图，分析可知，产物呈良好的球形，分散性较好，粒径约80nm。同时制备的SiO2@GQDs-Sgc8c靶向复合纳米颗粒具有较好的双光子荧光光谱特性，最佳双光子激发波长为760nm。
实施例5
SiO2@GQDs-Sgc8c靶向复合纳米颗粒的生物相容性
采用CCK-8法进行细胞存活率的检测，具体过程如下：首先，在装有2mL培养基的无菌培养皿中种植1×105个CCRF-CEM细胞，在体积分数5% CO2，37℃恒温培养箱中培养24h。其次，取对数生长期的CCRF-CEM 细胞，进行细胞计数，调整细胞浓度，按照2×104/孔接种到96孔板U 型板中。按照不同分组处理，培养24 h。按照20μL/孔加入CCK-8，在体积分数5%CO2，37℃恒温培养箱中培养2h。酶标仪检测450nm处的吸光度值，并根据公式计算相应的细胞存活率。
按照Control组、Sample组共2组。其中Control 组加入100μL/孔完全培养基；Sample组加入100μL/孔不同浓度的对应样品工作液。SiO2@GQDs-Sgc8c靶向复合纳米颗粒的实际工作浓度为10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL。每个处理组均做3个复孔。
按照RPMI1640培养基：胎牛血清为9:1的体积比例配制细胞完全培养基。
如图4所示，CCK-8结果分析可知，CCRF-CEM细胞在不同浓度SiO2@GQDs-Sgc8c靶向复合纳米颗粒孵育下仍然保持较好的细胞存活率。表明SiO2@GQDs-Sgc8c靶向复合纳米颗粒具有良好的生物相容性。
实施例6
SiO2@GQDs-Sgc8c靶向复合纳米颗粒在CCRF-CEM细胞中的双光子靶向成像应用
细胞培养过程同上述实例5，不同之处在于，将分组处理更换为SiO2@GQDs-Sgc8c组、GQDs-Sgc8c组、SiO2@GQDs组共3组。取对数生长期的细胞，进行细胞计数，调整细胞浓度，按照50×104细胞/组加入到1.5mL离心管中。按照上述分组处理，体积分数5% CO2，37℃恒温培养箱中培养1.5h培养结束后，离心收集细胞，加入100μL培养液重悬后，滴加到载玻片上，直接双光子共聚焦成像拍摄。
双光子激发波长为760nm，检测范围为460-560nm。
选用CCRF-CEM细胞为靶细胞组，Ramos细胞为对照细胞组。
如图5所示为SiO2@GQDs（A）、GQDs-Sgc8c（B）和SiO2@GQDs-Sgc8c的双光子细胞成像图。结果表明，SiO2@GQDs-Sgc8c靶向复合纳米颗粒与CCRF-CEM细胞培育后进行成像，展示出很好的靶标结合能力，视野中几乎所有细胞均染上了明亮的绿色光圈；GQDs-Sgc8c组与CCRF-CEM细胞孵育后的成像效果与上述基本一致。区别在于绿色光圈的亮度明显要低于SiO2@GQDs-Sgc8c靶向复合纳米颗粒的成像效果。结果说明，SiO2纳米载体的存在，起到了成像信号放大的目的。此现象与图2中的荧光光谱结果保持一致。
没有进行NH2-Sgc8c靶向修饰的复合纳米探针SiO2@GQDs，作为对照组，与CCRF-CEM细胞培育后进行成像，结果显示几乎无绿色荧光呈现。
三种不同探针与对照组Ramos细胞的成像结果显示，均没有绿色荧光呈现。
上述成像结果进一步表明，SiO2@GQDs-Sgc8c靶向复合纳米颗粒表面结合上去的靶向识别元件NH2-Sgc8c保留了对靶肿瘤细胞识别的特异性性能。并且由于SiO2纳米结构比表面积大，具备负载多个GQDs的性能，提供了“一对多”信号转换模式，使得SiO2@GQDs-Sgc8c靶向复合纳米颗粒比GQDs-Sgc8c 具备更高的双光子荧光成像对比度。
以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。
Claims (8)
1.一种基于适配体修饰二氧化硅@石墨烯量子点的双光子信号放大探针的制备方法，其特征在于：所述基于适配体修饰二氧化硅@石墨烯量子点的双光子信号放大探针由石墨烯量子点、二氧化硅纳米颗粒和适配体Sgc8c复合而成，其中石墨烯量子点作为双光子荧光信号单元，是以氧化石墨烯为碳源，利用N,N-二甲基甲酰胺溶剂热法制备所得；二氧化硅纳米颗粒作为功能纳米材料信号放大载体，是由反相微乳法制备所得，并通过共价键作用与石墨烯量子点结合制得二氧化硅@石墨烯量子点复合纳米颗粒，再将CCRF-CEM细胞特异性适配体Sgc8c交联接枝在二氧化硅@石墨烯量子点复合纳米颗粒表面制得靶向复合双光子纳米探针SiO2@GQDs-Sgc8c；
具体制备步骤为：
步骤S1：以氧化石墨烯为碳源，于150~250℃利用N,N-二甲基甲酰胺溶剂热法合成发射绿色荧光的羧基化GQDs；
步骤S2：利用反相微乳法合成氨基化二氧化硅纳米颗粒，通过EDC-NHS反应与羧基化GQDs表面的-COOH共价偶联，形成SiO2@GQDs复合荧光纳米颗粒；
步骤S3：将步骤S2得到的SiO2@GQDs复合荧光纳米颗粒分散在PBS缓冲溶液中，再加入缩合剂进行活化，其中缩合剂为N-羟基硫代琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺的混合物，混匀超声分散5~20s，振荡反应10~20min；再向反应体系中加入氨基化适配体NH2-Sgc8c，该氨基化适配体NH2-Sgc8c的序列为5’-NH2-TTTTTTTTTTATCTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGA-3’，然后于20~30℃在摇床中孵育1~3h，收集固相并用PBS至少清洗三次，最终得到适配体修饰二氧化硅@石墨烯量子点的双光子信号放大探针SiO2@GQDs-Sgc8c，该双光子信号放大探针SiO2@GQDs-Sgc8c在760nm双光子激发波长下，具有良好的双光子荧光特性，且能够对靶细胞高灵敏度、高分辨率3D成像。
2.根据权利要求1所述的基于适配体修饰二氧化硅@石墨烯量子点的双光子信号放大探针的制备方法，其特征在于：步骤S1的具体过程为：将氧化石墨烯粉末加至N,N-二甲基甲酰胺中，超声并且搅拌溶解完全，将溶液转移至反应釜中，再置于烘箱中于200℃进行溶剂热反应4.5h，待反应结束后取出反应釜中的反应液冷却至20~30℃，然后将反应液过滤并收集滤液，装入透析袋，在超纯水中透析，透析后的产物经冷冻干燥后得到淡黄色的石墨烯量子点粉末。
3.根据权利要求2所述的基于适配体修饰二氧化硅@石墨烯量子点的双光子信号放大探针的制备方法，其特征在于：步骤S1中所述氧化石墨烯与N,N-二甲基甲酰胺的投料配比2mg:1mL，将氧化石墨烯加入到N,N-二甲基甲酰胺中，在15~25℃、150W条件下超声处理30min，使其混合均匀并完全溶解。
4.根据权利要求2所述的基于适配体修饰二氧化硅@石墨烯量子点的双光子信号放大探针的制备方法，其特征在于：步骤S1中所述过滤过程使用孔径为0.22μM的微孔滤膜过滤除去氧化石墨烯残渣，所述透析过程是将滤液在8000Da的透析袋中透析24h，所述冷冻干燥温度为-50~-40℃，真空度为9~10Pa，冷冻干燥时间为12h。
5.根据权利要求1所述的基于适配体修饰二氧化硅@石墨烯量子点的双光子信号放大探针的制备方法，其特征在于：步骤S2的具体过程为：以环己烷、正己醇、曲拉通X-100和水组成反相微乳液体系，以APTES为氨基硅烷化试剂，反应制得NH2-SiO2纳米颗粒分散液；将步骤S1得到的石墨烯量子点分散在PBS缓冲溶液中，再加入缩合剂进行活化，其中缩合剂为N-羟基硫代琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺的混合物，混匀超声分散5~20s，振荡反应10~20min；再向反应体系中加入制得的NH2-SiO2纳米颗粒分散液进行反应，反应完全后离心，依次用超纯水和无水乙醇洗涤，得到SiO2@GQDs复合荧光纳米颗粒，该SiO2@GQDs复合荧光纳米颗粒的平均粒径为60nm，其在水中的悬浮液在紫外光照射下发射绿色荧光，相比于纯GQDs，SiO2@GQDs复合荧光纳米颗粒的荧光发射强度明显增加，且荧光量子产率由纯GQDs的0.12增加至0.49。
6.根据权利要求5所述的基于适配体修饰二氧化硅@石墨烯量子点的双光子信号放大探针的制备方法，其特征在于：步骤S2中所述环己烷、正己醇与曲拉通X-100的体积比为7.5:1.6:1.8，所述缩合剂中N-羟基硫代琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺的质量比为1:1。
7.根据权利要求1所述的基于适配体修饰二氧化硅@石墨烯量子点的双光子信号放大探针的制备方法，其特征在于：步骤S3中所述缩合剂中N-羟基硫代琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺的质量比为1:1。
8.根据权利要求1~7中任意一项所述的方法制备的基于适配体修饰二氧化硅@石墨烯量子点的双光子信号放大探针在CCRF-CEM靶细胞的特异性识别和高灵敏实时成像中的应用。
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- 2022-10-08 CN CN202211223391.4A patent/CN115926787B/zh active Active
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113667480A (zh) * | 2021-08-18 | 2021-11-19 | 佛山市三水佛水供水有限公司 | 基于适配体-巯基双面特异识别的荧光传感器阵列及其制备方法 |
| CN114032290A (zh) * | 2021-10-27 | 2022-02-11 | 中山大学 | 一种基于适配体功能化的sers-fl传感器及其制备方法和应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| "Aptamer/Graphene Quantum Dots Nanocomposite Capped Fluorescent Mesoporous Silica Nanoparticles for Intracellular Drug Delivery and Real-Time Monitoring of Drug Release";Fen-Fen Zheng et al.,;Anal. Chem.;第87卷;第11739-11745页 * |
| "Strong Two-Photon-Induced Fluorescence from Photostable, Biocompatible Nitrogen-Doped Graphene Quantum Dots for Cellular and Deep-Tissue Imaging";Qian Liu et al.,;Nano Lett.;第13卷;第2436-2441页&支持信息 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN115926787A (zh) | 2023-04-07 |
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