CN108250360A - 对卡那霉素具有双重特异性识别的适配体-分子印迹荧光传感器及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种对卡那霉素具有双重特异性识别的适配体‑分子印迹荧光传感器的制备方法，包括以下步骤：首先，由模版分子卡那霉素、巯基修饰的卡那霉素适配体、甲基丙烯酸形成预聚合复合物；然后，由预聚合复合物、交联剂、丙烯胺修饰的CdSe量子点、引发剂形成适配体‑量子点复合物；最后，将适配体‑量子点复合物中模版分子卡那霉素洗脱，得到对卡那霉素具有双重特异性识别的适配体‑分子印迹荧光传感器。本发明还提供一种有上述制备方法制备出的一种对卡那霉素具有双重特异性识别的适配体‑分子印迹荧光传感器，及其在检测样品中卡那霉素含量的应用。本发明的适配体‑分子印迹荧光传感器对卡那霉素具有双重特异性识别，对卡那霉素有很好的选择性。

Description

对卡那霉素具有双重特异性识别的适配体-分子印迹荧光传 感器及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于分子印迹制备领域，尤其涉及一种对卡那霉素具有双重特异性识别的适配体-分子印迹荧光传感器及其制备方法和应用。
背景技术
卡那霉素是一种氨基抗生素，在治疗和预防微生物感染中发挥重要作用，但过量使用会导致过敏反应、肾毒性和听力丧失等副作用。另外，环境水和食品中残留的卡那霉素也会造成水体和食品污染，进而危及人类健康。目前卡那霉素的检测方法大部分需要昂贵的仪器和复杂的操作，耗时耗力。因此，寻找一种简单、快速和选择性检测卡那霉素的方法非常有必要。
分子印迹聚合物作为一种识别元件，近年来获得了持续的关注，并广泛应用于纯化分离、化学/生物传感和药物递送等领域。由于其在空间和大小方面为模板分子量身定做了互补的结合位点，分子印迹聚合物能够高特异性和选择性的识别模板分子。相比于传统的识别元件，分子印迹聚合物制备成本低、物理稳定性好、可以多次循环使用。
适配体是一种短的单链DNA或RNA分子，从随机序列核酸组合文库中通过指数式富集配体系统进化技术筛选得到。适配体有许多优点如无毒、化学稳定性好、价格便宜、容易被修饰、序列设计灵活多变、无免疫原性及可以高亲和性和特异性得结合几乎任何目标分子如小分子、蛋白甚至微生物和细胞。因为这些优点使适配体成为一种非常具有吸引力的生物分子识别元件，已被广泛关注。
考虑到适配体和分子印迹各自独特的优点，将适配体和分子印迹结合起来的研究近年来陆续有所报道。随后，研究者们不断进行新的尝试和探索，相继报道出基于石英晶体微天平的微量重量分析法、电化学检测策略、基于上转换纳米粒子的分子印迹聚合物探针、基于电化学发光能量转移的识别系统及基于金纳米粒子修饰聚合物的信号放大方法。然而，基于半导体量子点的适配体-分子印迹荧光传感目前尚未报道过。
因此，开发一种以半导体量子点作为支撑，巯基修饰的适配体和功能单体，结合巯基-双键点击反应，制备出的一种对卡那霉素具有双重特异性识别的适配体-分子印迹荧光传感器，用来快速、灵敏和专一性的检测样品中的卡那霉素。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术所存在的不足，提供一种对卡那霉素具有双重特异性识别的适配体-分子印迹荧光传感器的制备方法，其步骤简单；所制备出的适配体-分子印迹荧光传感器能快速、灵敏和专一性的检测样品中的卡那霉素。
为了实现上述目的，本发明采用以下的技术方案：
一种对卡那霉素具有双重特异性识别的适配体-分子印迹荧光传感器的制备方法，包括以下步骤，首先，由模版分子卡那霉素、巯基修饰的卡那霉素适配体和甲基丙烯酸形成预聚合复合物；然后，由预聚合复合物、交联剂、丙烯胺修饰的CdSe量子点和引发剂形成适配体-量子点复合物；最后，将适配体-量子点复合物中模版分子卡那霉素洗脱，得到对卡那霉素具有双重特异性识别的适配体-分子印迹荧光传感器。
优选的，一种对卡那霉素具有双重特异性识别的适配体-分子印迹荧光传感器的制备方法包括以下步骤：
1)制备预聚合复合物
将模版分子卡那霉素、巯基修饰的卡那霉素适配体、甲基丙烯酸形成预聚合复合物溶于pH值为7的缓冲液中，混合均匀，在温度为37℃的条件下，反应2小时，制得预聚合复合物；
2)制备适配体-量子点复合物
在步骤1)所制得的预聚合复合物中，加入交联剂、丙烯胺修饰的CdSe量子点，超声5-10分钟，在氮气保护的条件下，加入引发剂，再加入所述缓冲液，在温度为40发的条件下，搅拌反应6小时，制得适配体-量子点复合物；
3)洗脱模版分子卡那霉素
将步骤2)获得的适配体-量子点复合物在转速为12000rpm的条件下离心10分钟，去掉上清液，用水洗涤适配体-量子点复合物，再用洗脱液除去适配体-量子点复合物中的模版分子卡那霉素，得到对卡那霉素具有双重特异性识别的适配体-分子印迹荧光传感器。
优选的，所述模版分子卡那霉素、巯基修饰的卡那霉素适配体和甲基丙烯酸的摩尔比为1∶1∶2-15。
特别优选的，所述模版分子卡那霉素、巯基修饰的卡那霉素适配体和甲基丙烯酸的摩尔比为1∶1∶5。
优选的，所述模版分子卡那霉素与丙烯胺修饰的CdSe量子点的摩尔比1∶111.25-223.13。
特别优选的，所述丙烯胺修饰的CdSe量子点的摩尔浓度为0.625mM；所述模版分子卡那霉素与丙烯胺修饰的CdSe量子点的摩尔体积比mmol∶L为1∶178-357。
优选的，所述丙烯胺修饰的CdSe量子点由以下步骤制备所得：
S1：将羧基修饰的CdSe量子点、EDC溶液和NHS溶液混合，在温度为40℃条件下，搅拌反应30分钟，使CdSe QDs表面的羧基被充分活化；
S2：加入丙烯胺溶液，在温度为40℃的条件下反应2小时；
S3：加入异丙醇，经过沉淀、离心、分离、清洗、重悬后得到纯化的丙烯胺修饰的CdSe量子点。
特别优选的，所述丙烯胺修饰的CdSe量子点由以下步骤制备所得：
S1：将羧基修饰的CdSe量子点、EDC溶液和NHS溶液混合，在温度为40℃条件下，搅拌反应30分钟，使CdSe QDs表面的羧基被充分活化；
S2：加入丙烯胺溶液，在温度为40℃的条件下反应2小时，制得丙烯胺修饰的CdSe量子点溶液；
S3：加入等体积的异丙醇，经过沉淀、离心、分离、清洗、重悬后得到纯化的丙烯胺修饰的CdSe量子点。
采用丙烯胺修饰的CdSe量子点，是因为其表面含有末端双键，可以与交联剂、功能单体发生聚合反应，有利于在量子点表面形成聚合物层。
优选的，所述羧基修饰的CdSe量子点的摩尔浓度为2.5mM，EDC溶液的摩尔浓度为0.1M，NHS溶液的摩尔浓度为0.1M；所述羧基修饰的CdSe量子点、EDC溶液和NHS溶液的体积比为：1∶0.1∶0.1。
优选的，所述羧基修饰的CdSe量子点和丙烯胺溶液的体积比为1∶0.001。
优选的，所述交联剂选自N，N’-亚甲基双丙烯酰胺或三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯。
优选的，所述引发剂选自四甲基乙二胺、过硫酸铵、偶氮二异丁腈中的一种或两种。
特别优选的，所述交联剂为N，N’-亚甲基双丙烯酰胺。
特别优选的，所述引发剂为四甲基乙二胺和过硫酸铵。
特别优选的，所述模版分子卡那霉素与N，N’-亚甲基双丙烯酰胺摩尔比为1∶923-2309。
最优选的，所述模版分子卡那霉素与N，N’-亚甲基双丙烯酰胺摩尔比为1∶1847。
特别优选的，所述模版分子卡那霉素与四甲基乙二胺摩尔体积比mol∶L为1∶107-357；所述模版分子卡那霉素与过硫酸铵摩尔比为1∶313-1565。
最优选的，所述模版分子卡那霉素与四甲基乙二胺摩尔体积比mol∶L为1∶107；所述模版分子卡那霉素与过硫酸铵摩尔比为1∶626。
优选的，所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液。
特别优选的，所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液。
优选的，所述洗脱液为含有0.01％(v/v)乙酸的80％(v/v)乙腈/水洗脱液。
本发明还提供一种对卡那霉素具有双重特异性识别的适配体-分子印迹荧光传感器，其由上述的对卡那霉素具有双重特异性识别的适配体-分子印迹荧光传感器的制备方法制备获得的。
本发明还提供对卡那霉素具有双重特异性识别的适配体-分子印迹荧光传感器在检测样品中卡那霉素含量的应用。
优选的，对卡那霉素具有双重特异性识别的适配体-分子印迹荧光传感器在检测样品中卡那霉素含量的检测条件分别为：pH为7.0，温度为室温，响应时间为25分钟。
本发明的有益效果：
1、本发明提供的制备方法，反应条件温和、反应速度快、产率高，是一种简便、高效的制备对卡那霉素具有双重特异性识别的适配体-分子印迹荧光传感器的制备方法。
2、本发明利用了适配体的高特异性与分子印迹的高选择性、特异性结合，以CdSe量子点为支撑材料和信号元件，采用表面印迹的方法，制备了一种具有双识别功能的荧光增强型分子印迹传感器。同时，制备过程中采用巯基修饰的卡那霉素适配体作为生物分子单体，甲基丙烯酸作为化学分子单体，两种功能单体，其协同作用进一步增强了印迹聚合物的双识别效果。
3、本发明的适配体-分子印迹荧光传感器进行了对卡那霉素的荧光滴定实验，得到线性检测范围为0.05-20.0μg/ml，线性相关系数为0.998，检测限为0.013μg/ml，专一性识别因子为3.22。
4、本发明的适配体-分子印迹荧光传感器进行了阴阳离子和类似物对卡那霉素检测的干扰试验，证明了本发明的适配体-分子印迹荧光传感器对卡那霉素具有很好的选择性。
5、本发明的适配体-分子印迹荧光传感器应用于实际样品包括自来水、湖水、牛奶和尿液中卡那霉素的加标检测，回收率在85.3％-116％，且相对标准偏差均小于5％。此外，将本发明的适配体-分子印迹荧光传感器应用于养殖场废水中卡那霉素的直接检测，测得废水样品中卡那霉素的含量分别为4.42μg/ml和6.54μg/ml，相对标准偏差分别为4.7％和3.8％。这些结果表明本发明的适配体-分子印迹荧光传感器对卡那霉素具有实际检测价值和意义。
附图说明
图1是本发明所述制备方法的工艺流程图；
图2是制备适配体-分子印迹荧光传感器(apta-MIP-CdSe QDs)和适配体-分子非印迹荧光传感器(apta-NIP-CdSe QDs)中模板分子卡那霉素(Template)、巯基修饰的卡那霉素适配体(Aptamer)、甲基丙烯酸(MAA)的优化摩尔比例试验结果图；
图3是羧基修饰的CdSe量子点(CdSe QDs)、丙烯胺修饰的CdSe量子点(CdSe QDs-AA)、适配体-分子印迹荧光传感器(apta-MIP-CdSe QDs)的FT-IR表征图；
图4是羧基修饰的CdSe量子点(CdSe QDs)和适配体-分子印迹荧光传感器(apta-MIP-CdSe QDs)的XRD表征图；
图5是羧基修饰的CdSe量子点(CdSe QDs)和适配体-分子印迹荧光传感器(apta-MIP-CdSe QDs)的透射电镜表征(TEM)图，其中图5A是CdSe QDs的透射电镜结果，图5B是CdSe QDs-AA的透射电镜结果；图5C和图5D分别是apta-MIP-CdSe QDs的透射电镜结果；
图6是适配体-分子印迹荧光传感器(apta-MIP-CdSe QDs)和适配体-分子非印迹荧光传感器(apta-NIP-CdSe QDs)吸附动力学试验结果图；
图7是pH值对适配体-分子印迹荧光传感器(apta-MIP-CdSe QDs)和适配体-分子非印迹荧光传感器(apta-NIP-CdSe QDs)测定卡那霉素的影响试验结果图；
图8是温度对适配体-分子印迹荧光传感器(apta-MIP-CdSe QDs)和适配体-分子非印迹荧光传感器(apta-NIP-CdSe QDs)测定卡那霉素的影响试验结果图；
图9是适配体-分子印迹荧光传感器(apta-MIP-CdSe QDs)对不同浓度的卡那霉素的荧光响应试验结果图；
图10是适配体-分子非印迹荧光传感器(apta-NIP-CdSe QDs)对不同浓度的卡那霉素的荧光响应试验结果图；
图11是适配体-分子印迹荧光传感器(apta-MIP-CdSe QDs)和适配体-分子非印迹荧光传感器(apta-NIP-CdSe QDs)对卡那霉素及其结构类似物的选择性试验结果图。
具体实施方式
如图1所示，本发明提供一种对卡那霉素具有双重特异性识别的适配体-分子印迹荧光传感器的制备方法，包括以下步骤，首先，由模版分子卡那霉素、巯基修饰的卡那霉素适配体、甲基丙烯酸形成预聚合复合物；然后，由预聚合复合物、交联剂、丙烯胺修饰的CdSe量子点、引发剂形成适配体-量子点复合物；最后，将适配体-量子点复合物中模版分子卡那霉素洗脱，得到对卡那霉素具有双重特异性识别的适配体-分子印迹荧光传感器。
本发明还提供由上述制备方法制备获得的对卡那霉素具有双重特异性识别的适配体-分子印迹荧光传感器和其在检测样品中卡那霉素含量的应用。
各种试验仪器与试剂均为市售商品，均为可通过商业途径购买获得。
以下实施例中的巯基修饰的卡那霉素适配体购于生工生物工程(上海)股份有限公司。
下面通过具体较佳实施例结合制备工艺试验例、结构表征试验例、检测条件试验例和效果试验例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明并不仅限于以下的实施例。
实施例1：
(一)羧基修饰的CdSe量子点(CdSe QDs)的合成
A：用分析天平称取2.3g硒粉和2.3g硼氢化钠，在氮气氛围下缓慢搅拌使其溶于25ml超纯水并反应，待溶液中停止产生氢气即反应结束后，得到无色的NaHSe前驱体溶液。
B：用天平称取0.228g二点五水氯化铬(CrCl2·2.5H2O)，加入到250ml的三颈圆底烧瓶中，添加100ml的超纯水使其溶解，接着边搅拌边缓慢加入97.5微升3-巯基丙酸，再逐滴加入新鲜配制的1M氢氧化钠溶液将溶液的pH调至11。
C：通氮气半个小时除去溶液中溶解的氧气，然后在剧烈的磁搅拌下将新鲜配制的NaHSe前驱体溶液快速加入到混合液中，接着在100℃回流适当的时间后得到橙色透明的CdSe QDs溶液。
D：向制得的CdSe QDs溶液中加入等体积的异丙醇，经过沉淀、离心、分离、清洗、重悬后得到纯化的CdSe QDs溶液(羧基修饰的CdSe QDs溶液的摩尔浓度为2.5mM)，并避光保存在4℃条件下备用。固态样品可以在室温下真空干燥得到。
(二)丙烯胺修饰的CdSe量子点(CdSe QDs-AA)的合成
S1：在25ml的圆底烧瓶中，依次加入10ml上述CdSe QDs溶液，1ml摩尔浓度0.1M的EDC溶液和1ml摩尔浓度0.1M的NHS溶液。在磁力搅拌的条件下，将混合液在40℃反应30min，使CdSe QDs表面的羧基被EDC和NHS充分活化。
S2：往溶液中加入10微升的丙烯胺(AA)溶液，在40℃继续反应2小时，使表面羧基被活化的CdSe QDs与丙烯胺(AA)通过脱水缩合反应制得丙烯胺修饰的CdSe量子点(CdSeQDs-AA)溶液。
S3：向上述溶液中加入等体积的异丙醇，经过沉淀、离心、分离、清洗、重悬后得到纯化的丙烯胺修饰的CdSe量子点(CdSe QDs-AA)溶液(CdSe QDs-AA溶液摩尔浓度为0.625mM)，并避光保存在4℃条件下备用。固态样品可以在室温下真空干燥得到。
(三)对卡那霉素具有双重特异性识别的适配体-分子印迹荧光传感器(apta-MIP-CdSe QDs)的制备
1)制备预聚合复合物
用天平称取1mg的卡那霉素，溶于1ml的pH值为7的磷酸盐缓冲液中配成1mg/ml的储存液。取2.8nmol的卡那霉素、2.8nmol的巯基修饰的卡那霉素适配体和14nmol的甲基丙烯酸(MAA)溶于0.1ml的磷酸盐缓冲液中，混合均匀后在37℃水浴条件下作用2小时，形成预聚合复合物。
2)制备适配体-量子点复合物
在步骤1)所制得的预聚合复合物中，加入0.8mg的N，N’-亚甲基双丙烯酰胺(MBAAM)和0.5ml上述丙烯胺修饰的CdSe量子点(CdSe QDs-AA)，超声5-10分钟后，通入氮气10-20分钟，在氮气保护的情况下加入0.3微升的四甲基乙二胺(TEMED)和0.4mg的过硫酸铵(APS)，再加入磷酸盐缓冲液使反应的终体积为1ml；在磁搅拌条件下，混合物在40℃水浴，聚合反应6小时，制得适配体-量子点(apta-MIP-CdSe QDs)复合物。
3)洗脱模版分子卡那霉素
将步骤2)获得的适配体-量子点复合物在转速为12000rpm的条件下离心10分钟，去掉上清液，用水洗涤适配体-量子点复合物，再用含有0.01％(v/v)乙酸的80％(v/v)乙腈/水洗脱液除去适配体-量子点复合物中的模版分子卡那霉素，得到对卡那霉素具有双重特异性识别的适配体-分子印迹荧光传感器(apta-MIP-CdSe QDs)。
实施例2：
(一)羧基修饰的CdSe量子点(CdSe QDs)的合成
本实施例中上述羧基修饰的CdSe量子点(CdSe QDs)的合成方法同实施例1。
(二)丙烯胺修饰的CdSe量子点(CdSe QDs-AA)的合成
本实施例中上述丙烯胺修饰的CdSe量子点(CdSe QDs-AA)的合成方法同实施例1。
(三)对卡那霉素具有双重特异性识别的适配体-分子印迹荧光传感器(apta-MIP-CdSe QDs)的制备
1)制备预聚合复合物
用天平称取1mg的卡那霉素，溶于1ml的pH值为7的磷酸盐缓冲液中配成1mg/ml的储存液。取2.8nmol的卡那霉素、2.8nmol的巯基修饰的卡那霉素适配体和5.6nmol的甲基丙烯酸(MAA)溶于0.1ml的磷酸盐缓冲液中，混合均匀后在37℃水浴条件下作用2小时，形成预聚合复合物。
2)制备适配体-量子点复合物
在步骤1)所制得的预聚合复合物中，加入0.8mg的N，N’-亚甲基双丙烯酰胺(MBAAM)和0.5ml上述丙烯胺修饰的CdSe量子点(CdSe QDs-AA)，超声5-10分钟后，通入氮气10-20分钟，在氮气保护的情况下加入0.3微升的四甲基乙二胺(TEMED)和0.4mg的过硫酸铵(APS)，再加入磷酸盐缓冲液使反应的终体积为1ml；在磁搅拌条件下，混合物在40℃水浴，聚合反应6小时，制得适配体-量子点(apta-MIP-CdSe QDs)复合物。
3)洗脱模版分子卡那霉素
将步骤2)获得的适配体-量子点复合物在转速为12000rpm的条件下离心10分钟，去掉上清液，用水洗涤适配体-量子点复合物，再用含有0.01％(v/v)乙酸的80％(v/v)乙腈/水洗脱液除去适配体-量子点复合物中的模版分子卡那霉素，得到对卡那霉素具有双重特异性识别的适配体-分子印迹荧光传感器(apta-MIP-CdSe QDs)。
实施例3：
(一)羧基修饰的CdSe量子点(CdSe QDs)的合成
本实施例中上述羧基修饰的CdSe量子点(CdSe QDs)的合成方法同实施例1。
(二)丙烯胺修饰的CdSe量子点(CdSe QDs-AA)的合成
本实施例中上述丙烯胺修饰的CdSe量子点(CdSe QDs-AA)的合成方法同实施例1。
1)制备预聚合复合物
用天平称取1mg的卡那霉素，溶于1ml的pH值为7的磷酸盐缓冲液中配成1mg/ml的储存液。取2.8nmol的卡那霉素、2.8nmol的巯基修饰的卡那霉素适配体和42nmol的甲基丙烯酸(MAA)溶于0.1ml的磷酸盐缓冲液中，混合均匀后在37℃水浴条件下作用2小时，形成预聚合复合物。
2)制备适配体-量子点复合物
在步骤1)所制得的预聚合复合物中，加入0.8mg的N，N’-亚甲基双丙烯酰胺(MBAAM)和0.5ml上述丙烯胺修饰的CdSe量子点(CdSe QDs-AA)，超声5-10分钟后，通入氮气10-20分钟，在氮气保护的情况下加入0.3微升的四甲基乙二胺(TEMED)和0.4mg的过硫酸铵(APS)，再加入磷酸盐缓冲液使反应的终体积为1ml；在磁搅拌条件下，混合物在40℃水浴，聚合反应6小时，制得适配体-量子点(apta-MIP-CdSe QDs)复合物。
3)洗脱模版分子卡那霉素
将步骤2)获得的适配体-量子点复合物在转速为12000rpm的条件下离心10分钟，去掉上清液，用水洗涤适配体-量子点复合物，再用含有0.01％(v/v)乙酸的80％(v/v)乙腈/水洗脱液除去适配体-量子点复合物中的模版分子卡那霉素，得到对卡那霉素具有双重特异性识别的适配体-分子印迹荧光传感器(apta-MIP-CdSe QDs)。
制备工艺试验例1：
模版分子卡那霉素、巯基修饰的卡那霉素适配体和甲基丙烯酸比例的优化。
试验方法：按表1，制备适配体-分子印迹荧光传感器(apta-MIP-CdSe QDs)和适配体-分子非印迹荧光传感器(apta-NIP-CdSe QDs)中模板分子卡那霉素(Template)、巯基修饰的卡那霉素适配体(Aptamer)、甲基丙烯酸(MAA)的摩尔比例共有8种。并通过印迹因子(imprinted factor，IF)来评估印迹聚合物的特异性识别能力。印迹因子的计算公式如下：
IF＝ΔF(MIP-cdSe QDs)/ΔF(NIP-cdSe QDs)
其中，ΔF(MIP-CdSe QDs)表示MIP-CdSe QDs溶液重新吸附模板前后荧光强度的差值，ΔF(NIP-CdSe QDs)表示NIP-CdSe QDs溶液重新吸附模板前后荧光强度的差值。
适配体-分子非印迹荧光传感器(apta-NIP-CdSe QDs)的合成方法：其与适配体-分子印迹荧光传感器(apta-MIP-CdSe QDs)的合成方法基本相同，唯一的区别在于步骤(1)中不加入模版分子卡那霉素。
表1模板分子和功能单体比例的优化
表1中，以MIP代表适配体-分子非印迹荧光传感器(apta-NIP-CdSe QDs)；以NIP代表适配体-分子非印迹荧光传感器(apta-NIP-CdSe QDs)。
具体的试验结果见图2。从图2中可以看出，当合成的印迹聚合物中只选用巯基修饰的卡那霉素适配体(Aptamer)作为功能单体时，IF为1.97；当合成的印迹聚合物中只选用甲基丙烯酸(MAA)作为功能单体时，IF仅为1.31；而当合成的印迹聚合物中同时选用巯基修饰的卡那霉素适配体(Aptamer)和甲基丙烯酸(MAA)作为功能单体时，IF均大于以上两种情况。且在模板分子卡那霉素(Template)、巯基修饰的卡那霉素适配体(Aptamer)和甲基丙烯酸(MAA)的比例为1∶1∶5时达到最大值3.51，大于分别选用巯基修饰的卡那霉素适配体(Aptamer)和甲基丙烯酸(MAA)单独作为功能单体时的IF之和，说明在合成apta-MIP-CdSeQDs时，巯基修饰的卡那霉素适配体(Aptamer)和甲基丙烯酸(MAA)之间存在协同作用，进一步提高了印迹聚合物的特异性识别能力。
结构表征试验例1：FT-IR表征
分别检测羧基修饰的CdSe量子点(CdSe QDs)、丙烯胺修饰的CdSe量子点(CdSeQDs-AA)、适配体-分子印迹荧光传感器(apta-MIP-CdSe QDs)的FT-IR表征
试验方法：分别称取烘干的100mg溴化钾和1mg实施例1中的CdSe QDs、CdSe QDs-AA或者apta-MIP-CdSe QDs，在干燥的玛瑙研钵中将其混合均匀并研磨成细粉，压片后放入傅里叶红外变换光谱仪中进行扫描，得到红外光谱图。通过分析羟基、羰基、碳碳双键、酰胺键等官能团的特征吸收峰进行表征。试验结果见图3。
由图3可以看出，(a)、(b)和(c)分别是CdSe QDs、CdSe QDs-AA和apta-MIP-CdSeQDs的红外光谱图。在(a)中，3207cm-1代表-OH的吸收峰，1648cm-1是C＝0的伸缩振动吸收峰，证明成功合成了羧基修饰的CdSe QDs；在(b)中，1632cm-1代表末端C＝C的伸缩振动特征峰，表明CdSe QDs表面成功偶联上丙烯胺；在(c)中，2921cm-1表示C-H的伸缩振动吸收峰，1523cm-1处的吸收峰则代表仲酰胺中N-H的面内弯曲振动，说明单体MAA和交联剂MBAAM成功聚合在CdSe QDs表面的印迹聚合物层中。值得一提的是，CdSe QDs-AA和apta-MIP-CdSeQDs中均含有二级酰胺键，分别是偶联丙烯胺的过程中产生和聚合反应中加入的交联剂中含有的，因此它们的吸收光谱图存在相似是合理的。
实施例2、3的FT-IR表征结果和实施列1基本相同，在此不再赘述。
结构表征试验例2：XRD表征
分别检测实施例1制备羧基修饰的CdSe量子点(CdSe QDs)和适配体-分子印迹荧光传感器(apta-MIP-CdSe QDs)的XRD表征，试验结果见图4，其中(a)是apta-MIP-CdSe QDs的XRD表征，(b)是CdSe QDs的XRD表征。
从图4中可以看出CdSe QDs的衍射图中有三个明显的特征峰，分别位于(111)、(220)和(311)处，与立方型闪锌矿结构的三个晶面的衍射相对应，表明CdSe QDs属于立方型闪锌矿结构。同时，apta-MIP-CdSe QDs衍射峰的位置与CdSe QDs的完全一样，说明聚合过程对量子点的结构没有造成影响。
实施例2、3的XRD表征结果和实施列1基本相同，在此不再赘述。
结构表征试验例3：透射电镜表征(TEM)
分别检测CdSe QDs、CdSe QDs-AA、apta-MIP-CdSe QDs的透射电镜表征(TEM)
试验方法：取少量实施例1制备的CdSe QDs、CdSe QDs-AA和apta-MIP-CdSe QDs溶解在水中，利用超声将其分散均匀，然后用微量移液枪从中吸取少量溶液滴在透射电镜专用的铜网表面，放在40℃的烘箱中干燥24h，然后将铜网放入仪器中观察。试验结果见图5。图5(A)是CdSe QDs的透射电镜结果，图5(B)是CdSe QDs-AA的透射电镜结果；图5(C)和图5(D)分别是apta-MIP-CdSe QDs的透射电镜结果。
从图5(A)中可以清楚地看到CdSe QDs量子点是球形的，大小分布均匀，且平均粒径在3.2nm左右，CdSe QDs量子点的晶格结构属于闪锌矿型，这一点与前面XRD的结果相一致，同时从高分辨率TEM图中可以看出量子点的晶格条纹，说明合成的量子点结晶度较高。从图5(B)中可以看出，修饰双双键后CdSe QDs-AA量子点基本没有太大变化。从图5(C)和图5(D)中可以看出，CdSe QDs-AA量子点表面被聚合物包裹，且平均粒径在25nm左右，聚合物壳的厚度约为3nm。这些结果表明印迹聚合物成功包覆在CdSe QDs-AA量子点的表面。
实施例2、3的透射电镜表征(TEM)结果和实施列1基本相同，在此不再赘述。
检测条件试验例1：apta-MIP-CdSe QDs对卡那霉素的吸附动力学
试验方法：分别取卡那霉素标准液和实施例1制备的apta-MIP-CdSe QDs溶液于40ml锥形瓶中，用pH为7.0的磷酸盐缓冲液将体积补至40ml，配成终浓度为10.00μg/ml的卡那霉素标准溶液。将荧光分光光度计F-4600的参数设定为：激发波长为365nm，扫描范围为450-600nm，光栅狭缝均为10.0nm，激发电压为400V。依次在0、2、5、10、15、20、25、30、40、50、60min时测一次溶液的荧光值，每个样品平行测定3次，取平均值。apta-NIP-CdSe QDs也采用相同的方法测定不同时间的荧光强度，探索两种复合物的吸附动力学。试验结果见图6，其中(a)是apta-MIP-CdSe QDs的吸附动力学试验结果，(b)是apta-NIP-CdSe QDs的吸附动力学试验结果。
从图6中可以看出，将终浓度为10.0μg/ml的卡那霉素加入到apta-NIP-CdSe QDs溶液中后，溶液荧光强度逐渐增强，并在15min左右后达到平衡。而将相同量的卡那霉素加入到apta-MIP-CdSe QDs溶液中后，溶液地荧光强度也呈增强的趋势，但不同的是溶液荧光增强的幅度更大，且在长达25min左右后才达到吸附-解吸平衡，荧光强度保持稳定不变。这些结果表明apta-NIP-CdSe QDs的平衡吸附比apta-MIP-CdSe QDs的更快。原因是印迹过程使apta-MIP-CdSe QDs中留下很多在大小、空间和结构上与卡那霉素互补的特异性印迹空穴，卡那霉素进入这些印迹空穴需要更长的时间，而apta-NIP-CdSe QDs中虽然存在功能单体MAA以及对卡那霉素具有一定特异性的卡那霉素适配体(Aptamer)，但其排列杂乱，导致对卡那霉素识别和吸附能力较差，因此在短时间内就达到平衡，荧光增强幅度较小。
实施例2、3的apta-MIP-CdSe QDs对卡那霉素的吸附动力学结果和实施列1基本相同，在此不再赘述
检测条件试验例2：pH对apta-MIP-CdSe QDs测定卡那霉素的影响
不同的pH条件下，印迹聚合物中结合位点的官能团存在形式不同，印迹聚合物的结合性能也不同。为提高印迹聚合物的结合性能，探索不同的pH条件对apta-MIP-CdSe QDs测定卡那霉素的影响是非常重要的。
试验方法：先用柠檬酸和柠檬酸钠配制pH＝5.0和pH＝6.0的缓冲溶液，用磷酸一氢钠和磷酸氢二钠配制pH＝7.0、pH＝8.0和pH＝9.0的缓冲溶液，用碳酸钠和碳酸氢钠配制pH＝10.0的缓冲溶液，缓冲液的浓度均为0.01mol/L。然后分别取一定量的卡那霉素标准液和实施例1制备的apta-MIP-CdSe QDs溶液于4ml EP管中，用不同pH的缓冲溶液将各体积补至4ml，配成终浓度为10.00μg/ml的卡那霉素标准溶液。将混合物摇匀后室温静置25min。将荧光分光光度计F-4600的参数设定为：激发波长为365nm，扫描范围为450-600nm，光栅狭缝均为10.0nm，激发电压为400V。测定不同的pH条件下溶液的荧光强度，每个样品平行测定3次，取平均值。apta-NIP-CdSe QDs也采用相同的方法测定pH对apta-NIP-CdSe QDs测定卡那霉素的影响。试验结果见图7，其中(a)是apta-NIP-CdSe QDs的试验结果，(b)是apta-MIP-CdSe QDs的试验结果。
从图7可以看出，在pH为5.0-10.0的范围内，apta-MIP-CdSe QDs的荧光增强量先升高后降低，在pH＝8.0的时候达到最大。而apta-MIP-CdSe QDs的荧光增强量与apta-NIP-CdSe QDs的荧光增强量的比值也呈先升高后降低的趋势，但却在pH＝7.0的时候达到最大值。这些结果表明在中性条件下，apta-MIP-CdSe QDs对卡那霉素的检测效果最好。解释这种现象的原因可能是在中性条件下，卡那霉素适配体(Aptamer)这种生物大分子以及甲基丙烯酸(MAA)的结构更稳定，过酸或过碱都可能导致卡那霉素适配体(Aptamer)的结构乃至印迹空穴发生形变，进而影响卡那霉素适配体(Aptamer)乃至印迹聚合物的特异性识别能力。
pH对实施例2、3的apta-MIP-CdSe QDs测定卡那霉素的影响结果和实施列1基本相同，在此不再赘述。
检测条件试验例3：温度对apta-MIP-CdSe QDs测定卡那霉素的影响
通常情况下，温度对不同的发光物质的荧光强度均有或大或小的影响。探索温度对apta-MIP-CdSe QDs测定卡那霉素的影响具有一定的意义。
试验方法：分别取一定量的卡那霉素标准液和实施例1制备的apta-MIP-CdSe QDs溶液于4ml EP管中，用缓冲溶液将体积补至4ml，分别配制8份终浓度为10.00μg/ml的卡那霉素标准溶液，其中溶液pH为7.0，然后依次放入温度为25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃和60℃的水浴锅中静置25min，并依次测定每个温度条件下溶液的荧光强度，每个样品平行测定3次，取平均值。apta-NIP-CdSe QDs也采用相同的方法测定温度对apta-NIP-CdSeQDs测定卡那霉素的影响。试验结果见图8。
从图8中可以看出，在室温下apta-MIP-CdSe QDs和apta-NIP-CdSe QDs溶液均有较高的荧光强度。而当温度从25℃逐渐升高到60℃时，apta-MIP-CdSe QDs和apta-NIP-CdSe QDs溶液的荧光强度均呈现下降的趋势。这个现象表明温度对apta-MIP-CdSe QDs测定卡那霉素具有较大的影响。可能存在的原因是较高的温度容易导致量子点聚集在一起，进而减弱其量子尺寸效应，造成量子点的荧光强度降低。同时，考虑到在室温下对平行样品进行荧光测定的误差更小以及室温更方便实验操作，荧光实验均选择在室温下进行测定。
温度对实施例2、3的apta-MIP-CdSe QDs测定卡那霉素的影响结果和实施列1基本相同，在此不再赘述。
效果试验例1：不同浓度的卡那霉素对apta-MIP-CdSe QDs测定卡那霉素的影响
为了评估apta-MIP-CdSe QDs和apta-NIP-CdSe QDs对卡那霉素的不同识别能力，采用滴定法，分别测定apta-MIP-CdSe QDs和apta-NIP-CdSe QDs对不同浓度的卡那霉素的荧光响应。
试验方法：用天平称量1.0mg的卡那霉素，溶于1mL的超纯水中，制得1mg/mL的卡那霉素标准溶液。分别取一定量的卡那霉素标准液和实施例1所制备的apta-MIP-CdSe QDs溶液于4mL EP管中，用pH为7.0的磷酸盐缓冲液将体积补至4mL，配成终浓度分别为0.00、0.01、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、4.00、6.00、10.00、20.00μg/mL的标准溶液。将混合物摇匀后室温静置25min。然后将荧光分光光度计F-4600的参数设定为：激发波长为365nm，扫描范围为450-600nm，光栅狭缝均为10.0nm，激发电压为400V。每个样品平行测定3次，取平均值。用不同浓度的卡那霉素下测得的apta-MIP-CdSe QDs溶液的荧光强度减去apta-MIP-CdSe QDs溶液的荧光初始值对卡那霉素浓度的对数作图得到标准曲线图。apta-NIP-CdSe QDs采用和上述相同的方法进行操作。apta-MIP-CdSe QDs对不同浓度的卡那霉素的荧光响应试验结果见图9；apta-NIP-CdSe QDs对不同浓度的卡那霉素的荧光响应试验结果见图10。
从图9、10中可以看出，当卡那霉素的浓度在0.05-20.0μg/ml的范围时，随着浓度的逐渐增加，apta-MIP-CdSe QDs和apta-NIP-CdSe QDs溶液的荧光强度均逐渐增强，并在10.0μg/ml时达到平衡状态，且apta-MIP-CdSe QDs溶液荧光增强的幅度远大于apta-NIP-CdSe QDs溶液的。
同时，apta-MIP-CdSe QDs与apta-NIP-CdSe QDs检测标准曲线的斜率定义为专一性识别因子。如图9、10中所示，apta-MIP-CdSe QDs与apta-NIP-CdSe QDs的荧光增强量(F-F0)与卡那霉素浓度的对数均呈现良好的线性关系，相关性系数分别为0.998和0.995，且根据两者的斜率求得的专一性识别因子为3.22。这些结果表明，apta-MIP-CdSe QDs对卡那霉素具有很好的专一性识别能力。主要是因为巯基修饰的卡那霉素适配体(Aptamer)和甲基丙烯酸(MAA)的双重作用提高了印迹空穴的亲和性识别效果。此外，根据IUPAC中检测线的定义，用3σ/s求得的这种方法的检测限为0.013μg/ml，其中σ为空白信号的标准偏差，s为线性方程的斜率。这个结果说明该方法的灵敏度良好。
效果试验例2：干扰离子对apta-MIP-CdSe QDs测定卡那霉素的影响
不同离子的电子排列方式不同，在外界光的照射下易产生能级跃迁，跃迁的电子返回基态时通过产生荧光释放能量。因此，探索不同离子对apta-MIP-CdSe QDs测定卡那霉素是否有干扰很关键。参考尿液中常见的阴阳离子种类以及其存在的浓度，探索了不同干扰离子对apta-MIP-CdSe QDs测定卡那霉素的影响。
试验方法：分别取一定量的卡那霉素标准液和实施例1制备的apta-MIP-CdSe QDs溶液于4ml EP管中，向其中加入不同的干扰离子，用水将溶液体积补至4ml，配成终浓度为10.00μg/ml的卡那霉素标准溶液。其中不同干扰离子的终浓度依次为：Na+、K+、Ca2+、NH4 +为1.0mmol/L，Zn2+、Mg2+为0.5mmol/L，NO3 -为0.3mmol/L，CO3 2-、HCO3 -、CH3COO-为0.1mmol/L。将混合液室温静置25min，然后测定其荧光强度，每个样品平行测定3次，取平均值。试验结果见表2。
表2不同种类的共存离子对apta-MIP-CdSe QDs测定卡那霉素的影响
从表2中可以看出，无论是稍大量存在普通阳离子Na+、K+、Ca2+、NH4 +、Mg2+，微量金属元素离子Zn2+，还是常见的阴离子NO3 -、CO3 2-、HCO3 -、CH3COO-，它们对apta-MIP-CdSe QDs测定卡那霉素的影响均在±5％的范围内。这些结果表明，不同离子对apta-MIP-CdSe QDs测定卡那霉素的干扰非常小，该体系具有良好的抗离子干扰能力，适用性较强。
干扰离子对实施例2、3的apta-MIP-CdSe QDs测定卡那霉素的影响结果和实施列1基本相同，在此不再赘述。
效果试验例3：类似物对apta-MIP-CdSe QDs测定卡那霉素的影响
为了测定apta-MIP-CdSe QDs对卡那霉素的选择性识别能力，选择链霉素、庆大霉素和红霉素作为模板的类似物。，并在相同的摩尔浓度下进行研究。同时，仍然依据ΔF(apta-MIP-CdSe QDs)/ΔF(apta-NIP-CdSe QDs)来进行选择性比较，其中ΔF(apta-MIP-CdSe QDs)表示apta-MIP-CdSe QDs溶液重新吸附模板或类似物前后荧光强度的差值，ΔF(apta-NIP-CdSe QDs)表示apta-NIP-CdSe QDs溶液重新吸附模板或类似物前后荧光强度的差值。
试验方法：分别取一定量的卡那霉素、链霉素、庆大霉素或者红霉素和实施例1制备的apta-MIP-CdSe QDs溶液于4ml EP管中，用pH为7.0的磷酸盐缓冲液将体积补至4ml，配成模板和类似物的摩尔浓度均为17.2μmol/L(相当于卡那霉素的浓度为10.00μg/ml)的溶液。室温静置25min后，分别测定其荧光强度，每个样品平行测定3次，取平均值。apta-NIP-CdSe QDs也采用相同的方法测定类似物对apta-NIP-CdSe QDs测定卡那霉素的影响。试验结果见图11。
从图11中可以看出，相比于结构类似物，apta-MIP-CdSe QDs对卡那霉素的荧光增强幅度最大，且是其apta-NIP-CdSe QDs的荧光增强量的3.3倍，而结构类似物ΔF(apta-MIP-CdSe QDs)/ΔF(apta-NIP-CdSe QDs)的比值分别是：链霉素为1.28，庆大霉素为1.30，红霉素为1.07。这些结果表明apta-MIP-CdSe QDs对卡那霉素具有较好的选择性和特异性识别能力。原因主要是apta-MIP-CdSe QDs中存在基于aptamer和MAA的双重识别的且与模板分子空间大小互补的印迹空穴。
类似物对实施例2、3的apta-MIP-CdSe QDs测定卡那霉素的影响结果和实施列1基本相同，在此不再赘述。
效果试验例4：实际样品检测
实际样品中自来水、湖水、牛奶、尿液分别取自实验室水龙头，华南师范大学的砚湖，超市燕塘牛奶和广州市中科院畜牧研究所实验猪的尿液。实际废水样品取自东瑞集团增城市恒昌养猪场和玉井养猪场。
样品取回后放于4℃冰箱保存。使用前将实际样品中自来水、湖水和实际废水样品以12000rpm转速离心10min，然后用0.45μm的滤膜过滤除去不溶杂质，使用时将废水样品稀释50倍，实际样品中牛奶样品和尿液样品各稀释100倍。检测过程中这些样品均不需要其它处理。
由于在实际样品中自来水、湖水、牛奶、尿液样品中没有检测到卡那霉素，所有这些样品采用加标回收实验，试验结果见表3。实际废水样品则直接检测，试验结果见表4。
表3.自来水、湖水、牛奶和尿液样品中卡那霉素的回收率实验
从表3中可以看出，将终浓度为0.2、1.0、4.0μg/ml的卡那霉素分别加入到自来水、湖水、牛奶和尿液样品中，所得回收率在85.3％到116％之间，且相对标准偏差均小于5％。这些结果表明这种方法对于实际样品中卡那霉素的检测具有较好的效果。
表4对废水样品中卡那霉素含量的检测
从表4中可以看出，直接检测到的养殖场废水中卡那霉素的浓度分别为4.42μg/ml和6.54μg/ml，且相对标准偏差分别为4.7％和3.8％。这些结果表明这种方法对于实际样品中卡那霉素的检测具有较好的效果。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，故凡未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种对卡那霉素具有双重特异性识别的适配体-分子印迹荧光传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
首先，由模版分子卡那霉素、巯基修饰的卡那霉素适配体和甲基丙烯酸形成预聚合复合物；
然后，由预聚合复合物、交联剂、丙烯胺修饰的CdSe量子点和引发剂形成适配体-量子点复合物；
最后，将适配体-量子点复合物中模版分子卡那霉素洗脱，得到对卡那霉素具有双重特异性识别的适配体-分子印迹荧光传感器。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)制备预聚合复合物
将模版分子卡那霉素、巯基修饰的卡那霉素适配体和甲基丙烯酸形成预聚合复合物溶于pH值为7的缓冲液中，混合均匀，在温度为37℃的条件下，反应2小时，制得预聚合复合物；
2)制备适配体-量子点复合物
在步骤1)所制得的预聚合复合物中，加入交联剂、丙烯胺修饰的CdSe量子点，超声5-10分钟，在氮气保护的条件下，加入引发剂，再加入所述缓冲液，在温度为40℃的条件下，搅拌反应6小时，制得适配体-量子点复合物；
3)洗脱模版分子卡那霉素
将步骤2)获得的适配体-量子点复合物在转速为12000rpm的条件下离心10分钟，去掉上清液，用水洗涤适配体-量子点复合物，再用洗脱液除去适配体-量子点复合物中的模版分子卡那霉素，得到对卡那霉素具有双重特异性识别的适配体-分子印迹荧光传感器。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：所述模版分子卡那霉素、巯基修饰的卡那霉素适配体和甲基丙烯酸的摩尔比为1∶1∶2-15。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述模版分子卡那霉素、巯基修饰的卡那霉素适配体和甲基丙烯酸的摩尔比为1∶1∶5。
5.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：所述丙烯胺修饰的CdSe量子点由以下步骤制备所得：
S1：将羧基修饰的CdSe量子点、EDC溶液和NHS溶液混合，在温度为40℃、磁力搅拌的条件下反应30分钟，使CdSe QDs表面的羧基被充分活化；
S2：加入丙烯胺溶液，在温度为40℃的条件下反应2小时；
S3：加入异丙醇，经过沉淀、离心、分离、清洗、重悬后得到纯化的丙烯胺修饰的CdSe量子点。
6.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：所述交联剂选自N，N’-亚甲基双丙烯酰胺或三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯；所述引发剂选自四甲基乙二胺、过硫酸铵、偶氮二异丁腈中的一种或两种。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述交联剂为N，N’-亚甲基双丙烯酰胺；所述引发剂为四甲基乙二胺和过硫酸铵。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液；所述洗脱液为含有0.01％(v/v)乙酸的80％(v/v)乙腈/水洗脱液。
9.一种对卡那霉素具有双重特异性识别的适配体-分子印迹荧光传感器，其特征在于：所述对卡那霉素具有双重特异性识别的适配体-分子印迹荧光传感器为根据权利要求1-8中任意一项所述的对卡那霉素具有双重特异性识别的适配体-分子印迹荧光传感器的制备方法制备获得的。
10.权利要求9所述的对卡那霉素具有双重特异性识别的适配体-分子印迹荧光传感器在检测样品中卡那霉素含量的应用。
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