JP6289705B1 - プローブ結合担体の製造方法、プローブ結合担体および標的物質を検出または分離する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明の目的は、タンパク質や核酸等の生体関連物質の非特異吸着が少なく、診断や検出等の際に高いS/N比を発現可能なプローブ結合担体および該担体の製造方法を提供することである。
本発明の構成例は以下の通りである。
担体表面のトシル基量を減少させる工程2とを含み、
前記工程1で用いる担体表面のトシル基1個あたりが占める面積S1Aに対する、前記工程2で得られた担体表面のトシル基1個あたりが占める面積S2の割合(S2/S1A×100%)が、140%以上である、
プローブ結合担体の製造方法。
トシル基を有する担体と硫酸アンモニウムとを混合する工程1a、および、
該工程1aの後、プローブを混合する工程1bを含む、
<1>〜<3>のいずれかに記載の製造方法。
<6> 前記磁性粒子がコアシェル構造を有する、<5>に記載の製造方法。
<7> 前記磁性粒子の体積平均粒子径が、0.1〜20μmである、<5>または<6>に記載の製造方法。
<9> 前記工程1が、液体中で担体とプローブとを混合する工程であり、該液体のpHが6〜12である、<1>〜<8>のいずれかに記載の製造方法。
<13> 前記工程2が、工程1で得られた担体とブロッキング剤とを混合するか、または、担体表面のトシル基を加水分解反応する工程であり、該混合時間または反応時間が2時間以上である、<1>〜<12>のいずれかに記載の製造方法。
該プローブ結合担体表面のトシル基1個あたりが占める面積が15Å2/トシル基以上である、
プローブ結合担体。
また、本明細書において、「〜(メタ)アクリレート」とは、「〜アクリレート」および「〜メタクリレート」の双方を包括する概念である。同様の記載は、同様の意味を有する。
本発明に係るプローブ結合担体の製造方法(以下「本方法」ともいう。)は、
トシル基を有する担体とプローブとを混合する工程1と、
担体表面のトシル基量を減少させる工程2とを含み、
前記工程1で用いる担体表面のトシル基1個あたりが占める面積S1Aに対する、前記工程2で得られた担体表面のトシル基1個あたりが占める面積S2の割合(S2/S1A×100%)が、140%以上である。
該プローブ結合担体の製造方法は特に制限されず、従来公知の方法であってもよいが、本方法であることが好ましい。
前記工程1は、トシル基を有する担体とプローブとを混合すれば特に制限されないが、担体とプローブとが容易に接触して、所望のプローブ結合担体を容易に得ることができる等の点から、液体中で前記担体とプローブとを混合する工程であることが好ましい。この場合、前記担体とプローブとの混合物に液体を添加して混合してもよく、プローブの分散液やプローブを含む試料に前記担体を添加して混合してもよいが、前記担体の分散液にプローブを添加して混合することが好ましい。
該加熱の際の温度としては、用いる担体やプローブの種類等により適宜選択すればよいが、プローブ活性を保ちつつ、効率よくプローブ結合担体を作製できる等の点から、好ましくは4〜50℃、より好ましくは20〜45℃、特に好ましくは35〜40℃である。
前記担体とプローブとを混合する際の系中に硫安が存在することで、前記担体へのプローブ結合量が増加し、特に、プローブとして親水性が高いプローブを用いる場合には、担体とプローブとの結合量が低下しやすいが、塩析によるタンパク質等の疎水化により、このようなプローブを用いた場合でも、前記担体へのプローブ結合量が多いプローブ結合担体を容易に得ることができる。
硫安濃度が前記下限未満の場合、担体に十分な量のプローブを結合できない恐れがあり、このために、得られる担体を用いた診断や検出等の際のシグナルの低下を招く場合があり、硫安濃度が前記上限を超える場合、プローブが沈殿や凝集しやすくなり、得られる担体を用いた診断や検出等の際のシグナルの低下を招く場合がある。
前記水系媒体としては、水を含有すれば特に制限されず、1種または2種以上の水以外の非水媒体を含んでいてもよい。
前記担体は、トシル基をその表面に有すれば特に制限されない。該トシル基を有する担体は、通常、プローブと混合または接触させるだけで、プローブを担体の表面に化学的に結合させることができるため、トシル基を有する担体が好適に用いられる。また、担体がトシル基を有することで、縮合剤等を用いなくても、該担体とプローブとを結合させることができるため、該担体を用いることで、簡便に診断や検出等を行うためのプローブ結合担体を容易に得ることができる。
前記工程1で用いる担体は、2種以上であってもよいが、通常は1種である。
なお、本発明においてトシル基とは、p−トルエンスルホニル基のことをいう。
なお、本発明における「少なくとも粒子表面に有する」とは、粒子表面を構成する成分を指し、有機ポリマー粒子が必ずしもコアシェル構造を有することを要件とするわけではない。従って、前記有機ポリマー粒子全体が架橋重合体であってもよい。
(i)有機ポリマーを含む連続相やシリカ等の無機材料中に磁性体粒子が分散している粒子
(ii)磁性体粒子または磁性体粒子の2次凝集体をコアとし、有機ポリマーやシリカ等の無機材料をシェルとする粒子
(iii)有機ポリマーやシリカ等の無機材料からなる核粒子と、該核粒子の表面に設けられた磁性体粒子を含む磁性体層(2次凝集体層)とを有する母粒子をコアとし、有機ポリマーを含む層をシェルとする粒子
(iv)粒子の最外層に有機ポリマーを含む層がシェルとして設けられていてもよい、有機ポリマーや無機材料からなる多孔質粒子の孔内に磁性体粒子が分散している粒子
前記核粒子を構成する有機ポリマーとしては、ビニル系ポリマーが好ましく、より好ましくは、架橋ポリスチレン、架橋アクリレート、架橋ポリメチルメタクリレートである。これらポリマーは、カルボキシル基などの官能基が導入されていてもよい。
このような核粒子は、従来公知の方法、例えば、特公昭57−24369号公報、特開昭61−215602号公報、特開昭61−215603号公報、特開昭61−215604号公報に記載の方法によって製造することができる。
これらの中でも、粒径が50nm以下、好ましくは5〜30nmの酸化鉄系の超常磁性微粒子が好ましく、AFe2O4(Aは、Mn、Co、Ni、Mg、Cu、ZnまたはLi0.5Fe0.5等)で表されるフェライト、マグネタイト(Fe3O4)またはγ−Fe2O3を含む超常磁性微粒子がより好ましく、飽和磁化が強く、かつ残留磁化が少ない等の点から、γ−Fe2O3およびFe3O4からなる超常磁性微粒子が特に好ましい。なお、磁性体の粒子径は、電子顕微鏡写真中の無作意に選択した100個の粒子の粒子径の平均値である。
磁性体粒子表面の疎水化処理方法は特に限定されないが、例えば、磁性体粒子と親和性の高い部分と疎水性の部分とを分子内に有する疎水性物質を、磁性体粒子に接触させて結合させる方法が挙げられる。該方法としては、より具体的には、市販の油性磁性流体から粒子を得、該粒子を乾燥させる方法等が挙げられる。
物理的な力をかける方法としては、例えば、乳鉢、自動乳鉢、ボールミル、ブレード加圧式粉体圧縮法、メカノフュージョン法のようなメカノケミカル効果を利用する方法や、ジェットミル、ハイブリダイザーなどの高速気流中での衝撃を利用する方法が挙げられる。効率よくかつ強固に複合化を実施するには、物理吸着力が強いことが望ましい。その方法としては、例えば、撹拌翼付き容器中で撹拌翼の周速度が、好ましくは15m/秒以上、より好ましくは30m/秒以上、さらに好ましくは40〜150m/秒で撹拌することが挙げられる。撹拌翼の周速度が15m/秒より低いと、核粒子の表面に磁性体粒子を十分に吸着させることができない場合がある。なお、撹拌翼の周速度の上限については、特に制限はないが、使用する装置、エネルギー効率等の点から決定すればよい。
前記水酸基としては、担体表面に容易に、効率的にトシル基を導入できる等の点から、2,3−ジヒドロキシプロピル基(−CH2CH(OH)CH2(OH))が好ましい。
接触角が前記範囲にあると、診断や検出等の際に高いS/N比を発現可能なプローブ結合担体を容易に得ることができる。接触角が前記範囲の上限を超えると、プローブ結合担体への生体関連物質の非特異吸着が増加する場合がある。
該乾燥塗膜は、50mgの担体粒子を含む0.2mlの水分散液を、アプリケーターを用いてスライドガラス等の平滑な基材に塗布し、湿度40%、気温25℃で24時間乾燥することにより得られる塗膜である。
該乾燥塗膜と水との接触角は、約1μLの水滴(25℃)を乾燥塗膜に滴下し、直ちに該塗膜の水平方向からの画像をカメラで撮影し、水滴の輪郭を円周の一部と仮定して塗膜の水平線との角度から求めることができる。
従って、2,3−ジヒドロキシプロピル基を有する粒子にトシル基を導入して得られる粒子は、2−ヒドロキシ−3−(4’−メチルフェニル)スルホニルオキシプロピル基、3−ヒドロキシ−2−(4’−メチルフェニル)スルホニルオキシプロピル基または2,3−ジ(4’−メチルフェニル)スルホニルオキシプロピル基を有する粒子のいずれであってもよい。
なお、トシル化されていない残余の水酸基は、担体の親水化に寄与するため、診断や検出等の際の低ノイズ化に寄与する傾向がある。
前記担体が粒子である場合、好ましくは磁性粒子である場合、担体の粒径は、好ましくは0.1〜20μm、より好ましくは0.2〜15μm、特に好ましくは0.3〜10μmである。
粒径が前記範囲にあると、単位体積当たりのプローブの結合量が多い担体を容易に得ることができ、該担体を用いることで、診断や検出等の際における感度が良好になる。粒径が前記範囲の下限を下回る場合、遠心分離などを用いた分離に長時間を要しやすく、水などの洗浄溶媒と粒子との分離が不十分になる傾向にあるため、目的外の分子(例えば、タンパク質や核酸等の生体関連物質)の除去が不十分になり、充分な精製ができない場合がある。一方、粒径が前記範囲の上限を上回ると、比表面積が小さくなり、プローブの結合量が少なくなる結果、感度が低くなる場合がある。
粒径は、詳細は後述するが、細孔電気抵抗法(電気的検知帯法)により求められる。
前記担体表面のトシル基1個あたりが占める面積(工程1で用いる担体表面のトシル基1個あたりが占める面積S1Aおよびプローブ結合前の担体表面のトシル基1個あたりが占める面積S1A')は、好ましくは5Å2/トシル基以上、より好ましくは10Å2/トシル基以上、特に好ましくは20Å2/トシル基以上であり、好ましくは80Å2/トシル基以下、より好ましくは60Å2/トシル基以下、特に好ましくは40Å2/トシル基以下である。
面積S1AおよびS1A'が前記範囲にあると、診断や検出等の際に高いS/N比を発現可能なプローブ結合担体を容易に得ることができる。
面積S1AおよびS1A'が前記範囲の下限を下回る場合、担体表面のトシル基密度が高いためにプローブが担体表面に多点で結合しやすい傾向にあり、プローブが変性することによるシグナルの低下を招く場合があり、また、プローブ結合担体に過剰なトシル基が残存しやすくなり、担体表面がより疎水的になる傾向にあるため、該担体を用いた診断や検出等の際のノイズの増大を招く場合がある。一方、面積S1AおよびS1A'が前記範囲の上限を上回る場合、担体に十分な量のプローブを結合できない傾向にあり、このために、該担体を用いた診断や検出等の際のシグナルの低下を招く場合がある。
本発明におけるトシル基1個あたりが占める面積は、詳細は後述するが、水系媒体中で測定した値である。
トシル基を有する担体表面の水(25℃)との接触角は50°以上であることが好ましい。該担体が粒子状である場合には、該担体からなる乾燥塗膜と水(25℃)との接触角が、好ましくは70°以上、より好ましくは90°以上、特に好ましくは105°〜120°である。
接触角が前記範囲にあると、診断や検出等の際に高いS/N比を発現可能なプローブ結合担体を容易に得ることができる。接触角が前記範囲の下限未満であると、得られるプローブ結合担体を用いた診断や検出等の際の感度が低下する場合がある。
また、トシル基を導入する前の担体の接触角が前記範囲にあり、かつ、トシル基を導入した後の担体の接触角がこの範囲にある担体を用いることで、プローブ結合担体への生体関連物質の非特異吸着を抑制することができ、プローブ結合担体を用いた診断や検出等を高感度化することができる。
前記プローブとしては特に制限されず、診断や検出等に用いる物質であればよいが、特異結合性物質であることが好ましく、具体的には、タンパク質または核酸が好ましく、抗原、抗体またはアビジンであることがより好ましく、抗原または抗体であることが特に好ましい。
工程1で用いるプローブは、2種以上であってもよいが、通常1種である。
前記抗体としては、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のどちらを用いてもかまわない。
前記工程1で得られた担体表面のトシル基1個あたりが占める面積S1Bは、好ましくは10Å2/トシル基以上、より好ましくは25Å2/トシル基以上、特に好ましくは40Å2/トシル基以上である。
面積S1Bが前記範囲にあると、診断や検出等の際に高いS/N比を発現可能なプローブ結合担体を容易に得ることができる。
面積の割合が斯かる範囲にあると、診断や検出等の際に高いS/N比を発現可能なプローブ結合担体を容易に得ることができる。
前記工程2は、担体表面のトシル基量を減少させる工程であれば特に制限されないが、担体表面のトシル基を遊離する工程であることが好ましい。該工程2は、通常、前記工程1の後に行う。
工程2の後に残存するトシル基は、疎水性が高いために、生体関連物質の非特異吸着の要因となる傾向にあり、トシル基が残存した担体を診断や検出等の際に用いると、ノイズの増大を招く傾向にあるため、工程1で得られた担体表面のトシル基量を減少させること、特に化学的にトシル基を遊離することが好ましい。
前記工程2としては、得られるプローブ結合担体の非特異吸着性をより抑制できる等の点から、ブロッキング剤をトシル基と反応させる方法が好ましい。
該加熱の際の温度としては、用いる担体やブロッキング剤等の種類などにより適宜選択すればよいが、効率よく所定のプローブ結合担体を作製できる等の点から、好ましくは4〜50℃、より好ましくは20〜45℃、特に好ましくは35〜40℃である。
前記ブロッキング剤としては、トシル基に対し反応性の官能基を有する物質であれば特に制限されないが、被検体中のタンパク質や脂質、核酸等の生体分子や細胞、測定試薬中のタンパク質や発光基質、吸光物質等の担体表面への非特異吸着を抑制できる親水性官能基を有する物質であることが好ましい。
前記親水性官能基としては、水酸基、カルボキシ基、スルホン酸基、リン酸基、糖を含む基、双性イオンを含む基、ポリエチレングリコールを含む基等が挙げられる。
ブロッキング剤として機能する生体高分子としては、BSA(ウシ血清アルブミン)、カゼイン、ゼラチンが挙げられ、非特異吸着を特に抑制できる等の点からBSAが好ましい。
ブロッキング剤として機能する合成ポリマーとしては、ポリオキシエチレン等の親水ポリマーを側鎖に有するビニルモノマーの共重合体、ポリオキシエチレン等の親水性ポリマーと他ポリマーのブロック共重合体、末端に官能基を有するポリオキシエチレン等の親水性ポリマーなどが公知である。特に、特開2008−170417号公報に示されるポリオキシエチレンの片末端にポリアミンを有する構造の合成ポリマーは、担体表面への非特異吸着抑制のみならず、抗体等プローブの配向を整列させ反応性を向上させる効果も見られることから、本発明の目的に好適に使用できる。このようなブロッキング剤としてJSRライフサイエンス(株)製ブロックマスターCE510やCE210が挙げられる。
プローブ結合担体表面のトシル基1個あたりが占める面積(前記工程2で得られた担体表面のトシル基1個あたりが占める面積S2およびプローブ結合担体表面のトシル基1個あたりが占める面積S2')は、好ましくは15Å2/トシル基以上である。
本発明者が鋭意検討した結果、このような面積を有するプローブ結合担体によれば、非特異吸着が少なく、プローブ活性が高いことを見出した。
また、面積S2およびS2'は、非特異吸着を少なくし、プローブ活性を高める等の点で、好ましくは30Å2/トシル基以上、より好ましくは40Å2/トシル基以上、特に好ましくは45Å2/トシル基以上である。
残存するトシル基は、生体関連物質等の非特異吸着の要因となる傾向にあり、トシル基が残存した担体を診断や検出等の際に用いると、ノイズの増大を招く傾向にあるため、トシル基は、プローブ結合担体表面に存在していなくてもよい。
面積の割合が斯かる範囲にあるプローブ結合担体は、タンパク質や核酸等の生体関連物質の非特異吸着を十分に抑制できるだけトシル基が低減されており、該担体を用いることで、診断や検出の際に、特にCLIA、CLIEA等のイムノアッセイにおいて優れた低ノイズ、高いS/N比を達成できる。
面積の割合が前記範囲の下限未満の場合、生体関連物質の非特異吸着が増大する傾向にあり、面積の割合が前記範囲の上限を超える場合、十分な量のプローブが結合したプローブ結合担体が得られない傾向にあり、該担体を用いた診断や検出等において高いシグナルが得られない場合がある。
面積の割合が斯かる範囲にあるプローブ結合担体は、タンパク質や核酸等の生体関連物質などの非特異吸着を十分に抑制できるだけトシル基が低減されており、該担体を用いることで、診断や検出の際に、特にCLIA、CLEIA等のイムノアッセイにおいて優れた低ノイズ、高いS/N比を達成できる。
面積の割合が前記範囲の下限未満の場合、生体関連物質の非特異吸着が増大する傾向にあり、面積の割合が前記範囲の上限を超える場合、十分な量のプローブが結合したプローブ結合担体が得られない傾向にあり、該担体を用いた診断や検出等において高いシグナルが得られない場合がある。
前記本法で得られるプローブ結合担体および本発明に係るプローブ結合担体は、標的物質の診断や検出に、特にCLIA、CLEIA等のイムノアッセイに好適に用いることができ、体外診断薬用または生体関連物質用として好適に用いることができる。具体的には、生化学分野での化合物担体用粒子および診断薬用の化学結合担体用粒子等のアフィニティー担体として用いることができ、好ましくは免疫診断や核酸検出に用いられ、特に、抗原または抗体等のプローブを結合させた免疫検査用のプローブ結合粒子として用いることができる。
前記生体関連物質とは、生体に関するすべての物質をいうが、例えば、生体に含まれる物質、生体に含まれる物質から誘導された物質、生体内で利用可能な物質が挙げられる。前記生体関連物質としては特に限定されないが、例えば、タンパク質(例:酵素、抗体、アプタマー、受容体)、ペプチド(例:グルタチオン)、核酸(例:DNA、RNA)、糖質、脂質、およびその他の細胞または物質(例:血小板、赤血球、白血球等の各種血球細胞を含む各種血液由来物質、各種浮遊細胞)が挙げられる。
本発明における、標的物質を検出または分離する方法(以下「本検出方法」ともいう。)は、前記プローブ結合担体を用いる。
本検出方法では、前記プローブ結合担体を用いるため、特出する高感度で被検出物質を検出することができる。
各磁性粒子の粒径は、Multisizer4e(Beckman Coulter社製)で測定した。電解液(Beckman Coulter社製ISOTON II)100mLに、0.1質量%Tween 20水溶液に分散させた1質量%の磁性粒子を、濃度センサが4〜10%の値を示すまで投入し、粒子50,000個の粒子の粒径を測定し、その平均値を算出することで、体積平均粒子径を測定した。
水1mLに分散させた磁性粒子(合成例1で得られた磁性粒子または各工程後の磁性粒子)100mgをマイクロチューブに採取し、エチレンジアミンを100μL加え、40℃で15時間反応した。反応後、マイクロチューブを磁気スタンドに立て上清を回収した。上清20μLをイオンクロマトグラフィー(装置:DIONEX社製ICS2000、カラム:AS18、検出:電気伝導度、流速:1.0mL/分、測定時間:30分、溶離液:50mM 水酸化カリウム水溶液)で分析し、保持時間23分程度に現れるピークの面積を求めた。別途、p−トルエンスルホン酸ナトリウムをイオンクロマトグラフィーで分析することで得られた検量線から、磁性粒子100mgあたりの表面トシル基量を算出した。
磁性粒子表面のトシル基1個あたりが占める面積は、以下の式で求められる。
磁性粒子表面のトシル基1個あたりが占める面積=磁性粒子の表面積/表面トシル基の個数
具体的には以下の式で求められる。
磁性粒子表面のトシル基1個あたりが占める面積[Å2/トシル基]=1/(1.004×磁性粒子比重[g/cm3]×粒径[μm]×トシル基量[mmol/g])
磁性粒子粉末30mgを、示差熱熱重量同時測定装置((株)日立ハイテクサイエンス製STA7300)に入れ、昇温温度:10℃/分、リミット温度:500℃、ホールド時間:20分、サンプリング時間:1.0秒、ガス種:窒素、ガス流量:200mL/分の条件で測定し、磁性粒子に含まれる酸化鉄と樹脂の質量%をそれぞれ求めた。酸化鉄比重を5.2[g/cm3]、樹脂比重を1.1[g/cm3]とし、前記得られたそれぞれの質量%の値から、磁性粒子の比重を算出した。
BCA Protein Assay Kit(Thermo Fisher Scientific社製)を用い、磁性粒子に結合した抗体の定量を行った。
まず、抗体0μg、5μg、10μgまたは15μgが溶解したMES緩衝液(0.1mol/L)50μLをそれぞれマイクロチューブに分注し、前記キット中の試薬Aと試薬Bとを50/1(v/v)で混合して作製したworking reagent 1mLを各マイクロチューブに添加した。37℃で30分インキュベートした後、マイクロチューブを磁気スタンドに立て上清を回収し、OD562の測定を行い、検量線を作成した。
続いて、MES緩衝液(0.1mol/L)50μLに分散させた抗PSA抗体結合磁性粒子1mgをマイクロチューブに採取した。Working reagent 1mLを添加し、37℃で30分インキュベートした後、マイクロチューブを磁気スタンドに立て上清を回収し、OD562の測定を行った。検量線から抗体結合量を算出した。
白色96ウェルプレートのウェル1およびウェル2に、TBS−T緩衝液(137mmol/L塩化ナトリウム、2.7mmol/L塩化カリウム、25mmol/Lトリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩(以下「Tris−HCl」ともいう。)、0.1質量%Tween20、pH7.4)50μLに分散した抗PSA抗体結合磁性粒子15μgをそれぞれ添加した。
次に、ノイズ測定用として、BSA/TBS緩衝液(1質量%BSA、137mmol/L塩化ナトリウム、2.7mmol/L塩化カリウム、25mmol/L Tris−HCl、pH7.4)10μLをウェル1に添加し、また、シグナル測定用として、BSA/TBS緩衝液(1質量%のBSAを含む)10μLに溶解したPSA抗原10μgをウェル2に添加し、37℃で10分間反応させた。その後、抗体結合粒子を磁石で集磁し、上清除去を行い、TBS−T緩衝液で粒子を洗浄した。この集磁−洗浄操作を計5回行った。その後、アルカリフォスファターゼを標識した抗PSA抗体を50μL添加し、37℃で10分間反応させた。反応後、前記と同様にTBS−T緩衝液を用いて集磁−洗浄操作を計5回行い、発光基質(富士レビオ(株)製クラスIIIシリーズ ルミパルス基質液)を50μL添加した。発光基質添加から5分後にルミノメーターを用いてノイズおよびシグナルの発光強度を測定した。
油性磁性流体(「EXPシリーズ、EMG」、(株)フェローテック製)にアセトンを加えて粒子を析出沈殿させた後、これを乾燥することにより、疎水化処理された表面を有するフェライト系(酸化鉄)の磁性体粒子(平均一次粒径:0.01μm)を得た。
ドデシル硫酸ナトリウム0.50質量%を含む水溶液150gに、メチルメタクリレート(以下「MMA」という。)27g、トリメチロールプロパントリメタクリレート(以下「TMP」という。)3gおよびジ(3,5,5−トリメチルヘキサノイル)パーオキサイド(日油(株)製パーロイル355(以下「パーロイル355」という。))0.6gを入れて分散させたプレエマルジョンを、60℃にコントロールした前記1Lセパラブルフラスコに2時間かけて滴下した。滴下終了後、60℃に保持し、1時間攪拌した後、ドデシル硫酸ナトリウム0.50質量%を含む水溶液75gに、グリシジルメタクリレート(以下「GMA」という。)13.5g、TMP1.5gおよびパーロイル355 0.3gを入れて分散させたプレエマルジョンを、60℃にコントロールした前記1Lセパラブルフラスコに1時間30分かけて滴下した。その後75℃に昇温した後さらに2時間重合を続けて、反応を完了させた。
合成例1で得られた磁性粒子(B)10mgを硫酸アンモニウムが溶解したホウ酸緩衝液(硫酸アンモニウム:0.5mol/L、ホウ酸:0.1mol/L、pH9.5)1.5mLに分散させた。磁性粒子分散液に前立腺特異抗原(PSA)に対する抗体(以下「抗PSA抗体」という。)100μgを加えて37℃で8時間反応させた。続いてブロッキング剤としてCE510(2.0質量%、JSR(株)製)50μLを加えて37℃で15時間反応させた。反応後、磁気スタンドを用いて粒子を磁気分離し、洗浄液(25mmol/L Tris−HCl、pH7.4、0.01質量%Tween20含有)で繰り返し洗浄し、抗PSA抗体結合磁性粒子(C−1)を得た。
ブロッキングの反応時間を6時間とした以外は実施例1と同様の操作を行い、抗PSA抗体結合磁性粒子(C−2)を得た。
[実施例3]
ブロッキング剤としてBSAを用いた以外は実施例1と同様の操作を行い、抗PSA抗体結合磁性粒子(C−3)を得た。
合成例1で得られた磁性粒子(B)10mgをホウ酸緩衝液(0.1mol/L、pH9.5)1.0mLに分散させ、抗PSA抗体100μgを加えた。続いて、硫酸アンモニウムが溶解したホウ酸緩衝液(硫酸アンモニウム:1.5mol/L、ホウ酸:0.1mol/L、pH9.5)0.5mLを加え、37℃で8時間反応させた。続いてブロッキング剤としてCE510(2.0質量%、JSR(株)製)50μLを加えて37℃で15時間反応させた。反応後、磁気スタンドを用いて粒子を磁気分離し、洗浄液(25mmol/L Tris−HCl、pH7.4、0.01質量%Tween20含有)で繰り返し洗浄した後、粒子濃度が0.03質量%になるように該洗浄液で希釈して、抗PSA抗体結合磁性粒子(C−4)を得た。
硫酸アンモニウムが溶解したホウ酸緩衝液中の硫酸アンモニウム濃度を1.0mol/Lとした以外は実施例1と同様の操作を行い、抗PSA抗体結合磁性粒子(C−5)を得た。
粒子として、Dynabeads M−280 Tosylactivated(Thermo Fisher Scientific社製)を用いた以外は実施例2と同様の操作を行い、抗PSA抗体結合磁性粒子(C−6)を得た。
硫酸アンモニウムが溶解したホウ酸緩衝液中の硫酸アンモニウム濃度を3.0mol/Lとした以外は実施例1と同様の操作を行い、抗PSA抗体結合磁性粒子(C−7)分散液を得た。
磁性粒子として磁性粒子(B)の代わりに磁性粒子(A)を用いた以外は実施例1と同様の操作を行い、抗PSA抗体結合磁性粒子(D−1)を得た。
ブロッキングを行わない以外は実施例1と同様の操作を行い、抗PSA抗体結合磁性粒子(D−2)を得た。
ブロッキングの反応時間を1時間とした以外は実施例1と同様の操作を行い、抗PSA抗体結合磁性粒子(D−3)を得た。
ブロッキングを行わない以外は実施例6と同様の操作を行い、抗PSA抗体結合磁性粒子(D−4)を得た。
ブロッキングの反応時間を1時間とした以外は実施例6と同様の操作を行い、抗PSA抗体結合磁性粒子(D−5)を得た。
Claims (17)
- トシル基を有する担体とプローブとを混合する工程1と、
担体表面のトシル基量を減少させる工程2とを含み、
前記工程1で用いる担体表面のトシル基1個あたりが占める面積S1Aに対する、前記工程2で得られた担体表面のトシル基1個あたりが占める面積S2の割合(S2/S1A×100%)が、140%以上である、
プローブ結合担体の製造方法。 - 前記工程1が、硫酸アンモニウムの存在下で前記担体とプローブとを混合する工程である、請求項1に記載の製造方法。
- 前記工程1で得られた担体表面のトシル基1個あたりが占める面積S1Bに対する、前記工程2で得られた担体表面のトシル基1個あたりが占める面積S2の割合(S2/S1B×100%)が、110%以上である、請求項1または2に記載の製造方法。
- 前記工程1が、
トシル基を有する担体と硫酸アンモニウムとを混合する工程1a、および、
該工程1aの後、プローブを混合する工程1bを含む、
請求項1〜3のいずれか1つに記載の製造方法。 - 前記担体が磁性粒子である、請求項1〜4のいずれか1つに記載の製造方法。
- 前記磁性粒子がコアシェル構造を有する、請求項5に記載の製造方法。
- 前記磁性粒子の体積平均粒子径が、0.1〜20μmである、請求項5または6に記載の製造方法。
- 前記工程1が、硫酸アンモニウムを含む液体中で担体とプローブとを混合する工程であり、担体とプローブとが接触する際の液体中の硫酸アンモニウム濃度が2.0mol/L以下である、請求項1〜7のいずれか1つに記載の製造方法。
- 前記工程1が、液体中で担体とプローブとを混合する工程であり、該液体のpHが6〜12である、請求項1〜8のいずれか1つに記載の製造方法。
- 前記工程1で用いる担体表面のトシル基1個あたりが占める面積S1Aが、5Å2/トシル基以上である、請求項1〜9のいずれか1つに記載の製造方法。
- 前記プローブがタンパク質または核酸である、請求項1〜10のいずれか1つに記載の製造方法。
- 前記工程1における混合時間が2時間以上である、請求項1〜11のいずれか1つに記載の製造方法。
- 前記工程2が、工程1で得られた担体とブロッキング剤とを混合するか、または、担体表面のトシル基を加水分解反応する工程であり、該混合時間または反応時間が2時間以上である、請求項1〜12のいずれか1つに記載の製造方法。
- トシル基を有する担体にプローブを結合し、ブロッキング剤が共有結合しているプローブ結合担体であって、
該プローブ結合担体表面のトシル基1個あたりが占める面積が15Å2/トシル基以上である、
プローブ結合担体。 - プローブ結合前およびブロッキング剤結合前の担体表面のトシル基1個あたりが占める面積S1A'に対する、プローブ結合担体表面のトシル基1個あたりが占める面積S2'の割合(S2'/S1A'×100%)が、140%以上である、請求項14に記載のプローブ結合担体。
- 体外診断薬用または生体関連物質検出用である、請求項14〜15のいずれか1つに記載のプローブ結合担体。
- 請求項14〜15のいずれかに1つに記載のプローブ結合担体を用いる、標的物質を検出または分離する方法。
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