WO2004092732A1

WO2004092732A1 - 磁性体内包粒子及びその製造方法、免疫測定用粒子、並びに、免疫測定法

Info

Publication number: WO2004092732A1
Application number: PCT/JP2004/005515
Authority: WO
Inventors: Takayuki Oka; Izumi Omoto; Haruma Kawaguchi; Wataru Wakui
Original assignee: Sekisui Chemical Co., Ltd.
Priority date: 2003-04-16
Filing date: 2004-04-16
Publication date: 2004-10-28
Also published as: KR101115903B1; EP1617220A4; KR20050119207A; EP1617220B1; DE602004022395D1; US20060188932A1; EP1617220A1; US7632688B2; ATE438854T1

Abstract

　本発明の目的は、均一な磁性を有し、分散安定性に優れ、粒径分布の狭い磁性体内包粒子及びその製造方法、それを用いてなる免疫測定用粒子、並びに、それら磁性体内包粒子又は免疫測定用粒子を用いる免疫測定法を提供することである。　本発明は、有機高分子物質と平均粒径１～３０ｎｍの磁性体とからなる磁性体内包粒子であって、上記磁性体は、分散した状態で粒子内部に包含されている磁性体内包粒子である。

Description

明細書，

磁性体内包粒子及びその製造方法、免疫測定用粒子、並びに、免疫測定法技術分野

本発明は、均一な磁性を有し、分散安定性に優れ、粒径分布の狭い磁性体内包粒子及びその製造方法、それを用いてなる免疫測定用粒子、並びに、それら磁性体内包粒子又は免疫測定用粒子を用いる免疫測定法に関する。背景技術

従来、磁性体含有高分子粒子の作製法として（1 ) 作製済みの高分子粒子に鉄イオンを含ませて磁性体を作製する方法、（2 ) モノマーから高分子粒子を重合する過程で作製済みの磁性体粒子を含ませる方法（特開平 9一 2 0 8 7 8 8号公報参照）、（3 ) 別々に作製した高分子粒子と磁性体粒子とを複合化させる方法 (特開平 6— 2 3 1 9 5 7号公報参照）が知られている。また、この他、（4 ) 磁性体粒子を高分子等で被覆する方法（特開平 6— 9 2 6 4 0号公報参照）がある。

( 1 ) の方法は鉄イオンを高分子粒子に吸収させるため、表面に磁性体が露出し、磁性体が酸化するという課題があった。また（2 ) の方法は磁性体粒子が均一に高分子粒子に取り込まれないという課題や、粒径の制御が困難で粒径分布の広い物となるという課題があった。また、（3 ) の方法は高分子粒子が凝集するため、粒径の小さな粒子には使用できないという課題がある。また、（4 ) の方法は、被覆が均一にできないため、浮遊性や分散性が悪く、また、磁性体粒子表面の一部が露出する場合があった。

一方、微量免疫測定法としては、ラジオィムノアツセィ、酵素ィムノアツセィ、蛍光ィムノアッセィ等が従来から知られており、既に実用化されている。これらの方法は、それぞれアイソトープ、酵素、蛍光物質等を標識として付加した抗原又は抗体を用い、これと特異的に反応する抗体又は抗原の有無を検出する方法である。このような免疫測定法に際して、磁性体内包粒子は、効率よくかつ簡便に B / F分離を行うために用いられている。また、 B / F分離以外の使用（特開 2 000-888 52号公報参照）や、磁性体内包粒子自体を標識材料とする免疫測定法（特開平 6— 148 1 89号公報、特開平 7- 22523 3号公報、特表 200 1 - 5 246 7 5号公報参照）が開示されている。

磁性体内包粒子自体を標識とする免疫測定法において、その測定精度は磁性体内包粒子の均質性、すなわち、粒子毎の磁性体含有量の均一性に依存する。しかしながら、市販されている磁性体内包粒子は、磁性体含有量にバラツキがあり、従来公知の磁性体内包粒子の製造法では、磁性体含有量の均一性を制御することは困難である。

磁性体内包粒子を免疫測定法に使用する際、抗原や抗体を結合させる工程や被検出物質と混合する工程において、磁性体内包粒子を緩衝液等に分散した分散液として取り扱う場合が生じる。このため、磁性体内包粒子には、分散液の状態で粒子が自然沈降しないような分散安定性の高いものであることが望ましい。しかしながら、市販されている磁性体内包粒子は、分散液の状態で、しばらく放置するとその一部が沈降する等という取り扱い性についての問題がある。発明の要約

本発明は、上記課題に鑑み、均一な磁性を有し、分散安定性に優れ、粒径分布の狭い磁性体内包粒子及びその製造方法、それを用いてなる免疫測定用粒子、並びに、それら磁性体内包粒子又は免疫測定用粒子を用いる免疫測定法を提供することを目的とする。

本発明は、有機高分子物質と平均粒径 1〜 30 n mの磁性体とからなる磁性体内包粒子であって、上記磁性体は、分散した状態で粒子内部に包含されている磁性体内包粒子である。

本発明の磁性体内包粒子において、有機高分子物質を構成する炭素元素と磁性体を構成する金属元素との構成比率の絶対偏差が 0. 3以下であることが好ましい。

本発明の磁性体内包粒子において、磁性体は磁性体内包粒子を形成する重合過程におレヽて粒子内部で金属ィオンが酸化して形成されたものであることが好ましい。また、上記金属イオンは、鉄イオンであることが好ましい。本発明の磁性体内包粒子において、上記有機高分子物質はァクリル系モノマーからなる重合体を主構成成分とすることが好ましく、上記アクリル系モノマーは- ダリシジル基を有するモノマーであることが好ましい。

また、上記有機高分子物質は、グリシジル基を有するモノマーとスチレン系モノマーとからなる重合体を主構成成分とすることも好ましい。その場合、上記有機高分子物質中のスチレン系モノマーに由来するモノマー単位の比率は 5〜 9 0 重量％であることが好ましい。

更に、上記有機高分子物質は、下記一般式（1 ) で表されるポリエチレングリコール（メタ）アタリレート又は下記一般式（2 ) で表される化合物を重合体のモノマー成分として有することも好ましい。特に、グリシジル基を有するモノマ一、又は、グリジシル基を有するモノマー及びスチレン系モノマーに、共重合成分として添加されるのが好ましい。

C H ₂ = C R— C O O— ( C H ₂ - C H ₂ - O ) n— H ( 1 )

式中、 Rは H又は C H ₃を表し、 nは 1〜 2 0の整数を表す。

式中、 Xは Η又は S 0 ₃— Ν Η ₄ +を表し、 ηは 3〜 3 0の整数を表す。

本発明の磁性体内包粒子において、上記有機高分子物質は架橋されていることが好ましい。

本発明の磁性体内包粒子は、粒子表面に、カルボキシル基、水酸基、エポキシ基、アミノ基、トリェチルアンモ -ゥム基、ジメチルァミノ基及びスルホン酸基よりなる群より選ばれる少なくとも 1種の官能基を有することが好ましい。本発明の磁性体内包粒子は、平均粒径が 0 . 0 5 ~ 1 μ mであることが好ましレ、。

本発明の磁性体内包粒子において、磁性体の含有量は 0 . 1〜5 0重量％でぁることが好ましい。

本発明の磁性体内包粒子が含有する磁性体の平均粒径は 1〜 1 0 n mであることが好ましい。

本発明の磁性体内包粒子は、粒子表面に抗原又は抗体と共有結合可能な官能基を有するリンカ一が結合していることが好ましい。上記官能基は、エポキシ基であることが好ましく、上記リンカ一は、ポリエチレングリコールジグリシジルェ一テルであることが好ましい。

本発明の磁性体内包粒子は、水系溶媒中において親水基を有さないモノマー及び/又は親水基を有するモノマーを重合して粒子を形成する工程と、上記粒子中に金属イオンを取り込みながら上記金属イオンを酸化して磁性体を形成する工程とからなり、上記粒子を形成する工程と上記磁性体を形成する工程とを同時に進行させる方法により製造することができる。

上記親水基を有さないモノマーは、グリシジル基を有するァクリル系モノマー、又は、グリシジル基を有するァクリル毛位モノマー及びスチレン系モノマーであることが好ましい。また、親水基を有さないモノマー及び親水基を有するモノマ一を重合して粒子を形成するのも好ましく、親水基を有するモノマーは、下記一般式 (1) で表されるポリエチレングリコール (メタ) ァクリレート又は下記一般式（2) で表される化合物であることが好ましい。

CH₂ = CR-COO- (CH₂- CH₂-0) n— H (1)

式中、 Rは H又は CH₃を表し、 nは 1〜 20の整数を表す。

式中、 Xは H又は S 0₃_NH₄ +を表し、 nは 3〜 3 0の整数を表す。

また、上記粒子を形成する工程においては、共重合モノマーとして反応性乳化剤を添加してもよい。また、重合開始剤を後添加することが好ましい。

本発明の磁性体内包粒子に、抗原又は抗体が吸着又は結合してなる免疫測定用粒子もまた、本発明の 1つである。

また、本発明の磁性体内包粒子又は免疫測定用粒子を用いる免疫測定法もまた、本発明の 1つである。更に、本発明の磁性体内包粒子を標識として用いる免疫測定法もまた、本発明の 1つである。図面の簡単な説明

図 1は、実施例 2で得られた磁性体内包粒子（平均粒径；磁性体内包粒子 0 . 2 1 Z m、磁性体 5 n m) の T E M写真である。発明の詳細な開示 ' 以下に本発明を詳述する。

本発明の磁性体内包粒子は、有機高分子物質と平均粒径 1〜 3 0 n mの磁性体とからなるものである。

上記有機高分子物質は、粒子のコアを形成するための親水基を有さないモノマ一と、水中で安定に分散する粒子を形成しつつ粒子のシェルを形成するための親水基を有するモノマーとからなる重合体を主構成成分とするものである。

く親水基を有さないモノマー >

上記親水基を有さないモノマーとしては、例えば、スチレン、 α—メチルスチレン、 —メチノレスチレン、 ρ—クロ口スチレン、クロロメチノレスチレンなどのスチレン系モノマー；塩化ビニル；酢酸ビュル、プロピオン酸ビュルなどのビニルエステル類；アクリロニトリルなどの不飽和-トリル類；メチル（メタ）ァクリレート、ェチル（メタ）アタリレート、ブチル（メタ）アタリレート、 2—ェチルへキシル（メタ）アタリレート、ステアリル（メタ）アタリレート、ェチレングリコール（メタ）アタリレート、トリフルォロェチル（メタ）ァクリレート、ペンタフルォロプロピル（メタ）アタリレート、シクロへキシル（メタ）アタリレート、グリシジル（メタ）アタリレート、テトラヒドロフルフリル（メタ）ァタリレートなどのアクリル系モノマー等が挙げられる。これら親水基を有さないモノマーは単独で用いてもよく、 2種以上を併用しても良い。

上記親水基を有さないモノマーとしては、好ましくは、メチル（メタ）アタリレート、ェチル（メタ）アタリレート、プチル（メタ）アタリレート、 2—ェチルへキシル（メタ）アタリレート、ステアリル（メタ）アタリレート、エチレングリコール（メタ）アタリレート、トリフルォロェチノレ (メタ) アタリレート、ペンタフルォロプロピル（メタ）アタリレート、シクロへキシル（メタ）アタリレート、グリシジル（メタ）アタリレート、テトラヒドロフルフリノレ（メタ）ァタリレートなどのアタリル系モノマーが用いられる。

上記親水基を有さないモノマーとしては、より好ましくは、重合による粒子形成と磁性体形成とを同時進行するため、粒子重合中に高濃度に金属イオンを取り込む能力に優れたグリシジル基を有するァクリル系モノマーが用いられる。上記アクリル系モノマーの中でも、特にグリシジルメタタリレート（GMA) は鉄ィオン及びマグネタイトとの親和性が高いため特に好適に使用される。

また、上記グリシジル基を有するアクリル系モノマーとスチレン系モノマーとを併用することも好ましい。

上記親水基を有さないモノマーとして、グリシジル基を有するァクリル系モノマーとスチレン系モノマーとを併用する場合、上記有機高分子物質中のスチレン系モノマーに由来するモノマー単位の比率は 5〜 9 0重量⁰ /₀であることが好ましい。 5重量％未満であると、得られる粒子の水中での分散安定性が低くなり、重合中に自己凝集し易くなり、また、 9 0重量％を超えると、磁性体の前駆体である金属イオンとの親和性が低くなり、粒子内に形成する磁性体が少なくなる。上記グリシジル基を有するァクリル系モノマーとスチレン系モノマーとを併用する際に、更に、メチルメタタリレートを併用してもよい。

また用途によっては、上記親水基を有さないモノマーとして架橋性モノマーが使用され、上記有機高分子物質が架橋されていてもよい。

上記架橋性モノマーとしては、例えば、ジビュルベンゼン、ジビニルビフエェル、ジビニルナフタレン、エチレングリコールジ（メタ）アタリレート、 1， 6 一へキサンジオールジ（メタ）アタリレート、ネオペンチルグリコールジ（メタ ) アタリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アタリレート、テトラメチロー^/メタントリ（メタ）アタリレート、テトラメチロールプロパンテトラ（メタ）アタリレート、ジァリルフタレート及びその異性体、トリアリルイソシァヌレート及びその誘導体等が挙げられる。これら架橋性モノマーは単独で用いてもよく、 2種以上を併用しても良い。これらの架橋性モノマーのなかでも、エチレングリコールジ（メタ）アタリレ一トは鉄イオン及ぴマグネタイトとの親和性が高いため好適に使用される。

<親水基を有するモノマー >

上記親水基を有するモノマーとしては、例えば、アクリル酸、メタクリル酸、ィタコン酸、フマル酸、マレイン酸などの重合性不飽和結合を有するカルボン酸；重合性不飽和結合を有するリン酸エステル；重合性不飽和結合を有するスルホン酸エステル；ジメチルアミノエチルメタクリレート 4級塩、ジェチルアミノエチルメタクリレート 4級塩などのァクリロイル基を有するァミンの塩やビエルピリジンなどのビュル基を有する含窒素化合物の塩のようにカチオン基を有するビ二ノレ系モノマー； 2—ヒドロキシェチノレメタクリレート、ポリエチレングリコール（メタ）ァクリレート、 (メタ）ァクリルアミド、メチロールァクリルアミド、グリセロールメタタリレート（G L M) などの非イオン性ビニル系モノマー等の一般に親水性モノマーと称されているものの他、親水基を有する反応性乳化剤等が挙げられる。これら親水基を有するモノマーは、単独で用いてもよく、 2種以上を併用しても良い。

上記親水基を有する反応性乳化剤としては、例えば、下記一般式（2 ) 〜（9 ) で表される反応性乳化剤類が挙げられる。

(5)

HC=CH CH2=OH-CONH

C12H25 OOC COO(CH2)3 SOa— Na⁺ GH3(CH2)e(7)-CH~(CH≥)7 COO- Na⁺

(6) («)

H^*"— CH CH3 CH3 Br

C12H25OOC CO (OCH₂CH₂)5 OCHg CH2=C-COOCH2CH₂ - ⁺-C₁₂H25

CH3

(7) (9)

上記親水基を有するモノマーのなかでも、下記一般式（1) で表されるポリエチレングリコール (メタ) アタリレートや上記一般式 (2) で表される反応性乳化剤は、水中で粒子を安定に分散する能力が高く、磁性体の生成を妨げないので好適に使用される。

CH₂ = C R-COO- (CH₂- CH₂-0) n_H ( 1)

式中、 Rは H又は CH₃を表し、 nは 1〜 20の整数を表す。

上記一般式（2) 中、 nは 3〜30の整数を表し、好ましくは 5〜 20の整数を表す。

本発明の磁性体内包粒子は磁性体含有量のバラツキが小さいことが好ましい。磁性体内包粒子の磁性体含有量のバラツキを評価する方法としては、 S EM-E DXを用いる方法、同期発光分析を利用する方法等が挙げられる。

上記 SEM— EDXは、 S EM観察を行っている微小領域の EDX分析（定性分析、定量分析、マッピング、粒子解析等）を行う装置であり、磁性体含有量のバラツキを測定することができる。

上記同期発光分析を利用する測定装置としては、例えば、パーティクルアナラィザー（D P— 1 0 0 0、堀場製作所社製）が市販されている。パーティクルァナライザ一は、ァスピレータによりサンプリングした固体微粒子に、ヘリウムマィクロ波誘導プラズマの高い励起エネルギーを照射して、固体微粒子 1個ずつの同期発光を計測する仕組みで、固体微粒子の幅広い用途元素の分析、及び、様々な成分の混在状態を解析することが可能である。

磁性体内包粒子の磁性体含有量のバラツキは、有機高分子物質を構成する炭素元素と磁性体を構成する金属元素の同期発光を測定し、粒子毎の炭素元素と金属元素との混在比率のバラツキから算出したその測定データの分散状態を示す偏差値（絶対偏差）で比較評価することができる。上記偏差値は、その数値が小さいほど磁性体含有量のバラツキが小さく、即ち磁性体内包粒子の均一性が高く、大きいほど磁性体含有量のバラツキが大きい、即ち磁性体内包粒子の均一性が低いことを示している。

本発明の磁性体内包粒子は、有機高分子物質を構成する炭素元素と磁性体を構成する金属元素との構成比率の絶対偏差が 0 . 3以下であることが好ましい。 0 . 3を超えると、免疫測定法に利用した場合、測定再現性や定量性が低くなり測定精度が悪化し、得られる測定データの信頼性が低くなる。より好ましくは 0 . 2 7以下であり、更に好ましくは 0 . 2 5以下であり、更に好ましくは 0 . 2 0以下である。

上記磁性体は、磁性体内包粒子を形成する重合過程において粒子内部で金属ィオンが酸化して形成したものであるのが好ましい。

<金属イオン >

上記金属イオンは、磁性体を形成するものであれば特に限定されないが、好ましくは、鉄イオン、コバルトイオン、ニッケルイオン等であり、より好ましくは鉄イオンである。磁性体であるマグネタイトは塩化第 2鉄を酸化剤等で酸化して得られる。重合開始剤により、上述のモノマーの重合を開始するとともに 2価の鉄イオンの酸化（マグネタイト化）を行うことにより磁性体（マグネタイト）内包粒子が調製される。

上記磁性体の平均粒径は l〜3 0 n mである。 I n m未満であると、磁性体の磁性応答特性が減少し、即ち磁性体内包粒子の磁性応答特性が減少し、免疫測定に使用した際の測定感度が低下する。また、 3 Q n mを超えると、粒子内での分散性が低下する。好ましくは、 2〜2 0 n mであり、より好ましくは、 2〜1 0 n mでめる

本発明の磁性体内包粒子において、上記磁性体は分散した状態で磁性体内包粒子内部に包含されている。即ち、本発明の磁性体内包粒子においては、磁性体が粒子表面に露出することなく、粒子内部に分散した状態で存在している。

本発明の磁性体内包粒子の磁性体含有量は、 0 . 1〜5 0重量％の範囲で調整するのが好ましい。 0 . 1重量％未満であると、磁性体内包粒子の磁性応答特性が減少し、免疫測定に使用した際の測定感度が低下する。また、 5 0重量％を超えると、粒子の重合操作性が低下し、粒子重合中に金属イオンを取り込み難くなる。より好ましくは 0 . 1〜4 0重量％であり、更に好ましくは 1〜3 0重量％である。

また、本発明の磁性体内包粒子は、必要に応じて、粒子表面にカルボキシル基、水酸基、エポキシ基、アミノ基、トリェチルアンモニゥム基、ジメチルァミノ基、スルホン酸基等の官能基を有していてもよい。これらの官能基を介して抗原ゃ抗体と共有結合を行うことができる。

上記官能基は、各々の官能基を有するモノマーを重合用モノマー混合物に予め配合するか、又は、重合途中に添加することにより磁性体内包粒子の表面に導入することができる。上記官能基を有するモノマーとしては、例えば、カルボキシル基を有するモノマーとしては（メタ）アクリル酸等が挙げられ、水酸基を有するモノマーとしては 2—ヒドロキシェチル（メタ）アタリレート等が挙げられ、エポキシ基を有するモノマーとしてはグリシジル（メタ）アタリレート等が挙げられ、トリェチルアンモニゥム基を有するモノマーとしてはトリェチルアンモ- ゥム（メタ）アタリレート等が挙げられ、ジメチルァミノ基を有するモノマーとしてはジメチルァミノ（メタ）アタリレート等が挙げられる。 '

本発明の磁性体内包粒子は、必要に応じて粒子表面に抗原又は抗体と共有結合可能な官能基を有するリンカーが結合していてもよい。

くリンカー >

上記リンカ一とは、磁性体内包粒子を免疫測定に使用した際、有機高分子物質からなる粒子と抗原、抗体等の化合物との間に存在することになる化学物質である。上記リンカ一は、立体障害が起こらないような長さで、かつ、非特異的吸着が生じにくい化合物であり、有機高分子物質からなる粒子及び抗原、抗体等の化合物と結合する前は、その分子末端に、例えば、アミノ基、力ルポキシル基、ェポキシ基、トシル基、チオール基等の抗原又は抗体と共有結合可能な官能基を有していることが好ましい。本発明におけるリンカ一としては、粒子表面のグリシジル基含有モノマー由来のエポキシ基、又はエポキシ基の開環により生じる水酸基、アミノ基等と抗原、抗体等を適当な距離を置いて結合し得るものであれば特に限定されない。好ましくは、エポキシ基を複数末端に有する化合物、例えば、ポリェチレングリコ一/レジグリシジノレエーテノレ、ポリプロピレングリコ一ルジグリシジノレエーテノレ、ネオペンチノレグリコーノレジグリシジノレエーテノレ、トリメチロールプロパンポリグリシジルエーテル等が挙げられる。より好ましくは、ポリエチレングリコーノレジグリシジノレエーテルが挙げられる。

このようなリンカーを磁性体内包粒子の粒子表面に導入することにより、例えば、磁性体内包粒子に結合する抗原、抗体、試薬等の反応性を上げることが可能となり、即ち感度良く精密な測定が可能となり、また、磁性体内包粒子の粒子表面がタンパク質に対して非吸着性のものであっても、リンカーがタンパク質との結合性を有するので、抗原又は抗体を磁性体内包粒子に確実に結合させることが可能となる。

本発明の磁性体内包粒子の平均粒径は、その重合条件により 0 . 0 5〜1 μ ηι の範囲で調整するのが好ましい。 0 . 0 5 ^ ιη未満であると、凝集しやすくなり、分散安定性が低下し、 1 mを超えると、例えば、磁性体内包粒子を懸濁液中で使用する場合は、磁性体内包粒子が沈殿し易くなり、また、免疫クロマト法のように磁性体内包粒子を多孔性担体中で使用する場合は、多孔性担体中で磁性体内包粒子が移動しにくくなるなど、試薬としての取り扱い性が低下する。より好ましくは、 0 . 0 6〜0 . であり、更に好ましくは、 0 . 0 7〜0 . 5 μ πι である。

本発明の磁性体内包粒子は、水系溶媒中において上記親水基を有さないモノマー及ぴ Ζ又は上記親水基を有するモノマーを重合して粒子を形成する工程と、上記粒子中に金属イオンを取り込みながら上記金属イオンを酸化して磁性体を形成する工程とからなり、上記粒子を形成する工程と上記磁性体を形成する工程とを同時に進行させる方法により製造される。

水系溶媒中において親水基を有さないモノマー及ぴ Z又は親水基を有するモノマーを重合して粒子を形成する工程においては、重合開始剤が用いられる。ぐ重合開始剤 >

上記重合開始剤としては特に限定されず、例えば、水溶性の有機ァゾ化合物、無機過酸化物、有機過酸化物等が挙げられる。

上記重合開始剤の好適な例としては、過硫酸カリウム（以下「K P S」と記す；重合温度 7 0 °C) 、ァゾビスアミジノプロパン塩酸塩（重合温度 7 0 °C) 、 2， 2—ァゾビス [ 2— ( 2—イミダゾリン _ 2—ィル）プロパン] ジハイド口クロライド（重合温度 6 0 °C) 、過硫酸アンモニゥム（重合温度 7 0 °C) 等が挙げられる。このうち過酸化物系重合開始剤である K P Sや過硫酸アンモユウムは、重合開始とともに 2価の鉄イオンの酸化に寄与することが期待され、 K P Sゃ過硫酸アンモ-ゥムを用いた場合は、モノマーと鉄イオンによる重合とマグネタイト生成とが同時に進行することが想定される。ァゾビスアミジノプロパン塩酸塩及び 2， 2—ァゾビス [ 2 - ( 2—イミダゾリン一 2—ィル）プロパン] ジハイド口クロライドは酸化力が弱く、 2価の鉄イオンの緩やかな酸化反応に関与する重合開始剤となる。なお、ァゾビスアミジノプロパン塩酸塩としては、商品名「V — 5 0」（和光純薬工業社製）力 2 , 2—ァゾビス [ 2— （ 2—イミダゾリン一 2 _ィル）プロパン] ジハイド口クロライドとしては、商品名「V A _ 0 4 4 」（和光純薬工業社製）が市販されている。

上記重合開始剤は、 F e ^{2 +}の酸化により消費されたり、 F e ^{3 +}によってラジカル活性を失う場合があるため、粒子成長を促す目的で、粒子成長過程に後添加することが有効である。この場合、新たな 2次粒子は形成されず、粒子表面がポリマーで被覆される。

< H調整剤 >

本発明において、重合と同時に磁性体を作製するためには、重合系内の p Hは塩基性に調整されるのが好ましい。上記重合開始剤として K P Sや過硫酸アンモ -ゥムを用いた系では、水中での分散安定性がよく粒径分布の狭い単分散粒子が得られるというメリットがあるが、酸化力の制御ができず重合系内が酸性になるために磁石への引き寄せられ方の弱い粒子になるというデメリットがある。一方、上記重合開始剤として酸化力を持たない 2， 2—ァゾビス [ 2— ( 2—イミダゾリン一 2—ィル）プロパン] ジハイド口クロライドを用いた系では、重合系内の Hがほぼ中性であるというメリツトがある。

重合系内の p Hを弱塩基性に保つには、一般的な塩基を使用することができる。好ましくは N H ₄ O Hが p H調整剤として使用される。

上記 p H調整剤は、必要に応じて数回添加することができる。

<重合方法 > '

本発明の磁性体内包粒子は、懸濁重合、分散重合、乳化重合、ソープフリー乳化重合等の粒子重合法により製造できるが、最終的に得られる磁性体内包粒子の C V値は 5 %以下であることが好ましいので、粒径分布の制御に優れたソープフリー乳化重合により好適に製造される。

以下、ソープフリー乳化重合による磁性体内包粒子の作製方法を例示するが、この方法に限定されるものではない。

代表的な重合組成は、

親水基を有するモノマー及び親水基を有さないモノマーからなるモノマー組成物： 3 g

H ₂ 0 ： 1 0 0 g

からなる。四つ口フラスコに上記モノマー組成物及び水を秤量する。それぞれの口には攪拌棒、還流冷却管を取り付ける。次に、系を恒温槽に入れ、攪拌しながら系内を窒素置換する。恒温槽は、添加する重合開始剤の重合温度に調整するのが好ましく、例えば、重合開始剤として K P S、ァゾビスアミジノプロパン塩酸塩又は過硫酸アンモニゥムを用いる場合は 7 0 °Cとするのが好ましく、重合開始剤として 2， 2—ァゾビス [ 2— （2—イミダゾリン一 2—^ fル）プロパン] ジハイドロクロライドを用いる場合は 5 0〜6 0 °Cとするのが好ましい。その後、水に溶かした重合開始剤を注射筒で系内に注入する。この時点を重合開始とし、所定時間後に注射筒を用いて磁性源となる F e C 1 ₂ ■ 4 H ₂ 0の水溶液を注入する。 F e C 1 ₂ · 411₂0は重合開始剤の1/ 3~4倍モルを水5 gに溶かしたものを使用する。即ち、重合開始剤により上述のモノマーの重合を開始するとともに 2価の鉄イオンの酸化（マグネタイト化）を行うことにより粒子を製造する。

重合は開始から 2時間〜 24時間行うことが好ましい。適度な酸化力を得るために、重合途中に NH₄OHを加えてもよく、更に、重合による粒子の成長を促すために、重合途中に重合開始剤を加えてもよい。この様にして磁性体を分散状態で含有する有機高分子物質からなる粒子を得ることができる。

上記モノマー組成物には、共重合モノマーとして反応性乳化剤を添加してもよい。

<反応性乳化剤 >

上記反応性乳化剤としては、例えば、下記一般式（2) 〜（10) で表される反応性乳化剤類が挙げられる。

(5)

HC=CH CH2=CH-CO H

Ci₂H25 OOC COO(CM2)3-S03- Na⁺ CH3(CH2}a(7)-CH-(CH2)7(8)COO- Na⁺

(«) (8)

H 一 CH CHa CHg ar

C12H25OOC CO {ΟΟΗεΟΗ₂)45 CH3 CH2=C-COOCH2CH₂一 N⁺-C₁₂H25

CH3

これら反応性乳化剤は、単独で用いてもよく、 2種以上を併用しても良い。作製した粒子は、残存モノマー、重合開始剤、未反応の鉄イオン等を取り除くために遠心分離 ·再分散を蒸留水で繰り返し行い精製する。遠心分離を行った後、上澄みをデカンテーシヨンにより捨て、蒸留水を加え、ガラス棒により再分散を行う。精製後、得られた磁性体内包粒子は、ガラス製バイアルに移し、ふた -パラフイルムで密閉 ·保存する。

本発明の磁性体内包粒子の粒子表面へのリンカ一の導入は、例えば、リンカ一未導入の磁性体内包粒子をアルカリ性水溶液中に分散し、続いて、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル等のリンカーとなる化学物質を加えて、 2 4時間程度混合することによりなし得る。

上述のようにして得られる本発明の磁性体内包粒子は、粒度分布が狭く、かつ、磁性体含有量のバラツキが小さいため、極めて均質である。このため、本発明の磁性体内包粒子は分散安定性が高く取り扱い性に優れている。また、本発明の磁性体内包粒子は、平均粒径が比較的小さいためコロイド安定性がよい。また、本発明の磁性体内包粒子は、内包する磁性体が微小なサイズで分散して含有されているため、磁化された際にも残留磁気がなく、それに起因する自己凝集による沈降も生じない。

本発明の磁性体内包粒子に抗原又は抗体を吸着又は結合させることにより免疫測定用粒子を得ることができる。抗体又は抗原を磁性体内包粒子に吸着又は結合させる方法としては、物理吸着法やカルポジイミドを用いた化学結合法等の公知の方法を使用することができる。本発明の磁性体内包粒子の粒子表面にエポキシ基を有するリンカーが導入されている場合は、リンカーを介して抗原又は抗体のァミノ基ゃチオール基等と化学結合させて、免疫測定用粒子を作製することができる。このような本発明の磁性体内包粒子に抗原又は抗体が結合してなる免疫測定用粒子もまた、本発明の 1つである。

本発明の磁性体内包粒子や免疫測定用粒子は免疫測定法に用いることができる。本発明の磁性体内包粒子や免疫測定用粒子を用いる免疫測定法もまた、本発明の 1つである。

本発明の免疫測定法としては、磁性体内包粒子を坦体として用いたラジオィムノアッセィ、酵素ィムノアッセィ等の公知の方法が挙げられ、サンドイッチ法や競合法により、目的とする抗原又は抗体を測定することができる。また、上記方法の標識物質であるアイソトープ、酵素等の代わりに、磁性体内包粒子を標識として用いることができる。本発明の磁性体内包粒子は磁性体を均一に分散含有する粒径分布の狭い粒子であるため、免疫測定法において標識として用いることにより感度よく精密な測定を行うことができる。

本発明の磁性体内包粒子を標識として用いる免疫測定法の具体例としては、従来、蛍光物質、着色粒子、金属コロイド等が標識として利用されてきた免疫測定法が挙げられる。なかでも、近年、簡便かつ迅速に被検出物質を検出する手法としてよく利用されている免疫クロマト法が好適である。上記免疫クロマト法は、少なくとも 2種類の抗体を利用したサンドィツチ法を利用している。上記サンドイッチ法においては、一方の抗体は液相中で移動可能な状態で標識され、他方の抗体はクロマト担体に永久的に固定化されている。上記サンドィツチ法の試薬に試料を添加するとまず標識された抗体と被検出物質とが反応し、その後、標識抗体と被検出物質との複合体がクロマト担体中を移動し、クロマト担体に抗体が固定化された固定化部に来るとそこで固定化された抗体に補足される。通常、免疫クロマト法に用いられるクロマト担体は、ポアサイズが 5〜2 0 μ ηιであり、現在、一般的なサンドイッチ法は、標識として金属コロイドや着色粒子が用いられ、固定化部の着色（標識物の捕捉状態）を目視観察する定性検査として用いられている。

しかしながら、市販されている磁性体内包粒子は、クロマト担体中に滞留したり、展開させる側のクロマト先端部位付近に不均一に残留したりする等の問題点を有し、金属コロイドや着色粒子に比べクロマト展開性が大きく劣るため、免疫クロマト法への適性がない。

これに対して、本発明の磁性体内包粒子は、ポアサイズに比べ充分に小さな粒径であるため、毛細管現象でクロマト担体中を展開（移動）することができる。即ち、本発明の磁性体内包粒子は、平均的なポアサイズ（1 0〜1 2 μ πι) のク口マト担体に展開した場合、上述のような不均一な滞留が認められず、クロマト展開性が非常に優れている。これは、本発明の磁性体内包粒子は、 1 ) 粒度分布が狭く、 2 ) 磁性体含有量が均一であり、 3 ) 残留磁気による自己凝集が生じないため、と推察される。すなわち、本発明の磁性体内包粒子は、従来の磁性体内包粒子と異なり、免疫クロマト法への適性を有している。発明を実施するための最良の形態

以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。

(実施例 1 ~ 7 )

2 0 O m Lの四つ口フラスコに表 1に示す各種モノマー及び水 9 0 gを秤量した。それぞれの口には攪拌シールと攪拌棒、還流冷却管、セラムラバーを取り付けた。系を 70°Cの恒温槽に入れ、 200 r pmで攪拌しながら系内を 30分間窒素置換した。その後、水に溶かした重合開始剤である KP S 0. 06 _§を1 0 gの水に溶解し注射筒で系内に注入した。この時点を重合開始時とし、適度な酸化力を得るために、重合途中に NH₄OH水溶液（NH₄OH 0. 1 6 5 g を水 5 gに溶解）を加えた。また、重合開始から 2分後に注射筒を用いて F e C 12 ■ 4H ₂ O水溶液（F e C l ₂ ' 4H₂0 0. 1 6 5 gを水 5 gに溶解）を注入した。重合は重合開始から 20時間行った。

作製した粒子は、遠心分離 ·再分散を蒸留水で 4回繰り返し行うことで精製した。この際、遠心分離は 20°C、 1 3500 r pmで行った。遠心分離を行った後、上澄みをデカンテーシヨンにより捨て、蒸留水を加え、ガラス棒により再分散を行って磁性体内包粒子を得た。

(単位: g) 表中の記載は以下のとおりである。

GMA ：グリシジルメタクリレート

EG DM：エチレングリコールジメタクリレート

AAm：アタリルァミド

P E- 9 0 ：ポリエチレングリコールメタクリレート（n = 2)

P E— 3 50 ：ポリエチレングリコールメタクリレート（n = 8 ) N E— 2 0 ：

式中、 Xは Hを表す。

S E - 2 0 ：

式中、 Xは S 0 ₄ N H ₄を表す。

得られた磁性体内包粒子分散液について、目視で粒子の分散状態を観察した。また、精製した磁性体内包粒子を水で希釈し、金属メッシュで支持したコロジォン膜上に沈着固定して、透過型電子顕微鏡（T E M) により、粒子の形態を観察した。

実施例 1で得られた磁性体内包粒子は、一部凝集塊が認められ、時間が経つにつれて磁性体内包粒子が沈降する分散安定性のやや低いものであったため、超音波処理により再分散した。一方、親水基を有するモノマーとしてポリエチレングリコールメタタリレートを用いた実施例 2〜5、及び、反応性乳化剤を用いた実施例 6、 7は、いずれも凝集塊が認められず、分散安定性の高い磁性体内包粒子が得られた。特に、反応性乳化剤を用いた実施例 6、 7で得られた磁性体内包粒子は、粒子サイズが小さく、分散安定性が優れていることが認められた。また、実施例 1〜 7で得られた磁性体内包粒子は、いずれも磁性体内包粒子内部に磁性体を分散状態で含み、粒子表面がきれいな輪郭であることが観察された。図 1に実施例 2の磁性体内包粒子の T E M写真（平均粒径；磁性体内包粒子 0 . 2 1 μ m、磁性体 5 n m) を示した。また、実施例 1〜 7における磁性体内包粒子の磁性体の平均粒径を表 2に示した表 2

更に、実施例 1〜 7で作製した磁性体内包粒子が、磁石へ引き寄せられることを確認するために、 1. 5 mLのマイクロチューブに磁性体内包粒子の分散液を少量取り、蒸留水で適当に希釈して磁石つきマイクロチューブ立て（DYNAL 社製、 MPC (登録商標）一 M) にチューブを立てて、分散している磁性体内包粒子が磁石に引き寄せられることを目視により確認した。特に、親水基を有するモノマーとしてポリエチレングリコールメタクリレートを用いた実施例 2〜 5は、他の実施例 1、 6、 7に比べ磁力が大きいことがうかがえた。

(実施例 8)

20 OmLの四つ口フラスコに下記に示す各種モノマー及び水を秤量した。 GMA/EGDM/AAm/H₂0 = 2. 8 35/0. 01 5/0. 1 5/90 (単位： g)

それぞれの口には攪拌シールと攪拌棒、還流冷却管、セラムラバーを取り付けた。系を 70°Cの恒温槽に入れ、 200 r pmで攪拌しながら系内を 30分間窒素置換した。その後、水に溶かした重合開始剤である KP S 0. 06 gを 1 0 gの水に溶解し注射筒で系内に注入した。この時点を重合開始時とし、重合開始 1分後に適度な酸化力を得るため NH₄OH水溶液（NH₄OH 0. 1 6 5 g を水 5 gに溶解）を加えた。また、重合開始から 2分後に注射筒を用いて F e C 1 ₂ ■ 4H ₂ O水溶液（F e C l ₂ ' 4H₂0 0. 1 6 5 gを水 5 gに溶解）を注入した。重合は重合開始から 2時間行った。作製した粒子は、遠心分離■再分散を蒸留水で 4回繰り返し行うことで精製した。この際、遠心分離は 20°C、 1 3500 r pmで行った。遠心分離を行った後、上澄みをデカンテーシヨンにより捨て、蒸留水を加え、ガラス棒により再分散を行って磁性体内包粒子を得た。

(実施例 9 )

重合開始後、下記物質の添加を以下の所定時間に変更したこと、重合時間を重合開始から 3時間としたこと以外は実施例 8と同様に磁性体内包粒子を得た。

NH₄OH水溶液（NH₄OH 0. 1 6 5 gを水 5 gに溶解）：重合開始 3 0分後

KP S (KP S 0. 1 6 5 _§を水5 _§に溶解）：重合開始 60分後 (実施例 1 0)

重合開始後、下記物質の添加を以下の所定時間に変更したこと、 GMAをさらに後添加したこと、重合時間を重合開始から 3時間としたこと以外は実施例 8と同様に磁性体内包粒子を得た。

KP S (KP S 0. 1 6 5 _§を水5 _§に溶解）：重合開始 60分後 F e C 1₂ · 4 H ₂ O水溶液（F e C l ₂ ' 4H₂〇 0. 1 6 5 gを水 5 gに溶解）：重合開始 60分後

GMA 0. 5 g ：重合開始 1 20分後（尚、重合開始前には実施例 8と同様に GMA 2. 8 3 5 gを四つ口フラスコに添加した）

NH₄OH水溶液（NH₄OH 0. 1 6 5 gを水 5 gに溶解）：重合開始 1 20分後 (実施例 1 1 )

重合開始後、下記物質の添加を以下の所定時間に変更したこと、重合時間を重合開始から 4時間としたこと以外は実施例 8と同様に磁性体内包粒子を得た。重合開始 1分後 NH₄OHZH₂O= 0. 1 6 5/5 (g)

NH₄OH水溶液（NH₄OH 0. 1 6 5 gを水 5 gに溶解）：重合開始 1 分後

KP S (KP S 0. 1 6 5 §を水5 8に溶解）：重合開始 1 20分後実施例 8〜 1 1で得られた磁性体内包粒子に対し、実施例 1と同様にして TE Mによる磁性体内包粒子の形態観察を行なった。

実施例 9、 10は、いずれも、実施例 8よりも多くの磁性体を含み、粒径が増大していることが認められた。また、実施例 1 1では、内部に実施例 9、 10と同程度の磁性体を含み、粒子表面がきれいな輪郭であることが観察された。これまでの実験より、粒子成長の速い段階で NH₄OHを加えることは、成長を阻害する要因になっていることが推測された。一方、重合開始剤の後添加は、重合率がほぼ 100%になり、また、 2次粒子が形成されず粒子表面がポリマーで覆われていることが観察され、有効な手段であることが確認された。実施例 8 ~ 1 1における磁性体内包粒子の磁性体の平均粒径を表 3に示した。表 3

(実施例 1 2 )

実施例 2で得られた磁性体内包粒子 1. 0 gを 10 %アンモニア水 50 m Lに投入し、 70°Cで 20時間攪拌した。次いで、イオン交換水を用いて遠心洗浄を 3回行い、 5 OmLのイオン交換水に分散させた。続いて、エチレングリコールジグリシジルエーテル 30 gを添加混合し、水酸化ナトリゥム水溶液を用いて p Hを 1 1に調整した後、室温で 24時間攪拌した。反応後、イオン交換水を用いて遠心洗浄を 3回行い、エポキシ基を有するリンカーが結合した磁性体内包粒子を得た。

(実施例 1 3 ) 20 OmLの四つ口フラスコにスチレン 3. 0 g、グリシジルメタタリレート 3 · O g、エチレングリコールジメタタリレート 0. 03 g、ポリエチレングリコールメタクリレート 0. 3 g及び水 200 gを秤量した。それぞれの口には攪拌シールと攪拌棒、還流冷却管、セラムラバーを取り付けた。系を 70°Cの恒温槽に入れ、 200 r pmで攪拌しながら系内を 30分間窒素置換した。その後、水に溶かした重合開始剤である KP S 0. l gを 20 gの水に溶解し注射筒で系内に注入した。この時点を重合開始時とし、 2分後に注射筒を用いて F e C 1 ₂ · 4Η₂ΟτΚ溶液（F e C 1 ₂ · 4H₂0 0. 2 gを水 20 m Lに溶解）を注入した。適度な酸化力を得るために、重合途中に NH₄OH 0. 4 gを加えた。重合は重合開始から 20時間行った。

(実施例 1 4)

スチレン 2. 0 g、グリシジルメタタリレート 4. O gに変更したこと以外は実施例 1 3と同様に磁性体内包粒子を作製した。 (実施例 1 5 )

スチレン 4. 0 g、グリシジルメタタリレート 1. O gに変更したこと以外は実施例 1 3と同様に磁性体内包粒子を作製した。

(実施例 1 6 )

実施例 1 3で作製した磁性体内包粒子 1. 0 gを 10 °/。アンモニア水 50 m L に投入し、 70°Cで 20時間攪拌した。次いで、イオン交換水を用いて遠心洗浄を 3回行ない、 5 OmLのイオン交換水に分散させた。続いて、エチレングリコールジグリシジルエーテル 30 gを添加混合し、水酸化ナトリゥム水溶液を用いて pHを 1 1に調整した後、室温で 24時間攪拌した。反応後、イオン交換水を用いて遠心洗浄を 3回行ないエポキシ基を有するリンカーが結合した磁性体内包粒子を得た。

(実施例 1 7及び 1 8)

200 OmLの四つ口フラスコに表 4に示す各種モノマー及び水 800 gを秤量した。それぞれの口には攪拌シールと攪拌棒、還流冷却管、セラムラバーを取り付けた。系を 70°Cの恒温槽に入れ、 200 r pmで攪拌しながら系内を 30 分間窒素置換した。その後、水に溶かした重合開始剤である過硫酸アンモニゥム 0. 2 gを 1 0 gの水に溶解し注射筒で系内に注入した。この時点を重合開始時とし、適度な酸化力を得るために、重合途中に NH₄OH水溶液（NH₄OH 0. 5 gを水 10 gに溶解）を加えた。また、重合開始から 2分後に注射筒を用いて F e S 0₄ ■ 7 H₂〇水溶液（F e S〇₄ · 7 H₂0 1. 3 gを水 20 gに溶解）を注入した。重合は重合開始から 20時間行った。

作製した粒子は、遠心分離 ·再分散を蒸留水で 4回繰り返し行うことで精製した。この際、遠心分離は 20°C、 1 3 500 r pmで行った。遠心分離を行った後、上澄みをデカンテーシヨンにより捨て、蒸留水を加え、ガラス棒により再分散を行って磁性体内包粒子を得た。表 4

(単位: g)

表中の記載は以下のとおりである。

GMA ：グリシジルメタクリレート

EG DM：エチレングリコールジメタクリレ一ト

S t ：スチレン

MMA ：メチルメタクリレート H S - 10 ：

式中、 Xは S 0₃— NH₄ +を表し、 nは 10を表す。

(実施例 1 9 )

実施例 17で得られた磁性体内包粒子 1. 0 gを 10 %アンモエア水 50 m L に投入し、 70°Cで 20時間攪拌した。次いで、イオン交換水を用いて遠心洗浄を 3回行い、 5 OmLのイオン交換水に分散させた。続いて、エチレングリコールジダリシジルエーテル 30 gを添加混合し、水酸化ナトリゥム水溶液を用いて 1) を1 1に調整した後、室温で 24時間攪拌した。反応後、イオン交換水を用いて遠心洗浄を 3回行い、エポキシ基を有するリンカーが結合した磁性体内包粒子を得た。

(実施例 20 )

実施例 2で得られた磁性体内包粒子から免疫測定用粒子を作製した。

実施例 2で得られた磁性体内包粒子 30 m gにリン酸緩衝液（ 100 mm o 1 ZL、 p H 7. 5) 6mLを加え、 15000 r p mにて 20分間遠心分離を行つた。得られた沈渣に、抗 HB s A gモノクローナル抗体を 0. S SmgZmL の濃度になるようにリン酸緩衝液（10 Omm o 1 /L、 pH7. 5) に溶解した溶液を lmL加え、室温にて 20時間撹拌混和した。その後、未反応の抗 HB s A gモノクローナル抗体を除去するために 15000 r pmにて 20分間遠心分離を行い、更に、得られた沈渣をリン酸緩衝液（l O Ommo 1/L、 p H 7. 5) 6 mLに懸濁させ、再度 15000 r pmにて 20分間遠心分離を行った。その後、得られた沈渣を、牛血清アルブミンを 1重量％の濃度になるようにリン酸緩衝液（100mmo l/L、 pH7. 5) に溶解した溶液 6 m Lに懸濁させ、室温で 1時間撹拌してプロッキング処理を行い、抗 HB s A gモノクローナル抗体が磁性体内包粒子に結合された免疫測定用粒子を得た。

次に、得られた免疫測定用粒子を冷蔵保存するため、 1 5 0 0 0 r p mにて 2 0分間遠心分離を行い、得られた沈渣を、牛血清アルブミンの濃度が 1重量％になるようにリン酸緩衝液（1 0 0mm o l ZL、 p H 7. 5) に溶解し、更に、アジ化ナトリウムを 0. 0 1重量％の濃度になるように溶解した溶液 6 mLに懸濁させ、すぐに冷蔵保存した。

(実施例 2 1、 2 2及び 2 3 )

実施例 1 2、 1 6及び 1 9で得られたリンカーが結合した磁性体内包粒子から免疫測定用粒子を作製した。

実施例 1 2、 1 6及び 1 9で作製したリンカーが結合した磁性体内包粒子 1 2 111 _§に0.

ゥ酸緩衝液1111 を加ぇ、 1 5 0 0 0 r pmにて 1 0分間遠心分離を行い、上清を除去した。得られた沈渣に、 0. 1 Mホウ酸バッファーを 3 8 0 μ L· 抗一 h CGモノクローナル抗体溶液（5. Omg/mL) を 2 0 μ L加え、充分混和して、室温にて 2 0時間攪拌した。反応液は 1 5 0 0 0 r p m にて 1 0分間遠心分離を行い、未反応の抗ひー h CGモノクローナル抗体を除去した。なお、磁性体内包粒子への抗 α— h CGモノクローナル抗体結合量は、上清の蛋白濃度測定から仕込みの 5 5 %であることを確認した。得られた沈渣は 1 0 OmMリン酸緩衝液（p H 7. 5) 1 mLに懸濁させ、再度遠心分離を行った。その沈渣を 1 0 0 mMリン酸緩衝液（ p H 7. 5) に牛血淸アルプミンを 5 % ( w/v) の濃度になるように溶解した溶液 9 0 0 μ Lに懸濁させ、 3 7 °Cで 1時間攪拌し、プロッキング処理を行った。その後 1 5 0 0 0 r： p mにて 2 0分間遠心分離を行い、沈渣に 0. 1Mホウ酸バッファー l mLを添加し、超音波で分散させた。続いて、 l O OmMリン酸緩衝液（p H 7. 5) に牛血清アルブミン及びグリセロールを各々 5 % (w/v) の濃度になるように溶解し、更にアジ化ナトリウムを 0. 0 1 % (w/v) の濃度になるように溶解した溶液 l mLに懸濁させ、免疫測定用粒子を得た。

(比較例 1〜 3 ) 比較例としてエスタポール M 1— 030Z40 (メルク社製）の 3ロットを用いた。

(比較例 4)

比較例 1の磁性体内包粒子から免疫測定用粒子を作製した。

比較例 1の磁性体内包粒子 1 2. 5m gに p H 9. 5の水酸化力リゥム水溶液 l mLを加え、 1 5 0 0 0 r pmにて 1 0分間遠心分離後、上清を除去し、分散液に添加されている界面活性剤を除去した。続いて、得られた沈渣に、 0. 0 2 Mリン酸緩衝液 6 2 5 μ L及び予め調整した 2 %濃度のカルポジィミド溶液（Ρ B S緩衝液） 0. 6 2 5 m Lを添加し、 3 7 °C恒温槽中で 1. 5時間攪拌した。反応溶液は、 1 5 0 0 0 r p mにて 1 0分間遠心分離を行い、上清を除去後、 0. 0 2 Mリン酸緩衝液 1. 2mLを添加し、超音波で再分散した。前述の遠心洗浄操作を 3回繰り返し、未反応のカルポジイミドを除去した。続いて、得られた沈渣に、 0. 1Mホウ酸緩衝液 1. 2mLを添加し、抗 α— h CGモノクローナル抗体 2 0 0 / g加え、 3 7 °C恒温槽中で一晩攪拌した。翌日、反応溶液に 3 O m Mグリシン溶液（ホウ酸緩衝液） 5 0 μ Lを添加し、 3 7 °C恒温槽中で 3 0分間攪拌した。その後、 1 5 0 0 0 r にて 1 0分間遠心分離を行い、未反応の抗ひ一 h CGモノクローナル抗体を除去した。なお、磁性体内包粒子への抗ひー h CGモノクローナル抗体結合量は、上清の蛋白濃度測定から仕込みの 6 3 %であることを確認した。得られた沈渣は 1 0 0 mMリン酸緩衝液（ p H 6. 5) 1 m Lに懸濁させ、再度遠心分離を行った。得られた沈渣は、牛血清アルブミンが 1 % (w/v) 濃度になるように調整した 1 0 OmMリン酸緩衝液（p H 6. 5) l mLに懸濁させ、 3 7 °C恒温槽で 3 0分間攪拌し、ブロッキング処理を行った。その後、 1 5 0 0 0 r pmにて 1 0分間遠心分離を行い、その沈渣を牛血清アルブミン及びグリセロールを各々 5 °/。 (w/v) 、アジ化ナトリウムを 0. 0 1 % (w/v) 濃度になるように調整した 1 0 O mMリン酸緩衝液（p H 7. 5) 1 mLに分散させ、免疫測定用粒子を得た。

<評価> (1) 分散安定性の評価

実施例 1 3〜 1 8で得られた磁性体内包粒子及ぴ比較例 1〜 3の磁性体内包粒子を用いて、固形分 1%の分散液を調製し、超音波分散後、静置して沈降粒子の発生を目視で観察した。比較例 1〜 3の磁性体内包粒子を用いた場合は分散直後に一部の沈降が認められた。また、静置した翌日にはサンプル瓶の底面に沈降層が形成され、分散安定性が悪いことがわかった。一方、実施例 1 3〜1 8の磁性体內包粒子では、静置した翌日においても沈降物は認められず、分散安定性が優れていることが明らかとなつた。

(2) 粒子形状の評価

実施例 1 3〜 1 8で得られた磁性体内包粒子及び比較例 1〜 3の磁性体内包粒子を水で希釈し、金属メッシュで支持したコロジオン膜上に沈着固定して、透過型電子顕微鏡（TEM) により、粒子の形態を観察した。

TEMで観察された磁性体内包粒子と磁性体の平均粒径を表 5に示した。表 5

表 5より、実施例 1 3、 14、 1 5及び 1 6で得られた磁性体内包粒子は、いずれも均一粒径の球形粒子で、磁性体を内包していることが観察された。一方、比較例 1〜 3ではいずれも粒径が 100〜1000 μ mの磁性体内包粒子が混ざつていて不均一であった。また、比較例 1〜 3ではいずれも磁性体内包粒子表面に磁性体が露出しているのが確認された。

更に、作製した磁性体内包粒子（実施例 1 3、 14、 1 5及び 1 6) 力磁石へ引き寄せられることを確認するために、 1. 5mLのマイクロチューブに磁性体内包粒子の分散液を少量取り、蒸留水で適当に希釈して磁石つきマイクロチューブ立て（DYNAL社製、 MPC (登録商標）一M) にチューブを立てて、分散している磁性体内包粒子が磁石に引き寄せられることを視覚により確認した。

(3) 磁性体含有量のバラツキの評価

パーティクルアナライザー（DP— 1 000 堀場製作所社製）を用いて、実施例 1 5〜 1 8及び比較例 1〜 3の磁性体内包粒子について、有機高分子物質を構成する炭素元素と磁性体を構成する鉄元素の同期発光を測定し、その測定データの偏差値を算出した。結果は表 6に示した。表 6

実施例及び比較例の磁性体内包粒子の偏差値を比較すると、実施例 1 5〜 1 8 の磁性体内包粒子の偏差値は小さく、磁性体含有量のバラツキが小さいことが分力る。一方、比較例 1〜3の磁性体内包粒子は、偏差値が大きく、磁性体含有量のバラツキが大きいことが明らかとなった。 (4) クロマト展開性の評価 1

(4) - 1 クロマト展開性の確認

実施例 21、 22及び比較例 4の免疫測定用粒子を固形分 0. 045 % (w/ v) になるように、牛血清アルブミン 1% (w/v) 及びトリトン一 100 0. 03% (w/v) 濃度になるように調整した生理食塩水に分散した。各々の分散液 30 μ Lをポアサイズ 10〜1 2 mのニトロセノレロースメンプレン（SRH F P 70、日本ミリポア社製）にスポットし、円形状に分散液を展開させた。展開した分散液は、いずれも直径約 18 mmの円状であった。その後、乾燥させ、磁性体内包粒子の展開により着色された円形の直径を計測した。結果は、実施例

1 8の免疫測定用粒子を用いた場合で 1 6 mmであり、実施例 1 9の免疫測定用粒子を用いた場合で 1 7 mmであり、比較例 4の免疫測定用粒子を用いた場合で

1 2mmでめつ 7こ。

実施例 21、 22においては、免疫測定用粒子の展開域が媒体の展開域の約 9 2%であったことから、クロマト担体中を展開媒体と共にスムーズに展開していることが分かった。一方、比較例 4では、上記展開域が、約 70%であることから実施例 21、 22に比べると展開性に劣る。また、比較例 4では、スポット中心部付近の着色が濃く不均一な展開であることが分かった。

(4) 一 2 試験片の作製

ュトロセルロースメンブレン（SRHF P 70、日本ミリポア社製）を幅 2 0 cmX長さ 6 cmに裁断し、その長さ方向上端より 3 c mの部位（反応部位）に、抗 ]3— h CGモノクローナル抗体を 2. Omg/m 1の濃度になるようにトリス塩酸緩衝液（10mmo lZL、 pH7. 4) に溶解した溶液を幅 0. 7 m mの直線状に塗布した。その後、 3 7°Cで 2時間乾燥した後、牛血清アルブミン (和光純薬工業社製）を 1重量％の濃度になるようにリン緩衝液（ 1 00 mm o 1 /L_N p H 7. 5) に溶解した溶液に 1時間浸漬し、プロッキング処理を行つた。更にその後、ラウリルベンゼンスルホン酸ナトリウムを 0. 1重量％の濃度になるようにリン酸緩衝液（10 Ommo 1 /L、 p H 7. 5) に溶解した溶液に洗浄後、シリカゲルデシケーター内で室温下にて乾燥し、抗 j3 _h CGモノクローナル抗体を固定化した試験片を得た。

得られた試験片を幅 5

の吸水パッド（AP 22 日本ミリポア社製）を、下端に幅 5mmX長さ 1 5m _mのコンジュゲートパッド（グラスファイバー日本ミリポア社製）を重ね、透明なテープで固定して試験片とした。 (4) - 3 免疫測定の実施

実施例 2 1〜 2 3及び比較例 4の免疫測定用粒子を 0. 0 5 % (w/v) の濃度になるように、牛血清アルブミン 1 % (wZv) 、トリトン一 1 0 0 0. 0 3 % (w/v) 及び h C Gが Om I U/mL、 2 5 m I U/mL、 1 0 Om I U/mL、 1 0 0 Om I UZmL及び 5 0 0 Om I UZmL濃度になるように試験液を調整した生理食塩水に分散した。 - 次に、作製した試験片のコンジユゲートパッドに h CGが所定濃度の試験液 1 0 0 μ Lをそれぞれ滴下した。

滴下 1,0分後、実施例 2 1〜2 3の免疫測定用粒子を用いた場合は、 h CGが Om I U/m Lを除いた試験片は、反応部位において免疫測定用粒子に基づく着色が認められた。また、その着色度合いは、 h CG濃度に依存していることが確認された。また、反応部位において h CG濃度に応じた磁性が確認され、磁性を標識とする免疫測定法に有用であることが示された。

一方、比較例 4の免疫測定用粒子を用いた場合は、いずれの試験片も反応部位及び反応部位までの部位で免疫測定用粒子に基づく着色が認められた。特に、コンジユゲートパッドを重ねた部位付近の着色が強く、免疫測定用粒子が滞留していることが認められ、 h CGが 1 0 0 Om I UZmL以上では、その部位は反応部位よりも強く着色していることが認められた。.比較例 4の免疫測定用粒子を用いた場合は、 1 ) 試験片に免疫測定用粒子が滞留する、 2) 被検出物質濃度に応じて展開する免疫測定用粒子量が変動する、 3) 被検出物質が存在しなくても（ h C G： Om I U/mL) 非特異的に反応部位に免疫測定用粒子がキヤプチヤーされることから、磁性を標識とする免疫測定法には適用できないことが示された。

( 5 ) クロマト展開性の評価 2

( 5 ) - 1 試験片の作製

ニトロセルロースメンブレン（S RHF、日本ミリポア社製）を幅 3 0 c mX 長さ 6 c mに裁断し、その長さ方向上端より 3 c mの部位（反応部位）に、実施例 2 0の免疫測定用粒子で用いたものとは異なる反応ェピトープを有する抗 HB s A gモノクローナル抗体を 2. OmgZmLの濃度になるようにトリス塩酸緩衝液（10mmo l/L、 pH7. 4) に溶解した溶液を幅 0. 7 mmの直線状に塗布した。その後、 37°Cで 2時間乾燥した後、牛血清アルブミン（和光純薬社製）を 1重量％の濃度になるようにリン酸緩衝液（100mino lZL、 pH

7. 5) に溶解した溶液に 1時間浸漬し、ブロッキング処理を行った。更にその後、ラウリルベンゼンスルホン酸ナトリウムを 0. 1重量％の濃度になるようにリン酸緩衝液（100mmo l/L、 pH7. 5) に溶解した溶液にて洗浄後、シリカゲルデシケーター内で室温下にて乾燥し、抗 HB s A gモノクローナル抗体固定化膜を得た。

得られた抗 HB s A gモノクローナル抗体固定化膜を幅 5 mmに裁断し、長さ方向上端に幅 5mmX長さ 2 cmの吸水用ろ紙（日本ミリポア社製）を重ね、透明なテープで固定して試験片とした。

(5) - 2 免疫測定の実施

リン酸緩衝液 (10 Ommo 1 /L、 pH7. 5) に実施例 20の免疫測定用粒子を 0. 1重量％の濃度になるように溶解し、更に牛血清アルブミンを 1重量 %の濃度になるように溶解し、更にアジ化ナトリウムを 0. 01重量％の濃度になるように溶解した溶液を作製し、該溶液を 96ウェルマイク口プレート（ナルジェヌンクインターナショナル社製）各ゥエルに添加した。

次に、 HB s抗原標準品（50 I UZmL) を所定の濃度になるようにリン酸緩衝液（100 mm o 1 / L、 p H 7. 5) で希釈し、各々 100 x Lをゥエルに添加混合後、試験片をゥエル内に入れ、立位するように立てた。

30分後、試験片を取り出した所、反応部位において HB s抗原濃度に応じた磁性が確認され、実施例 20の免疫測定用粒子は磁性を標識とする免疫測定法に有用であることが示された。産業上の利用の可能性

本発明によれば、親水基を有さないモノマーと親水基を有するモノマーとを共重合して粒子を形成する反応と、粒子内に金属イオンを取り込ませながら金属ィオンを変性して磁性体を形成する反応とを同時に行うことにより、均一な磁性を有し、かつ、粒径分布の狭い磁性体内包粒子を得ることができる。本発明の磁性体内包粒子に抗原又は抗体を吸着又は結合させることにより本発明の免疫測定用粒子を得ることができる。また、本発明の磁性体内包粒子又は免疫測定用粒子を用いて免疫測定法を行うことにより、感度良く精密な測定が可能になる。更に、本発明の磁性体内包粒子を標識として免疫測定法を行うことにより、感度よく精密な測定が可能になる。

また、本発明の磁性体内包粒子にリンカ一が導入されている場合には、例えば、磁性体内包粒子に結合する抗原、抗体、試薬等の反応性を上げることが可能となり、即ち感度良く精密な測定が可能となり、本発明の磁性体内包粒子の粒子表面がタンパク質に対して非吸着性のものであっても、リンカ一がタンパク質との結合性を有するので、抗原又は抗体を磁性体内包粒子に確実に結合させることが可能となる。

Claims

請求の範囲

1 . 有機高分子物質と平均粒径 1〜 3 0 n mの磁性体とからなる磁性体内包粒子であって、

前記磁性体は、分散した状態で粒子内部に包含されていることを特徴とする磁性体内包粒子。

2 . 有機高分子物質を構成する炭素元素と磁性体を構成する金属元素との構成比率の絶対偏差が 0 . 3以下であることを特徴とする請求の範囲第 1項記載の磁性体内包粒子。

3 . 磁性体は、磁性体内包粒子を形成する重合過程において粒子内部で金属ィォンが酸化して形成されたものであることを特徴とする請求の範囲第 1又は 2項記載の磁性体内包粒子。

4 . 金属イオンは、鉄イオンであることを特徴とする請求の範囲第 3項記載の磁性体内包粒子。

5 . 有機高分子物質は、アクリル系モノマーからなる重合体を主構成成分とすることを特徴とする請求の範囲第 1、 2、 3又は 4項記載の磁性体内包粒子。

6 . アクリル系モノマーは、グリシジル基を有するモノマーであることを特徴とする請求の範囲第 5項記載の磁性体內包粒子。

7 . 有機高分子物質は、グリシジル基を有するモノマーとスチレン系モノマーとからなる重合体を主構成成分とすることを特徴とする請求の範囲第 1、 2、 3又は 4項記載の磁性体内包粒子。

8 . 有機高分子物質中のスチレン系モノマーに由来するモノマー単位の比率が、 5〜 90重量％であることを特徴とする請求の範囲第 7項記載の磁性体内包粒子 _c

9. 有機高分子物質を構成する重合体のモノマー成分として、更に、下記一般式

(1) で表されるポリエチレングリコール（メタ）アタリレート又は下記一般式

(2) で表される化合物を有することを特徴とする請求の範囲第 5、 6、 7又は 8項記載の磁性体内包粒子。

CH₂ = CR-COO- (CH₂— CH₂— O) n— H (1)

式中、 Rは H又は CH₃を表し、 nは 1〜 2 0の整数を表す。

式中、 Xは H又は S〇₃— NH₄ ⁺を表し、 nは 3〜 3 0の整数を表す

10. 有機高分子物質は、架橋されていることを特徴とする請求の範囲第 1、 2 3、 4、 5、 6、 7、 8又は 9項記載の磁性体内包粒子。

1 1. 粒子表面に、カルボキシル基、水酸基、エポキシ基、アミノ基、トリェチルアンモ -ゥム基、ジメチルァミノ基及びスルホン酸基からなる群より選ばれる少なくとも 1種の官能基を有することを特徴とする請求の範囲第 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9又は 1 0項記載の磁性体内包粒子。

1 2. 平均粒径が 0. 05〜1 zmであることを特徴とする請求の範囲第 2 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 1 0又は 1 1項記載の磁性体内包粒子。

3. 磁性体の含有量が 0. 1〜 50重量％であることを特徴とする請求の範囲 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 1 1又は 1 2項記載の磁性体内包粒子

14. 磁性体の平均粒径が 2〜10 nmであることを特徴とする請求の範囲第 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 1 1、 1 2又は 1 3項記載の磁性体内包粒子。

1 5. 粒子表面に抗原又は抗体と共有結合可能な官能基を有するリンカーが結合していることを特徴とする請求の範囲第 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 1 0、 1 1、 1 2、 1 3又は 1 4項記載の磁性体内包粒子。

1 6. 抗原又は抗体と共有結合可能な官能基は、エポキシ基であることを特徴とする請求の範囲第 1 5項記載の磁性体内包粒子。

17. リンカ一は、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテルであることを特徴とする請求の範囲第 1 5又は 1 6項記載の磁性体内包粒子。

18. 水系溶媒中において親水基を有さないモノマー及び又は親水基を有するモノマーを重合して粒子を形成する工程と、

前記粒子中に金属イオンを取り込みながら前記金属イオンを酸化して磁性体を形成する工程とからなり、

前記粒子を形成する工程と前記磁性体を形成する工程とを同時に進行させることを特徴とする磁性体内包粒子の製造方法。

1 9. 親水基を有さないモノマーは、グリシジル基を有するアクリル系モノマー、又は、グリシジル基を有するァクリル系モノマー及ぴスチレン系モノマーであることを特徴とする請求の範囲第 1 8項記載の磁性体内包粒子の製造方法。

20. 粒子を形成するモノマーは、親水基を有さないモノマー及び親水基を有するモノマーからなり、親水基を有するモノマーは、下記一般式（1) で表されるポリエチレングリコール（メタ）アタリレート又は下記一般式（2) で表される化合物であることを特徴とする請求の範囲第 1 8又は 1 9項記載の磁性体内包粒子の製造方法。

CH₂ = CR— COO— （CH₂— CH₂— O) n— H (1)

式中、 Rは H又は CH₃を表し、 nは 1〜 20の整数を表す。

式中、 Xは H又は S 0₃— NH₄ +を表し、 nは 3〜 30の整数を表す _c 21. 粒子を形成する工程において、共重合モノマーとして反応性乳化剤を添加することを特徴とする請求の範囲第 18、 1 9又は 20 ^記載の磁性体内包粒子の製造方法。

22. 粒子を形成する工程において、重合開始剤を後添加することを特徴とする請求の範囲第 1 8、 1 9、 20又は 2 1項記載の磁性体内包粒子の製造方法。

23. 請求の範囲第 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 1 1、 1 2、 1 3、 14、 1 5、 1 6又は 1 7項記載の磁性体内包粒子に、抗原又は抗体が吸着又は結合してなることを特徴とする免疫測定用粒子。

24, 請求の範囲第 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 1 1、 1 2、 1 3、 14、 1 5、 1 6又は 1 7項記載の磁性体内包粒子又は請求の範囲第 23 項記載の免疫測定用粒子を用いることを特徴とする免疫測定法。

25. 請求の範囲第 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 1 1、 1 2、 1 3、 14、 1 5、 1 6又は 17項記載の磁性体内包粒子を標識として用いることを特徴とする免疫測定法。

26. 免疫クロマト法を用いることを特徴とする請求の範囲第 24又は 25項記載の免疫測定法。