KR100206159B1 - 자성입자 및 그것을 사용한 면역측정법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 유기고분자를 핵으로 하고, 그 표면에 주로 페라이트를 피복한 자성입자와 그 표면에 항원 또는 항체가 결합된 입자 및 그것을 사용한 면역측정법에 관한 것이다. 본 발명은 균일한 직경을 갖는 입자를 제공해 줄 뿐만 아니라, 항원 또는 항체의 결합상태가 대단히 양호한 입자를 제공해준다. 또한, 본 발명의 입자는 장기간동안 안정하므로, 장기 보존할 수 있는 등의 잇점이 있다. 이러한 특징을 갖는 입자를 면역측정법에 이용하므로서 측정의 신속화 또 고감도화에 기여할 수가 있다.

Description

자성 입자 및 그것을 사용한 면역 측정법
제1도는 페라이트 피복 입자와 어드밴스드 마그네틱사(Advanced Magnetics Inc.) 입자를 사용한 CEA 검정의 결과.
제2도는 페라이트 피복 입자의 자기(磁氣) 분리 속도를 표시한 도면.
본 발명은 자성 입자 및 그것을 사용하는 면역 측정법에 관한 것이다. 더 상세하게는 본 발명은 핵이 유기 고분자이며 표면이 산화철계의 페라이트 피복층을 가지는, 항원 또는 항체가 결합된 직경 0.2-3㎛의 자성 입자, 및 그것을 사용하는 면역 측정법에 관한 것이다.
면역 측정법, 특히 효소 면역 측정법에 있어서는, 고체상의 큰 직경을 가지는 비이드(bead)를 사용하는 대신 입경이 작은 라텍스 입자 등을 사용하는 것이 고감도로 면역 반응을 행할 수 있다는 점에서 유리하다. 그러나, 입경이 작은 입자를 사용하였을 경우는 결합물/유리물(Bound/Free) 분리를 행하는 데 있어서, 원심 분리기를 사용하든가, 또는 필터에 의한 여과를 행해야 하므로 이 방법은 간편한 방법이라고 할 수 없다. 따라서 효율이 좋고 또 간편하게 결합물/유리물 분리를 행하는 방법으로서, 입경이 작은 자성 입자를 사용하는 방법에 제안되었다. 이 방법으로서는 예를 들어, 마그네타이트를 핵으로 하여 실란을 피복한 입경 1.0-10.0㎛의 입자를 사용하는 면역 측정법(일본국 특허 공개(소) 제55-141670호 및 특 제50-122997호 참조), 및 자성 금속 산화물을 핵으로 하여 실란을 피복한 입경 0.1-1.5㎛의 입자를 사용하는 면역 측정법(일본국 특허 공개(소) 제60-1564호 참조) 등이 공지되어 있다. 이들 자성 입자의 핵은 자성 금속이고, 그 표면의 피복에 실란을 사용하고 있다.
이들 자성 금속을 핵으로 하는 입자는 입자 크기의 균일성이 부족하고, 또, 철의 용출이 나타나며 장기 보존에 대한 안정성이 낮은 결점을 가지고 있었다. 그로 인해 이들 입자를 사용한 면역 측정법은 측정 결과의 재현성이 낮으며, 사용하는 측정 시약의 장기 보존이 불가능하였다.
본 발명자들은 이러한 문제점을 해결하기 위하여, 연구를 거듭하여 핵이 유기 고분자이며 표면이 산화철계의 페라이트 피복층을 가지는 직경 0.2-3㎛의 입자에 항원 또는 항체를 결합시킨 자성 입자를 제조하였고, 그것을 면역 측정법에 사용하였던 바, 재현성이 높은 측정 결과를 얻을 수 있었다. 또한, 그 자성 입자가 장기간 동안 안정하므로, 장기 보존을 할 수 있는 잇점이 있었다. 또, 본 발명의 자성 입자는 원하는 대로 재현성을 더 높일 수 있다.
본 발명의 자성 입자는 핵으로서 유기 고분자를 사용하고, 거기에 산화철계의 페라이트 피복을 하고, 얻어진 자성 입자에 항원 또는 항체를 결합시킴으로써 제조할 수 있다. 유기 고분자로는 폴리스티렌 또는 (메타)아크릴산 에스테르류로부터의 하나 이상의 고분자를 사용할 수 있다.
(메타)아크릴산 에스테르류로는 예를 들어 (메타)아크릴산 2-히드록시에틸, (메타)아크릴산 2-히드록시프로필, (메타)아크릴산 1-메틸-2-히드록시에틸, 모노메타크릴산 글리세롤, 2-아크릴아미드-2-메틸프로판설폰산, 메타크릴산 2-설포에틸, 2-히드록시에틸 메타크릴레이트 산 포스페이트, (3-클로로-2-히드록시프로필메타크릴레이트) 산 포스페이트, 2-프로페논산 2-메틸-3(포스포녹시)프로필 에스테르, (메타)아크릴산에틸, (메타)아크릴산 n-부틸, (메타)아크릴산 i-부틸, (메타)아크릴산 2-에틸헥실, 메타크릴산라우릴, 메타크릴산시클로헥실, (메타)아크릴산아미드, N-메틸롤아크릴아미드, N-부톡시메틸아크릴아미드, (메타)아크릴산글리시딜, (메타)아크릴산메틸글리시딜 등을 사용할 수 있다.
이들 모노머를 사용하여 중합시키는 방법으로 유화중합 또한 다단계 유화중합을 이용할 수 있다. 유화 중합법으로서는 중합 배합물의 전부를 일시에 넣어서 중합하는 방법, 모노머의 일부와 모노머 이외의 배합물로 선행 중합을 하고, 그것에 나머지 모노머를 연속적으로 첨가하면서 중합시키는 모노머 첨가법 및 중합 배합물을 미리 유화시켜 놓고, 그 일부를 선행 중합시킨 다음 나머지 에멀젼을 연속적으로 첨가하여 중합을 진행시키는 에멀젼 첨가법이 알려져 있다. 또, 새로운 라텍스 입자를 생성시키지 않고 핵(seed) 라텍스 입자를 단계적으로 성장시키는 다단계 유화 중합법이 알려져 있다. 이들의 중합 방법은 모노머의 성질, 중합열제거의 난이성, 라텍스의 평균 입경 및 입경의 분포 등을 고려하여 선택할 수 있다.
이들 중합 반응에 있어서는 라디칼 개시제로서 벤조일퍼옥사이드, 라우로일퍼옥사이드, 쿠멘하이드로퍼옥사이드, 디-t-부틸퍼옥사이드 등의 유기 과산화물계 개시제, α, α'-아조비스이소부티로니트릴 등의 니트릴계 개시제 등이 사용된다. 또한, 과황산칼륨, 과황산암모늄, 과산화수소 등, 및 산화 환원 중합 촉매를 사용하여도 좋다. 유화 중합에 있어서 사용할 수 있는 유화제로는 이온성 활성제인 음이온 활성제, 양이온 활성제 및 양성 활성제, 비이온 활성제 등이 있다.
다음은, 상기 방법에 의하여 얻어진 유기 고분자의 핵에 대하여 페라이트 피복을 행하고 페라이트 피복 입자를 형성하는 것이다.
페라이트 피복은 핵체 입자가 혼합된 수용액 중에서 실시된다. 수용액 중에는 페라이트막 형성에 필수인 제1철 이온이 존재한다. 제1철 이온은 제1철의 염산염, 황산염, 아세트산염 등의 염의 형태로 수용액 중에 존재한다. 수용액이 금속 이온으로서 제1철 이온만을 함유할 경우에는 금속 원소로서 철판을 함유하는 스피넬 페라이트, 즉, 마그네타이트 Fe3O4의 막으로서 얻어진다. 또 수용액 중에는 제1철 이온 이외에 기타의 전이 금속 이온 Mn+를 함유하여도 좋다. 이타의 금속 이온종으로서는 아연, 코발트, 니켈, 망간, 구리, 바나듐, 안티몬, 리튬, 몰리브덴, 티탄, 루비듐, 알루미늄, 실리콘, 크롬, 주석, 칼슘, 카드뮴, 인듐 등이 예시된다. Mn+가 코발트인 경우에는 코발트 페라이트(CoXFe3-XO4), 니켈의 경우에는 니켈 페라이트(NiXFe3-XO4)가 얻어지고, Mn+가 복수종의 경우에도 혼정(混晶) 페라이트가 얻어진다. 이들의 제1철 이온 이외의 금속 이온종도 각각 수용성 염의 형태로 수용액 중에 존재한다.
본 발명에서는, 제1철 이온과 핵체 입자를 혼입한 탈산소 수용액에 산화제 용액을 첨가함으로써 페라이트 피복의 형성이 시작된다. 산화제의 예로는 아질산염, 질산염, 과산화수소, 유기 과산화물, 과염소산, 또는 용존 산소수 등을 들 수 있다. 바람직하게는 산화제의 수용액을 분석 화학에서의 적정법과 같이 일정량으로 용액중에 적하하는 것이 바람직하다. 이와 같이, 일정량의 적하에 의하면, 페라이트막 두께의 조정이 용이하게 행하여진다.
수용액의 pH는 수용액 중에 존재하는 음이온, 금속 이온의 종류에 따라서 적당히 선택되고, 조절되지만, 바람직하게는 6-11, 가장 바람직하게는 7-11의 범위가 적당하다. pH의 안정화를 위해, 예를 들어 아세트산암모늄 등의 완충액 또는 완충효과가 있는 염을 가하여도 좋다.
본 발명의 반응을 실행하기 위한 온도 조건은 수용액의 비점 이하의 범위이면 가능하지만, 바람직한 것은 60-90℃의 범위에서 행하는 것이다. 또, 반응은 본질적으로 탈산소 분위기하에 행하여진다. 산소가 다량으로 존재하는 조건하에서는 불필요한 산화 반응이 진행되므로 바람직하지 못하다. 구체적으로는 질소 분위기 하에서 반응을 행하는 것이 바람직하다. 또, 마찬가지로 수용액에서도 산소를 제거하고, 탈산소 수용액으로 한다.
본 발명의 바람직한 방법은 우선 탈산소수에 입자상 물질을 현탁하고, 이때, 필요에 따라 계면활성제 등의 첨가제를 첨가하여 입자상 물질의 물에 대한 용해도를 향상시켜도 좋다. 이어서, 필요에 따라 pH 조정을 위하여 pH 완충제 등을 혼입하고 다시 제1철 이온을 염의 형태로 혼입한다. 또, 필요에 따라 다른 금속 이온을 제1철 이온과 동시에 혼입한다. 모든 것의 혼입이 끝난 상태에서, 전술한 바와 같이, 적정법에 의하여 산화제 용액을 용액 중에 첨가함으로써 반응을 진행시킨다. 이 공정에서는 금속 이온 종류 또는 산화제의 농도에 따라, 페라이트막의 두께가 조정되므로, 매우 바람직하다. 얻어진 페라이트 피복은 입자상 물질을 여과함으로써 분리시키고 건조시켜 목적물을 얻는다.
[고분자량 화합물 또는 실란으로 처리된 입자의 제조 방법]
본 발명에 사용되는 자성 입자는 고분자량 화합물 또는 실란으로 처리하여 사용할 수도 있다. 고분자량 화합물로는, 예를 들면, 나일론 또는 폴리스티렌을 사용할 수 있다. 예를 들어, 실란 처리의 방법으로는 산성수성 실란화법이 사용된다. 우선, 페라이트 피복 입자와 실란 모노머를 산성 용액 중에서 혼합하고, 이어서, 실온 내지 95℃에서 가열함으로써 달성된다. 사용하는 실란 모노머로는, 예를 들어 p-아미노페닐트리메톡시실란, 3-아미노프로필트리메톡시실란, N-2-아미노메틸-3-아미노프로필트리메톡시실란, 트리아미노관능성실란(H2NCH2CH2-NHCH2CH2-NHCH2CH2-Si-(OCH3)3), n-도데실트리에톡시실란 및 n-헥실트리메톡시실란 등의 오르가노실란을 사용할 수 있다. 또, 실란의 말단 아미노기를 카르복실기로 전환시키기 위하여, 실란 처리된 입자에 산무수물을 상온에서 반응시킬 수 있다. 또, 나일론의 처리에 있어서는 1%의 탄산나트륨 수용액에 페라이트 피복 입자를 현탁시키고, 헥사메틸렌디아민의 적당량을 용해시키고, 이 용액에 5배 용량의 8% 트윈(Tween) 80을 함유하는 헥산클로로포름 혼합액(3:1)을 혼합하고, 이어서, 초음파 처리하여 에멀젼을 형성시킨다. 여기에 헥사메틸렌디아민과 등몰의 세바코일 디클로라이드를 함유하는 상기와 동일한 헥산클로로포름 혼합액을 적하함으로써 목적하는 입자를 얻을 수 있다. 또, 폴리스티렌에 있어서도, 당업자에 용이한 방법을 이용하여 처리할 수 있다. 다시, 나일론, 폴리스티렌의 고분자 수지 용액을 분무 피복, 또는 침지 피복 등의 방법에 의하여 자성 입자를 직접 피복할 수 있다.
본 발명은 전술한 방법에 의하여 얻어진 페라이트 피복 입자 및 고분자량 화합물 또는 실란 처리된 입자에 항원 또는 항체를 결합시켜 얻어지는 자성 입자에 관한 것이다. 사용하는 항체로는 약제, 예를 들면 테오필틴, 페니토인, 발프로산; 저분자 호르몬, 예를 들어 티록신, 에스트로겐, 에스트라디올; 암 마커(marker), 예를 들면 CEA, AFP; 바이러스 항원, 예를 들어 HIV, ATLA, HBV; 고분자 호르몬, 예를 들어 TSH, 인슐린; 사이토킨, 예를 들어 IL-1, IL-2, IL-6; 각종 성장 인자, 예를 들어 EGF, PDGF; 또 상기 바이러스의 적당한 DNA, RNA 등에 대한 항체가 있다. 또, 사용하는 항원으로는 바이러스, 예를 들어 HIV, ATLA, HBV; 상기 바이러스의 DNA; 고분자 호르몬, 예를 들어 인슐린, TSH 등이 있다.
입자에의 결합 방법으로는 물리흡착법 또는 화학결합법을 이용할 수 있다. 물리흡착법은 적당한 완충액 중에서 상기 입자와 항원 또는 항체를 반응시킴으로써 행하는 것이다. 이 반응에 사용하는 완충 용액으로는 인산염 완충액, 트리스-염산염 완충액, 탄산염 완충액 등이다. 반응은 상기 두가지를 실온에서 혼합함으로써 용이하게 진행하고, 목적물을 얻을 수 있다. 또, 화학 결합법은 소위 펩티드 결합법에서의 카르보디이미드법을 이용할 수 있다. 예를 들어 반응을 행함에 있어서 0.1-5%의 실란 처리된 입자의 분산액에 대하여 등량의 수용성 카르보디이미드를 산성하(pH 4-6)에서 가하고, 실온에서 10분-1시간 반응시키고, 상등액을 제거한 후, 0.01-10.0mg/ml, 바람직하게는 0.1-5mg/ml의 항체 또는 항원 용액을 가함으로써 결합시킬 수 있다. 이때 사용하는 완충액은 인산 완충액을 사용하는 것이 바람직하다. 또 기타의 화학결합법으로서는 글루타르알데히드나 염화시아누르 등의 2가 가교 시약의 존재하에 행하는 방법도 이용할 수 있다[펩티드 합성법, 마루젠주식회사 출판(소화 50년 발행), 및 효소 면역 측정법, 코리츠출판주식회사 출판, 단백질 핵산 효소 별책 제31호(1987년) 참조].
이상과 같이 하여 제조된 자성 입자는 일정한 입경을 유지하고 있었다. 이 입자는 적당한 단백질 용액, 예를 들어 BSA, 글로불린 등의 용액 중에 1년간 보존하여도 변화하지 않았다.
또, 본 발명에서의 자성 입자는 0.2㎛ 이상 3㎛ 이하의 직경을 갖는다. 입자 직경이 3㎛을 초과하면 면역 반응에 사용하였을 경우, 부유 시간이 짧고, 충분한 반응을 행할 수가 없으므로 바람직하지 않다. 또, 입자 직경이 0.2㎛ 미만이 되면, 면역 반응 후의 자기 분리 효율이 바람직하지 않게 된다.
[면역 측정법]
본 발명에서의 면역 측정법으로 방사 면역 측정법, 효소 면역 측정법을 사용할 수 있다. 이들 측정법은 표지물을 사용하는 면역 측정법이며, 샌드위치법 또는 경쟁법에 의하여 목적하는 항원 또는 항체를 측정할 수 있다.
본 발명에 있어서의 효소 면역 측정법은 예를 들어, 항체 결합 자성 입자와 효소 표지 항체와 검체를 10분 내지 3시간 반응시켜 행하는 것이다. 반응 실시시의 반응 온도는 4-40℃이며, 바람직하게는 25-38℃이다. 미반응 효소 표지 항체를 세척한 후, 고체상에 결합된 항체 결합 효소의 양을 효소 기질에 가하여 활성을 측정함으로써 검체 중 리간드의 양을 정량할 수 있다. 본 방법에 사용할 수 있는 효소는 퍼옥시다제, 알칼리포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코스옥시다제 등이다. 이때 기질은 사용된 효소에 적합한 것을 사용하며, 예를 들어, ABTS, 루미놀-H2O2(퍼옥시다제용), p-니트로페닐포스페이트, 메틸움베릴페릴포스페이트, 3-(2'-스피로-트리시클로[3.3.1.13,7]데칸)-4-메톡시-4-(3-포스포릴옥시)페닐-1,2-디옥세탄 이나트륨염(알칼리포스파타제용), p-니트로페닐-β-o-갈락토스, 메틸움베릴페릴-β-o-갈락토스(β-갈락토시다제용) 등을 사용할 수 있다. 측정은 실온 내지 40℃에서 1분 내지 18시간 동안 반응시킨 후, 나타나는 발색, 형광 또는 발광량을 측정함으로써 행하는 것이다. 효소 발광 반응외의 측정은 4-40℃ 범위에서 가온하면서 행하는 소위 레이트(rate)법을 이용할 수도 있다.
또, 면역 측정법의 방사 면역 측정법은 상기 효소 표지 대신125I 등의 방사성 동위 원소를 표지물로 하여 행하는 것이다. 방사능을 측정하는 것을 제외하고는 조작이 상기 효소 면역 측정법의 경우와 완전히 같다.
또, 항원 또는 항체의 방사능 표지는 이미 시판되고 있는 볼튼-헌터(Bolton-Hunter) 시약에 의하여 용이하게 제조할 수 있다. 예를 들어, 0.1M 탄산수소나트륨 수용액에 용해된 항원 또는 항체 용액에 이 볼튼-헌터 시약을 가하고 1-2시간 후에, G-25의 탈염 컬럼 등을 사용하여 미반응의 볼튼-헌터 시약을 제거함으로써 제조할 수 있다. 이외에, 클로라민 T법이나 요오드법 등을 이용함으로써 용이하게125I의 방사 표지를 행할 수 있다. 면역 반응을 행함에 있어서는 본 발명의 자성 입자에 시료를 가하고, 4-40℃, 바람직하게는 20-38℃에서 1-18시간 반응시키는 것이다. 이 다음, 생리 식염수 또는 증류수로 세척하고, 방사 표지 항체를 자성 입자에 가하고, 4-40℃, 바람직하게는 20-38℃에서 1-18시간 반응시키고, 생리 식염수 또는 증류수로 세척하고, 그 방사능 활성을 측정하는 것이다. 측정에는 신틸레이션 카운터를 사용할 수 있다.
또 본 발명의 측정법은 이소루미놀이나 아크리딘 에스테르 등을 표지한 화학발광 측정법, 플루오레스세인이나 로다민으로 표지한 형광 면역 측정법으로 행할 수도 있다. 이때, 표지물의 표지는 활성화 에스테르법이나 이소시아네이트법을 이용함으로써 용이하게 행할 수 있다[효소 면역 측정법(의학서원, 1987년) 참조].
마찬가지로 항체의 측정은 본 발명의 자성 입자를 사용하고, 그 시료와 그 입자를 혼합하여 실온 내지 37℃에서 1분 내지 18시간 동안 반응시킨 후 생리 식염수 또는 증류수로 세척하고 다시 표지한 항-인간 면역 글로불린 항체를 가하고, 실온 내지 37℃에서 1분 내지 18시간 동안 반응시킨 후, 세척하고, 표지물의 활성을 측정함으로써 행하여진다.
본 발명은 유기 고분자를 핵으로 하고 그 표면에 주로 페라이트층을 피복한 자성 입자와, 그 표면에 결합된 항원 또는 항체로 이루어진 입자에 관한 것이다. 이 입자는 면역 측정법의 고체상으로 사용할 수 있다.
다음의 실시예로서 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
[실시예 1]
유기 고분자 입자의 제조
교반기, 온도계, 모노머 적하 로드, 환류 냉각기, 가열 장치, 질소 가스 도입관을 가지는 중합 반응 용기에 이온 교환수 230부를 넣고, 80℃에서 스티렌, 아크릴산 2-에틸헥실 및 에틸렌글리콜 디메타크릴레이트의 80/10/10의 혼합 모노머(A) 1부와 10%의 과황산암모늄 수용액 10부를 가한 후, 사기 혼합 모노머(A) 99부를 3시간 동안 적하하여 라텍스를 얻었다. 입자를 전자 현미경으로 관찰하였던 바, 입자는 대개 단분산이고, 입경은 0.3㎛이었다.
페라이트 피복 입자의 제조
교반기, 온도계, 산화제 적하 로드, 가열 장치, 질소 가스 도입관을 가지는 자성체 생성 장치에 상기 에멀젼(고형분 30%) 100부를 넣고, N2가스를 도입하여 핵 에멀젼 중의 산소를 탈기시켰다.
이어서, 미리 준비한 염화제1철 용액 100부(고형분 40부), 아세트암모늄 150부(고형분 75부)를 장치내에 투입하고, 충분하게 교반 혼합하면서 70℃로 가온하였다. 그 후 교반을 계속하면서 암모니아수로 pH를 7.2로 조절하였다.
이 용액에 아질산나트륨 용액 150부(고형분 15부)를 약 1시간에 걸쳐 적하하였다. 적하 반응 중 질소 가스를 도입하고, 교반을 계속하면서 용액 온도 70℃, pH 7.0-7.2의 범위를 유지하여 입자 표면에 페라이트 피복을 형성하였다. 약 20분 후, 용액을 냉각하여 여과하고, 이온 교환수로 세척을 반복한 후 페라이트 피복 입자를 얻었다.
[실시예 2]
항 TSH 마우스 IgG 결합 자성 입자의 제조
실시예 1에서 제조한 5% 페라이트 피복 입자 분산 수용액(20mM 인산 완충액, pH 3.5) 4ml에 항 TSH 마우스 IgG(5mg/ml) 1ml를 가하고, 엔드 오버 엔드(end-over-end) 믹서로 실온에서 하룻밤 교반하였다. 이 입자 분산액을 표면이 3000 가우스인 자석으로 상등액과 입자로 분리한 후, 상등액을 제거하고, 2% BSA 용액(0.1M 트리스-염산, 1mM 염화마그네슘, 0.1mM 염화아연, pH 7.5)으로 5회 세척하고, 동일한 BSA 용액에 5ml에 분산시켜 자성 입자를 제조하였다.
[실시예 3]
항 CEA 마우스 IgG 결합 자성 입자의 제조
실시예 1에서 제조한 5% 페라이트 피복 입자 분산 수용액(20mM 인산 완충액, pH 3.5) 4ml에 항 CEA 마우스 IgG(5mg/ml) 1ml를 가하고, 엔드 오버 엔드 믹서로 실온에서 하룻밤 교반하였다. 이 입자 분산액을 표면이 3000 가우스인 자석으로 상등액과 입자로 분리한 후, 상등액을 제거하고, 2% BSA 용액(0.1M 트리스-염산, 1mM 염화마그네슘, 0.1mM 염화아연, pH 7.5)으로 5회 세척하고, 동일한 BSA 용액에 5ml에 분산시켜 자성 입자를 제조하였다.
[실시예 4]
카르복실화 페라이트 입자의 제조
카르복실화 페라이트 입자는 미리 초음파 세척기[배트(batt)형, 니혼 세이끼세이사꾸쇼제]를 사용하여 증류수를 60초씩 5회 세척한 실시예 1의 페라이트 피복입자(핵 평균 입경 0.3㎛의 폴리스티렌) 5g에 3-아미노프로필트리에톡시실란 50ml를 가하고, 다시 빙냉 아세트산 30ml를 첨가하고, 실온하에서 3시간 반응시키고, 세척 후 무수글루타르산을 반응시켜 얻을 수 있다. 빙냉 아세트산은 빙냉하에 교반하면서 적하하고 세척은 증류수, 메탄올, 증류수로 각각 3회씩 세척하고 다시, 0.1M 탄산수소나트륨 용액 300ml 씩으로 5회 세척하였다. 무수 글루타르산과의 반응은 입자의 5wt%(0.1M 탄산수소나트륨 용액) 100ml에 무수 글루타르산 2.85g을 가하고, 10분간 반응시켰다. 반응 종료 후, 0.1M 탄산수소나트륨 용액 300ml씩으로 3회 세척하고, 다시 증류수로 5회 세척하여 카르복실화 페라이트 입자로서 사용하였다.
[실시예 5]
항 TSH 결합 카르복실화 페라이트의 제조
20mM 인산 완충액(pH 4.5) 5ml에 실시예 4에서 제조한 카르복실화 페라이트 입자 50mg을 분산시키고, 여기에 수용성 카르보디이미드 50mg을 가하였다. 실온에서 20분간 반응시킨 후, 상등액을 제거하고, 항 TSH 마우스 IgG 용액(1mg/ml, 0.02M 인산 완충액, pH 4.5) 5ml를 가하고, 엔드 오버 엔드 믹서로 교반하였다. 2시간 후, 이 입자를 2% BSA 용액(0.1M 트리스-HCl, 1mM MgCl2, pH 7.5)으로 5회 세척하고, 이것을 같은 BSA 용액에 분산시켜 항 TSH-마우스 IgG 감작 카르복실화 페라이트 입자를 얻었다.
[실시예 6]
항 TSH 감작 페라이트 입자에 의한 TSH 검정
TSH를 15μl 함유하는 시료(0.10μU/ml)에 항 TSH Fab'를 결합시킨 알칼리 포스파타제 콘쥬게이트 20μl(콘쥬게이트 농도 0.5mg/ml, 0.1M 트리스-염산, 2% BSA, 1mM MgCl2, 0.1mM ZnCl2, pH 7.5)를 혼합하고, 여기에 실시예 2에서 제조한 항 TSH 마우스 IgG를 코팅한 페라이트 입자 500μl(002% 용액)를 혼합하고, 실온하에 20분간 방치하였다. 상기 혼합물을 포함하는 튜우브를 표면 자장이 3000 가우스인 자석에 접촉시켜 페라이트 입자를 집자(集磁)시키고, 상등액을 디캔테이션(기울여 따라내기)에 의하여 제거하였다. 그 후 0.04% 생리 식염수 1ml를 가하여 교반하였다. 이 튜우브를 전술한 자석에 접촉시키고, 상등액을 디캔테이션에 의하여 제거하였다. 이 조작을 3회 반복하였다. 이 입자를 포함하는 튜우브에 3-(2'-스피로-트리시클로[3.3.1.13,7]데칸)-4-메톡시-4-(3-포스포릴옥시)페닐-1,2-디옥세탄 이나트륨염(AMPPD) 100mg/ml를 함유하는 기질액(0.1M 트리스 염산, 1μM MgCl2, 0.1mM ZnCl2, pH 9.8) 200μl를 가하여 실온에서 반응시켰다. 17분간 반응시킨 후, 루미노미터[벨트홀드사(Belthold Co.)제]로 측정하였다.
표 1에 5초간의 S/N비 적산치를 표시하였다. 비교에 어드밴스드 마그네틱스사의 페라이트 입자[어피니티 크로마토그라피용 자기 담체(카르복실기 말단)]를 사용한 결과를 표시하였다.
[실시예 7]
카르복실화 입자에 의한 TSH 검정
TSH를 15μl 함유하는 시료(0.10μU/ml)에 항 TSH Fab'가 결합된 알칼리 포스파타제 콘쥬게이트 20ul(콘쥬게이트 농도 0.5μg/ml, 0.1M 트리스-염산, 2% BSA, 1mM MgCl, 0.1mM ZnCl, pH 7.5)를 혼합하고, 여기에 실시예 5에서 제조한 항 TSH 마우스 IgG를 코팅한 카르복실화 페라이트 입자 500μl(0.02% 용액)를 혼합하고, 실온하에 20분간 방치하였다. 이 튜우브를 표면 자장이 3000 가우스인 자석에 접촉시켜 페라이트 입자를 집자시키고, 상등액을 디캔테이션에 의하여 제거하였다. 그 후 0.04% 생리 식염수 1ml를 가하여 교반하였다. 이 튜우브를 전술한 자석에 접촉시키고, 상등액을 디캔테이션에 의하여 제거하였다. 이 조작을 3회 반복하였다. 이 입자를 함유하는 튜우브에 AMPPD 100mg/ml를 함유하는 기질액(0.1M 트리스-염산, 1mM MgCl, 0.1mM ZnCl, pH 9.8)㎍200μl를 가하여 실온에서 반응시켰다. 17분간 반응시킨 후, 루미노미터(벨트홀드사제)로 측정하였다.
표 2에 5초간의 S/N비 적산치를 표시하였다. 비교에 어드밴스드 마그네틱스사의 페라이트 입자[어피니티 크로마토그라피용 자기 담체(카르복실기 말단)]를 사용한 결과를 표시하였다.
[실시예 8]
항 CEA 감작 페라이트 입자에 의한 CEA 검정
CEA 15μl를 함유하는 시료(0. 25, 50ng/ml)에 항 CEA Fab'가 결합된 알칼리 포스파타제 콘쥬게이트 20ul(콘쥬게이트 농도 0.2μg/ml, 0.1M 트리스-염산, 2% BSA, 1mM MgCl, 0.1mM ZnCl, pH 7.5)를 혼합하고, 여기에 실시예 3에서 제조한 항 CEA 마우스 IgG를 코팅한 페라이트 입자 500μl(0.02% 용액)를 혼합하고, 실온하에 20분간 방치하였다. 이 튜우브를 표면 자장이 3000 가우스인 자석에 접촉시켜 페라이트 입자를 집자시키고, 상등액을 디캔테이션에 의하여 제거하였다. 그 후 0.04% 상리 식염수 1ml를 가하여 교반하였다. 이 튜우브를 전술한 자석에 접촉시키고, 상등액을 디캔테이션에 의하여 제거하였다. 이 조작을 3회 반복하였다. 이 입자를 함유하는 튜우브에 AMPPD 100㎍/ml를 함유하는 기질액(0.1M 트리스-염산, 1mM MgCl, 0.1mM ZnCl, pH 9.8)200μl를 가하여 실온에서 반응시켰다. 17분간 반응시킨 후, 루미노미터(벨트홀드사제)로 측정하였다.
제1도에 5초간의 S/N비 적산치를 표시하였다. 비교에 어드밴스드 마그네틱스사의 페라이트 입자[어피니티 크로마토그라피용 자기 담체(카르복실 말단)]를 사용한 결과를 표시하였다.
[실시예 9]
페라이트 입자의 자기 분리 속도 비교
0.02%항 TSH 마우스 IgG 결합 페라이트 입자(2% BSA, 0.1M 트리스-HCl, 1mM MgCl, pH7.5) 500μl를 튜우브에 넣고, 표면 자장이 3000 가우스인 자석에 접촉시켰다. 접촉 후 0, 10, 20, 30, 40, 60초 후에 상등액을 분리하고, 파장 600nm에서의 흡수를 측정하였다. 제2도는 분리 속도를 표시하고 있다.
[실시예 10]
입자의 부유성의 검토
항 TSH 마우스 IgG 결합 페라이트 입자(0.02%)를 1000μl 튜우브에 취하여 실온에서 정치시켰다.
0분 및 30분 후의 상등액을 취하여, 파장 660nm에서의 흡수를 측정하였다.
(상대 탁도란 정치후 0분에 있어서의 탁도를 100%로 하였을 때, 30분 후의 탁도를 의미한다.)
본 발명은 유기 고분자를 핵으로 하고, 그 표면에 주로 페라이트를 피복한 자성 입자와 그 표면에 항원 또는 항체가 결합된 입자에 관한 것이다. 본 발명의 입자는 균일한 직경을 갖는 입자를 제공할 뿐만 아니라, 항원 또는 항체의 결합 상태가 대단히 양호한 입자를 제공한다. 또한, 본 발명의 입자는 장기간 동안 안정하므로, 장기 보존할 수 있는 등의 잇점이 있다. 이러한 특징을 갖는 입자를 면역 측정법에 이용함으로써 측정의 신속화 및 고감도화에 기여할 수 있다.

Claims (15)

  1. 유기 고분자로 이루어진 핵과 상기 핵 표면 위에 페라이트형 피복층으로 이루어진 피복층 및 선택적으로는 그 위에 고분자량 화합물 또는 실란을 피복함으로써 얻는 또 하나의 피복층, 및 상기 페라이트형 피복층 또는 상기 또 하나의 피복층의 표면 상에 항원 또는 항체가 결합된, 직경 0.2 내지 3μm의 자성입자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 고분자량 화합물이 나일론 또는 폴리스티렌인 자성 입자.
  3. 제1항에 있어서, 상기 유기 고분자가 폴리스티렌 또는 하나 이상의 (메타)아르릴레이트로 구성된 폴리머인 자성입자.
  4. 제1항에 있어서, 상기 페라이트형 피복층이 스피넬(spinel) 페라이트 또는 액정 페라이트층인 자성입자.
  5. 제1항에 있어서, 상기 페라이트형 피복층이 코발트 페라이트, 니켈 페라이트 및 망간 페라이트로 이루어진 군으로 부터 선택된 것인, 유기 고분자로 이루어진 핵 및 상기 페라이트형 피복층으로 이루어진 피복층을 포함하는 자성입자.
  6. 유기 고분자를 포함하는 핵과 상기 핵 표면 위에 페라이트형 피복층을 포함하는 피복층 및 선택적으로는 그 위에 고분자량 화합물 또는 실란을 피복함으로써 얻는 또 하나의 피복층, 및 상기 페라이트형 피복층 또는 상기 또 하나의 피복층의 표면 상에 항원 또는 항체가 결합된, 입자의 크기가 0.2 내지 3㎛인 자성입자를 사용하는 면역측정법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 면역측정법이 효소 면역측정법인 측정법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 효소 면역측정법이 검체를 항체 결합 자성 입자 및 효소 표지 항체와 혼합하고, 반응하지 않은 효소 표지 항체를 분리하고, 상기 반응하지 않은 효소 표지 항체를 세척하고, 효소 기질을 첨가한 다음 항체 결합 효소의 활성을 측정함으로써 수행되는 것인 면역측정법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 효소 기질이 2,2'-아지노-비스-(3-에틸-2,3-디히드로-1,3-벤즈티아졸-6-술폰산의 이암모늄염 및 루미놀-H2O2(퍼옥시다제용); 3-2'-스피로트리시시클로[3.3.1.13,7]데칸)-4-메톡시-4-(3-포스포릴옥시)페닐-1,2-디옥세탄 이나트륨염, p-니트로페닐포스페이트 및 메틸움베릴페릴포스페이트(알칼리포스파타제용); p-니트로페닐-β-o-갈락토스, 및 메틸움베릴페릴-β-o-갈락토스(β-갈락토시다제용)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 면역측정법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 효소 기질이 3-(2'-스피로트리시시클로[3.3.1.13,7]데칸)-4-메톡시-4-(3-포스포릴옥시)페닐-1,2-디옥세탄 이나트륨염인 것인 면역측정법.
  11. 제6항에 있어서, 상기 고분자량 화합물이 나일론 또는 폴리스티렌인 면역측정법.
  12. 제6항에 있어서, 상기 유기 고분자가 폴리스티렌 또는 하나 이상의 (메타)아르릴레이트로 구성된 폴리머인 면역측정법.
  13. 제6항에 있어서, 상기 페라이트형 피복층이 스피넬 페라이트 또는 액정 페라이트층인 면역측정법.
  14. 제6항에 있어서, 상기 페라이트형 피복층이 코발트 페라이트, 니켈 페라이트 및 망간 페라이트로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 유기 고분자를 포함한 핵 및 상기 페라이트형 피복층을 포함한 피복층을 포함하는 자성입자를 사용하는 면역측정법.
  15. 핵으로서의 유기 고분자를 페라이트형 피복 처리하고 선택적으로는 상기 페라이트형 피복 입자를 고분자량 화합물 또는 실란으로 피복하여 또 하나의 피복층을 제공하고, 상기 페라이트형 피복 입자 또는 상기 또 하나의 피복층에 항원이나 항체를 결합시키는 단계를 포함하는, 0.2 내지 3㎛의 입자 크기를 갖는 자성입자의 제조방법.
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