CN113667480A - 基于适配体-巯基双面特异识别的荧光传感器阵列及其制备方法 - Google Patents

基于适配体-巯基双面特异识别的荧光传感器阵列及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于适配体‑巯基双面特异识别的荧光传感器阵列的制备方法，包括以下步骤：S1：采用水热法合成MPA表面修饰的r/g CdTe QDs；S2：通过溶胶‑凝胶法将r/g CdTe QDs掺杂在SiO2中，合成r/g CdTe QDs@SiO2；S3：通过界面溶胶‑凝胶自组装合成Janus‑r/g QDs‑NH2/Vinyl复合材料，其为一面氨基，一面双键的双荧光复合材料；S4：通过巯基‑烯基点击化学反应将巯基修饰的核酸适配体接枝到步骤S3制得的Janus‑r/g QDs‑NH2/Vinyl复合材料的双键面上，再将巯基丙酸的羧基与Janus‑r/g QDs‑NH2/Vinyl复合材料的氨基通过酰胺化反应结合，得到Janus‑r/g QDs‑SH/Apt复合材料，即得荧光传感器阵列。该荧光传感器阵列可以同时识别水中三种氨基糖苷类抗生素和三种重金属离子，实现有机/无机污染物的同时区分检测。

Description

基于适配体-巯基双面特异识别的荧光传感器阵列及其制备 方法
技术领域
本发明属于污染物检测领域，具体涉及一种基于适配体-巯基双面特异识别的荧光传感器阵列及其制备方法。
背景技术
随着工农业的发展，大量污染物被排放到环境中，造成水体污染等严峻问题，严重危害人类身体健康。水污染出现的原因复杂，各类型有机污染物与无机污染物同时存在，在这些污染物中，以抗生素的污染以及重金属离子污染最为严重。其中，氨基糖苷类抗生素常用于细菌感染的疾病治疗及提高家禽饲料效率，我国抗生素年总使用量约为16.2万吨，超过5万吨是排放进水土环境中，而抗生素滥用加剧了人体耐药性，导致每年800亿元的医疗费用增长。重金属的污染也尤为严重，有文献报道，从1972年至今，地表水中重金属污染已由单一金属污染转向混合金属污染。并且水体当中的重金属由于无法降解，难以代谢，使得其可以以多种方式进入人体，对人体健康产生巨大的影响，例如损害神经系统，损伤肝脏，引发癌症等。
目前，对于这些污染物的检测已有比较成熟的分析方法和国家标准，如分光光度法、气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)、液相色谱-串联质谱仪(LC-MS/MS)。污染物单一成分检测、同一系列类似物的检测也时有文献报道，但是，对于有机物与无机物同时进行分析检测，若采用常规的分析检测手段依然是非常困难的。因此，如何实现不同系列和同一系列的类似物质同时进行分析检测，发展和建立简便、快速、高灵敏度和高选择性的分析检测技术是非常有必要的。
近几年，传感器阵列技术已经有了很成熟的发展，在传统的传感器阵列技术的构建过程中，都需要合成大量的材料来组建三个传感单元，这不仅耗时、合成成本高，而且很难广泛的应用到实际问题。因此，越来越多的人开发多功能材料，弥补传感器阵列构建对大量传感单元需求不足。例如，Wu等人利用Mn掺杂硫化锌量子点同时发射荧光、掺杂引起的磷光和聚集产生的散射光提供三个传感通道用于多种蛋白质的同时检测。Lu等人基于氧化石墨烯(GO)与蛋白质相互作用后，荧光、催化活性和组装行的同时发生改变，而对每个蛋白质产生不同响应，构建了一种以GO为单传感元件的三通道光传感器阵列。因此，利用多功能材料可以有效降低传感器阵列构建的工作量与成本，但是目前能应用于构建传感器阵列的多功能材料并不多，开发多功能材料仍然面临着较大的挑战。
Janus材料因其双面特性引起了人们的广泛注意。在最初的研究中，Janus首先应用在催化以及吸附材料领域。Alina Kirillova等人合成的一种“毛茸茸”的Janus微球，在Janus微球两面分别修饰具有亲水与疏水的聚合物壳，再在亲水测接枝具有催化活性的AuNPs，能在界面处高效催化亚甲基蓝。Pan课题组在通过界面溶胶-凝胶自组装合成的SiO2基Janus纳米片的亲/疏水面上分别引入巯基和分子印迹聚合物同时识别水中无机/有机污染物。这些应用都依赖于Janus材料的多功能性。
量子点(QDs)作为一种新型的荧光纳米粒子，具有优良的荧光性能，其粒径、波长可调，近年来在分析测试领域有广泛的应用。此外，其光稳定性与抗光漂泊能力强，能很大程度提高物质检测的灵敏度，在荧光传感器阵列构建中也起着重要作用。
传感器阵列、新型多功能纳米材料的出现，在很大程度上解决了多种分析物同时检测问题，并且也已经有将二者结合起来同时检测不同系列目标的工作。但是，依然存在着一些不足，例如，目前多功能型材料合成复杂，检测多系列目标物也需要大量的传感单元的支撑，工作量大等。
发明内容
本发明的一个目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种可以同时识别水中三种氨基糖苷类抗生素和三种重金属离子的基于适配体-巯基双面特异识别的荧光传感器阵列及其制备方法。
为了实现以上发明目的，本发明提供了一种基于适配体-巯基双面特异识别的荧光传感器阵列的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1：采用水热法合成MPA表面修饰的r/g CdTe QDs；
S2：通过溶胶-凝胶法将r/g CdTe QDs掺杂在SiO2中，合成r/g CdTe QDs@SiO2；
S3：通过界面溶胶-凝胶自组装合成Janus-r/g QDs-NH2/Vinyl复合材料，其为一面氨基，一面双键的双荧光复合材料；
S4：通过巯基-烯基点击化学反应将巯基修饰的核酸适配体接枝到步骤S3制得的Janus-r/gQDs-NH2/Vinyl复合材料的双键面上，再将巯基丙酸的羧基与Janus-r/g QDs-NH2/Vinyl复合材料的氨基通过酰胺化反应结合，得到Janus-r/g QDs-SH/Apt复合材料，即得荧光传感器阵列。
相比于现有技术，本发明利用Janus在界面溶胶-凝胶自组装过程掺杂红/绿CdTeQDs，在掺杂r/g-CdTe QDs后的Janus纳米片的亲/疏水面分别修饰巯基和核酸适配体，构建了一个单传感元件的双识别的荧光传感器阵列。该荧光传感器阵列可以同时识别水中三种氨基糖苷类抗生素和三种重金属离子，实现有机/无机污染物的同时区分检测。同时，该Janus-r/gQDs-SH/Apt复合材料合成条件温和、材料稳定性高、灵敏度高、检测范围大，具有较大的实际应用价值和潜力。
优选地，步骤S3包括以下步骤：将Tween-80充分溶于去离子水中，调节溶液pH值为3作为水相；然后将甲苯和Span-80搅拌均匀，加入TEOs、APTEs和mLKH-570，搅拌5min后，调节转速到10000rpm，逐滴加入所述水相，形成W/O乳液；随后再滴加步骤S2制得的r/g CdTeQDs@SiO2量子点，搅拌5min，调节转速到3000rpm，在70℃下溶胶-凝胶反应12h，经过离心分离、洗涤和干燥，得到Janus-r/g QDs-NH2/Vinyl复合材料。
优选地，步骤S4包括以下步骤：将步骤S3得到的Janus-r/g QDs-NH2/Vinyl粉末在甲醇中超声分散20min，加入巯基修饰的氨基糖苷类适配体，并调整pH值为8，45℃下搅拌反应6h，经过离心分离、洗涤和干燥后得到Janus-r/g QDs-NH2/Apt复合材料；然后再将其分散于乙醇中，超声分散5min，加入EDC、NHS和MPA，45℃搅拌3h，经过离心分离、洗涤和干燥后得到Janus-r/g QDs-SH/Apt复合材料，即得荧光传感器阵列。
优选地，步骤S3中，所述水相中Tween-80和去离子水的用量比例为0.1g：6mL；甲苯、Span-80、TEOs、APTEs、KH-570和r/g CdTe QDs@SiO2的用量比例为25mL：3g：1.5mL：0.5mL：0.5mL：2mL。
优选地，步骤S4中，Janus-r/gQDs-NH2/Vinyl粉末、甲醇、巯基修饰的氨基糖苷类适配体、乙醇、EDC、NHS和MPA的用量比例为0.5g：5mL：0.28μmol：25mL：0.1g：0.1g：100μL。
优选地，步骤S1包括以下步骤：将柠檬酸三钠和CdCl2.2.5H2O充分溶解混合在去离子水中，然后立即滴加MPA，调节溶液pH值为10.5，再加入Na2TeO3和NaBH4，分别在100℃下水热回流30min和120min得到绿色与红色CdTe量子点溶液，冷却至室温，加入无水乙醇，9000rpm离心以去除上清液，洗涤3次，最后将纯化的绿色与红色CdTe量子点分别分散于去离子水中，稀释至100mg.L-1，得到g-CdTe QDs溶液和r-CdTe QDs溶液。
优选地，步骤S2包括以下步骤：将步骤S1得到的g-CdTe QDs溶液和r-CdTe QDs溶液与乙醇溶液混合均匀，搅拌15min后向溶液中加入TEOS和NH3.H2O，搅拌反应6h，反应结束后9000rpm离心分离r/gCdTe QDs@SiO2，分别用乙醇和去离子水洗涤数次，分散在去离子水中4℃冷藏备用。
优选地，步骤S1中，柠檬酸三钠、CdCl2.2.5H2O、去离子水、MPA、Na2TeO3和NaBH4的用量比例为0.20g：0.5mmol：50mL：52μL：0.1mmol：50mg。
优选地，步骤S2中，g-CdTe QDs溶液、r-CdTe QDs溶液、乙醇溶液、TEOS、NH3.H2O和去离子水的用量比例为5mL：3mL：50mL：100μL：200μL：4mL。
本发明还提供一种采用上述制备方法制备而成的基于适配体-巯基双面特异识别的荧光传感器阵列，其可同时识别水中三种氨基糖苷类抗生素和三种重金属离子，稳定性高，灵敏度高，检测范围广，具有较大的实际应用价值和潜力。
本发明首先在不同水热回流时间下获得同一激发的红色和绿色CdTe QDs，然后通过掺杂与界面溶胶-凝胶自组装获得一面氨基，一面双键的双荧光复合材料，再利用巯基-烯基点击化学反应将巯基修饰的核酸适配体接枝到Janus材料的双键面，再将巯基丙酸的羧基与Janus的氨基通过酰胺化反应结合获得Janus-r/gQDs-SH/Apt复合材料，构建了2(识别位点)
×2(信号输出)的多通道传感器阵列，其可以同时识别水中三种氨基糖苷类抗生素(卡那霉素、阿米卡星和庆大霉素)和三种重金属离子(Co2+、Cu2+和Hg2+)，其中卡那霉素、阿米卡星和庆大霉素主要是通过Janus-r/gQDs-SH/Apt的核酸适配体(Apt)来识别，Apt与掺杂的红/绿色量子点间通过静电猝灭，氨基糖苷类抗生素的加入会覆盖Apt，切断了Apt与量子点间作用，使得荧光恢复。而Co2+、Cu2+和Hg2+三种重金属离子的识别主要是通过Janus-r/gQDs-SH/Apt的巯基面，巯基和金属离子间通过螯合作用，捕获金属离子，从而使红/绿量子点发生荧光猝灭。
经过实验测试，本发明提供的荧光传感器阵列在最优检测条件，在0.05-8μg.mL-1浓度范围内成功区分六种有机/无机污染物，并在实际废水样中成功识别出不同浓度的有机/无机污染物。这是首次通过溶胶-凝胶在Janus材料中掺杂上不同颜色量子点并构建传感器阵列用于有机/无机污染物的同时区分检测，同时其合成条件温和，材料稳定性高，灵敏度高，检测范围广，具有较大的实际应用价值和潜力。
附图说明
图1为g-CdTe QDs和r-CdTe QDs的粒径分布图
图2为CdTe QDs@SiO2、Janus-NH2/Vinyl、Janus-r/gQDs-NH2/Vinyl和Janus-r/gQDs-SH/Apt的红外光谱图
图3(a)为r/g-CdTe@SiO2量子点的TEM图，插图是高倍放大图；(b)为超声后Janus-NH2/Vinyl纳米片的TEM图；(c)为超声后Janus-r/gQDs-NH2/Vinyl纳米片的TEM图
图4(a-b)为双面异性Janus-NH2/CdTe QDs@SiO2纳米片的扫描电镜图；(c-d)为超声前后的Janus-r/gQDs-NH2/Vinyl空心球和纳米片的扫描电镜图
图5为核酸染料与适配体作用后的荧光光谱图
图6为核酸染料与适配体作用后的定量工作曲线图
图7为在0.05-8μg.mL-1时，Janus-r/gQDs-SH/Apt分别对卡那霉素、阿米卡星、庆大霉素、Co2+、Cu2+和Hg2+多重检测图。其中，(a)为柱形图；(b)为LDA图，(d)为LDA图部分放大图；(c)为六种有机-无机污染物的欧几里得距离平均值的雷达图
图8为在0.1μg.mL-1时，具有对称结构的r/gCdTe QDs@SiO2-Apt与r/gCdTe QDs@SiO2-SH分别对卡那霉素、阿米卡星、庆大霉素、Co2+、Cu2+和Hg2+多重检测图
图9为在0.01-10μg.mL-1时，Janus-r/gQDs-SH/Apt对卡那霉素定量分析的荧光变化光谱图(a1)、LDA图(a2)和典型因子1与浓度对数的线性关系图(a3)
图10为在0.01-10μg.mL-1时，Janus-r/gQDs-SH/Apt对阿米卡星定量分析的荧光变化光谱图(b1)、LDA图(b2)和典型因子1与浓度对数的线性关系图(b3)
图11为在0.01-10μg.mL-1时，Janus-r/gQDs-SH/Apt对庆大霉素定量分析的荧光变化光谱图(c1)、LDA图(c2)和典型因子1与浓度对数的线性关系图(c3)
图12为在0.01-10μg.mL-1时，Janus-r/gQDs-SH/Apt对Co2+定量分析的荧光变化光谱图(d1)、LDA图(d2)和典型因子1与浓度对数的线性关系图(d3)
图13为在0.01-10μg.mL-1时，Janus-r/gQDs-SH/Apt对Cu2+定量分析的荧光变化光谱图(e1)、LDA图(e2)和典型因子1与浓度对数的线性关系图(e3)
图14为在0.01-10μg.mL-1时，Janus-r/gQDs-SH/Apt对Hg2+定量分析的荧光变化光谱图(f1)、LDA图(f2)和典型因子1与浓度对数的线性关系图(f3)
图15为在总浓度为0.1μg.mL-1时，不同抗生素与金属离子按不同摩尔比例混合的荧光光谱图与LDA图
图16为实验例4中对实际水样检测得到的荧光光谱图和LDA图
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明，而非用于限制本发明的范围。
以下实施例、测试例和实验例中用到的仪器如表1所示，试剂如表2所示。
表1实验仪器表
Figure BDA0003217293740000061
表2实验试剂表
Figure BDA0003217293740000062
Figure BDA0003217293740000071
Figure BDA0003217293740000081
实施例1：基于适配体-巯基双面特异识别的荧光传感器阵列的制备
按以下步骤制备基于适配体-巯基双面特异识别的荧光传感器阵列：
S1：采用水热法合成MPA(巯基丙酸)表面修饰的r/g CdTe QDs。具体地，首先，在150mL的三颈烧瓶中加入0.20g柠檬酸三钠，0.5mmol CdCl2.2.5H2O，50mL去离子水。充分溶解混合后，立即滴加52μL MPA，用2M的NaOH溶液调节溶液pH为10.5左右，再加入0.1mmolNa2TeO3和50mg NaBH4。分别在100℃下水热回流30min和120min得到绿色与红色CdTe量子点溶液。冷却至室温，向烧瓶中加入30mL无水乙醇，9000rpm离心以去除上清液，洗涤3次。最后，纯化的绿色与红色CdTe量子点分别分散于去离子水中，稀释至100mg.L-1，即得到g-CdTeQDs溶液和r-CdTe QDs溶液。
S2：通过溶胶-凝胶法将r/g CdTe QDs掺杂在SiO2中，合成r/g CdTe QDs@SiO2。具体地，150mL圆底烧瓶中加入5mL的g-CdTe QDs溶液，3mL的r-CdTe QDs溶液与50mL乙醇溶液混合，搅拌15min。再向反应溶液中加入100μL TEOS和200μL NH3.H2O，搅拌反应6h。反应结束后9000rpm离心分离r/gCdTe QDs@SiO2，分别用乙醇和去离子水洗涤数次，分散在4mL的去离子水中4℃冷藏备用。以类似方法合成巯基封端的CdTe QDs@SiO2，只是在加入TEOS时再加入20μL(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷，作为对比例。
S3：通过界面溶胶-凝胶自组装合成Janus-r/g QDs-NH2/Vinyl复合材料，其为一面氨基，一面双键的双荧光复合材料。具体地，在10mL离心管中加入0.1g Tween-80充分溶于6mL去离子水中，加入2M HCl溶液调节溶液pH到3作为水相备用。然后在100mL的圆底烧瓶中加入25mL甲苯，3g Span-80，搅拌均匀，加入1.5mLTEOs，0.5mLAPTEs和0.5mLKH-570，搅拌5min后，调节转速到10000rpm，逐滴加入上述水相，形成W/O乳液，随后再滴加步骤S2制得的r/gCdTe QDs@SiO2，搅拌5min，调节转速到3000rpm，在70℃下溶胶-凝胶反应12h。所得Janus-r/gQDs-NH2/Vinyl复合材料，经过9000rpm离心分离，分别用乙醇和去离子水洗涤数次，50℃真空干燥，待用。不掺杂量子点的Janus-NH2/Vinyl复合材料的合成方法与上述方法相同，只是不添加量子点，作为对比例。
S4：通过巯基-烯基点击化学反应将巯基修饰的核酸适配体接枝到步骤S3制得的Janus-r/g QDs-NH2/Vinyl复合材料的双键面上，再将巯基丙酸的羧基与Janus-r/g QDs-NH2/Vinyl复合材料的氨基通过酰胺化反应结合，得到Janus-r/g QDs-SH/Apt复合材料，即得荧光传感器阵列。具体地，在10mL圆底烧瓶中加入0.5g Janus-r/gQDs-NH2/Vinyl粉末，5mL甲醇，超声分散20min，加入0.28μmol巯基修饰的氨基糖苷类适配体，逐滴加入三乙胺调节pH到8，45℃下搅拌反应6h。所得Janus-r/gQDs-NH2/Apt在9000rpm离心分离，用去离子水洗涤三次，45℃真空干燥。再将干燥的Janus-r/gQDs-NH2/Apt分散于25mL乙醇，超声分散5min，加入0.1g EDC，0.1g NHS，100μL MPA，45℃搅拌3h。所得Janus-r/gQDs-SH/Apt在9000rpm离心分离，乙醇洗涤三次，45℃真空干燥，待用。
本实施例步骤S4中的巯基修饰的氨基糖苷类适配体的碱基序列为5-SH-C6-TGGGGGTTGAGGCTAAGCCGA-C6-SH-3，该核酸适配体对于不同氨基糖苷类抗生素具有差异选择性，因此可用于阵列的构建。在其他实施例中，也可以选择其他序列的核酸适配体，比如在此序列基础上增加或减少碱基段。
实施例2：Janus-NH2/QDs@SiO2的合成
本实施例合成Janus-NH2/QDs@SiO2是为了证明实施例1所用方法合成的Janus材料分别是由氨基和双键封端的双面材料，且两面互不干扰。首先，在10mL圆底烧瓶中加入0.5gJanus-NH2/Vinyl粉末，10mL甲醇，超声分散20min，加入1.5mL巯基封端的CdTe QDs@SiO2，逐滴加入三乙胺调节溶液的pH到8，60℃搅拌反应4h。所得Janus-NH2/QDs@SiO2在9000rpm离心分离，用去离子水洗涤三次，50℃真空干燥，待用。
测试例1：实施例1和实施例2所得的几种Janus复合材料的结构表征
纳米粒度表征
取少量r-CdTe QDs和g-CdTe QDs分散在水中，利用超声分散均匀，放入纳米粒度和Zeta电位分析仪中进行测定。
请参阅图1，其为g-CdTe QDs和r-CdTe QDs的粒径分布图，由图可知，经过仪器测定，量子点的颗粒分布均匀，g-CdTe QDs粒径大小约为3.5nm，r-CdTe QDs粒径大小约为7nm。由此可以表明量子点具有的尺寸效应，通过不同热回流时间获得不同粒径分布的量子点，且荧光发射波长随粒径增大而向着长波长移动，并且在巯基丙酸为稳定剂情况下，使得量子点颗粒表面缺陷和表面能大大降低，减少量子点自身的自聚集，因此得到的g-CdTeQDs和r-CdTe QDs颗粒均较小。
FT-IR表征
分别称取烘干的100mg KBr(溴化钾)，和r/gCdTe QDs@SiO2、Janus-NH2/Vinyl、Janus-r/gQDs-NH2/Vinyl、Janus-r/gQDs-SH/Apt，在干燥的玛瑙研钵中将其混合均匀并研磨成细粉，压片后进行扫描，得到FT-IR光谱图，对主要官能团的特征吸收峰进行表征分析。
请参阅图2，其为CdTe QDs@SiO2、Janus-NH2/Vinyl、Janus-r/gQDs-NH2/Vinyl和Janus-r/gQDs-SH/Apt的红外光谱图。其中，吸收峰1048cm-1、930cm-1和1092cm-1分别是Si-O-Si、Si-O-H和Si-O的伸缩振动。1400cm-1是量子点这是由于量子点上羧基的非对称伸缩振动。在Janus-NH2/Vinyl和Janus-r/gQDs-NH2/Vinyl的谱图主要是1718cm-1和1562cm-1处分别有C＝C和NH2的特征吸收峰，及1476cm-1处是N-H的变形峰，同时具有双键和氨基表明材料两面异性存在的可能性。Janus-r/gQDs-SH/Apt的谱图中双键和氨基的1718cm-1、1562cm-1和1476cm-1吸收峰消失，在1685cm-1处出现C＝N伸缩振动强特征吸收，及1400cm-1处C＝O吸收峰增强，这是核酸适配体上碱基结构主要官能团吸收峰，与前面键合量计算结构相符合，表明材料上成功修饰适配体，在2565cm-1处出现S-H的特征吸收峰，表明巯基也成功接枝上去。
透射电镜表征
取少量超声前后的Janus-NH2/Vinyl、Janus-Janus-r/gQDs-NH2/Vinyl溶解在乙醇中，超声分散均匀，用微量移液器从中吸取少量液体滴在透射电镜专用的铜网表面，在红外灯下烘干，然后放入仪器中观察。
请参阅图3，其中，图a是硅烷化后的r/g-CdTe@SiO2的透射电镜图，可以看出是球形颗粒，大小均一，从插图的高倍放大图看其粒径大概在22nm左右，表面有一层薄膜状衬度，说明包硅成功。图b中右上插图是超声前的Janus-NH2/Vinyl空心球，其粒径在400nm左右，超声破碎后形成Janus-NH2/Vinyl纳米片，从图可以看出其有较大的比表面积。图c中右上插图是超声前Janus-r/gQDs-NH2/Vinyl空心球，与未掺杂r/g-CdTe@SiO2相比，其表面相对粗糙，能看到掺杂有硅烷化后的量子点，粒径依然保持在400nm左右，形貌几乎不变。超声破碎后形成Janus-r/gQDs-NH2/Vinyl纳米片，表面均匀掺杂上了r/g-CdTe@SiO2，证明本发明利用界面溶胶-凝胶自组装法首次成功合成掺杂红/绿量子点的Janus-r/gQDs-NH2/Vinyl纳米材料。
扫描电镜表征
用牙签取少量r/gCdTe QDs@SiO2、超声前后的Janus-r/gQDs-NH2/Vinyl和Janus-NH2/QDs@SiO2粉末，平铺在扫描电镜专用的样品台导电胶上，用洗耳球吹去表面多余粉末，在用镊子加紧样品台，在桌子边缘轻敲，出去浮在导电胶表面的粉末，再用蘸取乙醇的棉签将导电胶周边擦洗干净，放入仪器中观察。
请参阅图4，其中，图(a)和图(b)是Janus-NH2/CdTe QDs@SiO2的扫描电镜图，可以看出，材料的一面光滑而另一面相对粗糙，粗糙面是由于CdTe QDs@SiO2-SH的巯基与Janus-NH2/Vinyl的双键作用而负载到材料表面，而氨基面几乎没有吸附到CdTe QDs@SiO2-SH，(图b红色圈处能明显看到该片是两面不同粗糙度的纳米片)，因此证明了我们所合的Janus-NH2/Vinyl纳米片确实为一面带氨基一面带巯基的双面材料。图c是超声前的Janus-r/gQDs-NH2/Vinyl空心球，其表面能看出具有小颗粒状的硅烷化后的r/g-CdTe QDs@SiO2，从图c中超声破碎后的Janus-r/gQDs-NH2/Vinyl纳米片能更明显的看出掺杂的小颗粒量子点，与未掺杂的Janus纳米片(a-b)相比，其厚度增加了，这也是在界面溶胶-凝胶自组织合成Janus时加入硅烷化后的造成的结果。
Janus-r/gQDs-SH/Apt中适配体键合量的测定
用磷酸缓冲液(PBS，pH＝7.5，10mM)溶解巯基修饰的适配体，配制成1mL的浓度为0.02，0.05，0.10，0.20，0.30，0.40μM的标准溶液。加入1μL的4S red plus核酸荧光染料，混合均匀后置于黑暗条件下静置30min。以320nm为激发波长，扫描上述标准溶液在540到700nm范围内的荧光发射光谱，测试时需使用420nm长通滤光片。每个样品平行测定3次，以F-F0/F0为纵坐标(F0和F分别代表未加入DNA和加入DNA后616nm处的荧光强度)，DNA浓度的对数值为横坐标作图，拟合散点得到标准曲线。制备Janus-r/gQDs-SH/Apt的聚合反应结束后，离心获得上清液。吸取100μL上清液，用PBS稀释至1mL，采用同样方法进行染色和荧光测试，得到剩余溶液中DNA的含量，从而计算得到适配体的键合量。
Janus-r/gQDs-SH/Apt中核酸适配体键合量的测定主要是基于核酸适配体与荧光染料分子以静电作用相结合，使荧光染料分子的发射强度增强，且随适配体浓度变化递增，发射峰位置在645nm附近(图5)，线性范围为0.02-0.30μM。如图6所示，工作曲线的相关系数达0.992，满足测试的要求。最后采用了3组Janus-r/gQDs-SH/Apt的上清液进行残留适配体含量的测定，键合量均在95％以上。
实验例1：Janus-r/gQDs-SH/Apt复合材料构建的荧光传感器阵列对有机/无机污染物检测
先分别配制1mg.mL-1的卡那霉素、阿米卡星、庆大霉素和Cu2+、Hg2+、Co2+溶液，并放于冰箱4℃保存。然后在5mL的离心管中分别加入一定量的卡那霉素、阿米卡星、庆大霉素和Cu2+、Hg2+、Co2+溶液，再加入Janus-r/gQDs-SH/Apt溶液(Janus-r/gQDs-SH/Apt分散于pH为7的磷酸盐缓冲液或去离子水中得到)，用pH为7.0的磷酸盐缓冲液将体积补至4mL，配成分析物浓度最终分别为：0.00、0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、5.00、8.00、10.00、15.00μg.mL-1，且所有样品溶液中的Janus-r/gQDs-SH/Apt浓度均为1mg.mL-1。25℃下孵育30min，测定荧光值，每个样品平行测定4次。由此，产生4次重复×2个信号输出(或者2面特异识别位点)×6个分析物的数据矩阵。将原始数据归一化处理后，即(F-F0)/F0，采用SPSS v16.0软件进行线性判别分析(LDA)。
如图7所示，将实施例1合成的Janus-r/gQDs-SH/Apt多功能单传感器来构建双识别双信号的(2×2)多通道传感器阵列用于三种氨基糖苷类抗生素和三种重金属离子的检测。其中，卡那霉素、阿米卡星和庆大霉素主要是通过Janus-r/gQDs-SH/Apt的核酸适配体(Apt)来识别，Apt与掺杂的红/绿色量子点间通过静电猝灭，氨基糖苷类抗生素的加入会覆盖Apt，切断了Apt与量子点间作用，使得荧光恢复。如图7(a)柱形图所示，在0.05-8μg.mL-1浓度范围里，三种抗生素对两种量子点的荧光恢复起到不同程度的促进作用，且随着浓度增大，促进效果更好。而对Co2+、Cu2+和Hg2+三种重金属离子的识别主要是通过Janus-r/gQDs-SH/Apt的巯基面，巯基和金属离子间通过螯合作用，捕获金属离子，从而使红/绿量子点发生荧光猝灭。同样的，在0.05-8μg.mL-1浓度范围里，三种重金属离子对两种量子点的荧光具有不同程度猝灭，且随着浓度增大，猝灭程度越大。从2(Apt/SH识别位点)×2(红/绿量子点)个通道对6种污染物在0.05-8μg.mL-1浓度范围里产生的指纹图谱进行LDA数据分析，如图7(b)所示，对6(分析物)×6(浓度)×2(信号输出)×4(重复测量)的高维数据采用其组质心函数绘制LDA图(质心图)。从图中可以看出，在最低浓度时(0.05μg.mL-1，蓝色图案)，六种分析物的质心位置比较靠近，从部分放大图(图7(d))来看，每个分析物及其不同浓度也是能完全区分开，且其质心距离随着浓度增大而增大。相对于抗生素，三种金属离子间的质心位置更加散，更易区分。另外，在传感器阵列中，欧氏距离也常用来作为区分效果的参考因子。因此，我们计算了0.05-8μg.mL-1浓度范围里六种污染物质心位置的欧氏距离平均值，绘制了雷达图(图7(c))，可以明显的看出，随着浓度增大，欧氏距离平均值也越大，表明了这六种污染物更容易识别。由以上结果可以看出，以Janus-r/gQDs-SH/Apt单传感器构建的多通道传感器阵列，能在较宽的浓度范围内同时识别有机-无机污染物，并且表现出良好的定性和定量分析能力。
此外，本实验例还对比了对称结构的r/gCdTe QDs@SiO2-Apt与r/gCdTe QDs@SiO2-SH对三种氨基糖苷类抗生素与金属离子同时测定区分的能力。如图8所示，当浓度为0.1μg.mL-1时，r/gCdTe QDs@SiO2-Apt与卡那霉素、阿米卡星和庆大霉素作用后，红色、绿色量子点荧光有不同程度的恢复，而与Co2+、Cu2+和Hg2+作用后，红色、绿色量子点荧光也发生不同程度猝灭，但是与r/gCdTe QDs@SiO2-SH相比，其猝灭程度小的多，表明在修饰巯基后，材料对金属离子的识别作用更强。而r/gCdTe QDs@SiO2-SH与卡那霉素、阿米卡星和庆大霉素作用后，红色、绿色量子点荧光强度几乎没有发生明显变化。由此可见，对称性结构的功能较单一，并不能用于化学性质差异较大的不同类型物质的分析，而实施例1合成的Janus-r/gQDs-SH/Apt同时具有氨基糖苷类抗生素的特异识别面(Apt)和重金属离子的特异识别面(-SH)，两面之间互不干扰，并对以上两种有机-无机污染物起到很好的同时识别作用。
实验例2：Janus-r/gQDs-SH/Apt复合材料构建的荧光传感器阵列对有机/无机污染物的半定量分析
图9～11中的图a1、b1、c1分别是Janus-r/gQDs-SH/Apt对卡那霉素、阿米卡星和庆大霉素检测后的荧光变化光谱图，随着三种抗生素浓度的增大，量子点的荧光增强的越大。图a2、b2、c2是对Apt识别面和r/gCdTe QDs对三种抗生素产生的指纹图谱进行LDA处理，三种抗生素在0.05-10μg.mL-1浓度范围里表现出良好的递增关系，而且每个浓度重复测量4次形成的团簇明显区分开，没有出现交集，表明我们构建的传感器阵列对于卡那霉素、阿米卡星和庆大霉素有较大浓度范围检测能力，且具有良好的重复稳定性。图a3、b3、c3通过绘制典型因子1与浓度对数的关系，得到了定量响应曲线，说明构建的传感器阵列能用于半定量分析。
图12～14中的d1、e1、f1分别是Janus-r/gQDs-SH/Apt的巯基面对Co2+、Cu2+和Hg2+的特异性识别后产生的荧光猝灭光谱图，随着浓度的增大，量子点荧光猝灭程度越大。此外也能看出，Co2+对r/gCdTe QDs两个量子点的猝灭效果几乎一致，Cu2+则对红色量子点更敏感，Hg2+对绿色量子点更敏感，这种强烈的差异性也表明了金属离子更容易被区分。图d2、e2、f2是对应的LDA图，浓度从0.01-10μg.mL-1增加时，每个浓度重复测量4次形成的团簇也被均匀区分开。图d3、e3、f3通过绘制典型因子1与浓度对数的关系，得到的定量响应曲线可以看出Co2+的定量检测效果最好，在0.01-10μg.mL-1浓度范围里具有良好的相关系数；Cu2+在0.01-8μg.mL-1浓度范围也表现出良好的线性关系；Hg2+在高浓度时对量子点有一个急剧下降的过程，在0.01-5μg.mL-1浓度范围的线性关系更好。
从以上结果可以看出，实施例1合成的Janus-r/gQDs-SH/Apt复合材料同时具有氨基糖苷类抗生素和重金属离子的特异性识别位点，且同时还掺杂有红色和绿色量子点，由单传感单元实现了四通道的多功能检测，对于这六种有机/无机污染物能起到很好的双特异性识别的效果，这对于拓新传感器阵列技术的发展和环境污染检测方面具有重要意义。
实验例3：传感器阵列对混合样品的检测
环境污染问题越来越严峻，污染基质也越来越复杂，同时检测有机/无机污染物对环境分析起到重要作用。为了检验该传感器阵列的多重检测能力，对不同比例的有机/无机污染物混合样品进行了检测。本实验例对两种、三种、四种不同氨基糖苷类抗生素和重金属离子进行随机的摩尔比例混合(总浓度为0.1μg.mL-1)进行了检测。
首先，分别配制1mg.mL-1不同分析物的系列摩尔比例混合溶液，Hg2+：Cu2+＝10:0、9:1、7:3、5:5、3:7、1:9、0:10；卡那霉素：庆大霉素＝5:5；Hg2+：卡那霉素卡＝2:8；Cu2+：庆大霉素＝7:3；Hg2+：Cu2+：卡那霉素卡＝4:3:3；Cu2+：卡那霉素卡：庆大霉素＝2:4:4；Hg2+：Cu2+：卡那霉素卡：庆大霉素＝2:3:2::3。然后，5mL离心管中分别加入一定量的上述混合溶液，再加入Janus-r/gQDs-SH/Apt溶液，用pH为7.0的磷酸盐缓冲液将体积补至4mL，配成不同摩尔比例混合分析物总浓度最终为0.1μg.mL-1，样品溶液中的Janus-r/gQDs-SH/Apt浓度为1mg.mL-1。25℃下孵育30min，测定荧光值，每个样品平行测定4次。
如图15a所示是Hg2+和Cu2+分别按不同比例混合(Hg2+：Cu2+＝10:0、9:1、7:3、5:5、3:7、1:9、0:10)，用Janus-r/gQDs-SH/Apt对其检测后的荧光变化光谱图。可以看出Hg2+对绿色量子点的猝灭最强，对红色量子点的猝灭较弱，Cu2+恰好相反。而在随着Hg2+/Cu2+比例由大到小变化的过程中，混合物对绿色量子点的猝灭逐渐减弱，而对红色量子点的猝灭作用增强(Cu2+则表现出相反的变化趋势)。在图15b中，利用LDA图对Hg2+和Cu2+混合溶液对两个信号变化的趋势做了分析。首先是每组按不同比例混合Hg2+和Cu2+的4次重复彼此聚集成紧密的簇，表明传感器阵列的重复稳定性好，不同的簇有规律的分布在不同的区域，且没有任何的错误交叉，显示了该传感器阵列的多重识别能力，并且混合样中某个物质浓度比例越高，其分布区域就越靠近该纯样品，并且随着浓度比例递减而规律性远离该纯样品，表现出良好的位置信息规律。
在图15c中，是Janus-r/gQDs-SH/Apt对Hg2+、Cu2+、卡那霉素、庆大霉素、卡那霉素：庆大霉素＝5:5；Hg2+：卡那霉素卡＝2:8；Cu2+：庆大霉素＝7:3；Hg2+：Cu2+：卡那霉素卡＝4:3:3；Cu2+：卡那霉素卡：庆大霉素＝2:4:4；Hg2+：Cu2+：卡那霉素卡：庆大霉素＝2:3:2::3的检测荧光变化光谱图。卡那霉素与庆大霉素使量子点荧光增强，Hg2+与Cu2+使量子点荧光猝灭，不同比例混合的样品对量子点的荧光变化趋势主要由占比最大的成分决定，但其对量子点荧光变化的影响始终会介于构成该混合样的纯样品之间。这在LDA图(图15d)中能更明显的显示出来，比如重复4次测量的A1+2(Hg2+：Cu2+＝3:7)团簇的位置在A1(Hg2+)和A2(Cu2+)之间，且更靠近A2。A1+2+3(Hg2+：Cu2+：卡那霉素卡＝4:3:3)的位置在A1+2和A1+3之间，当然它也在A1、A2和A3包围的共同区域内，且更靠近A1。四种物质混合时也有类型规律，A1+2+3+4(Hg2+：Cu2+：卡那霉素卡：庆大霉素＝2:3:2::3)的团簇首先在A1+2+3和A2+3+4构成的小区域之间，在往外扩是两两混合的样品构成的区域，最后是处在这四种纯样品构成的大区域位置处。因此，无论样品混合复杂程度有多高，通过该传感器阵列检测区分后，都能将他们按一定的规律分布，从而达到检测识别的目的。而且这种区分能力会随着传感器阵列的传感单元数量的增多、信号变化增多而越强。
实验例4：实际样品检测
实际样品主要来源于佛山某工业废水，样品取回后放于4℃冰箱保存由于没有检测到目标物，采用加标区分实验。首先分别加入一定浓度的Cu2+、Hg2+和卡那霉素到废水样中，混合均匀后将水样以12000rpm转速离心10min，然后用0.45μm的滤膜过滤除去不溶杂质，使用时将废水样品稀释50倍。按上述方法进行检测。
分别向工业废水中加入了0.1μg.mL-1和0.5μg.mL-1的Cu2+、Hg2+和卡那霉素，如图16a所示，即使是在废水样环境中，加入Cu2+、Hg2+的水样使得量子点猝灭，加入卡那霉素的水样使得量子点荧光增强，并利用LDA对产生的指纹图谱进行分析(图16b)，四次重复测量的点紧密团聚成簇，且都分布在不同的区域，没有出现交叉，表明构建的传感器阵列在实际水样应用中依然保持高稳定性与区分能力。此外，废水样单独分布在一个区域，而加入不同目标物的废水样，随着加入浓度增大而依次远离原废水样，依然能呈现出线性变化的规律。证实了Janus-r/gQDs-SH/Apt传感器阵列在实际样品中的应用能力。
本发明并不局限于说明书和实施方式所列运用，其完全可以被适用于各种适合本发明的领域，在不背离本发明精神及其实质的情况下，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改和变形，但这些相应的修改和变形都应属于本发明所要求的保护范围。
以上所述仅为本发明的部分实施例，并非因此限定本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书内容所做出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，应当包含在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 佛山市三水佛水供水有限公司
<120> 基于适配体-巯基双面特异识别的荧光传感器阵列及其制备方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgggggttga ggctaagccg a 21

Claims (10)

1.一种基于适配体-巯基双面特异识别的荧光传感器阵列的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1：采用水热法合成MPA表面修饰的r/g CdTe QDs；
S2：通过溶胶-凝胶法将r/g CdTe QDs掺杂在SiO2中，合成r/g CdTe QDs@SiO2；
S3：通过界面溶胶-凝胶自组装合成Janus-r/g QDs-NH2/Vinyl复合材料，其为一面氨基，一面双键的双荧光复合材料；
S4：通过巯基-烯基点击化学反应将巯基修饰的核酸适配体接枝到步骤S3制得的Janus-r/g QDs-NH2/Vinyl复合材料的双键面上，再将巯基丙酸的羧基与Janus-r/g QDs-NH2/Vinyl复合材料的氨基通过酰胺化反应结合，得到Janus-r/g QDs-SH/Apt复合材料，即得荧光传感器阵列。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤S3包括以下步骤：将Tween-80充分溶于去离子水中，调节溶液pH值为3作为水相；然后将甲苯和Span-80搅拌均匀，加入TEOs、APTEs和mLKH-570，搅拌5min后，调节转速到10000rpm，逐滴加入所述水相，形成W/O乳液；随后再滴加步骤S2制得的r/g CdTe QDs@SiO2量子点，搅拌5min，调节转速到3000rpm，在70℃下溶胶-凝胶反应12h，经过离心分离、洗涤和干燥，得到Janus-r/g QDs-NH2/Vinyl复合材料。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤S4包括以下步骤：将步骤S3得到的Janus-r/g QDs-NH2/Vinyl粉末在甲醇中超声分散20min，加入巯基修饰的氨基糖苷类适配体，并调整pH值为8，45℃下搅拌反应6h，经过离心分离、洗涤和干燥后得到Janus-r/gQDs-NH2/Apt复合材料；然后再将其分散于乙醇中，超声分散5min，加入EDC、NHS和MPA，45℃搅拌3h，经过离心分离、洗涤和干燥后得到Janus-r/g QDs-SH/Apt复合材料，即得荧光传感器阵列。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤S3中，所述水相中Tween-80和去离子水的用量比例为0.1g：6mL；甲苯、Span-80、TEOs、APTEs、KH-570和r/g CdTe QDs@SiO2的用量比例为25mL：3g：1.5mL：0.5mL：0.5mL：2mL。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤S4中，Janus-r/gQDs-NH2/Vinyl粉末、甲醇、巯基修饰的氨基糖苷类适配体、乙醇、EDC、NHS和MPA的用量比例为0.5g：5mL：0.28μmol：25mL：0.1g：0.1g：100μL。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤S1包括以下步骤：将柠檬酸三钠和CdCl2.2.5H2O充分溶解混合在去离子水中，然后立即滴加MPA，调节溶液pH值为10.5，再加入Na2TeO3和NaBH4，分别在100℃下水热回流30min和120min得到绿色与红色CdTe量子点溶液，冷却至室温，加入无水乙醇，9000rpm离心以去除上清液，洗涤3次，最后将纯化的绿色与红色CdTe量子点分别分散于去离子水中，稀释至100mg.L-1，得到g-CdTe QDs溶液和r-CdTeQDs溶液。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：步骤S2包括以下步骤：将步骤S1得到的g-CdTe QDs溶液和r-CdTe QDs溶液与乙醇溶液混合均匀，搅拌15min后向溶液中加入TEOS和NH3.H2O，搅拌反应6h，反应结束后9000rpm离心分离r/gCdTe QDs@SiO2，分别用乙醇和去离子水洗涤数次，分散在去离子水中4℃冷藏备用。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：步骤S1中，柠檬酸三钠、CdCl2.2.5H2O、去离子水、MPA、Na2TeO3和NaBH4的用量比例为0.20g：0.5mmol：50mL：52μL：0.1mmol：50mg。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：步骤S2中，g-CdTe QDs溶液、r-CdTeQDs溶液、乙醇溶液、TEOS、NH3.H2O和去离子水的用量比例为5mL：3mL：50mL：100μL：200μL：4mL。
10.一种基于适配体-巯基双面特异识别的荧光传感器阵列，其特征在于：根据权利要求1～9任一项所述的制备方法制备而成。
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