JPH07225233A - 水晶発振子を用いる免疫測定法 - Google Patents
水晶発振子を用いる免疫測定法Info
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- JPH07225233A JPH07225233A JP1872294A JP1872294A JPH07225233A JP H07225233 A JPH07225233 A JP H07225233A JP 1872294 A JP1872294 A JP 1872294A JP 1872294 A JP1872294 A JP 1872294A JP H07225233 A JPH07225233 A JP H07225233A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 高い検出感度を持ち、抗原や抗体が再利用で
きる水晶発振子を用いた免疫測定法を提供する。 【構成】 試料中の目的成分を、固相と結合した目的成
分に特異的に結合する物質を用いて定量する免疫測定法
において、標識物質として磁性粒子を用い、磁性粒子量
を水晶発振子の発振周波数の変化を測定することにより
定量することを特徴とする方法。
きる水晶発振子を用いた免疫測定法を提供する。 【構成】 試料中の目的成分を、固相と結合した目的成
分に特異的に結合する物質を用いて定量する免疫測定法
において、標識物質として磁性粒子を用い、磁性粒子量
を水晶発振子の発振周波数の変化を測定することにより
定量することを特徴とする方法。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、臨床検査等で有用な生
体試料の免疫測定法の改良に関する。
体試料の免疫測定法の改良に関する。
【0002】
【従来の技術】水晶発振器を用いて抗原又は抗体を測定
する方法としては、水晶発振子の電極面上に、抗原又は
抗体に対して、それぞれ特異的に結合する物質を吸着も
しくは結合させておき、目的とする抗体又は抗原をその
特異的結合体により捕捉し、生じる水晶発振子の発振周
波数の変化を測定して目的成分量を求める方法が報告さ
れている(アナリティカルケミストリー1987年,5
9巻,2760頁、特開昭64−35269号公報)。
また水晶発振子の表面に結合させる方法とは異なり、抗
原抗体反応の結果生成する沈澱により水晶発振子の発振
周波数が変化する現象を利用して、目的とする抗原又は
抗体の濃度を測定する方法(ジャーナルオブ アメリカ
ン ケミカル ソサエティー,110巻,8623頁,
1988年;特開平3−77061号公報)も知られて
いる。
する方法としては、水晶発振子の電極面上に、抗原又は
抗体に対して、それぞれ特異的に結合する物質を吸着も
しくは結合させておき、目的とする抗体又は抗原をその
特異的結合体により捕捉し、生じる水晶発振子の発振周
波数の変化を測定して目的成分量を求める方法が報告さ
れている(アナリティカルケミストリー1987年,5
9巻,2760頁、特開昭64−35269号公報)。
また水晶発振子の表面に結合させる方法とは異なり、抗
原抗体反応の結果生成する沈澱により水晶発振子の発振
周波数が変化する現象を利用して、目的とする抗原又は
抗体の濃度を測定する方法(ジャーナルオブ アメリカ
ン ケミカル ソサエティー,110巻,8623頁,
1988年;特開平3−77061号公報)も知られて
いる。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】水晶発振子の発振周波
数の変化を測定する免疫測定法は微量の抗原または抗体
を測定する場合、検出感度が十分ではなく、さらに高価
な抗原または抗体を再利用できないといった欠点を有す
るため、広く普及するには至っていない。
数の変化を測定する免疫測定法は微量の抗原または抗体
を測定する場合、検出感度が十分ではなく、さらに高価
な抗原または抗体を再利用できないといった欠点を有す
るため、広く普及するには至っていない。
【0004】本発明により、試料中の抗原または抗体を
高感度に検出でき、かつ測定に使用した抗原または抗体
を再利用できる水晶発振子を用いた免疫測定法が提供さ
れる。
高感度に検出でき、かつ測定に使用した抗原または抗体
を再利用できる水晶発振子を用いた免疫測定法が提供さ
れる。
【0005】
【課題を解決するための手段】本発明は、試料中の目的
成分を、固相と結合した目的成分に特異的に結合する物
質を用いて定量する免疫測定法において、標識物質とし
て磁性粒子を用い、磁性粒子量を水晶発振子の発振周波
数の変化を測定することにより定量することを特徴とす
る方法に関する。
成分を、固相と結合した目的成分に特異的に結合する物
質を用いて定量する免疫測定法において、標識物質とし
て磁性粒子を用い、磁性粒子量を水晶発振子の発振周波
数の変化を測定することにより定量することを特徴とす
る方法に関する。
【0006】本発明において、試料中の目的成分を固相
と結合した目的成分に特異的に結合する物質を用いて定
量する免疫測定法としては、固相と結合した目的成分に
特異的に結合する物質と目的成分とを反応させ結合させ
た後、該結合物と、標識物質の結合した目的成分に特異
的に結合する第2物質とを反応させ、間接的に固相に結
合した標識物質量を測定する免疫測定法(サンドイッチ
法)、固相と結合した目的成分に特異的に結合する物質
に、目的成分または標識物質の結合した目的成分とを競
合させて結合させ、間接的に固相と結合した標識物質量
を測定する免疫測定法(競合法)があげられる。
と結合した目的成分に特異的に結合する物質を用いて定
量する免疫測定法としては、固相と結合した目的成分に
特異的に結合する物質と目的成分とを反応させ結合させ
た後、該結合物と、標識物質の結合した目的成分に特異
的に結合する第2物質とを反応させ、間接的に固相に結
合した標識物質量を測定する免疫測定法(サンドイッチ
法)、固相と結合した目的成分に特異的に結合する物質
に、目的成分または標識物質の結合した目的成分とを競
合させて結合させ、間接的に固相と結合した標識物質量
を測定する免疫測定法(競合法)があげられる。
【0007】本発明においては、標識物質として、磁性
粒子を目的成分に特異的に結合する第2物質または目的
物質に結合させた磁性体を用い、免疫反応後間接的に固
相と結合した磁性粒子量を水晶発振子を用いて測定する
ことを特徴とする。
粒子を目的成分に特異的に結合する第2物質または目的
物質に結合させた磁性体を用い、免疫反応後間接的に固
相と結合した磁性粒子量を水晶発振子を用いて測定する
ことを特徴とする。
【0008】本発明をサンドイッチ法により行う場合
は、磁性粒子を目的成分に特異的に結合する第2物質に
結合させた磁性体を用い、競合法により行う場合は、磁
性粒子を目的成分に結合させた磁性体を用いる。
は、磁性粒子を目的成分に特異的に結合する第2物質に
結合させた磁性体を用い、競合法により行う場合は、磁
性粒子を目的成分に結合させた磁性体を用いる。
【0009】本発明において試料はどのようなものでも
よいが、血液、尿等の体液を用いることができる。
よいが、血液、尿等の体液を用いることができる。
【0010】目的成分とは、抗原または抗体を表す。抗
原または抗体(被検体)としては、がん胎児性抗原(C
EA)、免疫グロブリン(IgG、IgA、IgM、I
gD、IgE)、補体 (C3、C4、C5、C1
q)、C反応性蛋白質(CRP)、α1 −アンチトリプ
シン、α1 −マイクログロブリン、β2 −マイクログロ
ブリン、ハプトグロブリン、トランスフェリン、セルロ
プラスミン、フェリチン、アルブミン、ヘモグロビンA
1 、ヘモグロビンA1C、ミオグロビン、ミオシン、デュ
パン−2、α−フェトプロテイン(AFP)、組織ポリ
ペプチド抗原(TPA)、アポリポ蛋白A1 、アポリポ
蛋白E、リウマチ因子、抗ストレプトリジンO(AS
O)、フィブリン分解産物(FDP)、フィブリン分解
産物D分画(FDP−D)、フィブリン分解産物D−D
分画(FDP−D Dimer)、フィブリン分解産物
E分画(FDP−E)、アンチトロンビン−III (AT
−III)等の蛋白質、アミラーゼ、前立腺由来酸性ホスフ
ァターゼ(PAP)、神経特異エノラーゼ(NSE)、
フィブリノーゲン、エラスターゼ、プラスミノーゲン、
クレアチンキナーゼ心筋型(CK−MB)等の酵素、イ
ンシュリン、甲状腺刺激ホルモン(TSH)、3,5,3 ´
−トリヨードサイロニン(T3 )、サイロキシン(T
4 )、副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)、生長ホルモ
ン(GH)、黄体化ホルモン(LH)等のホルモン、B
型肝炎ウイルス関連抗体、B型肝炎ウイルス関連抗原、
C型肝炎ウイルス抗体、HTLV(成人T細胞白血病ウ
イルス)抗体、HIV(エイズウイルス)抗体、クラミ
ジア抗体、梅毒の抗体、トキソプラズマ抗体等各種感染
症の原因ウイルスに対する抗体等があげられる。
原または抗体(被検体)としては、がん胎児性抗原(C
EA)、免疫グロブリン(IgG、IgA、IgM、I
gD、IgE)、補体 (C3、C4、C5、C1
q)、C反応性蛋白質(CRP)、α1 −アンチトリプ
シン、α1 −マイクログロブリン、β2 −マイクログロ
ブリン、ハプトグロブリン、トランスフェリン、セルロ
プラスミン、フェリチン、アルブミン、ヘモグロビンA
1 、ヘモグロビンA1C、ミオグロビン、ミオシン、デュ
パン−2、α−フェトプロテイン(AFP)、組織ポリ
ペプチド抗原(TPA)、アポリポ蛋白A1 、アポリポ
蛋白E、リウマチ因子、抗ストレプトリジンO(AS
O)、フィブリン分解産物(FDP)、フィブリン分解
産物D分画(FDP−D)、フィブリン分解産物D−D
分画(FDP−D Dimer)、フィブリン分解産物
E分画(FDP−E)、アンチトロンビン−III (AT
−III)等の蛋白質、アミラーゼ、前立腺由来酸性ホスフ
ァターゼ(PAP)、神経特異エノラーゼ(NSE)、
フィブリノーゲン、エラスターゼ、プラスミノーゲン、
クレアチンキナーゼ心筋型(CK−MB)等の酵素、イ
ンシュリン、甲状腺刺激ホルモン(TSH)、3,5,3 ´
−トリヨードサイロニン(T3 )、サイロキシン(T
4 )、副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)、生長ホルモ
ン(GH)、黄体化ホルモン(LH)等のホルモン、B
型肝炎ウイルス関連抗体、B型肝炎ウイルス関連抗原、
C型肝炎ウイルス抗体、HTLV(成人T細胞白血病ウ
イルス)抗体、HIV(エイズウイルス)抗体、クラミ
ジア抗体、梅毒の抗体、トキソプラズマ抗体等各種感染
症の原因ウイルスに対する抗体等があげられる。
【0011】目的成分に特異的に結合する物質として
は、目的成分に特異的に結合する物質であればどのよう
なものでもよく、例えば目的成分が抗原である場合は該
抗原に対する抗体、目的成分が抗体である場合は該抗体
に対する抗原、目的成分がIgGの場合はプロテインA
等があげられる。
は、目的成分に特異的に結合する物質であればどのよう
なものでもよく、例えば目的成分が抗原である場合は該
抗原に対する抗体、目的成分が抗体である場合は該抗体
に対する抗原、目的成分がIgGの場合はプロテインA
等があげられる。
【0012】抗原に対する抗体とは、試料中の抗原に対
するポリクローナル抗体、試料中の抗原に対するモノク
ローナル抗体等通常抗原に対して反応し得る抗体があげ
られる〔「単クーロン抗体実験マニュアル」,富山朔二
ら編、講談社サイエンティフィック刊,1987年:新
生化学実験講座 第12巻,「分子免疫学 III 抗原、
抗体、補体」,日本生化学会編,東京化学同人社刊,1
992年〕。該抗体は複数の抗体からなるものでもよ
く、抗体を限定分解したもの、蛋白修飾したものでもよ
い。
するポリクローナル抗体、試料中の抗原に対するモノク
ローナル抗体等通常抗原に対して反応し得る抗体があげ
られる〔「単クーロン抗体実験マニュアル」,富山朔二
ら編、講談社サイエンティフィック刊,1987年:新
生化学実験講座 第12巻,「分子免疫学 III 抗原、
抗体、補体」,日本生化学会編,東京化学同人社刊,1
992年〕。該抗体は複数の抗体からなるものでもよ
く、抗体を限定分解したもの、蛋白修飾したものでもよ
い。
【0013】抗体に対する抗原とは、天然の抗原の抗体
結合部位でもよく、遺伝子操作等により人工的に作成さ
れたものでもよい。例えば、被測定抗体が各種感染症の
原因ウイルスに対する抗体である場合、被測定抗体に対
する抗原は上述の感染症のウイルスのマーカー蛋白質等
を用いることができる。該抗原は複数の抗原分子からな
るものでもよく、抗原分子を限定分解したもの、蛋白修
飾したものでもよい。
結合部位でもよく、遺伝子操作等により人工的に作成さ
れたものでもよい。例えば、被測定抗体が各種感染症の
原因ウイルスに対する抗体である場合、被測定抗体に対
する抗原は上述の感染症のウイルスのマーカー蛋白質等
を用いることができる。該抗原は複数の抗原分子からな
るものでもよく、抗原分子を限定分解したもの、蛋白修
飾したものでもよい。
【0014】固相としては水晶発振子または固形物を用
いることができる。固相として固形物を用いる場合は、
例えばプラスチック、シリカ、セラミックス、ガラス、
金属、メンブラン、グラファイト等の固形物に目的成分
と特異的に結合する物質とを、直接結合させるかまたは
必要により担体を介して結合させておけばよい。
いることができる。固相として固形物を用いる場合は、
例えばプラスチック、シリカ、セラミックス、ガラス、
金属、メンブラン、グラファイト等の固形物に目的成分
と特異的に結合する物質とを、直接結合させるかまたは
必要により担体を介して結合させておけばよい。
【0015】固相と目的成分に特異的に結合する物質と
を結合させるために用いる担体としては、ポリアクリル
アミドゲル、セファロース、ポリスチレン、シリコーン
ゴム、ポリビニールアルコール、ナイロン(6,6−ナ
イロン、6−ナイロン)、ポリアクリルアミド、ポリカ
ーボネート、ポリエステル、ポリウレタン、ろ紙等があ
げられ、これらの担体をガラス、シリカ、セラミック、
金属、グラファイト等の固体と結合させて用いることが
できる。また、グルタルアルデヒド処理ポリアクリルア
ミドゲル(Bio−Gel P)、臭化シアン活性化セ
ファロース等の市販品を担体として用いることができ
る。担体と固相との結合方法は常法により行えばよい。
を結合させるために用いる担体としては、ポリアクリル
アミドゲル、セファロース、ポリスチレン、シリコーン
ゴム、ポリビニールアルコール、ナイロン(6,6−ナ
イロン、6−ナイロン)、ポリアクリルアミド、ポリカ
ーボネート、ポリエステル、ポリウレタン、ろ紙等があ
げられ、これらの担体をガラス、シリカ、セラミック、
金属、グラファイト等の固体と結合させて用いることが
できる。また、グルタルアルデヒド処理ポリアクリルア
ミドゲル(Bio−Gel P)、臭化シアン活性化セ
ファロース等の市販品を担体として用いることができ
る。担体と固相との結合方法は常法により行えばよい。
【0016】担体または固相と目的成分に特異的に結合
する物質との結合方法は、目的成分に特異的に結合する
物質はいずれもタンパク質であるため、以下に説明する
方法で結合させる(タンパク質ハイブリッド第3巻,共
立出版,1990年,続生化学実験講座5.免疫生化学
研究法,東京化学同人,1986年)。
する物質との結合方法は、目的成分に特異的に結合する
物質はいずれもタンパク質であるため、以下に説明する
方法で結合させる(タンパク質ハイブリッド第3巻,共
立出版,1990年,続生化学実験講座5.免疫生化学
研究法,東京化学同人,1986年)。
【0017】担体と目的成分に特異的に結合する物質と
の結合は、担体結合法、架橋法(クロロギ酸エチル、グ
ルタルアルデヒドなど)、包括法などにより行えばよ
い。
の結合は、担体結合法、架橋法(クロロギ酸エチル、グ
ルタルアルデヒドなど)、包括法などにより行えばよ
い。
【0018】固相または担体と目的成分に特異的に結合
する物質との結合には、固相への結合が強固な共有結合
方式が一般によく用いられる。とりわけシッフ塩基結合
法、ジアゾ化法、臭化シアン活性化法、アルキル化法な
どはヒンジが抗体活性を損なわず、かつ重合体の生成が
ないので適した結合法である。
する物質との結合には、固相への結合が強固な共有結合
方式が一般によく用いられる。とりわけシッフ塩基結合
法、ジアゾ化法、臭化シアン活性化法、アルキル化法な
どはヒンジが抗体活性を損なわず、かつ重合体の生成が
ないので適した結合法である。
【0019】固相としてガラス、シリカ、セラミック、
金属、グラファイト等を用いる場合は、表面の水酸基
と、シラン試薬(例えばγ−アミノプロピルトリエトキ
シシランなど)により、アルキルアミンを形成し、グル
タルアルデヒドで架橋してタンパクと結合させることが
できる。また固相が金属の場合は、表面の酸化被膜を臭
化シアン処理し、タンパク質と結合させることもでき
る。このような化学的な結合法の他に、目的成分に特異
的に結合する物質としてプロテインA等を用いるときは
蒸着した金表面に強く吸着するプロテインAの性質、ア
ルブミン、グロブリン等を用いるときは、定電位電解に
より電析した白金黒に強く吸着するという該分子の物理
的な性質を利用して結合させてもよい。
金属、グラファイト等を用いる場合は、表面の水酸基
と、シラン試薬(例えばγ−アミノプロピルトリエトキ
シシランなど)により、アルキルアミンを形成し、グル
タルアルデヒドで架橋してタンパクと結合させることが
できる。また固相が金属の場合は、表面の酸化被膜を臭
化シアン処理し、タンパク質と結合させることもでき
る。このような化学的な結合法の他に、目的成分に特異
的に結合する物質としてプロテインA等を用いるときは
蒸着した金表面に強く吸着するプロテインAの性質、ア
ルブミン、グロブリン等を用いるときは、定電位電解に
より電析した白金黒に強く吸着するという該分子の物理
的な性質を利用して結合させてもよい。
【0020】また、ジャーナル オブ マイクロスコ
ピー、1981年,123巻,215頁に記載の方法に
従って金電極表面にレクチン、抗体、ホルモンなどを結
合させてもよい。
ピー、1981年,123巻,215頁に記載の方法に
従って金電極表面にレクチン、抗体、ホルモンなどを結
合させてもよい。
【0021】水晶発振子を固相として用いる場合は、水
晶発振子は金属電極を有するので、前記の金属の固相と
目的物質に特異的に結合する物質との結合法により結合
することができる。該方法においては金属表面を活性化
させるため水晶発振子を0.5〜2規定の水酸化ナトリ
ウム液等の塩基溶液に10〜60分間漬けて水洗し、次
に、0.5〜2規定の塩酸等の酸に数分浸漬する。さら
に1〜100μlの塩酸を電極中央にのせて1〜10分
後に水洗を行う。エタノールで洗浄した後、100〜3
00℃で10〜40分かけて加熱する。温度を下げた
後、目的成分に特異的に結合する物質を容量の半分程度
含む濃度20〜200mM、pH3〜10のリン酸緩衝
液を入れ、次に、2〜10%の塩化ナトリウム等の塩を
含むpH3.5〜5、濃度50〜200mMの酢酸緩衝
液を入れ、目的タンパク質の等電点にpHを調整した
後、数時間放置し担体と結合させればよい。
晶発振子は金属電極を有するので、前記の金属の固相と
目的物質に特異的に結合する物質との結合法により結合
することができる。該方法においては金属表面を活性化
させるため水晶発振子を0.5〜2規定の水酸化ナトリ
ウム液等の塩基溶液に10〜60分間漬けて水洗し、次
に、0.5〜2規定の塩酸等の酸に数分浸漬する。さら
に1〜100μlの塩酸を電極中央にのせて1〜10分
後に水洗を行う。エタノールで洗浄した後、100〜3
00℃で10〜40分かけて加熱する。温度を下げた
後、目的成分に特異的に結合する物質を容量の半分程度
含む濃度20〜200mM、pH3〜10のリン酸緩衝
液を入れ、次に、2〜10%の塩化ナトリウム等の塩を
含むpH3.5〜5、濃度50〜200mMの酢酸緩衝
液を入れ、目的タンパク質の等電点にpHを調整した
後、数時間放置し担体と結合させればよい。
【0022】本発明において、目的物質に特異的に結合
する第2物質としては抗IgG、プロテインA、ビオチ
ン−アビジン結合等、通常サンドイッチ法で用いる第2
抗体があげられる。
する第2物質としては抗IgG、プロテインA、ビオチ
ン−アビジン結合等、通常サンドイッチ法で用いる第2
抗体があげられる。
【0023】本発明において、標識物質として用いる磁
性粒子としてはフェライトやマグネタイト(磁鉄鉱、F
e3 O4 )の粒子が一般に用いられる。マグネタイトは
第一鉄イオンと第二鉄イオンとの反応、あるいは第一鉄
イオンの酸化反応によって得ることができる。
性粒子としてはフェライトやマグネタイト(磁鉄鉱、F
e3 O4 )の粒子が一般に用いられる。マグネタイトは
第一鉄イオンと第二鉄イオンとの反応、あるいは第一鉄
イオンの酸化反応によって得ることができる。
【0024】磁性粒子に、目的物質に特異的に結合する
第2物質または目的物質等のタンパク質を結合させ、標
識された磁性体を得る方法には、直接法と間接法があ
る。直接法はタンパク質を磁性粒子に直接吸着させる
か、あるいは磁性粒子に吸着したタンパク質同志をグル
タルアルデヒドなどで架橋するものであり、間接法は磁
性粒子とタンパク質とを有機高分子(デキストラン、ア
ルブミン、デンプン、ポリアクリルアミド、ポリエチレ
ングリコールなど)を介して行う方法である。
第2物質または目的物質等のタンパク質を結合させ、標
識された磁性体を得る方法には、直接法と間接法があ
る。直接法はタンパク質を磁性粒子に直接吸着させる
か、あるいは磁性粒子に吸着したタンパク質同志をグル
タルアルデヒドなどで架橋するものであり、間接法は磁
性粒子とタンパク質とを有機高分子(デキストラン、ア
ルブミン、デンプン、ポリアクリルアミド、ポリエチレ
ングリコールなど)を介して行う方法である。
【0025】該間接法は磁性粒子に有機高分子を結合さ
せた後、さらにタンパク質と結合させてもよいし、磁性
粒子に有機高分子とタンパク質との結合体を結合させて
もよい。なお、市販のIgG,IgM,IgA、IgH
等の抗体を用いた磁性体(アドバンス・マグネティック
社)を用いてもよい。
せた後、さらにタンパク質と結合させてもよいし、磁性
粒子に有機高分子とタンパク質との結合体を結合させて
もよい。なお、市販のIgG,IgM,IgA、IgH
等の抗体を用いた磁性体(アドバンス・マグネティック
社)を用いてもよい。
【0026】本発明において磁性粒子量を水晶発振子に
より定量する方法としては、水晶発振子の発振周波数の
変化から質量変化を検出する水晶マイクロバランス法、
水晶ラム波デバイス法、表面弾性波法(Surface
Acoustic Wave Sensors)など
がある。水晶マイクロバランス法においては、水晶板
(AT板、BT板など)の両面に金、銀、アルミニウ
ム、銅などの電極をつけたものを水晶発振子として用い
る。水晶発振子にアルキルアミンを結合させるためにパ
ラジウム(Pd)などの貴金属を電着する場合もある。
より定量する方法としては、水晶発振子の発振周波数の
変化から質量変化を検出する水晶マイクロバランス法、
水晶ラム波デバイス法、表面弾性波法(Surface
Acoustic Wave Sensors)など
がある。水晶マイクロバランス法においては、水晶板
(AT板、BT板など)の両面に金、銀、アルミニウ
ム、銅などの電極をつけたものを水晶発振子として用い
る。水晶発振子にアルキルアミンを結合させるためにパ
ラジウム(Pd)などの貴金属を電着する場合もある。
【0027】本発明の測定法を水性媒体中で行う場合
は、水性媒体として水また緩衝液を用いる。水また緩衝
液としては、蒸留水、イオン交換水、生理食塩水または
pH4〜10で濃度範囲が5〜200mM、好ましくは
10〜100mMの緩衝液があげられる。緩衝液として
はリン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、グリシン緩衝
液、ホウ酸緩衝液、酢酸緩衝液、グッドの緩衝液等があ
げられる。なお、水または緩衝液は必要により、塩化ナ
トリウム等の塩、牛血清アルブミン等の安定化剤、アジ
化ナトリウム等の防腐剤、ポリオキシエチレンソルビタ
ンモノラウレート(Tween20)等の界面活性剤を
含有していてもよい。
は、水性媒体として水また緩衝液を用いる。水また緩衝
液としては、蒸留水、イオン交換水、生理食塩水または
pH4〜10で濃度範囲が5〜200mM、好ましくは
10〜100mMの緩衝液があげられる。緩衝液として
はリン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、グリシン緩衝
液、ホウ酸緩衝液、酢酸緩衝液、グッドの緩衝液等があ
げられる。なお、水または緩衝液は必要により、塩化ナ
トリウム等の塩、牛血清アルブミン等の安定化剤、アジ
化ナトリウム等の防腐剤、ポリオキシエチレンソルビタ
ンモノラウレート(Tween20)等の界面活性剤を
含有していてもよい。
【0028】以下に本発明の測定方法を説明する。pH
6〜8、濃度10〜100mMの緩衝液中、0.1〜10
mg/mlの固相と結合した目的成分と特異的に結合す
る物質に、(1)サンドイッチ法の場合は、試料を加え
10〜45℃で、15〜180分間反応させた後、必要
により緩衝液で洗浄し、さらに0.1〜10mg/mlの
磁性体を加え、10〜45℃で、30〜180分間反応
させる。また(2)競合法の場合は、試料と磁性体とを
加え10〜45℃で、10〜180分間反応させる。
6〜8、濃度10〜100mMの緩衝液中、0.1〜10
mg/mlの固相と結合した目的成分と特異的に結合す
る物質に、(1)サンドイッチ法の場合は、試料を加え
10〜45℃で、15〜180分間反応させた後、必要
により緩衝液で洗浄し、さらに0.1〜10mg/mlの
磁性体を加え、10〜45℃で、30〜180分間反応
させる。また(2)競合法の場合は、試料と磁性体とを
加え10〜45℃で、10〜180分間反応させる。
【0029】固相中に補足された磁性体を、必要により
pH6〜8、濃度10〜100mMの洗浄用緩衝液で洗
浄した後、pH2〜3、濃度10〜200mMの磁性粒
子遊離液に漬け磁性粒子を遊離させる。遊離させた磁性
粒子と水晶発振子を共存させることにより水晶発振子の
発振周波数が変化するのでこれを水晶発振器で測定す
る。
pH6〜8、濃度10〜100mMの洗浄用緩衝液で洗
浄した後、pH2〜3、濃度10〜200mMの磁性粒
子遊離液に漬け磁性粒子を遊離させる。遊離させた磁性
粒子と水晶発振子を共存させることにより水晶発振子の
発振周波数が変化するのでこれを水晶発振器で測定す
る。
【0030】また水晶発振子を固相として用いる場合
は、磁性体が固相に間接的に結合後、緩衝液で洗浄した
後、結合前と洗浄後の間における水晶発振子の発振周波
数の変化を測定すればよい。
は、磁性体が固相に間接的に結合後、緩衝液で洗浄した
後、結合前と洗浄後の間における水晶発振子の発振周波
数の変化を測定すればよい。
【0031】洗浄用緩衝液としては1〜100mMの塩
化ナトリウム、塩化カリウム等を含むリン酸緩衝液、生
理食塩水含有リン酸緩衝液があげられ、磁性粒子遊離液
としてはグリシンー塩酸緩衝液等があげられる。
化ナトリウム、塩化カリウム等を含むリン酸緩衝液、生
理食塩水含有リン酸緩衝液があげられ、磁性粒子遊離液
としてはグリシンー塩酸緩衝液等があげられる。
【0032】なお該測定方法が終了後、磁性体と結合し
た目的成分に特異的に結合する第2物質または目的成分
と結合した磁性体を磁石により回収し、再度使用しても
よい。以下に本発明の具体例を説明する。
た目的成分に特異的に結合する第2物質または目的成分
と結合した磁性体を磁石により回収し、再度使用しても
よい。以下に本発明の具体例を説明する。
【0033】
実施例1 (1)検量線用溶液の調製 和光純薬工業製Chromopure ヒト IgG
(whole molecule)を50mMリン酸緩
衝液(pH7.0)に溶かし、10-2〜10-5mg/m
lのヒトIgG溶液を得、検量線用溶液とした。
(whole molecule)を50mMリン酸緩
衝液(pH7.0)に溶かし、10-2〜10-5mg/m
lのヒトIgG溶液を得、検量線用溶液とした。
【0034】(2)ヒトIgGの定量 顕微鏡用ガラススライドプレートを、5%(γ−アミノ
プロピル)トリエトキシシランのPアセトン溶液に漬
け、25℃で1時間放置した。風乾後、o−リング(内
径5mm)をエポキシ樹脂にて接着し、そこに50mM
リン酸緩衝液に5%グルタルアルデヒドを溶かしたもの
(pH7)を入れ、3時間放置した。水洗後、プロテイ
ンA1mg/mlを含むpH7の50mMリン酸緩衝液
を入れ1時間放置し、プロテインAをガラススライドプ
レートに固定した。
プロピル)トリエトキシシランのPアセトン溶液に漬
け、25℃で1時間放置した。風乾後、o−リング(内
径5mm)をエポキシ樹脂にて接着し、そこに50mM
リン酸緩衝液に5%グルタルアルデヒドを溶かしたもの
(pH7)を入れ、3時間放置した。水洗後、プロテイ
ンA1mg/mlを含むpH7の50mMリン酸緩衝液
を入れ1時間放置し、プロテインAをガラススライドプ
レートに固定した。
【0035】得られたプロテインA結合ガラススライド
プレートに対し、残存するグルタルアルデヒドをブロッ
クするための100mMグリシン溶液を加えた後水洗し
た後、pH2.4の100mMグリシン−塩酸緩衝液で
リンスし水洗した。次に、水を切り、試料としての各種
濃度のヒトIgG(10-2〜10-5mg/ml)を含む
50mMリン酸緩衝液(pH7)を入れ1時間放置し
た。次に、50mM塩化ナトリウム溶液を入れ水洗し
た。磁性体と結合した抗IgG(アドバンスドマグネテ
ィック社製Bio Mag Anti−Human I
gG)0.1mg/mlを50mMリン酸緩衝液(pH
7)を加え、2時間放置した後水洗した。最後に100
mMグリシン−塩酸緩衝液(pH2.4)を25μl入
れ、マイクロピペットで水晶発振子(相互薬工業製:未
被覆水晶発振子)のプローブに移した。この操作を2回
繰り返し、50μlの液に対応する発振周波数変化を水
晶発振器(相互薬工業製:ニオイセンサーSF−105
W)で測定した。得られた検量線を図1に示す。
プレートに対し、残存するグルタルアルデヒドをブロッ
クするための100mMグリシン溶液を加えた後水洗し
た後、pH2.4の100mMグリシン−塩酸緩衝液で
リンスし水洗した。次に、水を切り、試料としての各種
濃度のヒトIgG(10-2〜10-5mg/ml)を含む
50mMリン酸緩衝液(pH7)を入れ1時間放置し
た。次に、50mM塩化ナトリウム溶液を入れ水洗し
た。磁性体と結合した抗IgG(アドバンスドマグネテ
ィック社製Bio Mag Anti−Human I
gG)0.1mg/mlを50mMリン酸緩衝液(pH
7)を加え、2時間放置した後水洗した。最後に100
mMグリシン−塩酸緩衝液(pH2.4)を25μl入
れ、マイクロピペットで水晶発振子(相互薬工業製:未
被覆水晶発振子)のプローブに移した。この操作を2回
繰り返し、50μlの液に対応する発振周波数変化を水
晶発振器(相互薬工業製:ニオイセンサーSF−105
W)で測定した。得られた検量線を図1に示す。
【0036】実施例2 (1)検量線用溶液の調製 和光純薬工業製Chromopure ヒト IgG
(whole molecule)を50mMリン酸緩
衝液(pH7.0)に溶かし、10-2〜10-5mg/m
l溶液を得、検量線用溶液とした。
(whole molecule)を50mMリン酸緩
衝液(pH7.0)に溶かし、10-2〜10-5mg/m
l溶液を得、検量線用溶液とした。
【0037】(2)ヒトIgGの定量 水晶発振子(相互薬工業製未被覆水晶発振子)を1N水
酸化ナトリウムに20分浸漬し、水洗後1N塩酸に5分
間浸せきした。次に、濃塩酸0.1mlを金電極に均等
に塗り、2分後水洗し、エタノールで洗い、200℃で
20分間乾燥した。乾燥器から取り出し、水晶振動子プ
ローブに固定し、直ちに、1mg/mlプロテインAを
含む50mMリン酸緩衝液(pH7.2)50μlを注
入した。次に、5%塩化ナトリウムを含む100mM酢
酸ナトリウム緩衝液(pH4.5)50μlを注入し、
2時間放置し、金電極表面にプロテインAを固定した。
酸化ナトリウムに20分浸漬し、水洗後1N塩酸に5分
間浸せきした。次に、濃塩酸0.1mlを金電極に均等
に塗り、2分後水洗し、エタノールで洗い、200℃で
20分間乾燥した。乾燥器から取り出し、水晶振動子プ
ローブに固定し、直ちに、1mg/mlプロテインAを
含む50mMリン酸緩衝液(pH7.2)50μlを注
入した。次に、5%塩化ナトリウムを含む100mM酢
酸ナトリウム緩衝液(pH4.5)50μlを注入し、
2時間放置し、金電極表面にプロテインAを固定した。
【0038】100mMリン酸緩衝液(PBS)で水晶
振動子を洗浄後、5%牛アルブミンを含む100mMリ
ン酸塩緩衝液を注入し、20分放置し、そこに、試料と
しての検量線用IgG溶液2μlを注入し、ゆるやかに
かきまぜた後、安定した発振周波数を読みとった。次
に、磁性体と結合した抗IgG(アドバンスドマグネテ
ィック社製Bio Mag Anti−Human I
gG)を50mMリン酸緩衝液に1mg/ml溶かした
ものを2μl加え、1時間放置した。十分水洗後、一端
水をマイクロピペットで切り、次に水50μlを加え、
共振周波数を読みとった。得られた検量線を図1に示
す。
振動子を洗浄後、5%牛アルブミンを含む100mMリ
ン酸塩緩衝液を注入し、20分放置し、そこに、試料と
しての検量線用IgG溶液2μlを注入し、ゆるやかに
かきまぜた後、安定した発振周波数を読みとった。次
に、磁性体と結合した抗IgG(アドバンスドマグネテ
ィック社製Bio Mag Anti−Human I
gG)を50mMリン酸緩衝液に1mg/ml溶かした
ものを2μl加え、1時間放置した。十分水洗後、一端
水をマイクロピペットで切り、次に水50μlを加え、
共振周波数を読みとった。得られた検量線を図1に示
す。
【0039】
【発明の効果】 本発明により高い検出感度を持ち、抗
原や抗体が再利用できる水晶発振子を用いた免疫測定法
が提供される。
原や抗体が再利用できる水晶発振子を用いた免疫測定法
が提供される。
【図1】実施例1および実施例2の測定方法により得ら
れたヒトIgGの検量線。
れたヒトIgGの検量線。
─●─ 実施例1の検量線。 ─■─ 実施例2の検量線。
Claims (1)
- 【請求項1】 試料中の目的成分を、固相と結合した目
的成分と特異的に結合する物質を用いて定量する免疫測
定法において、標識物質として磁性粒子を用い、磁性粒
子量を水晶発振子の発振周波数の変化を測定することに
より定量することを特徴とする方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP1872294A JPH07225233A (ja) | 1994-02-15 | 1994-02-15 | 水晶発振子を用いる免疫測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP1872294A JPH07225233A (ja) | 1994-02-15 | 1994-02-15 | 水晶発振子を用いる免疫測定法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH07225233A true JPH07225233A (ja) | 1995-08-22 |
Family
ID=11979560
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP1872294A Pending JPH07225233A (ja) | 1994-02-15 | 1994-02-15 | 水晶発振子を用いる免疫測定法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH07225233A (ja) |
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2005015217A1 (ja) * | 2003-08-11 | 2005-02-17 | Kyowa Medex Co., Ltd. | 測定対象物測定器具、測定装置および測定方法 |
JP2007003411A (ja) * | 2005-06-24 | 2007-01-11 | Sekisui Chem Co Ltd | ヘモグロビンA1cの測定方法及びヘモグロビンA1c測定用キット |
WO2007018187A1 (ja) * | 2005-08-05 | 2007-02-15 | Kyowa Medex Co., Ltd. | 測定器具及びこれを用いた測定用キット、測定方法、測定装置並びに圧電振動子の再生方法 |
US7407814B2 (en) | 2000-08-09 | 2008-08-05 | California Institute Of Technology | Active NEMS arrays for biochemical analyses |
US7632688B2 (en) | 2003-04-16 | 2009-12-15 | Sekisui Chemical Co., Ltd. | Particle having magnetic material incorporated therein, process for producing the same, particle for immunoassay and method of immunoassay |
JP2014006208A (ja) * | 2012-06-27 | 2014-01-16 | Nippon Dempa Kogyo Co Ltd | 感知方法 |
JP2017187476A (ja) * | 2016-03-31 | 2017-10-12 | 東ソー株式会社 | 変性抗体測定方法 |
-
1994
- 1994-02-15 JP JP1872294A patent/JPH07225233A/ja active Pending
Cited By (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7407814B2 (en) | 2000-08-09 | 2008-08-05 | California Institute Of Technology | Active NEMS arrays for biochemical analyses |
US7989198B2 (en) | 2000-08-09 | 2011-08-02 | California Institute Of Technology | Active NEMS arrays for biochemical analyses |
US8329452B2 (en) | 2000-08-09 | 2012-12-11 | California Institute Of Technology | Active NEMS arrays for biochemical analyses |
US7632688B2 (en) | 2003-04-16 | 2009-12-15 | Sekisui Chemical Co., Ltd. | Particle having magnetic material incorporated therein, process for producing the same, particle for immunoassay and method of immunoassay |
WO2005015217A1 (ja) * | 2003-08-11 | 2005-02-17 | Kyowa Medex Co., Ltd. | 測定対象物測定器具、測定装置および測定方法 |
JPWO2005015217A1 (ja) * | 2003-08-11 | 2006-10-05 | 協和メデックス株式会社 | 測定対象物測定器具、測定装置および測定方法 |
JP2007003411A (ja) * | 2005-06-24 | 2007-01-11 | Sekisui Chem Co Ltd | ヘモグロビンA1cの測定方法及びヘモグロビンA1c測定用キット |
WO2007018187A1 (ja) * | 2005-08-05 | 2007-02-15 | Kyowa Medex Co., Ltd. | 測定器具及びこれを用いた測定用キット、測定方法、測定装置並びに圧電振動子の再生方法 |
JP2014006208A (ja) * | 2012-06-27 | 2014-01-16 | Nippon Dempa Kogyo Co Ltd | 感知方法 |
JP2017187476A (ja) * | 2016-03-31 | 2017-10-12 | 東ソー株式会社 | 変性抗体測定方法 |
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20030325 |