CN111289481B

CN111289481B - 一种生物胺配位印迹材料、生物胺荧光阵列传感器及其制备方法和用途

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Publication number: CN111289481B
Application number: CN201911382993.2A
Authority: CN
Inventors: 李楠; 李耘; 邱静; 钱永忠
Original assignee: Institute of Agricultural Quality Standards and Testing Technology for Agro Products of CAAS
Current assignee: Institute of Agricultural Quality Standards and Testing Technology for Agro Products of CAAS
Priority date: 2019-12-27
Filing date: 2019-12-27
Publication date: 2021-09-17
Anticipated expiration: 2039-12-27
Also published as: CN111289481A

Abstract

本发明公开一种生物胺配位印迹材料、生物胺荧光阵列传感器及其制备方法和用途。生物胺配位印迹材料含有硼酸基，且所述印迹材料能够与生物胺配位，该印迹材料还能够与荧光指示剂配位，生物胺和荧光指示剂分别与该印迹材料竞争配位。该生物胺配位印迹材料可以用于检测生物胺，优选用于生物胺荧光阵列传感器中。本发明提供的荧光阵列传感器首次利用配位印迹竞争吸附法，其能够对不同生物胺产生指纹响应，能够实现多种生物胺的同步识别及检测，大大扩大了生物胺的检测覆盖面，提供了一种普适性的生物胺荧光检测方法。

Description

一种生物胺配位印迹材料、生物胺荧光阵列传感器及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于荧光传感器材料领域，具体涉及一种生物胺配位印迹材料、荧光阵列传感器及其制备方法和用途。

背景技术

生物胺是一类结构中含活性氮的有机小分子碱，通常产生于富含蛋白质的海产品、鱼以及发酵食品等在储藏加工过程中因高温或细菌酶解引起的氨基酸降解。食品中常见的生物胺类主要有酪胺、组胺、腐胺、尸胺、精胺、乙醇胺等，已有文献报道很多生物胺能够对人类健康造成不良影响，因而这些物质已成为食品质量安全的重要生物标志物。另外，生物胺通常以低浓度水平存在于代谢通路中，在细胞和生理机能中扮演着多种重要的角色，其浓度水平的升高能够指示多种疾病的发生。因此，发展高效、快速、高灵敏度的生物胺检测方法对于食品安全、生命科学、临床医学等多学科领域都具有十分重要的意义。

目前，生物胺的检测方法主要包括液相色谱法、电化学方法、氨基酸分析法等。其中，荧光检测法因其快速、灵敏度高、操作简单等优点而在食品质量安全监测中广受青睐。传统的荧光探针主要利用生物胺结构中的氨基与荧光探针之间的电子转移引起荧光增强或荧光淬灭，从而实现对生物胺的检测。然而，目前已报道的传统荧光探针仅能针对生物胺总和、或者个别某种生物胺进行响应，无法适用于不同生物胺的同时识别及检测。

发明内容

本发明提供一种生物胺配位印迹材料，所述印迹材料含有硼酸基，且所述印迹材料能够与生物胺配位。

进一步地，所述生物胺和荧光指示剂分别与所述印迹材料竞争配位。

根据本发明，所述生物胺可以选自酪胺、组胺、腐胺、尸胺、精胺和乙醇胺等中的至少一种，例如为酪胺、组胺和腐胺中的至少一种，示例性为酪胺和/或组胺。

根据本发明，所述荧光指示剂选自含有与生物胺配位印迹材料中的硼酸基形成B-N配位键结构的荧光物质，例如为1-氨基芘、1,4-二氨基芘、聚乙烯基亚胺修饰的芘等中的至少一种，例如选自1-氨基芘和/或1,4-二氨基芘。

根据本发明，所述生物胺配位印迹材料的平均粒径为10nm-1μm，例如20-500nm、30-200nm。

根据本发明，所述生物胺印迹材料具有核-壳结构，所述核为磁性纳米颗粒，例如为四氧化三铁磁性纳米颗粒，所述壳为生物胺配位印迹聚合物，壳层包覆在所述核的外层。例如，所述壳为酪胺配位印迹聚合物、组胺配位印迹聚合物、腐胺配位印迹聚合物、尸胺配位印迹聚合物、精胺配位印迹聚合物和乙醇胺配位印迹聚合物中的至少一种；示例性为酪胺配位印迹聚合物或组胺配位印迹聚合物。进一步地，所述核的平均粒径为5-100nm，例如8-50nm、10-30nm。

根据本发明，所述生物胺配位印迹材料可以选自酪胺配位印迹磁性材料、组胺配位印迹磁性材料、腐胺配位印迹磁性材料、尸胺配位印迹磁性材料、精胺配位印迹磁性材料和乙醇胺配位磁性印迹材料等中的至少一种，例如为酪胺配位印迹磁性材料、组胺配位印迹磁性材料和腐胺配位印迹磁性材料中的至少一种，示例性为酪胺配位印迹磁性材料和/或组胺配位印迹磁性材料。

根据本发明，所述生物胺配位印迹材料的制备原料包括：聚合引发原料、硼酸类单体、模板、交联剂、引发剂和溶剂；

所述硼酸类单体可以选自4-乙烯基苯硼酸和氨基苯硼酸等中的至少一种，例如4-乙烯基苯硼酸；

所述模板为生物胺，所述生物胺具有如上文所述的含义。

根据本发明，所述聚合引发原料可以选自碳碳双键、氨基或卤代基(例如-Cl、-Br、-I)修饰的磁性聚合引发原料；例如选自带有碳碳双键的硅烷偶联剂(例如MPS)、带有氨基的硅烷偶联剂(例如APTES)或Br修饰的磁性聚合引发原料；又如为Fe₃O₄@MPS、Fe₃O₄@APTES或Fe₃O₄@Br；示例性为Fe₃O₄@MPS。所述Fe₃O₄@MPS、Fe₃O₄@APTES或Fe₃O₄@Br可以采用本领域已知方法制备得到。

根据本发明，所述交联剂、引发剂和溶剂可以选自自由基聚合所用的交联剂、引发剂和溶剂。例如，所述交联剂可以选自乙二醇二甲基丙烯酸酯(EMDA)；

例如，所述引发剂可以选自偶氮二异丁腈(AIBN)、过硫酸铵；

例如，所述溶剂可以选自水、甲醇、乙醇、丙酮、乙腈等中的至少一种，比如为乙腈。

其中，所述自由基聚合可以为传统自由基聚合或活性可控自由基聚合(如原子转移自由基聚合、可逆加成-断裂链转移聚合)等。

根据本发明，所述印迹材料的制备原料还可以任选包括其它功能单体，例如甲基丙烯酸(MMA)、甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)、N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)等中的至少一种，优选为甲基丙烯酸。

根据本发明，所述模板、单体(至少含有硼酸类单体)和交联剂的摩尔比为1:(1-100):(1-1000)，例如1:(2-50):(10-100)，示例性为1:8.3:22.2。

根据本发明，所述聚合引发原料与所述模板的质量摩尔比为100:(0.02-0.2)mg/mmol，例如100:(0.05-0.15)mg/mmol，示例性为100:0.09mg/mmol。

根据本发明，所述溶剂与所述模板的体积摩尔比为(20-100):(0.02-0.2)mL/mmol，例如(30-60):(0.05-0.15)mL/mmol，示例性为40:0.09mL/mmol。

根据本发明，所述引发剂的量为本领域已知用量，例如引发剂与溶剂的质量体积比为0.05-0.5mg/mL，例如0.1-0.4mg/mL，示例性为0.2mg/mL。

本发明还提供如上所述的制备生物胺配位印迹材料的组合物以及上述组合物在制备所述生物胺配位印迹材料中的应用。

本发明还提供所述生物胺配位印迹材料的制备方法，包括如下步骤：所述制备生物胺配位印迹材料的组合物进行自由基聚合反应，反应完成后，洗涤除去模板，得到所述生物胺配位印迹材料。

根据本发明，所述模板具有如上文所述的含义。

根据本发明，所述自由基聚合反应包括预聚合和引发聚合；所述预聚合的过程包括：将聚合引发原料、硼酸类单体(和其它功能单体)、模板、交联剂和溶剂室温搅拌混合，得到预混物，例如室温搅拌混合0.5-3h，示例性为1h；所述引发聚合的过程包括：向所述预混物中加入引发剂，于50-90℃下搅拌反应4-10h，例如60-80℃下搅拌反应5-9h，示例性为70℃下搅拌反应6h。

根据本发明，洗涤用的试剂为能够溶解所述模板的试剂，优选为能够同时溶解所述模板和未参与反应的单体的试剂，进一步地所述试剂还可以除去聚合产物中的其它杂质；例如洗涤试剂为水、有机酸、醇中的至少一种，比如为水、甲酸、乙酸、甲醇、乙醇等中的至少一种，示例性为甲醇、甲酸和水中的至少一种。

根据本发明，所述洗涤完成后，还可以对聚合产物进行干燥，例如真空干燥，比如40-60℃真空干燥8-20h。

根据本发明的实施方案，所述生物胺配位磁性印迹材料的制备方法，包括如下步骤：

(1)将磁性聚合引发原料、硼酸类单体、其它功能单体)、模板、交联剂和溶剂混合，室温搅拌进行预聚合，预聚合时间为0.5-3h；而后加入引发剂，50-90℃下进行引发聚合4-10h；

(2)步骤(1)反应完成后，洗涤聚合产物，除去模板和未反应完的单体，经干燥后，得到所述生物胺配位磁性印迹材料。

根据本发明，至少引发聚合过程在惰性气氛下进行，优选地，整个聚合反应均在惰性气氛下进行。例如所述惰性气氛为氮气。

本发明还提供由上述制备方法得到的生物胺配位印迹材料。

本发明还提供上述生物胺配位印迹材料在检测生物胺中的应用。例如，在检测生物胺类传感器中的应用，优选传感器为生物胺荧光阵列传感器。

本发明提供一种生物胺荧光阵列传感器，所述的荧光阵列传感器包括荧光指示剂和至少一种所述生物胺配位印迹材料；

所述生物胺配位印迹材料中含有硼酸基，能够与荧光指示剂形成B-N配位键。进一步地，所述印迹材料与生物胺配位和所述印迹材料与荧光指示剂形成B-N配位键之间，存在竞争关系。

根据本发明，所述荧光指示剂具有如上文所述的含义。

根据本发明，所述生物胺荧光阵列传感器包括至少一个传感器单元，每个传感器单元包括一种生物胺配位印迹材料和一种荧光指示剂；每个传感器单元中的生物胺配位印迹材料均不相同，但其中的荧光指示剂相同。例如，所述生物胺荧光阵列传感器为双通道荧光阵列传感器，其包括两个传感器单元，第一传感器单元包括酪胺配位印迹材料和1-氨基芘，第二传感器单元包括组胺配位印迹材料和1-氨基芘。

根据本发明，每个传感器单元中，所述生物胺配位印迹材料和荧光指示剂的质量比为(1-10)×10⁸:1，例如(2-8)×10⁸:1，示例性为5×10⁸:1。

本发明还提供所述荧光阵列传感器的制备方法，将荧光指示剂和至少一种所述生物胺配位印迹材料混合，得到所述生物阵列传感器。例如，当所述荧光阵列传感器中至少含有两个传感器单元时，可以分别制备每个传感器单元，再将每个传感器单元并列构建，得到所述荧光阵列传感器。其中，每个传感器单元的制备方法均包括：将所述生物胺配位印迹材料和荧光指示剂混合。进一步地，所述传感器单元、生物胺配位印迹材料和荧光指示剂均具有如上文所述的含义。

根据本发明，所述荧光指示剂以溶液形式加入，例如将荧光指示剂溶解于水、乙腈、丙酮、正己烷、二氯甲烷等至少一种试剂中，优选溶于乙腈和水的混合液中。进一步地，荧光指示剂溶液的浓度为(0.0005-0.002)μg/mL，例如(0.0008-0.0015)μg/mL，示例性为0.001μg/mL。

本发明还提供所述荧光阵列传感器检测生物胺的方法，包括如下步骤：

将待测生物胺溶液加入所述荧光阵列传感器或传感器单元中，充分混合，由生物胺配位印迹材料对荧光指示剂、待测的生物胺进行竞争吸附，吸附完成后，磁分离除去混合液中的所述生物胺配位印迹材料，测定吸附后的混合液的发射荧光I_e，根据发射荧光I_e与空白样发射荧光I₀之间的关系，判断生物胺的种类。

其中，所述空白样与荧光阵列传感器或传感器单元的区别在于：不含有所述生物胺配位印迹材料。例如，所述空白样为荧光指示剂与水的混合液。

根据本发明，所述方法中还包括检测待测的生物胺溶液中生物胺的浓度：根据I_e/I₀与制定的生物胺标准曲线之间的关系，计算待测的生物胺溶液中生物胺的浓度。其中，所述生物胺标准曲线的制定过程包括：将一系列已知浓度、已知种类的生物胺溶液加入与含有相同种类的生物胺配位印迹材料的荧光阵列传感器或传感器单元中，充分混合吸附后，磁分离除去混合液中的所述生物胺配位印迹材料，测定吸附后的混合液的发射荧光I_e，制定I_e/I₀与生物胺溶液浓度c的关系，即为生物胺标准曲线。

根据本发明，所述吸附的时间为30s-720min，例如1-360min，又如1.5-100min，示例性为2min。

本发明所提供荧光阵列传感器对生物胺的检测原理如下：每一个荧光传感器单元中均包含竞争荧光指示剂和印迹材料，当荧光体系中不存在生物胺时，荧光指示剂结构中伯胺能够和印迹材料中的硼酸基配位，形成B-N配位键，即荧光指示剂能够被印迹材料吸附。当荧光体系中存在生物胺时，生物胺与荧光指示剂竞争配位印迹材料中的印迹作用位点，若印迹材料对生物胺的结合亲和性高于对荧光指示剂的结合亲和性，则会释放出荧光指示剂，使待测溶液中的荧光增强，且释放荧光指示剂的浓度与生物胺的浓度相关。由于不同模板制备得到的印迹材料对不同生物胺及荧光指示剂的亲和性有所差异，因而一系列传感器单元会对每一个生物胺产生指纹响应，以实现对不同生物胺的定性鉴定区分，通过考察荧光增强与生物胺的浓度变化关系从而实现对生物胺的定量。

有益效果：

1.与已报道的生物胺荧光检测方法相比，本发明提供的荧光阵列传感器首次利用配位印迹竞争吸附法，其能够对不同生物胺产生指纹响应，因而能够实现多种生物胺的同步识别及检测，大大扩大了生物胺的检测覆盖面，提供了一种普适性的生物胺荧光检测方法。根据含有不同模板印迹材料的荧光阵列传感器单元的荧光响应情况，利用主元素分析等数据分析方法对印迹阵列传感器的指纹响应情况进行分析，可鉴定区分不同的生物胺。本发明解决了现有生物胺荧光传感器的检测覆盖面狭窄、检测选择性低等局限性的问题。

2.本发明传感器的荧光响应原理简单，该荧光阵列传感器的制备可避免大量的有机合成步骤，制备原料廉价易得。

附图说明

图1为实施例1制备的酪胺印迹磁性纳米颗粒的TEM图。

图2为实施例3不同传感单元对酪胺和组胺的荧光响应强度(传感单元A1；B.传感单元A2)。

图3为实施例3传感单元A1对不同浓度酪胺的荧光响应。

图4为实施例3传感单元A2对不同浓度组胺的荧光响应。

具体实施方式

下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。

除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。

实施例1酪胺配位印迹磁性材料

将Fe₃O₄@MPS(100.0mg)，MAA(0.03mL，0.35mmol)，VPBA(0.06g,0.40mmol)，EDMA(0.4mL,2.00mmol)和酪胺(0.013g,0.09mmol)，加入4.0mL乙腈中在室温下搅拌，预聚合1小时后，加入引发剂AIBN(20.0mg)，氮气保护下在70℃条件下加热搅拌6小时，待聚合反应后，依次用甲醇/甲酸(v/v，9/1)、去离子水、甲醇洗涤聚合产物，磁分离除去未参与反应的单体与模板，最后将制备得到的酪胺印迹磁性纳米颗粒放置于真空干燥箱中，在55℃条件下干燥12小时。由图1可看出，所制备的印迹磁性纳米颗粒直径约为10nm，磁性纳米颗粒表面被印迹聚合物覆盖。

实施例2组胺配位印迹磁性材料

与实施例1不同之处在于，以组胺替换酪胺，组胺加入量为0.01g。制备得到组胺配位印迹磁性纳米颗粒。

实施例3酪胺和组胺的识别检测

以实施例1和2合成的两种印迹磁性纳米颗粒为识别元件，以1-氨基芘为荧光指示剂，构建双通道的荧光传感器。具体检测步骤如下：

(1)于乙腈中配制1μg/mL的1-氨基芘溶液，再用水稀释至0.001μg/mL，得到荧光指示剂溶液。

(2)5mg实施例1酪胺印迹磁性纳米颗粒和荧光指示剂1-氨基芘溶液(100μL，0.001μg/mL)混合，制备得到传感器单元A1；

5mg实施例2组胺印迹磁性纳米颗粒和荧光指示剂1-氨基芘溶液(100μL，0.001μg/mL)混合，制备得到传感器单元A2。

(3)分别配制一系列不同浓度的酪胺水溶液和组胺水溶液，

酪胺水溶液和组胺水溶液的系列浓度均为：0.0001μg/mL、0.0002μg/mL、0.0005μg/mL、0.001μg/mL、0.002μg/mL、0.005μg/mL。

(4)将酪胺水溶液和组胺水溶液共同加入不同传感器单元中，静置2min后外加磁铁，待印迹磁性纳米颗粒被磁铁吸附聚集，收集吸附后的上清溶液，测定发射荧光I_e。

(5)配制空白对照溶液：1-氨基芘溶液(100μL，0.001μg/mL)与水(100μL)混合均匀。测定空白对照溶液发射荧光I₀。

(6)考察传感器单元A1和A2对酪胺和组胺的荧光响应情况。

如图2所示，不同印迹磁性纳米颗粒对生物胺的选择性不同，因而两个传感单元对组胺和酪胺的响应不同(图2)。图2中的(A)显示，传感器单元A1对酪胺有优异的响应性；图2中的(B)显示，传感器单元A2对组胺有优异的响应性。

根据传感器单元的指纹响应对生物胺进行定量，发现传感单元A1荧光强度随酪胺浓度增加而增强，荧光强度I_e/I₀与酪胺浓度呈线性关系(图3)，从而实现对酪胺的定量。同理可以利用传感器单元A2对组胺浓度进行定量分析(图4)。

以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种生物胺荧光阵列传感器，其特征在于，所述的荧光阵列传感器包括荧光指示剂和至少一种生物胺配位印迹材料；

所述生物胺配位印迹材料含有硼酸基，且所述印迹材料能够与生物胺配位；

所述印迹材料还能够与荧光指示剂配位，所述荧光指示剂选自含有与生物胺配位印迹材料中的硼酸基形成B-N配位键结构的荧光物质：1-氨基芘、1,4-二氨基芘、聚乙烯基亚胺修饰的芘中的至少一种；

所述印迹材料与生物胺配位和所述印迹材料与荧光指示剂形成B-N配位键之间，存在竞争关系；

所述生物胺配位印迹材料的制备原料包括：聚合引发原料、硼酸类单体、模板、交联剂、引发剂和溶剂；所述硼酸类单体选自4-乙烯基苯硼酸和氨基苯硼酸中的至少一种；

所述生物胺配位印迹材料具有核-壳结构，所述核为磁性纳米颗粒，所述壳为生物胺配位印迹聚合物，壳层包覆在所述核的外层。

2.根据权利要求1所述的生物胺荧光阵列传感器，其特征在于，所述生物胺选自酪胺、组胺、腐胺、尸胺、精胺和乙醇胺中的至少一种。

3.根据权利要求1所述的生物胺荧光阵列传感器，其特征在于，所述生物胺配位印迹材料的平均粒径为10nm-1μm。

4.根据权利要求1所述的生物胺荧光阵列传感器，其特征在于，所述核为四氧化三铁磁性纳米颗粒。

5.根据权利要求1或4所述的生物胺荧光阵列传感器，其特征在于，所述核的平均粒径为5-100nm。

6.根据权利要求4或5所述的生物胺荧光阵列传感器，其特征在于，所述生物胺配位印迹材料选自酪胺配位印迹磁性材料、组胺配位印迹磁性材料、腐胺配位印迹磁性材料、尸胺配位印迹磁性材料、精胺配位印迹磁性材料和乙醇胺配位磁性印迹材料中的至少一种。

7.根据权利要求1所述的生物胺荧光阵列传感器，其特征在于，

所述模板为生物胺；

所述聚合引发原料选自碳碳双键、氨基或卤代基修饰的磁性聚合引发原料；

所述交联剂、引发剂和溶剂选自自由基聚合所用的交联剂、引发剂和溶剂；

所述自由基聚合为传统自由基聚合或活性可控自由基聚合；

所述印迹材料的制备原料还任选包括其它功能单体：甲基丙烯酸MMA、甲基丙烯酸缩水甘油酯GMA、N-异丙基丙烯酰胺NIPAM中的至少一种。

8.根据权利要求7所述的生物胺荧光阵列传感器，其特征在于，所述模板、硼酸类单体和交联剂的摩尔比为1:(1-100):(1-1000)；

所述聚合引发原料与所述模板的质量摩尔比为100mg:(0.02-0.2)mmol；

所述溶剂与所述模板的体积摩尔比为(20-100)mL:(0.02-0.2)mmol。

9.根据权利要求7所述的生物胺荧光阵列传感器，其特征在于，所述生物胺配位印迹材料的制备方法包括如下步骤：所述生物胺配位印迹材料的制备原料进行自由基聚合反应，反应完成后，洗涤除去模板，得到所述生物胺配位印迹材料。

10.根据权利要求9所述的生物胺荧光阵列传感器，其特征在于，所述自由基聚合反应包括预聚合和引发聚合；所述预聚合的过程包括：将聚合引发原料、硼酸类单体或硼酸类单体和其它功能单体、模板、交联剂和溶剂室温搅拌混合，得到预混物；

所述引发聚合的过程包括：向所述预混物中加入引发剂，于50-90℃下搅拌反应4-10h。

11.根据权利要求1所述的生物胺荧光阵列传感器，其特征在于，所述生物胺荧光阵列传感器包括至少一个传感器单元，每个传感器单元包括一种生物胺配位印迹材料和一种荧光指示剂。

12.根据权利要求11所述的生物胺荧光阵列传感器，其特征在于，所述生物胺荧光阵列传感器为双通道荧光阵列传感器，其包括两个传感器单元，第一传感器单元包括酪胺配位印迹材料和1-氨基芘，第二传感器单元包括组胺配位印迹材料和1-氨基芘。

13.根据权利要求11或12所述的生物胺荧光阵列传感器，其特征在于，每个传感器单元中，所述生物胺配位印迹材料和荧光指示剂的质量比为(1-10)×10⁸:1。

14.权利要求1-13任一项所述荧光阵列传感器的制备方法，其特征在于，将荧光指示剂和至少一种所述生物胺配位印迹材料混合，得到所述生物胺阵列传感器。

15.根据权利要求14所述的制备方法，其特征在于，所述荧光指示剂以溶液形式加入，将荧光指示剂溶解于水、乙腈、丙酮、正己烷、二氯甲烷至少一种试剂中。

16.权利要求1-13任一项所述荧光阵列传感器检测生物胺的方法，其特征在于，包括如下步骤：

17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述方法中还包括检测待测的生物胺溶液中生物胺的浓度：根据I_e/I₀与制定的生物胺标准曲线之间的关系，计算待测的生物胺溶液中生物胺的浓度。

18.根据权利要求16或17所述的方法，其特征在于，所述吸附的时间为30s-720min。