CN113351182A - 表面两性离子聚合物修饰的磁性微球及其制备方法和应用 - Google Patents

表面两性离子聚合物修饰的磁性微球及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种表面两性离子聚合物修饰的磁性微球及其制备方法和应用，包括以下步骤：(1)制备磁性纳米颗粒，分散在有机溶剂中制备磁流体；(2)将磁流体分散到含有表面活性剂的水相中，利用反向微乳液法制备亚微米级磁性微球；(3)制备二氧化硅修饰的磁性纳米颗粒；(4)分散在含有阴离子表面活性剂、羧基类单体、氨基类单体、交联剂、引发剂的溶剂中，升温反应聚合，得到表面包覆两性离子聚合物的超顺磁性微球。该磁性微球表面活性基团可通过单体的比例进行控制，能够高效特异性偶联核酸、蛋白等生物大分子，能够抑制生物活性大分子在磁性微球表面的非特异性结合，极大提高蛋白检测中的灵敏度和细胞分选效率。

Description

表面两性离子聚合物修饰的磁性微球及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及磁性微球的制备，具体涉及一种表面两性离子聚合物修饰的磁性微球及其制备方法和应用。
背景技术
磁性微球作为固相载体，广泛应用于用于体外诊断和生化分离领域。磁性微球不仅用于蛋白、核酸、细胞的捕获和操纵，同时也可以作为探针提供磁检测信号。磁性微球在蛋白、核酸、细胞捕获和操纵过程中均在溶液中进行，只需要使用简单的磁分离就能达到使用的目的，极大优化了效率，检测灵敏度也有很大的提高。磁性微球具有较为明显的颜色，可以通过颜色进行信号传递，磁性微球也是优异的磁性信号源，可以通过磁性传感器来进行信号读取。在侧向层析应用中，相对于传统的胶体金显色和荧光信号检测，磁免疫层析具有较好灵敏度的同时信号也更加稳定，由于不需要激发光源，磁检测仪器体积更小，更加便于携带。
目前市面上商业化免疫诊断磁性微球制备方法主要是磁性内核，外面包覆聚苯乙烯壳层，然后进行表面功能基团(氨基、羧基、环氧基等)改性。该类磁性颗粒制备过程复杂，在模板微球制备过程中需要多次离心操作，不利于产业化和降低使用成本。聚苯乙烯属于疏水性功能材料，在水相体系中会和蛋白进行非特异性结合，在体外诊断应用中会大大降低灵敏度，甚至造成假阳性的严重后果。
专利文献CN104031201A公开了一种生物蛋白磁性微球制备方法，通过乳液聚合实现对微球基体的表面修饰，从而获得表面包覆有聚丙烯酸酯类聚合物层的磁性微球，该方法会在功能磁性微球表面形成亲水聚合物，降低了磁性微球对蛋白的非特异性吸附，但该方法会降低功能磁性微球表面功能基团密度，导致磁性微球在体外诊断应用中灵敏度降低。
专利文献CN104316679A公开了一种聚缩水甘油醚修饰纳米磁性微球在化学发光免疫分析中的应用，制备表面获得表面亲水并富含官能团的纳米微球材料，可以抑制蛋白的非特异性吸附，但聚缩水甘油醚需要特殊修饰，而且结构不可控，不利于大规模制备。
专利文献CN104316679A公开了一种羧基为球的制备方法，该方法中先制备多孔微球，然后将铁盐沉淀到多孔微球中制备磁性微球，通过蒸馏沉淀聚合对该磁性微球进行表面修饰，该专利中制备方法复杂，蒸馏沉淀聚合装置复杂，产业化前景渺茫。
发明内容
本发明的目的就是为了解决上述问题而提供一种表面两性离子聚合物修饰的磁性微球及其制备方法和应用，制备方法简单、蛋白非特异性吸附低、能够提高体外诊断灵敏度的磁性微球。
本发明提供的磁性微球具有亚微米尺寸，具备良好的磁响应性，可以高效负载活性大分子，通过在磁性微球表面聚合一层两亲性聚合物，可以高效偶联蛋白的同时，明显降低蛋白的非特异性吸附，提高检测灵敏度。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种表面两性离子聚合物修饰的磁性微球的制备方法，该磁性微球由内至外依次为超顺磁性磁核-二氧化硅层-两性离子聚合物层，其制备方法包括以下步骤：
(1)通过共沉淀法、热氧化法或者高温时热分解法制备磁性纳米颗粒，然后将磁性纳米颗粒分散在有机溶剂中制备磁流体；
(2)将磁流体分散到含有表面活性剂的水相中，利用反向微乳液法制备亚微米级磁性微球；
(3)将磁性微球分散在醇水溶液中，通过正硅酸四乙酯水解包覆一层二氧化硅，得到二氧化硅修饰的磁性纳米颗粒；
(4)将二氧化硅修饰的磁性微球分散在含有阴离子表面活性剂、羧基类单体、氨基类单体、交联剂、引发剂的有机溶剂中，升温反应聚合，得到表面包覆两性离子聚合物的超顺磁性微球。
该磁性微球表面活性基团可以通过单体的比例进行控制，能够高效特异性偶联核酸、蛋白等生物大分子，该磁性微球表面的两性离子聚合物能够抑制生物活性大分子在磁性微球表面的非特异性结合，极大提高了核酸和蛋白诊断中的灵敏度。
进一步地，步骤(1)磁性纳米颗粒为四氧化三铁纳米颗粒，粒径为5-50nm，优选的粒径为10-30nm，磁流体中磁性颗粒质量浓度为5％-80％，优选为20-60％；用于分散纳米颗粒的有机溶剂为氯仿、环己烷、正辛烷。
进一步地，步骤(2)中所述的表面活性剂为十二烷基硫酸钠、吐温20、span60、聚乙烯吡咯烷酮、曲拉通100中的一种或多种，表面活性剂的质量浓度为0.05％-5％，组装得到的亚微米磁性颗粒大小为100-1000nm，优选为200-500nm。
进一步地，步骤(2)中将磁流体分散到含有表面活性剂的水中，用细胞破碎仪超声处理。
进一步地，步骤(3)具体方法为，将磁性微球分散在醇水相中，机械搅拌后加氨水，继续搅拌后加正硅酸四乙酯，机械搅拌后纯化，用水和乙醇洗涤后得到二氧化硅包覆的磁性微球。
进一步地，所述的醇为乙醇或者异丙醇，水为超纯水，醇水的比例为1～5：1，氨水质量浓度为0.5-5％，磁性微球质量浓度为0.2-20mg/ml。
进一步地，步骤(4)中，阴离子表面活性剂为十二烷基硫酸钠、十二烷基磺酸钠、十二烷基苯磺酸钠、聚(4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸-钠盐)，质量浓度为0.02-2％，阴离子表面活性剂既可以起到辅助磁性微球分散的作用，也可以在磁性微球表面形成阴离子层；
羧基类单体包括但不限于丙烯酸、甲基丙烯酸、甲基丙烯酰氧乙基琥珀酸单酯，浓度为0.02-1mg/ml；
氨基类单体包括但不限于N,N’-亚甲基双丙烯酰胺，丙烯酰胺，浓度为0.02-1mg/ml；
引发剂包括但不限于过硫酸钾、偶氮二异丁腈或过氧化苯甲酰，引发剂与单体比例为1：500-1：20；
交联剂包括但不限于二甲基丙烯酸乙二醇酯，交联剂与单体比例为1：50-1：1；
所述的溶剂为水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙腈。
反应温度为60-120℃，反应时间为1～3小时。
一种表面两性离子聚合物修饰的磁性微球的应用，所述磁性微球用于蛋白检测和细胞分选，对两性离子聚合物包覆的磁性微球进行活化后与待测分子探针偶联形成微球-探针偶联物，将偶联物均匀分散到玻纤膜上，干燥后组装成层析试纸条对靶标分子进行检测，最终根据试纸条上T线计算待测样本中靶标分子的浓度，可以用于靶向分子的高灵敏检测，例如在免疫检测中的应用，能够明显提高检测灵敏度。此类应用，例如检测血清、血浆中的特定蛋白的含量。
本发明在二氧化硅磁性微球表面进行两性离子聚合物修饰避免了对微球进行表面疏水性双键的修饰，工艺流程更加高效，最终得到的磁性微球具有良好的亲水性，阴离子表面活性剂的亲水基会暴露在磁性微球表面，和微球表面的羧基、氨基、亚氨基形成两性离子聚合物，能够降低蛋白在磁性微球表面的非特异性吸附，微球表面的羧基密度可以通过单体进行调控，微球表面的羧基和蛋白偶联和封闭后，微球表面的依然存在大量的正离子和负离子基团形成两性离子聚合物，能够抑制蛋白在磁性微球表面的非特异性吸附，和微球表面羧基进行特异性结合的蛋白够高效识别抗原。亚微米磁性微球保证了磁性微球在磁场中的磁响应性，磁性微球对活性大分子的包被效率也较商业化的微米级磁性微球更高，进而提高检测灵敏度。
附图说明
图1为分散在磁流体中的四氧化三铁纳米颗粒。
图2为制备表面二氧化硅修饰的亚微米四氧化三铁微球。
图3为二氧化硅修饰的亚微米四氧化三铁微球经过两性离子包覆后的磁性微球。
图4为采用本专利中制备磁性微球和商业化磁性微球进行蛋白非特异性测试比较结果。
图5为采用本专利中制备磁性微球进行SARS-COV-2的N蛋白测试结果。
图6为细胞分选前计数结果。
图7为商业化磁性微球细胞分选后计数结果。
图8为本发明中磁性微球细胞分选后计数结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
(1)磁流体的制备：称取硫酸亚铁20g溶解到100ml超纯水中，升温到70℃，加10ml氨水，机械搅拌10分钟后加5ml油酸，继续搅拌30min后升温到80℃，保温1小时后关闭加热，冷却至室温后纯化，用水和甲醇洗涤后烘干得到油酸修饰的四氧化三铁。用氯仿将油酸修饰的四氧化三铁均匀分散的制备磁流体，得到质量浓度为50％的磁流体，图1为磁流体透射显微镜下形貌。
(2)亚微米磁性微球的制备：准确称量100mg十二烷基硫酸钠分散到50ml超纯水中，取2ml步骤(1)中的磁流体分散到SDS水溶液中，用细胞破碎仪200W超声10min，得到质量浓度2％亚微米磁性微球。
(3)制备表面二氧化硅包覆的磁性微球：取20ml步骤2中的磁性微球分散液加入到80ml乙醇中，机械搅拌10分钟后加1ml氨水，继续搅拌5分钟后加100微升正硅酸四乙酯，机械搅拌6小时后纯化，用水和乙醇各洗涤一次后得到二氧化硅包覆的磁性微球，将磁性微球分散到无水乙醇中，得到质量浓度为5％二氧化硅包覆的磁性微球，图2为二氧化硅修饰的磁性微球透射电镜图。
(4)两性离子包覆磁性微球的制备：准确称量100mg聚(4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸-钠盐)加入到100ml无水乙醇中，机械搅拌10分钟至完全溶解，加4ml步骤3二氧化硅包覆的磁性微球、100μl甲基丙烯酸、100mg N,N’-亚甲基双丙烯酰胺，10mg甲基丙烯酸乙二醇酯，2.5mg偶氮二异丁腈，通高纯氮气并继续搅拌30分钟后开始加热到70℃，继续搅拌反应2小时后纯化，用乙醇洗涤后分散到水中，浓度50mg/ml,得到两性离子修饰的磁性微球，图3为两性离子修饰磁性微球透射电镜图。
(5)磁性微球蛋白偶联：取10mg步骤4中磁性微球分散到500μl pH 6.0 MES缓冲液中，混匀后磁分离一次弃上清，继续加400μl pH 6.0 MES缓冲液，加100μl EDC溶液，40ug抗体，37℃孵育30分钟后磁分离，弃上清，用2％BSA溶液封闭后保存。
(6)磁性微球对蛋白的非特异性测试，将本实施例中磁性微球和对照1(上海奥润微纳新材料科技有限公司，货号PM3-020)及对照2(默克，货号M2-200)层析通过固定有甲型流感捕获抗体、乙型流感捕获、新型冠状病毒捕获抗体和质控抗体的试纸条，验证磁性微球和蛋白的非特异性吸附。
图4为本专利中制备磁性微球和商业化磁性微球进行蛋白非特异性测试比较结果。结果表面本实施例中磁性微球不会和蛋白出现非特异性结合，而商业化的磁性微球都出现了非特异性结合，这表面本实施例中磁性微球非常适合于蛋白的超灵敏检测。
(7)磁免疫层析试纸条制备：将磁性微球均匀分散在玻纤膜上，37℃干燥2小时后切成5mm宽试纸条，并和吸水纸、固定有抗体的纤维素膜、上样垫一起组成免疫层析试纸条，将不同浓度待测样本滴加到试纸条上进行测试，通过仪器读取试纸条上的T、C值磁信号后拟合计算样品的浓度，最终SARS-CoV-2N蛋白检测下限为50pg/ml，图5为磁层析测定SARS-CoV-2N蛋白显色结果。
实施例2
(1)两性离子包覆磁性微球的制备：准确称量100mg聚(4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸-钠盐)加入到100ml乙腈中，加100mg实施例(1)二氧化硅包覆的磁性微球、100μl甲基丙烯酸、100mg N,N’-亚甲基双丙烯酰胺，10mg甲基丙烯酸乙二醇酯，2.5mg偶氮二异丁腈，通高纯氮气并继续搅拌30分钟后开始加热到90℃，继续搅拌反应2小时后纯化，用乙醇洗涤后分散到水中，得到两性离子修饰的磁性微球。
(2)磁性微球蛋白偶联：取10mg步骤4中磁性微球分散到500μl pH 6.0 MES缓冲液中，混匀后磁分离一次弃上清，继续加400μl pH 6.0 MES缓冲液，加100μl EDC溶液，40ugNT-proBNP抗体，37℃孵育30分钟后磁分离，弃上清，用2％BSA溶液封闭后保存。
(3)NT-proBNP磁免疫层析试纸条制备：将磁性微球均匀分散在玻纤膜上，37℃干燥2小时后切成5mm宽试纸条，并和吸水纸、固定有抗体的纤维素膜、上样垫一起组成免疫层析试纸条，将不同浓度待测样本滴加到试纸条上进行测试，通过仪器读取试纸条上的T、C值磁信号后拟合计算样品的浓度，最终NT-proBNP检测下限为10pg/ml，图6为磁层析测定NT-proBNP标准曲线图，图7为磁层析测定血清中NT-proBNP和商业化试剂盒测试对比结果。结果显示本实施例中磁性微球在体外检测蛋白方面具有较高的灵敏度，并且和现有的商业试剂盒具有较好的相关性。
实施例3
(1)磁流体的制备：称取12g七水硫酸亚铁、20g六水三氯化铁溶解解到100ml超纯水中，升温到65℃，加10ml氨水,机械搅拌10分钟后加5ml油酸，继续搅拌30min后升温到80℃，保温1小时后关闭加热，冷却至室温后纯化，用水和甲醇洗涤后烘干得到油酸修饰的四氧化三铁。用氯仿将油酸修饰的四氧化三铁均匀分散的制备磁流体，得到质量浓度为60％的磁流体。
(2)亚微米磁性微球的制备：准确称量20μl tween20分散到50ml超纯水中，取2ml步骤(1)中的磁流体分散到SDS水溶液中，用细胞破碎仪200W超声10min，得到质量浓度2％亚微米磁性微球。
(3)制备表面二氧化硅包覆的磁性微球：取20ml步骤2中的磁性微球分散液加入到80ml乙醇中，机械搅拌10分钟后加1ml氨水，继续搅拌5分钟后加100微升正硅酸四乙酯，机械搅拌6小时后纯化，用水和乙醇各洗涤一次后得到二氧化硅包覆的磁性微球，将磁性微球分散到乙腈中，得到质量浓度为5％二氧化硅包覆的磁性微球。
(4)两性离子包覆磁性微球的制备：准确称量100mg聚(4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸-钠盐)加入到100ml水中，机械搅拌10分钟至完全溶解，加4ml步骤3二氧化硅包覆的磁性微球、100μl甲基丙烯酸、100mg甲基丙烯酰胺，10mg甲基丙烯酸乙二醇酯,2.5mg偶氮二异丁腈，通高纯氮气并继续搅拌30分钟后开始加热到70℃，继续搅拌反应2小时后纯化，用乙醇洗涤后分散到水中，浓度50mg/ml,得到两性离子修饰的磁性微球。
(5)以新型新冠N蛋白为抗原的化学发光检测评估磁性微球灵敏度。
将磁性微球蛋白偶联：取10mg步骤4中磁性微球分散到500μl pH 6.0 MES缓冲液中，混匀后磁分离一次弃上清，继续加400μl pH 6.0 MES缓冲液，加100μl EDC溶液，40ug抗体，37℃孵育30分钟后磁分离，弃上清，用5％BSA溶液封闭后保存。将磁珠抗体偶联物和辣根过氧化酶的另一个新冠抗原抗体与不同梯度新冠N蛋白37℃孵育30分钟，形成免疫复合物，在磁场作用清洗过量的酶标抗体，加入化学发光底物，测试不同抗原浓度下的化学发光信号值，然后绘制标准曲线，计算灵敏度，表1中对比了本实施例中磁性微球和对照(上海奥润微纳新材料科技有限公司，货号PM3-020)化学发光法测试新型冠状病毒测试结果，结果表明本发明公开的磁性微球能够提高化学发光免疫检测的灵敏度。
表1
Figure BDA0003115568560000071
Figure BDA0003115568560000081
结果显示，使用本实施例子中制备的磁性微球检测的灵敏度为5pg/ml，对照组只能测试到10pg/ml，结果表明本发明公开的磁性微球能够提高化学发光免疫检测的灵敏度。
实施例4
两性离子聚合物微球在细胞富集方面的应用
按照实施例2中的方法制备两性离子聚合物微球和CD45抗体偶联后用于富集血液中的稀有细胞。CD45抗体购置于BD biosciences(货号：APC-R700)采用商业化的DynabeadsCD45(货号11153D)作为对照。
取两性离子聚合物微球10mg分散到500μl pH 6.0 MES缓冲液中，混匀后磁分离一次弃上清，继续加400μl pH 6.0 MES缓冲液，加100μl EDC溶液，40ug抗CD45抗体，37℃孵育30分钟后磁分离，弃上清，用5％BSA溶液封闭后保存到500μl 1％BSA溶液中。
在荧光显微镜下精确取1、5、10、20个Alexa Fluor 594标记后的hela细胞加入到10ml含有2×107人白细胞中，加入100μl CD 45标记的磁性微球，室温孵育20分钟后磁分离，将剩余细胞悬液取出后离心后用1ml细胞保存液重悬，用细胞计数器计算残留细胞数后将细胞涂片，在荧光显微镜下观测计数回收的hela细胞，计算磁珠对白细胞的去除效率和hela细胞的回收率。
表2中对比了本实施例中磁性微球和市面上采购磁性微球在负选中对白细胞去除效率结果；表3中对比了本实施例中磁性微球和市面上采购磁性微球在负选中对目标细胞的回收效率结果。
表2
Figure BDA0003115568560000082
Figure BDA0003115568560000091
表3
Figure BDA0003115568560000092
从表2、3中结果可以看出，本实施例制备的磁性微球对白细胞的去除效率要高于商业化的磁性微球，同时对靶细胞具有较低的非特异性吸附，靶细胞的回收效率明显高于商业化磁性微球。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种表面两性离子聚合物修饰的磁性微球的制备方法，其特征在于，该磁性微球由内至外依次为超顺磁性磁核-二氧化硅层-两性离子聚合物层，其制备方法包括以下步骤：
(1)制备磁性纳米颗粒，然后将磁性纳米颗粒分散在有机溶剂中制备磁流体；
(2)将磁流体分散到含有表面活性剂的水中，利用反向微乳液法制备亚微米级磁性微球；
(3)将磁性微球分散在醇水溶液中，通过正硅酸四乙酯水解包覆一层二氧化硅，得到二氧化硅修饰的磁性纳米颗粒；
(4)将二氧化硅修饰的磁性微球分散在含有阴离子表面活性剂、羧基类单体、氨基类单体、交联剂、引发剂的有机溶剂中，升温反应聚合，得到表面包覆两性离子聚合物的超顺磁性微球。
2.根据权利要求1所述的一种表面两性离子聚合物修饰的磁性微球的制备方法，其特征在于，步骤(1)制备磁性纳米颗粒的方法可以是共沉淀法、热氧化法也可以是高温热分解法制备的磁性纳米粒子，磁性纳米粒子用油酸包覆后分散到油性有机溶剂中得到磁流体。
3.根据权利要求2所述的一种表面两性离子聚合物修饰的磁性微球的制备方法，其特征在于，磁性四氧化三铁纳米颗粒粒径为5-50nm，磁流体中磁性颗粒质量浓度为5％-80％；用于分散纳米颗粒的有机溶剂为氯仿、环己烷、正辛烷。
4.根据权利要求1所述的一种表面两性离子聚合物修饰的磁性微球的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的表面活性剂为十二烷基硫酸钠、吐温20、span60、聚乙烯吡咯烷酮、曲拉通100中的一种或多种，表面活性剂的质量浓度为0.05％-0.5％，组装得到的亚微米磁性颗粒大小为100-1000nm。
5.根据权利要求4所述的一种表面两性离子聚合物修饰的磁性微球的制备方法，其特征在于，步骤(2)中将磁流体分散到含有表面活性剂的水中，用细胞破碎仪超声处理。
6.根据权利要求1所述的一种表面两性离子聚合物修饰的磁性微球的制备方法，其特征在于，步骤(3)具体方法为，将磁性微球分散在醇水相中，机械搅拌后加氨水，继续搅拌后加正硅酸四乙酯，机械搅拌后纯化，用水和乙醇洗涤后得到二氧化硅包覆的磁性微球。
7.根据权利要求6所述的一种表面两性离子聚合物修饰的磁性微球的制备方法，其特征在于，醇为乙醇或者异丙醇，水为超纯水，醇水的比例为1：1～5：1，氨水质量浓度为0.5-5％，磁性微球质量浓度为0.2-20mg/ml。
8.根据权利要求1所述的一种表面两性离子聚合物修饰的磁性微球的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，阴离子表面活性剂为十二烷基硫酸钠、十二烷基磺酸钠、十二烷基苯磺酸钠、烷基二苯醚二磺酸钠、聚(4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸-钠盐)，质量浓度为0.02-2％；
羧基类单体包括但不限于丙烯酸、甲基丙烯酸、甲基丙烯酰氧乙基琥珀酸单酯，浓度为0.02-1mg/ml；
氨基类单体包括但不限于N,N’-亚甲基双丙烯酰胺，丙烯酰胺，浓度为0.02-1mg/ml；
引发剂包括但不限于过硫酸钾、偶氮二异丁腈或过氧化苯甲酰，引发剂与单体比例为1：500-1：20；
交联剂包括但不限于二甲基丙烯酸乙二醇酯，交联剂与单体比例为1：50-1：1；
所述的溶剂为水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙腈；
反应温度为60-120℃，反应时间为1～3小时。
9.一种表面两性离子聚合物修饰的磁性微球，其特征在于，采用如权利要求1～8任意一项所述的制备方法制备得到。
10.如权利要求9所述的一种表面两性离子聚合物修饰的磁性微球的应用，其特征在于，所述磁性微球用于蛋白检测和细胞分选。
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