CN105102979B - 利用磁性纳米粒子的检测测定法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于检测靶分子的新型测定法。所述测定法利用与捕捉分子缔合的小尺寸的被可检测地标记的磁性纳米粒子。所述检测测定法是通过在所述测定法期间施加磁场来加速的。本发明的测定法可以用于提高斑点印迹法、蛋白质印迹法以及ELISA中检测步骤的效率。
Description
技术领域
本发明涉及用于检测靶分子的加速测定法。
现有技术
被认为作为背景与本发明所公开的主题相关的参考文献列于下文中:
[1]WO2011/030286
[2]US 2005/0032051
[3]WO2011/045436
[4]EP 0339980
[5]WO 2011/155890
[6]US 7927561
[7]US 5736349
[8]US 5320944
[9]US 2003/0049864
[10]EP 0339623
[11]Urbach,A.R.等人,J.Am Chem.Soc.2003,125,12704-12705
[12]Osman,O.等人,15th International Conference on MiniaturizedSystems for Chemistry and Life Sciences(第15届化学和生命科学小型化系统国际会议),2011年10月2日-6日,美国华盛顿州的西雅图(Seattle,Washington,USA)。在本文对上述参考文献的承认不应当被推断为意味着这些参考文献以任何方式与本发明所公开的主题的可专利性有关。
背景技术
测定法通常被用于检测样品中的靶分子以实现研究或诊断的目的。
US 7,927,561公开了在流体样品中检测分析物的方法。将所述流体样品与涂有针对所述分析物的结合分子的磁性粒子一起孵育。所述方法是基于使用聚焦磁体将磁性标记的分析物集中到检测区。
WO 2011/045436公开了一种侧流测定装置和一种在液体样品中检测分析物的方法。所述侧流测定装置包括样品区和反应区,所述反应区形成样品的流动路径。所述方法利用带有非磁性标记的第一捕捉分子和带有磁性粒子的第二捕捉分子。
WO 2011/030286公开了一种用于检测样品中的分析物的方法,所述方法包括能够与所述分析物结合的多种捕捉部分。这些捕捉部分中的至少一种与固体基质结合并且至少一种其它捕捉部分与可检测的标记物结合,其中所述可检测的标记物是具有≥50nm-≤5,000nm的粒度的大粒子标记物。这种测定法是以"夹心测定法”的形式进行的,其中所述分析物被捕捉在两种不同的捕捉分子之间。
多种检测测定法涉及将靶分子固定到多孔基质(例如膜)上,继而与靶标结合剂一起孵育(例如斑点印迹法或蛋白质印迹法)。对靶标结合剂进行标记(直接或经由二级结合剂),因此在进行合适的反应时,形成信号,所述信号指示所述靶分子的存在以及它的量。
蛋白质印迹的工作流程是长时间的、繁重的并且常常从开始到结束要耗时超过一天。在将蛋白质转移到印迹膜之后,进行显影过程,这个过程要耗时3-4小时到过夜才完成。显影过程包括膜封闭、抗体探测、反复的膜洗涤以及信号检测;这是整个工作流程中最繁重的部分。
因此需要研发一种提高基于基质的检测方法的速度的测定法。
发明内容
本发明是基于以下发现:使靶标结合剂(捕捉分子)与磁性纳米粒子(MNP),优选地与具有小直径的磁性纳米粒子缔合并且在测定期间施加磁场在很大程度上提高了斑点印迹、蛋白质印迹以及ELISA分析测定法中检测步骤的效率。
使用具有相对小直径的MNP对检测测定法的速度和效率具有这样的提高作用的事实是惊人的。如以下实施例中所证实,在数分钟内获得可靠的测定结果。
不希望受理论所束缚,使用小的MNP相对于利用更大的MNP的现有技术测定法的所举例说明的优势可能起因于以下原因:
A.MNP的小尺寸允许所述粒子渗入到具有小孔隙的基质中,从而允许与被固定在所述基质的孔隙内的靶分子结合。因此,如斑点印迹法和蛋白质印迹法的测定法的磁力加速可以仅通过使用比这些测定法中常用的膜的平均孔径小得多的小MNP而成为可能。
B.使用更大的MNP可能对测定的动态范围加以限制。使用大的MNP来检测连接到固体基质的较小分子(甚至是大分子,如蛋白质)可能会用MNP使基质饱和并且从而干扰测定动力学。也就是说,即使当在基质上存在少量的分子时,一个MNP仍将与超过一个分子结合,并且因此检测上限将是相对低的。相比之下,使用小MNP,例如与靶大分子具有相似尺寸的MNP即使当在基质上存在大量的分子时仍将使得1:1的结合比成为可能,并且因此,将获得更高的动态范围。
C.小MNP的溶解性一般优于大MNP,并且由于更少沉降在表面上而产生更好的测定性能,例如就表面上的信号均匀度以及更低的背景而言。
因此,在第一个方面,本发明提供了一种用于检测靶分子的测定法,所述测定法包括:
a.将潜在地包含至少一种靶分子的基质与被可检测地标记的磁性纳米粒子(MNP)复合体一起孵育,其中所述MNP复合体包含具有小直径的与捕捉分子缔合的MNP,所述捕捉分子能够直接地或间接地与所述靶分子结合;
b.施加磁场;以及
c.对所述孵育过的基质进行检测步骤;
借此检测信号的存在指示所述靶分子的存在并且信号强度指示所述靶分子的量。
在第二个方面,本发明提供了一种用于检测靶分子的测定法,所述测定法包括:
a.提供被可检测地标记的磁性纳米粒子(MNP)复合体,其中所述MNP复合体包含与二级结合剂缔合的MNP,所述二级结合剂能够结合一级结合剂;
b.将所述MNP复合体与一级结合剂一起孵育,从而形成第二MNP复合体,所述第二MNP复合体包含MNP、二级结合剂、以及一级结合剂;
c.将潜在地包含至少一种靶分子的基质与所述第二MNP复合体一起孵育;
d.施加磁场;以及
e.对所述孵育过的样品进行检测反应;
借此检测信号的存在指示所述靶分子的存在并且信号强度指示所述靶分子的量。
在另一个方面,本发明提供了一种测定系统,所述测定系统包括潜在地包含至少一种靶分子的基质;至少一种被可检测地标记的MNP复合体,其中所述MNP复合体包含具有小直径的与捕捉分子缔合的MNP,所述捕捉分子能够直接地或间接地与所述靶分子结合;以及至少一种磁体。
在另一个方面,本发明提供了一种被可检测地标记的MNP复合体,所述复合体包含具有小直径的与捕捉分子缔合的磁性纳米粒子,所述捕捉分子能够直接地或间接地与靶分子结合,所述复合体用于检测所述靶分子的测定法中,其中所述靶分子被固定到基质上。
在一个实施方案中,所述基质是多孔基质。所述多孔基质可以是膜、过滤器或凝胶。
在一个实施方案中,所述多孔基质的平均孔径大于MNP的平均直径。
在另一个实施方案中,所述基质是无孔基质。
在一个实施方案中,所述捕捉分子是一级结合剂。
在另一个实施方案中,所述捕捉分子是二级结合剂。
在一个实施方案中,将所述基质与一级结合剂一起孵育,之后与包含所述二级结合剂的MNP复合体一起孵育。
在另一个实施方案中,将包含所述二级结合剂的MNP复合体与一级结合剂一起孵育,之后与所述基质一起孵育。
在某些实施方案中,所述一级结合剂是一抗。
在某个实施方案中,所述二级结合剂是二抗。
在一个实施方案中,所述MNP复合体中的MNP被可检测地标记。
在另一个实施方案中,所述MNP复合体中的捕捉分子被可检测地标记。
标记剂可以选自由以下各项组成的组:荧光化合物,如荧光素(或荧光素衍生物,如FITC)或藻红蛋白(PE);荧光粒子,如量子点;酶,如辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP);发色团;或电化学活性分子或放射性分子。
在一个实施方案中,所述检测步骤包括信号显影反应。
在一个实施方案中,所述信号显影反应是化学发光反应或比色反应。
在一个实施方案中,所述MNP具有小于50nm的直径。
在具体的实施方案中,所述MNP具有10nm、20nm、25nm或30nm的直径。
在某些实施方案中,所述测定法被用于斑点印迹分析、蛋白质印迹分析、狭缝印迹法、ELISA或RIA。
在一个实施方案中,所述磁场是由磁体阵列产生的,所述磁体阵列由呈棋盘式配置的小磁体构成。
在某些实施方案中,在将所述基质与所述MNP复合体一起孵育之前,使用封闭溶液对所述基质进行封闭。
在一个实施方案中,在将所述基质与封闭溶液一起孵育之前,对所述基质进行干燥步骤。
所述干燥步骤可以通过加热、空气流动、浸泡在极性有机溶剂中、真空或其任何组合来执行。
附图说明
为了更好地理解本文所公开的主题以及为了举例说明如何可以在实践中实施所述主题,现将仅通过非限制性实例的方式,参考附图来描述实施方案,其中:
图1A-C示出了容纳具有三种不同直径(20nm、100nm以及200nm)的MNP的小瓶:图1A示出了在施加磁场之前的小瓶,图1B和1C示出了在施加强磁场(7300高斯的表面场)5分钟之后同一些小瓶。图2是根据本发明的测定法的示意图。
图3是具有100nm的平均直径的示例性MNP复合体的示意图。
图4示出了与荧光标记的标准捕捉分子链霉亲和素-PE(藻红蛋白)和抗体-FITC(异硫氰酸荧光素)相比较,100nm MNP随膜上斑点的量而变的荧光信号。
图5A-B示出了生物素化的蛋白质的反应的斑点印迹测定法:图5A使用标准捕捉分子链霉亲和素-PE,检测暴露时间:4秒,并且图5B使用涂有链霉亲和素的100nm MNP,检测暴露时间:15秒。
图6是示例性小MNP(平均直径<50nm)的图示。该图示出了具有两亲性聚合物表面涂层的水溶性IO纳米粒子的图示。
图7示出了在指示HRP催化的颜色形成的450nm波长下随以下各项的浓度而变的光密度(OD)的图表:抗兔IgG-HRP标记的10nm MNP、20nm MNP、30nm MNP、或游离抗兔IgG-HRP。
图8示出了以不同的靶标浓度使用游离抗兔IgG-HRP(上图)和带有抗兔IgG-HRP的10nm MNP(下图)对兔IgG进行的斑点印迹测定。
图9是使用游离抗体的测定法的示意图。
图10示出了使用带有抗兔IgG-HRP的20nm MNP(左图)和游离抗兔IgG-HRP(右图)对人类转铁蛋白(hT)/兔抗hT抗体进行的斑点印迹测定。
图11A-C示出了示例性斑点印迹装备:图11A是样品膜上的实验设置的方案,图11B是用于在磁场下进行斑点印迹法的代表性装置的俯视照片,图11C是该代表性装置的不同元件的照片:钕盘式磁体、膜、以及夹具。
图12示出了在施加磁场(左图)和不施加磁场(右图)的情况下使用以下各项对兔IgG进行的斑点印迹测定:10nm MNP、20nm MNP、30nm MNP(全部均带有抗兔IgG-HRP)、以及游离抗兔IgG-HRP。
图13是使用分开的抗体结合步骤的测定法的示意图。
图14是使用组合的抗体结合步骤的测定法的示意图。在进行该测定之前,例如在电泳期间将连接有二抗和标记的MNP与一抗一起预先孵育。
图15示出了使用分开的抗体结合步骤(上图)和组合的抗体结合步骤(下图)对hT/兔抗hT抗体/MNP-抗兔抗体复合体进行的斑点印迹测定,其中该测定在磁场存在下持续5分钟(左图)、在不存在磁场的情况下持续5分钟(中央图)、或在不存在磁场的情况下持续1小时(右图)。
图16示出了用于蛋白质印迹实验中的磁性配置:大块磁体和小磁体阵列。示出了用于斑点印迹实验的磁体以说明尺寸比例。
图17示出了用于如实施例7和8中所述的蛋白质印迹实验中的包括振荡器在内的实验装备。
图18A-D示出了如实施例7中所述的基于MNP的蛋白质印迹实验的Chemidoc MP图像。在这些实验中,免疫测定作为在磁场下的一个5分钟步骤(A:hSA模型,暴露时间:2秒,B:hT模型,暴露时间:3秒)以及参考测定——即标准蛋白质印迹实验(C:hSA模型,暴露时间:2秒,D:hT模型,暴露时间:3秒)进行。指出了用于所示图像的暴露时间。
图19A-B示出了图18中所示的图像即随抗原蛋白质的量变化的信号的分析图表(A:hSA;B:hT)。
图20A-D示出了如实施例8中所述的基于MNP的蛋白质印迹实验的Chemidoc MP图像。在这些实验中,免疫测定是作为在磁场下在进行膜干燥的情况下(C:hSA模型,暴露时间:3秒,D:hT模型,暴露时间:5秒),或在没有进行膜干燥的情况下(A:hSA模型,暴露时间:7秒,B:hT模型,暴露时间:5秒)的一个5分钟步骤而进行的。指出了用于所示图像的暴露时间。
图21示出了图20中所示的图像,即随抗原蛋白质的量变化的SNR的分析图表。
图22示出了如实施例9中所述的对hSA模型和hT模型这两者进行的基于MNP的ELISA实验的结果。在这些实验中,免疫测定作为在磁场下的一个5分钟步骤以及参考测定——即标准ELISA实验进行。
具体实施方式
本发明提供了一种具有提高的效率和速度的免疫测定法。本发明的免疫测定法利用与捕捉分子(结合剂)缔合的并且被可检测地标记的小尺寸的磁性纳米粒子。该测定法是通过使用磁体而加速的。
MNP的磁化率在很大程度上取决于它们的尺寸,小MNP具有更低的磁化率,如例如图1中所示。将具有三种不同直径(20nm、100nm以及200nm)的MNP以相同的浓度(100μg/ml)溶解在PBS缓冲液中并且放置在小瓶(图1A)中,将这些小瓶在强磁体(7300高斯的表面场)上放置5分钟(图1B)。如可以在图1B和1C中清楚地看到,100nm MNP和200nm MNP被吸引到磁体上,而20nm MNP的溶液颜色仍在视觉上保持不变,也就是说,这些小MNP没有被显著地吸引到磁体上。因此,惊人的是,使用这些小MNP在5分钟内在相同的磁场下提供了这样有效的测定加速。
在一个实施方案中,本发明的磁性纳米粒子用于检测被固定在多孔基质上的分析物或靶分子。
在另一个实施方案中,本发明的磁性纳米粒子用于检测被固定在无孔基质上的分析物或靶分子。
基于基质的检测测定法的非限制性实例是斑点印迹法、狭缝印迹法、蛋白质印迹法以及ELISA分析。这些是用于检测样品中靶分子(通常是蛋白质)的存在和量的常用测定法。在斑点印迹测定法中,将假定包括靶分子的整个样品原样放置到多孔物质(例如硝化纤维素膜)上并且将该样品内的蛋白质以斑点的形式固定在膜中。
在蛋白质印迹测定法中,首先使假定包括靶分子的样品在分离凝胶上进行电泳,从而将蛋白质彼此分离,并且根据它们的尺寸形成梯度。随后,将分离的蛋白质根据它们在凝胶中对应的位置印迹到硝化纤维素膜上并且固定到膜上。
在ELISA(酶联免疫吸附测定法)中,将假定包括靶分子的整个样品原样放置到无孔物质(例如标准96孔培养板的孔)上并且该样品内的蛋白质涂覆孔的底部。或者,可以进行夹心ELISA测定法。在这种情况下,将孔的底部预先涂覆以针对靶分子的特异性一抗。因此,靶分子经由与这些抗体特异性结合而被固定到表面上。
随后,通过常规地利用一抗和二抗的免疫测定法来评估靶分子的存在和量,其中所述二抗被可检测地标记以检测靶分子的存在和它的量。
下文提供的实施例证实了通过使用本发明的磁性纳米粒子使免疫反应加速、缩短了测定时间并且获得更高的测定灵敏度。
因此,在一个方面,本发明提供了一种用于检测靶分子的测定法,所述测定法包括:
a.将潜在地包含至少一种靶分子的基质与被可检测地标记的磁性纳米粒子(MNP)复合体一起孵育,其中所述MNP复合体包含具有小直径的与捕捉分子缔合的MNP,所述捕捉分子能够直接地或间接地与所述靶分子结合;
b.施加磁场;以及
c.对所述孵育过的基质进行检测步骤;借此检测信号的存在指示所述靶分子的存在并且信号强度指示所述靶分子的量。
在一个实施方案中,所述基质是多孔基质,如膜、过滤器、凝胶、海绵或任何其它多孔基质。在一个实施方案中,所述多孔基质的平均孔径大于小MNP的平均直径。
在一个实施方案中,所述基质是无孔基质,如塑料或玻璃。
展示所述测定法的一个实施方案的代表性方案描绘在图13中。
与MNP缔合的捕捉分子可以是一级(靶标)结合剂(例如一抗)或二级结合剂(例如二抗)。与MNP缔合的结合剂可以被可检测地标记。或者,MNP本身可以被可检测地标记。
如果MNP与一级结合剂缔合,那么所述测定法以单个步骤进行,其中将所述MNP直接与靶分子一起孵育。任选地,将所述靶分子固定在多孔物质上。
如果MNP与二级结合剂缔合,那么可以在将靶分子与一级靶标结合剂一起孵育之后将它们添加到测定中。或者,可以向容纳靶分子的测定容器中同时添加靶标(一级)结合剂和与二级结合剂缔合的磁性纳米粒子,任选地在孵育一段时间之后。任选地,所述靶分子被固定在多孔物质上。
被放置在多孔基质下或测定容器下的磁体引起加速的结合反应,如下文提供的实施例中所证实。
图2以非限制性方式示意性地图示了本发明的总体构思。该图图示了本发明的测定法的不同组分:与能够识别靶蛋白的抗体缔合的被可检测地标记的磁性纳米粒子、含有所述蛋白质靶标的基质以及磁体。经由施加磁场使MNP与被固定在基质上的靶蛋白的结合加速。
该总体构思可以应用于其中分析物被固定在多孔基质内的任何测定法。非限制性实例包括斑点印迹测定法和蛋白质印迹分析。类似地,本发明可以应用于其中分析物被直接固定到无孔基质上或经由与被固定到所述无孔基质上的特异性抗体结合而被固定到无孔基质上的任何测定法,例如在孔板中进行的ELISA中。
根据本发明,可以在不分开步骤(i)使一级结合剂与靶分子结合和步骤(ii)使二级结合剂与所述一级结合剂结合的情况下进行所述检测测定法。这种“组合步骤”测定法是基于带有二级结合剂的MNP与一级结合剂的预孵育,所述一级结合剂通常呈摩尔过量以确保高效地形成带有一级结合剂的MNP复合体。所述测定法进一步基于MNP-一级结合剂复合体与靶分子的提高的反应速率,这是通过施加磁场来加速的。
因此,在另一个方面,本发明提供了一种用于检测靶分子的测定法,所述测定法包括:
a.提供被可检测地标记的磁性纳米粒子(MNP)复合体,其中所述MNP复合体包含与二级结合剂缔合的MNP,所述二级结合剂能够结合一级结合剂;
b.将所述MNP复合体与一级结合剂一起孵育,从而形成第二MNP复合体,所述第二MNP复合体包含MNP、二级结合剂、以及一级结合剂;
c.将潜在地包含至少一种靶分子的基质或样品与所述第二MNP复合体一起孵育;
d.施加磁场;以及
e.对所述孵育过的样品进行检测步骤;
借此检测信号的存在指示所述靶分子的存在并且信号强度指示所述靶分子的量。
在一个实施方案中,所述MNP具有小直径。
在一个实施方案中,所述基质是多孔基质。在一个实施方案中,所述多孔基质的平均孔径大于小MNP的平均直径。
在一个实施方案中,所述基质是无孔基质。
展示“组合步骤”测定法的一个实施方案的代表性方案描绘在图14中。
如本文所提到的术语“磁性纳米粒子复合体(MNP复合体)”指的是包含与一个或多个捕捉分子缔合的一个或多个磁性纳米粒子的复合体。本发明的MNP复合体被可检测地标记。如本文所用的术语“被可检测地标记的MNP复合体”指的是如下的MNP复合体,所述MNP复合体与可以通过适当的反应(酶促反应或显色反应)或通过荧光激发来检测的化合物缔合并且有助于对靶分子进行可视化、定量或检测。所述标记化合物可以与MNP缔合(例如在MNP的磁壳周围形成)或与捕捉分子缔合或与这两者缔合。
标记的MNP的非限制性实例是具有亲脂性荧光染料壳的MNP,所述壳在磁芯周围形成并且涂有多糖基质。捕捉分子可以与多糖基质缔合(或嵌在所述多糖基质内)。
标记剂可以是荧光化合物,例如荧光素(或荧光素衍生物,如FITC)或藻红蛋白(PE);荧光粒子,如量子点;酶,如辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP);发色团;或电化学活性分子或放射性分子。
如本文所用的术语“缔合”或“缔合的”指的是任何物理力或化学力,如范德华力(Van-der-Walls)、配位、共价、离子、静电、偶极-偶极、或氢键缔合(键合或相互作用)。所述缔合可以直接或间接(即包含一种或多种中间剂)发生。在一些实施方案中,所述中间剂是抗体、另外的蛋白质、激素、配体或间隔物。举例来说,所述中间剂可以是链霉亲和素、生物素、免疫球蛋白结合蛋白(例如蛋白质A、蛋白质G、蛋白质A/G、蛋白质L等)、DNA或RNA分子、肽标签或它的螯合复合体(例如聚组氨酸标签或次氮基三乙酸的金属络合物,如Ni-NTA)。
磁性纳米粒子复合体可以呈干燥形式(例如粉末)或分散在介质中。“介质”根据它最宽泛的定义是带有所述复合体的任何材料或体积。在一些实施方案中,所述介质可以是液体、凝胶、或多孔材料。在一些实施方案中,所述介质可以是水性或非水性液体。
如本文所用的术语“捕捉分子”指的是直接地或间接地与靶分子结合的试剂。捕捉分子可以是靶标结合剂(也被称为一级结合剂)并且因而,它直接与靶分子结合。所述捕捉分子还可以是与一级结合剂结合的二级结合剂并且因而它间接地经由一级结合剂与靶分子结合。
捕捉剂的非限制性实例包括抗体、免疫球蛋白结合蛋白(例如蛋白质A、蛋白质G、蛋白质A/G、蛋白质L)、链霉亲和素(与生物素和生物素标记的化合物结合)、与互补DNA或RNA链结合的DNA或RNA链、以及与特定的肽标签(例如聚组氨酸标签)结合的螯合复合体(如Ni-NTA)。
如本文所用的术语“靶标结合剂或一级结合剂”指的是特异性地与靶分子(分析物)缔合(结合)的试剂。在一些实施方案中,所述靶标结合剂是针对靶抗原的一抗。
如本文所用的术语“二级结合剂”指的是与靶标结合剂(一级结合剂)结合的试剂。
在一些实施方案中,靶标结合剂是特异性地结合靶分子的抗体并且二级结合剂是结合一抗的二抗。一抗针对靶标具有特异性并且可以是但不限于小鼠抗体、兔抗体、山羊抗体等。二抗类型的选择取决于一抗的类别(例如IgG或IgD)以及一抗的来源,例如如果一抗是小鼠抗体,那么二抗将是抗小鼠抗体。二抗可以被可检测地标记。标记的非限制性实例包括酶(例如HRP或AP)、荧光化合物(例如荧光素或藻红蛋白)、发色团、或电化学活性分子或放射性分子。
如本文所用的术语“第二MNP复合体”指的是包含MNP、二级结合剂、以及一级结合剂的复合体。这种复合体是通过将与二级结合剂缔合的MNP复合体与一级结合剂一起孵育而获得的。“第二MNP复合体”然后可以被直接施用于靶分子上。
如本文所用的术语“抗体”指的是IgG、IgM、IgD、以及IgA抗体。这个术语指的是全抗体或包含抗原结合域的抗体片段,例如scFv、Fab、F(ab')2、双特异性抗体、双体抗体、以及能够结合靶分子的其它片段。所述定义包括多克隆抗体和单克隆抗体。
根据本发明的“磁性纳米粒子”涵盖具有使用磁场所观测到的磁性(响应于所施加的磁场)的任何纳米粒子(或纳米粒子材料)。所述磁性纳米粒子可以是顺磁性纳米粒子、铁磁性纳米粒子、亚铁磁性纳米粒子或超顺磁性纳米粒子。
在一些实施方案中,所述磁性纳米粒子由金属构成(或掺杂有金属),如铁(Fe)、镍(Ni)、钴(Co)、锰(Mn)、或其任何组合。在一些实施方案中,所述磁性纳米粒子由稀土金属构成,如钆(Gd)、钕(Nd)、钐(Sm)、镝(Dy)、钬(Ho)、或其任何组合。
在一些实施方案中,所述材料是金属的合金,其中至少一种金属具有磁性。在一些实施方案中,所述合金是钢、钕-铁-硼合金(Nd2Fe14B)、镍-铁合金(也被称为坡莫合金(Permalloy))、铝-镍-钴合金、钐-钴合金、钇-铁合金(YIG)、钇-钴合金(YCo5)。
在一些实施方案中,所述磁性纳米粒子由金属氧化物构成。非限制性实例是铁氧化物,如Fe2O3、Fe3O4、FeO;锰氧化物,如Mn3O4、Mn2O3;以及其它金属氧化物,如CrO2、EuO;或其任何组合。
在一些实施方案中,所述磁性纳米粒子由矿物构成。磁性矿物的非限制性实例是FeS2、Fe3Si。
在一些实施方案中,所述磁性纳米粒子是掺杂有磁性组分的材料(磁性或非磁性,例如金属、半导体、绝缘体)。在一些实施方案中,所述磁性纳米粒子由掺杂有磁性材料(或与磁性材料合金化)的半导体材料构成,例如掺杂有以下掺杂剂(原子或离子)中的一种或多种的GaAs、InAs、InSb、AlN、TiO2、ZnO、SnO2:Fe、Co、Ni、Cr、Mn、V。
在一些另外的实施方案中,所述磁性纳米粒子由半导体材料构成,如MnAs、MnSb。
在一些实施方案中,所述磁性纳米粒子由氧化铁构成。
根据本发明的磁性纳米粒子具有在纳米范围(1nm至1000nm)的尺寸(长度或直径)。在一些实施方案中,本发明的纳米粒子是具有在1nm至50nm的范围的长度或直径的小尺寸纳米粒子。在一些具体的实施方案中,所述纳米粒子具有平均在1nm至30nm范围的长度或直径。在其它实施方案中,所述纳米粒子具有平均在10nm至30nm范围的长度或直径。在具体的实施方案中,所述纳米粒子具有10nm、或20nm、或25nm、或30nm的直径。
在一些实施方案中,所述纳米粒子是在各向同性形状的纳米粒子和各向异性形状的纳米粒子当中选择的。在不限于此的情况下,所述纳米粒子可以是对称的或不对称的,可以是伸长的或具有圆形(球形)形状、棒状形状、椭圆形、分支形状、网络形状或任何不规则的形状。在一些实施方案中,所述纳米粒子选自纳米球、纳米棒、分支纳米粒子、多脚状纳米粒子以及其它纳米粒子。在一个具体的实施方案中,根据本发明的标记的MNP复合体是涂有线性两亲性聚合物的小尺寸氧化铁纳米粒子(≤30nm),所述聚合物带有末端羧基,所述末端羧基与辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗兔IgG二抗缔合。
本发明的测定法可以是蛋白质印迹测定法。用于进行蛋白质印迹测定法的方案是本领域公知的。一般来说,蛋白质印迹测定法中的第一步骤是使含有靶分子的样品进行电泳。通常,在聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳。用于进行蛋白质印迹测定法的方案的非限制性实例提供于下文实施例7中。在电泳后,将靶分子转移到多孔基质上以进行进一步的分析。
本发明的系统是基于磁性纳米粒子复合体的加速作用而起作用的,所述磁性纳米粒子复合体将捕捉剂运送到含有靶分子的基质。所述基质可以是多孔基质。如本文所用的术语“多孔基质”指的是具有多个孔(凹陷)的基质。这些孔隙具有由内表面界定的相同或不同体积和形状的内部空隙。所述基质孔具有纳米尺寸,也就是说具有小于1,000nm的平均尺寸。在一些实施方案中,平均孔径低于500nm。在其它实施方案中,平均孔径低于300nm。在另外的实施方案中,平均孔径低于200nm。在其它实施方案中,平均孔径低于100nm。在其它实施方案中,平均孔径低于50nm。在另外的实施方案中,平均孔径是300nm至50nm。在具体的实施方案中,所述多孔基质是具有200nm或450nm孔的膜。
所述基质还可以是无孔基质。
所述基质可以是柔性的或刚性的或软的基质,并且可以由任何材料构成。在一些实施方案中,所述基质是层状基质,例如无孔层上的多孔层或金属层(夹具)上的软层(如凝胶或组织)。基质(或它的一层)可以由绝缘材料、导体材料或半导体材料构成。在一些实施方案中,所述基质可以由玻璃材料、聚合材料、陶瓷材料、纤维材料、或其任何组合构成。在一些实施方案中,基质的材料可以由玻璃、纸材、羊毛、抓绒、凝胶、纤维素、或其任何组合构成。在一些实施方案中,所述基质由硝化纤维素膜或PVDF膜构成。硝化纤维素膜或PVDF膜可以具有不同的孔径,例如0.2μm(200nm)或0.45μm(450nm)。
一种或多种靶分子缔合到(固定在)基质的表面上。“靶分子”或“分析物”(在本文可互换使用)指的是存在和/或量有待被确定的任何因子。在一些实施方案中,靶分子可以是多种靶分子的混合物。在一些实施方案中,有待确定不同的靶分子的存在或浓度分布。
所述靶分子可以是任何生物因子和/或化学因子(即分子/大分子/复合体/缀合物)。在一些实施方案中,靶分子是有机分子或无机分子。在一些实施方案中,靶分子是生物因子。
在一个实施方案中,靶分子是蛋白质、多肽或肽。在一些其它实施方案中,靶分子是核酸(例如DNA、RNA)、碳水化合物、脂质、糖脂、甘油三酯或多糖。靶分子可以是激素、维生素、抗体、代谢物、氨基酸(例如谷氨酸、天冬氨酸)、醇(例如乙醇)、有机酸(例如乙酸、乳酸)、抗氧化剂(例如抗坏血酸)、多元醇(例如甘油)或其任何衍生物和/或组合。在一些实施方案中,靶分子是毒素或药物。在一些实施方案中,本发明的测定法可以检测甚至少量的靶分子。在一些实施方案中,在基质内靶分子的量是以微克计的。在一些实施方案中,靶分子的量低于1微克。在一些实施方案中,在基质内靶分子的量是以纳克计的。在一些实施方案中,在基质内靶因子的量是100ng至1ng。在一些实施方案中,在基质内靶因子的量是100pg至1pg。
本发明的系统包括产生磁场的元件,即磁体。本发明的系统可以具有一个或多个磁体。在一些实施方案中,所述系统具有至少一个位于所述基质附近的磁体。在一些实施方案中,所述磁体被定位在所述基质的下方。在其它实施方案中,所述磁体可以被定位在所述基质的顶部上或侧面上。所述磁体可以是永磁体或电磁体。
磁体的尺寸是根据在测定法中所使用的基质的尺寸来选择的。在一些非限制性实施方案中,产生磁场的元件是由小磁体(例如1/4英寸×1/4英寸×1/2英寸,如图16中所示)构成的磁体阵列。所述磁体阵列中的磁极性可以是垂直的,也就是说以直角与由这些磁体形成的主平面相交,并且每一个相邻的磁体的磁极性是相反的(即棋盘式配置),在本文也被称作“棋盘式磁体阵列”。
在一些实施方案中,本发明的测定法进一步包括检测步骤。在一些实施方案中,所述检测步骤可以涉及对所述基质进行照射,继而进行荧光检测(例如通过使用荧光成像器)、光密度测定法测量、分光光度计测量、光散射测量、电流测量、磁感应测量、光检测(通过例如CCD照相机、照相底片)或放射性检测。在一些实施方案中,本发明的测定法包括基于质量或折射率变化的无标记检测,如表面等离子体共振(SPR)或石英晶体微量天平(QCM)。
在一些实施方案中,所述检测步骤包括信号显影反应。在一个具体的实施方案中,所述信号显影反应是化学发光反应,所述化学发光反应是由基质上的标记剂所催化的。举例来说,鲁米诺(lumiunol)的化学发光反应是由酶HRP或AP在合适的条件下所催化的,这些酶提供于标准的化学发光显影溶液中。在另一个具体的实施方案中,所述信号显影反应形成可检测的颜色。举例来说,诸如TMB或OPD等多种试剂的比色反应是由HRP在合适的条件下催化的。
根据本发明的一个方面,使用包含至少一种靶分子的基质进行所述测定法。在一些实施方案中,通过使潜在地包含靶分子的样品与基质接触而形成包含至少一种靶分子(或与至少一种靶分子缔合)的基质。在一个实施方案中,使靶分子在基质的表面上沉积,所述基质可以是多孔基质,并且经由基质的一个或多个表面开口,一种或多种靶分子被固定到基质孔的内表面上。或者,所述基质可以是无孔基质。在这种情况下,经由靶分子直接地或间接地与被固定到基质表面上的特异性抗体结合使基质的表面涂覆靶分子。可以通过任何方法使靶分子沉积在基质上。在一些实施方案中,可以通过简单地将含有靶分子的样品滴在基质上或将基质浸泡在样品中来实现沉积。在一些实施方案中,可以在暴露于靶分子之前将基质活化,例如通常通过含有EDC和NHS的溶液使表面羧酸基活化以使得能够进行标准胺偶合。在一些实施方案中,使基质(例如硝化纤维素膜)与带有靶分子的凝胶紧邻,藉此靶分子从凝胶被转移(印迹)到硝化纤维素膜或PVDF膜上。在一些实施方案中,通过利用电化学沉积、电泳沉积、电镀、喷涂、旋涂、或任何其它沉积方法使包含一种或多种靶分子的样品沉积在基质上。
在一些实施方案中,在使本发明的磁性纳米粒子复合体与包含靶分子的基质接触之前,可以对所述基质进行一个或多个处理步骤,如洗涤、干燥、封闭、加热或失活。在一些实施方案中,所述处理步骤是封闭。在一些实施方案中,通过将基质放置(或浸泡)在封闭溶液中来进行封闭处理,所述封闭溶液可以含有蛋白质(例如脱脂乳或BSA)、缓冲液(例如Tris缓冲盐水(TBS)或磷酸盐缓冲盐水(PBS))、以及洗涤剂(如Tween 20或TritonX-100)。
在一些实施方案中,所述测定法可以包括干燥步骤(即除水或部分除水的步骤),其中在将基质与MNP复合体一起孵育之前,并且特别是在与MNP复合体一起孵育之前的封闭步骤之前,将基质(例如膜)干燥。将膜干燥会提高信噪比(SNR),也就是说在包括膜干燥的测定法中获得更高的信号以及更低的背景。不希望受理论所束缚,更高的信号可能是由于靶蛋白被固定到膜上,以及阻止了蛋白质在随后的测定和洗涤步骤期间发生损失。更低的背景可能是由于更高效的封闭,封闭蛋白质是通过润湿过程被带入膜中的,所述润湿过程比标准封闭中的扩散过程要快速和高效得多。
可以使用本领域已知的任何方法来进行膜干燥,例如通过加热、经受空气流动、浸泡在极性有机溶剂(例如醇或DMSO)中、施加真空或其任何组合。
在一个具体的实施方案中,通过将膜在实验室烘箱中在37℃在空气流动下放置30分钟来进行干燥。
在一些实施方案中,这些测定步骤中的一些或全部(如使靶分子沉积到基质上、容许一级结合剂与靶分子缔合、使至少一种磁性纳米粒子复合体或含有这样的复合体的介质与基质接触等)可以具有之前和/或之后的洗涤步骤。在一些实施方案中,洗涤步骤是通过将基质放置(或浸泡)在洗涤溶液中而进行的。在一些实施方案中,洗涤溶液包含缓冲液(例如TBS或PBS)和洗涤剂(如Tween 20或Triton X-100)。在一些实施方案中,从基质表面洗涤MNP可以通过磁引力而加速或变得更高效。为此,应当将磁体沿与用于加速MNP-分析物结合反应的方向相反的方向放置。举例来说,如果将磁体放置在膜的下方以进行结合步骤,那么在洗涤步骤中应当将它放置在膜上方。或者,可以使膜旋转以使它的上面向下,而磁体保持在膜下方。
在一些实施方案中,所述测定法包括将磁性纳米粒子复合体与介质中的其它试剂分离。举例来说,如果将MNP复合体与过量的一级结合剂混合,那么将结合一级结合剂的MNP复合体纯化以及洗掉过量的一级结合剂可能是有用的。可以使用MNP的磁特性来进行分离。分离手段的非限制性实例是通过磁力沉淀或穿过磁柱。或者,可以使用根据尺寸进行分离的常见方法,如离心、色谱或过滤。
下文概述了本发明的若干个实施方案:
在一个具体的实施方案中,本发明提供了一种斑点印迹测定法,所述测定法包括以下步骤:
a.将靶分子印迹到膜上;
b.将所述膜与具有小直径的与标记的靶标结合剂缀合的MNP一起孵育,同时施加磁场;以及
c.对标记进行检测。
在另一个具体的实施方案中,本发明提供了一种斑点印迹测定法,所述测定法包括以下步骤:
a.将靶分子印迹到膜上;
b.将所述膜浸泡在封闭溶液中;
c.将所述膜与靶标结合剂一起孵育;
d.将所述膜与具有小直径的与标记的二级结合剂缀合的MNP一起孵育,同时施加磁场;以及
e.对标记进行检测。
这个实施方案的示意图概述于图13中。
在另一个具体的实施方案中,本发明提供了一种斑点印迹测定法,所述测定法包括以下步骤:
a.将靶分子印迹到膜上;
b.将所述膜浸泡在封闭溶液中;
c.将所述膜浸泡在含有一级结合剂(例如一抗)和具有小直径的与标记的二级结合剂(例如二抗)缔合的MNP的预先制备的溶液中,同时施加磁场;以及
d.对标记进行检测。
这个实施方案的示意图概述于图14中。
在另一个具体的实施方案中,本发明提供了一种蛋白质印迹测定法,所述测定法包括以下步骤:
a.对包含蛋白质的样品进行电泳分离;
b.将分离的蛋白质转移(即印迹)到膜上;
c.将所述膜浸泡在封闭溶液中;
d.将所述膜浸泡在含有一级结合剂(例如一抗)和具有小直径的与标记的二级结合剂(例如二抗)缔合的MNP的预先制备的溶液中,同时施加磁场;以及
e.对标记进行检测。
在另一个具体的实施方案中,本发明提供了一种蛋白质印迹测定法,所述测定法包括以下步骤:
a.对包含蛋白质的样品进行电泳分离;
b.将分离的蛋白质转移(即印迹)到膜上;
c.将所述膜浸泡在封闭溶液中;
d.将所述膜与靶标结合剂一起孵育;
e.将所述膜与具有小直径的与标记的二级结合剂缀合的MNP一起孵育,同时施加磁场;以及
d.对标记进行检测。
在另一个具体的实施方案中,本发明提供了一种蛋白质印迹测定法,所述测定法包括以下步骤:
a.对包含蛋白质的样品进行电泳分离;
b.将分离的蛋白质转移(即印迹)到膜上;
c.将所述膜干燥;
d.将所述干燥的膜浸泡在封闭溶液中;
e.将所述膜浸泡在含有一级结合剂(例如一抗)和具有小直径的与标记的二级结合剂(例如二抗)缔合的MNP的预先制备的溶液中,同时施加磁场;以及
f.对标记进行检测。
在另一个具体的实施方案中,本发明提供了一种蛋白质印迹测定法,所述测定法包括以下步骤:
a.对包含蛋白质的样品进行电泳分离;
b.将分离的蛋白质转移(即印迹)到膜上;
c.将所述膜干燥;
d.将所述干燥的膜浸泡在封闭溶液中;
e.将所述膜与靶标结合剂一起孵育;
f.将所述膜与具有小直径的与标记的二级结合剂缀合的MNP一起孵育,同时施加磁场;以及
g.对标记进行检测。
在另一个具体的实施方案中,本发明提供了一种ELISA,所述ELISA包括以下步骤:
a.将基质用靶蛋白涂覆;
b.添加封闭溶液;
c.添加含有一级结合剂(例如一抗)和具有小直径的与标记的二级结合剂(例如二抗)缔合的MNP的预先制备的溶液,同时施加磁场;以及
d.对标记进行检测。
在另一个具体的实施方案中,本发明提供了一种ELISA,所述ELISA包括以下步骤:
a.将基质涂覆以第一一级结合剂(例如第一一抗);
b.添加封闭溶液;
c.添加靶蛋白;
d.添加含有第二一级结合剂(例如第二一抗)和具有小直径的与标记的二级结合剂(例如二抗)缔合的MNP的预先制备的溶液,同时施加磁场;以及
e.对标记进行检测。
在另一个具体的实施方案中,本发明提供了一种ELISA,所述ELISA包括以下步骤:
a.将基质用靶蛋白涂覆;
b.添加封闭溶液;
c.添加一级结合剂(例如一抗);
d.添加具有小直径的与标记的二级结合剂(例如标记的二抗)缀合的MNP,同时施加磁场;以及
e.对标记进行检测。
在另一个具体的实施方案中,本发明提供了一种ELISA,所述ELISA包括以下步骤:
a.将基质涂覆以第一一级结合剂(例如第一一抗);
b.添加封闭溶液;
c.添加靶蛋白;
d.添加第二靶标结合剂(例如第二一抗);
e.添加具有小直径的与标记的二级结合剂缀合的MNP,同时施加磁场;以及
f.对标记进行检测。
优选地,第一一级结合剂和第二一级结合剂是针对靶分子上不同的结合位点。
在另一个方面,本发明提供了一种被可检测地标记的MNP复合体,所述复合体包含具有小直径的与捕捉分子缔合的磁性纳米粒子,所述捕捉分子能够直接地或间接地与靶分子结合,所述复合体用于检测所述靶分子的测定法中,其中所述靶分子被固定到多孔物质上。在另一个实施方案中,所述靶分子被固定到无孔物质上。
在一些实施方案中,所述被可检测地标记的MNP复合体用于研究实验室、医院或医疗护理中心中(用于专业的使用者,如技术人员、护士、医生)。在一些实施方案中,所述被可检测地标记的MNP复合体用于家庭使用(由患者使用)。
在以下实施例中展示了本发明。
实施例
实施例1:使用100nm荧光MNP-捕捉剂复合体的斑点印迹分析
具有100nm尺寸(流体动力学直径)的荧光磁性纳米粒子(MNP)购自Chemicell公司。这些MNP含有亲脂性荧光染料壳,该壳在磁芯周围形成并且涂有多糖基质。捕捉剂嵌在多糖基质内(图3)。测试具有以下三种捕捉剂的MNP:蛋白质G、抗小鼠IgG以及链霉亲和素。所有这三种MNP类型均具有在547nm处具有激发峰并且在580nm处具有发射峰的荧光。
进行了初步实验以评价这些MNP的荧光水平。将一系列浓度含有MNP的小滴(2μl)溶液点样在0.45μm的硝化纤维素(NC)膜上。使用经过常用的荧光团,即荧光素(如FITC)和藻红蛋白(PE)标记的标准捕捉剂进行类似的点样。使用ChemiDoc MP成像器(伯乐公司(Bio-Rad))进行荧光检测。证实了MNP的摩尔荧光比标准捕捉剂的摩尔荧光强得多(图4)。
因此预期的是,在斑点印迹实验中,也就是说在与被点样到膜上的抗原的免疫反应中,MNP将提供比标准捕捉剂更强(或至少相当)的信号。然而,斑点印迹实验的结果表明MNP不能与标准捕捉剂一样好地起作用。举例来说,将一系列浓度的生物素化的2μl抗体滴点样到0.45μm的NC膜上。然后使一个膜暴露于涂有链霉亲和素的MNP的溶液,并且使第二参考膜在相似的条件(例如相同的摩尔浓度)下暴露于标准捕捉剂链霉亲和素-PE。使用ChemiDoc MP成像器进行的检测揭示在使用链霉亲和素-PE的情况下产生强信号(图5A)并且在使用链霉亲和素-MNP的情况下仅产生弱信号(图5B)。
当将其它MNP类型(具有蛋白质G或抗小鼠IgG)与标准标记捕捉剂相比较时,记录到相似的结果。施加磁场以增强基于MNP的检测并没有改进结果。
从这些实验所得到的显而易见的结论是MNP与被吸附到多孔膜上的抗原的结合与标准捕捉分子相比并不高效。不希望受理论所束缚,这种低结合可能是由于所研究的MNP的大尺寸,所述大尺寸限制了它们的膜穿透。因此,在以下实施例中,使用更小的MNP。
实施例2:对更小(≤30nm)MNP-抗体复合体的表征
为了克服实施例1中所述的系统的缺点,从大洋纳米科技公司(Ocean Nanotech)购得包含小尺寸的氧化铁纳米粒子(≤30nm)的磁性纳米粒子-抗体复合体。这些氧化铁(IO)纳米粒子涂有带有末端羧基的线性两亲性聚合物,所述聚合物可以用于固定抗体或其它蛋白质(图6)。
在以下实验中使用与辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗兔IgG二抗缔合的IO磁性纳米粒子(大洋纳米科技公司)。使用以下三种纳米粒子尺寸:10nm、20nm、以及30nm。在溶液中使用比色测定来测试纳米粒子的酶(HRP)活性,并与游离的标记抗体(抗兔IgG-HRP,来自杰克逊公司(Jackson))相比较。通过将一系列浓度的MNP或抗体溶液放置在非结合型96孔培养板的孔中(每孔50μl溶液)来进行这一分析。通过将100μl的标准TMB溶液添加到每一个孔中来进行显色,并且通过添加50μl硫酸来停止。通过使用培养板读数器对450nm处的光密度(OD450)进行读数来检测信号。
结果呈现于图7中,其中示出了随标记的MNP/抗体浓度而变化的OD450。在所有所测试的MNP的情况下均观测到高活性,同时发现所有MNP均比游离抗兔HRP更具活性(以摩尔计)。与抗兔-HRP缔合的磁性粒子随着磁性粒子直径增加而显示出更高的摩尔活性。通过使用如图7中所示的斜率值以及对于作为参考的游离抗兔HRP所记录的值,对于10nmMNP、20nmMNP以及30nm MNP,每个MNP的抗体分子的平均数目分别被估计为约1.5、4.5以及9.6。显然,更大的粒子每个粒子可以带有更大数目的抗体分子,并且因此它们的酶活性增加。
实施例3:使用带有二抗的小MNP的斑点印迹分析
使用兔IgG/抗兔IgG抗体的斑点印迹测定法
将兔IgG溶液(2μl)以一系列16种浓度(1.5倍稀释系列)点样到两个0.45μm的NC膜上,从而产生从5μg降至11ng的点样量。使一个膜与实施例2中所述的10nm IO磁性纳米粒子(0.43nM)反应。使第二参考膜与游离抗兔HRP在相似的条件(例如相同的摩尔浓度)下反应。使用4-CN底物和ChemiDoc MP成像器使颜色信号显影并且进行检测。
结果示于图8中。可以看到的是,10nm MNP的结果与游离抗兔HRP的结果相当。举例来说,可以通过这两种方法类似地检测最低量11ng的兔IgG。
使用转铁蛋白/抗转铁蛋白抗体的斑点印迹测定法
将人类转铁蛋白(hT)点样到NC膜上,与抗hT一抗反应,然后与20nmMNP(实施例2中所述的MNP)反应(这个程序的示意图概述于图9中)。
所述方案由以下步骤构成:
1.斑点形成:在圆形(1英寸直径)的硝化纤维素膜(0.45μm孔径,伯乐实验室公司(Bio-Rad Laboratories))上形成400ng人类转铁蛋白(hT,罗克兰免疫化学公司(RocklandImmunochemicals))的四个斑点。通过在膜表面上放置一滴2μl的于PBS缓冲液中的200μg/ml的浓度的hT,并且使它在环境条件下干燥约5分钟而形成每一个斑点。
2.封闭:在轻微振荡下将膜在以下封闭溶液中浸泡1小时:0.1%Tween20的TBS缓冲液(TBST)中10%的脱脂奶粉封闭剂(伯乐公司)。
3.一抗(1°Ab)的结合:在轻微振荡下将膜在含有2.1nM兔抗hT抗体(罗克兰公司)的封闭溶液中浸泡1小时。然后将膜通过在轻微振荡下在TBST中浸泡3次×5分钟来洗涤。
4.具有标记的二抗(2°Ab)的磁性纳米粒子(MNP)的结合:将膜浸泡在0.09nM连接有山羊抗兔IgG-HRP的20nm氧化铁MNP(大洋纳米科技公司)在封闭溶液中的溶液中。将膜轻微地振荡1小时。在相似的条件(例如相同的摩尔浓度以及反应时间)下进行参考反应(对照),其中使用抗兔HRP代替MNP。然后将膜通过在轻微振荡下在TBST中浸泡3次×5分钟来洗涤。
5.化学发光信号显影:将约0.3ml的针对HRP的化学发光显影溶液(Immun-Star蛋白质印迹试剂盒,伯乐公司)放在膜的顶部上。在1分钟之后使用ChemiDoc MP成像器(伯乐公司)以6秒的暴露时间记录信号。
结果示于图10中。其清楚地表明在使用20nm MNP的情况下的信号强于在使用游离抗体-HRP的情况下的参考信号。这可能是由于这个事实,即若干个抗体与每一个MNP结合(参见实施例2)。
这个实施例的主要结论是更小的MNP(≤30nm)可以与高效的捕捉剂和检测剂一样良好地起作用,并且不受它们的尺寸限制。
实施例4:施加磁场
在这个实施例中,测试在测定期间施加磁场的作用。如上文所述进行斑点印迹测定法。在这个实验中,将用作靶蛋白的兔IgG以一系列浓度(0.5ng、5ng、0.05μg、0.5μg以及5μg)印迹到硝化纤维素膜上,并且与0.05nM和抗兔IgG-HRP缀合的MNP反应。使用化学发光进行检测。为了施加磁场,将钕盘式磁体(1英寸的直径和厚度,最大表面场7300高斯,K&JMagnetics公司)放置在膜下。简单的磁场斑点印迹装置和实验设置呈现于图11A-C中。图11B是所述代表性装置的俯视照片,并且图11C是所述代表性装置的不同元件的照片:钕盘式磁体、膜、以及夹具。在图11A中示意性地图示的实验设置包括显示6个样品区的膜,其中五个是各自不同浓度的兔IgG并且一个是包括不相关抗体的对照样品(0.5μg的CAII)。
在施加磁场和没有施加磁场5分钟的情况下使用四种不同的测量剂来进行斑点印迹测定:10nm磁性纳米粒子-抗兔-HRP抗体的复合体、20nm磁性纳米粒子-抗兔-HRP抗体的复合体、30nm磁性纳米粒子-抗兔-HRP抗体的复合体、以及游离抗兔IgG-HRP(图12)。结果显示在施加磁场或没有施加磁场的情况下,在使用游离抗兔IgG进行的斑点印迹测定中,高兔IgG浓度(5μg和0.5μg)有非常弱的检测信号并且在更低的浓度,根本没有信号。在没有磁场的情况下使用10nm磁性粒子-抗体复合体进行的测定显示出与游离抗兔IgG-HRP测量剂相似的结果,然而在施加磁场时,检测信号明显提高并且所述测定甚至对0.05μg显示出灵敏度。当使用20nm和30nm磁性粒子-抗体复合体以及所施加的磁场进行测定时,检测信号变得甚至更加明显。灵敏度也被提高,显示出甚至在肉眼检查中检测出甚至直到5ng的更低的兔IgG水平的能力。因此,磁场主要在使用20nmMNP和30nm MNP的情况下明显地改进了检测。
实施例5:具有分开的抗体结合步骤的斑点印迹测定法和具有组合的抗体结合步
骤的斑点印迹测定法的比较
具有分开的抗体结合步骤的斑点印迹测定法:
在这个实验中,使纳米粒子复合体与二级结合剂缔合并且在将基质与第一结合剂一起孵育之后施用于所述基质(这个程序的示意图概述于图13中)。
所述方案由以下步骤构成(步骤1-3和5类似于上述实施例3中所详述的那些):
1.斑点形成:在圆形(1英寸直径)的硝化纤维素膜(0.45μm孔径,伯乐实验室公司)上形成400ng人类转铁蛋白(hT,罗克兰免疫化学公司)的四个斑点。通过在膜表面上放置一滴2μl的200μg/ml浓度的于PBS缓冲液中的hT,并且使它在环境条件下干燥约5分钟而形成每一个斑点。
2.封闭:在轻微振荡下将膜在以下封闭溶液中浸泡1小时:含0.1%Tween 20的TBS缓冲液(TBST)中10%的脱脂奶粉封闭剂(伯乐公司)。
3.一抗(1°Ab)的结合:在轻微振荡下将膜在含有2.1nM兔抗hT抗体(罗克兰公司)的封闭溶液中浸泡1小时。然后将膜通过在轻微振荡下在TBST中浸泡3次×5分钟来洗涤。
4.具有标记的二抗(2°Ab)的磁性纳米粒子(MNP)的结合:将膜浸泡在0.09nM连接有山羊抗兔IgG-HRP的20nm氧化铁MNP(大洋纳米科技公司)在封闭溶液中的溶液中。通过将膜放置在圆柱形钕磁体(1英寸的直径和厚度,最大表面场7300高斯,K&J Magnetics公司)的顶部上来施加磁场。将膜轻微振荡5分钟。对于对照实验,在没有施加磁场的情况下,将膜轻微振荡5分钟(对照1S)或1小时(对照1L)。然后将膜通过在轻微振荡下在TBST中浸泡3次×5分钟来洗涤。
5.化学发光信号显影:将约0.3ml的针对HRP的化学发光显影溶液(Immun-Star蛋白质印迹试剂盒,伯乐公司)放在膜的顶部上。在1分钟之后使用ChemiDoc MP成像器(伯乐公司)以6秒的暴露时间记录信号。
具有组合的抗体结合步骤的斑点印迹测定法:
在这个实验中,使纳米粒子复合体与二级结合剂缔合并且与第一结合剂一起预先孵育,然后将组合溶液施用于基质上(这个程序的示意图概述于图14中)。
●组合溶液的制备:作为初始步骤,在进行测定之前,制备1°Ab和经过2°Ab标记的MNP的组合溶液。这种溶液在封闭溶液中含有兔抗hT抗体(4.2nM)和20nM具有山羊抗兔IgG-HRP(0.18nM)的MNP,并且在使用之前在室温以30倍浓缩溶液的形式平衡至少1小时。
●如上文所述进行斑点形成(1)和封闭(2)的步骤。
●组合的抗体结合步骤:将膜浸泡在组合溶液中。通过将膜放置在圆柱形钕磁体(1英寸的直径和厚度,K&J Magnetics公司)的顶部上来施加磁场。将膜轻微振荡5分钟。对于对照实验,在没有施加磁场的情况下,将膜轻微振荡5分钟(对照2S)或1小时(对照2L)。然后将膜通过在轻微振荡下在TBST中浸泡3次×5分钟来洗涤。
●如上文所述进行化学发光信号显影步骤。
图15汇总了实施例5中所概述的实验的结果。
结果显示如下:
在施加磁场5分钟的情况下组合抗体测定法与具有分开的结合步骤的测定法相比显示出更高的检测信号。不希望受理论所束缚,这种结果可能是由于在组合测定法中孵育时间缩短,从而引起更少的非特异性结合。此外,组合测定法包括更少的处理步骤,如洗涤。
在施加磁场5分钟的情况下组合抗体测定法显示出比在没有磁场的情况下,甚至在实施长时间(1小时)结合步骤时在组合抗体测定法中所获得的信号更高的信号。在上述条件下分开抗体步骤测定法的比较显示出相反的行为,即在没有磁场的情况下具有长时间(1小时)结合步骤的测定法比在施加磁场5分钟的情况下相应的测定法显示出更高的检测信号。在这两种情况下,对于对照实验,在没有磁场的情况下进行测定一段短的时间时,没有观测到检测信号。
在分开结合步骤测定法中,结果表明磁场使检测加速,并且在一段短的时间之后表现出检测信号,在没有利用磁场的情况下没有如此快速地出现检测信号。
在组合抗体测定法中,在游离一抗和磁性纳米粒子-二抗复合体的混合物中进行结合步骤。可以在没有将游离一抗与和MNP结合的一抗分离的情况下进行所述程序,这是因为尽管游离一抗和现在与磁性纳米粒子结合的一抗这两者均可以与靶分子结合,但是当施加磁场时,磁性纳米粒子-一抗复合体以加快的速度被吸引到膜,而游离一抗保持在介质中并且以慢得多的速率与靶分子结合。这是一种简单的竞争,其中与MNP结合的一抗具有显著的优势。然而,在没有磁力的情况下,两种一抗(与MNP结合的一抗和游离一抗)彼此竞争结合靶蛋白,并且因此在没有施加磁体的情况下在一小时之后在这种测定法中检测信号更低。
因此,结果证实本发明的测定法提供了显著缩短的测定时间和可明显检测的结果。
不同的斑点印迹测定步骤和它们的持续时间汇总在表1中。
如可以从该表中看到的那样,通过使用本发明的技术显著地缩短了测定持续时间。
实施例6:磁体配置的按比例扩大
在实施例3-5中,使用斑点印迹测定法提供了概念验证。然后期望证实本发明在如蛋白质印迹法的其它测定法中的适用性。在这些测定法中,基质(即膜)的面积是更大的并且因此应当在更大的区域上均匀地施加磁场。
使用大块磁体(4英寸×4英寸×1英寸)进行最初的尝试,如图16中所示。然而,结果表明在表面上的磁场太弱并且不均匀,在磁体边缘附近更强(结果未示)。由Urbach等人先前证实,在MNP上施加的磁力不仅与磁场成比例,还与磁场梯度成比例。因此,由小立方形磁体(1/4英寸×1/4英寸×1/2英寸)构建磁体阵列,如图16中所示。磁极性是垂直的(即沿Z轴方向)并且每一个相邻磁体的磁极性是相反的(“棋盘式配置”),从而形成在每一个小磁体的边缘处具有高磁梯度的稳定结构,如由Osman等人所证实。
为了确保在整个膜区域上均匀的磁力,并且同时提供MNP溶液的混合,使得膜能够在X轴和Y轴方向上垂直移动。这是通过使用振荡器来进行的,如图17中所示。
使用这种实验装备产生了良好的结果,如以下实施例7-9中所述。
实施例7:具有组合的抗体结合步骤的蛋白质印迹测定法
利用磁力加速的测定法:
使用两种蛋白质,即人类转铁蛋白(hT,罗克兰公司)和人血清白蛋白(hSA,罗克兰公司)展示了蛋白质印迹测定法。所述方案由以下步骤构成:
1.电泳:使用聚丙烯酰胺预制凝胶(Mini-PROTEAN TGX 4%-20%凝胶,伯乐公司)。在含有355mM 2-巯基乙醇(伯乐公司)的标准Laemmli样品缓冲液中制备这两种蛋白质的原液,并且将所述原液通过加热到95℃,持续5分钟来预处理。对于每一个凝胶,将所述蛋白质中的一种(hT或hSA)在含有2-巯基乙醇的Laemmli样品缓冲液中以一系列的量(50ng、25ng、12.5ng、6.25ng、3.1ng、1.6ng、0.8ng、0.4ng以及0.2ng)上样到9条泳道中。在第10条泳道中,将分子量标准梯(molecular weight ladder)(Precision Plus蛋白质双色标准(Precision Plus Protein Dual Color Standards),伯乐公司)上样。使用Mini-PROTEANTetra Cell(伯乐公司),使用180V的操作电压进行电泳分离,持续约40分钟。
2.转移到膜上:使用Trans-Blot Turbo转移系统(伯乐公司)将蛋白质在电泳分离之后从凝胶转移到被嵌入Trans-Blot Turbo转移包(伯乐公司)中的硝化纤维素膜上。
3.封闭:在轻微振荡下将膜在如下封闭溶液中浸泡1小时:含0.1%Tween 20的TBS缓冲液(TBST)中10%的脱脂奶粉封闭剂(伯乐公司)。
4.组合溶液的制备:作为初始步骤,在进行测定之前,制备1°Ab和经过2°Ab标记的MNP的组合溶液。这种溶液在封闭溶液中含有兔抗hT抗体或抗hSA抗体(0.65nM)和具有山羊抗兔IgG-HRP(0.17nM)的0.013nM MNP,并且在使用之前在室温以30倍浓缩溶液的形式平衡至少1小时。
5.组合抗体结合步骤:将膜浸泡在组合溶液中。通过将膜放置在如上述实施例6中所述的磁体阵列的顶部上来施加磁场。使用如实施例6中所述的振荡装置将膜轻微振荡5分钟。然后将膜通过在轻微振荡下在TBST中浸泡3次×5分钟来洗涤。
6.化学发光信号显影:将约4ml的针对HRP的化学发光显影溶液(Clarity蛋白质印迹ECL底物(Clarity Western ECL substrate),伯乐公司)放在膜的顶部上。在5分钟之后使用ChemiDoc MP成像器(伯乐公司)记录信号。
参考测定法:
参考测定法是相同生物模型的标准蛋白质印迹实验。类似于利用磁力加速的测定法进行步骤1-3和6。代替步骤4和5,进行以下步骤:
4.1°Ab的结合:在轻微振荡下将膜在于封闭溶液中的0.65nM兔抗hT抗体或抗hSA抗体(罗克兰公司)中浸泡1小时。然后将膜通过在轻微振荡下在TBST中浸泡3次×5分钟来洗涤。
5.标记的2°Ab的结合:在轻微振荡下将膜在0.17nM山羊抗兔IgG-HRP(杰克逊公司)在封闭溶液中的溶液中浸泡1小时。然后将膜通过在轻微振荡下在TBST中浸泡3次×5分钟来洗涤。
图18和19汇总了这些实验的结果。Chemidoc MP图像(图18)和分析图表(图19)揭示了短时间的基于MNP的测定法对于hT模型和hSA模型这两者均产生更高的信号。基于MNP的测定法获得更多可检测的条带,这表明测定灵敏度更高。不希望受理论所束缚,信号的增加可能是由于这个事实,即有多个标记的抗体(在这种情况下,约12个)与每一个MNP连接,并且因此获得信号放大。
图18还示出了在基于MNP的测定法中背景噪音更高。因此需要减少这些测定中的背景并且获得更高的信噪比(SNR)。已经测试了许多实验参数以提高SNR。产生最显著提高的方法涉及将膜干燥,如以下实施例8中所述。
实施例8:通过膜干燥提高信噪比(SNR)
根据实施例6中标题为“利用磁力加速的测定法”的方案对hT和hSA进行蛋白质印迹测定,但有一些变化:
●在步骤1(电泳)中,靶蛋白的上样量是20ng、6.7ng、2.2ng、0.74ng、0.25ng、0.082ng、0.027ng以及0.009ng。
●在步骤2(转移)之后并且在步骤3(封闭)之前,通过将膜在实验室烘箱中在37℃在空气流动下放置30分钟来将它干燥。对一个膜施用这个干燥步骤,而不对另一个膜施用,该另一个膜用作参考以评估和证实干燥的作用。
图20和21汇总了这些实验的结果。Chemidoc MP图像(图20)和分析图表(图21)揭示包括膜干燥的测定法对于hT模型和hSA模型这两者均产生更高的信号和更低的背景(以及因此提高的SNR)。不希望受理论所束缚,更高的信号可能是由于靶蛋白被固定到膜上,以及阻止了蛋白质在随后的测定和洗涤步骤期间发生损失。更低的背景可能是由于更高效的封闭,封闭蛋白质是通过润湿过程被带入膜中的,所述润湿过程比标准封闭中的扩散过程要快速和高效得多。
实施例9:具有组合的抗体结合步骤的ELISA测定法
在以下实验中,目标在于证实与斑点印迹和蛋白质印迹测定法中所示相同的使用MNP的原理可以应用于非常常用的ELISA免疫测定法中。
利用磁力加速的测定法:
使用与上文所示相同的两种蛋白质,即hT和hSA进行ELISA测定。所述方案由以下步骤构成:
a.将孔表面用抗原蛋白涂覆:在标准96孔培养板(MaxiSorp,Nunc公司)中,将100μl在PBS中的蛋白质以一系列浓度(对于hT,3.33ng、1.11ng、0.37ng、0.12ng、0.04ng、以及0.01ng;对于hSA,1.67ng、0.56ng、0.19ng、0.06ng、以及0.02ng)放置在每一个孔中。将这些溶液在轻微振荡下在室温在培养板中保留2小时。最终,去除溶液并且将孔用PBS洗涤3次。
b.封闭:向每一个孔中,添加300μl封闭溶液,即在PBS缓冲液中的2%脱脂奶粉封闭剂(伯乐公司),并且在轻微振荡下保留1小时。在步骤4之前从孔中去除这种溶液。
c.组合溶液的制备:作为初始步骤,在进行测定之前,制备1°Ab和经过2°Ab标记的MNP的组合溶液。这种溶液在封闭溶液中含有兔抗hT抗体或抗hSA抗体(3.3nM)和0.031nM具有山羊抗兔IgG-HRP(0.54nM)的MNP,并且在使用之前在室温以30倍浓缩溶液的形式平衡至少1小时。
d.组合抗体结合步骤:添加组合溶液,每一个孔100μl。通过将培养板放置在如上述实施例6中所述的磁体阵列的顶部上来施加磁场。将培养板在磁体阵列上轻微振荡5分钟。最终,去除溶液并且将孔用PBS洗涤3次。
e.比色信号显影:添加针对HRP的比色检测溶液(TMB,丹科公司(Dako)),每孔100μl。当在所有孔中均可以观测到蓝色时,向每一个孔中添加50μl停止溶液(2N H2SO4)。使用培养板读数器(MultiSkan Go,赛默公司(Thermo))记录450nm处的信号。
参考测定法:
参考测定法是相同生物模型的标准ELISA实验。类似于利用磁力加速的测定法进行步骤1、2以及5。代替步骤3和4,进行以下步骤:
3.1°Ab的结合:向每一个孔中添加100μl在封闭溶液中的3.3nM兔抗hT抗体或抗hSA抗体(罗克兰公司)并且在轻微振荡下保留1小时。然后,去除溶液并且将孔用PBS洗涤3次。
4.标记的2°Ab的结合:向每一个孔中添加100μl在封闭溶液中的0.54nM山羊抗兔IgG-HRP(杰克逊公司)并且在轻微振荡下保留1小时。然后,去除溶液并且将孔用PBS洗涤3次。
图22汇总了这些实验的结果。对于hT模型和hSA模型这两者,对短时间的基于MNP的测定法记录到更高的SNR,这表明测定灵敏度更高。这种提高的SNR源自于更高的信号和更低的背景这两者(结果未示)。不希望受理论所束缚,信号的增加可能是由于这个事实,即有多个标记的抗体(在这种情况下,约17个)与每一个MNP连接,并且因此获得信号放大。
Claims (45)
1.一种用于检测靶分子的测定法,所述测定法包括:
a.将潜在地包含至少一种靶分子的基质与被可检测地标记的磁性纳米粒子(MNP)复合体一起孵育,其中所述MNP复合体包含具有小直径的与捕捉分子缔合的MNP,所述捕捉分子能够直接地或间接地与所述靶分子结合,其中在施加磁场的同时进行所述孵育;以及
b.对孵育过的基质进行检测步骤;
借此检测信号的存在指示所述靶分子的存在并且所述信号的强度指示所述靶分子的量。
2.根据权利要求1所述的测定法,其中所述基质是多孔基质。
3.根据权利要求2所述的测定法,其中所述多孔基质是膜、过滤器或凝胶。
4.根据权利要求2所述的测定法,其中所述多孔基质的平均孔径大于所述MNP的平均直径。
5.根据权利要求1所述的测定法,其中所述基质是无孔基质。
6.根据权利要求1所述的测定法,其中所述捕捉分子是一级结合剂。
7.根据权利要求1所述的测定法,其中所述捕捉分子是二级结合剂。
8.根据权利要求7所述的测定法,其中将所述基质与一级结合剂一起孵育,之后与包含所述二级结合剂的所述MNP复合体一起孵育。
9.根据权利要求7所述的测定法,其中将包含所述二级结合剂的所述MNP复合体与一级结合剂一起孵育,之后与所述基质一起孵育。
10.根据权利要求6、8或9中任一项所述的测定法,其中所述一级结合剂是一抗。
11.根据权利要求7-9任一项所述的测定法,其中所述二级结合剂是二抗。
12.根据权利要求1-9中任一项所述的测定法,其中所述MNP复合体中的所述MNP被可检测地标记。
13.根据权利要求1-9中任一项所述的测定法,其中所述MNP复合体中的所述捕捉分子被可检测地标记。
14.根据权利要求1-9中任一项所述的测定法,其中所述MNP复合体被标记剂可检测地标记,所述标记剂选自由以下各项组成的组:荧光化合物;荧光粒子;酶;发色团;或电化学活性分子或放射性分子。
15.根据权利要求14所述的测定法,其中所述荧光化合物是荧光素、FITC或藻红蛋白(PE)。
16.根据权利要求14所述的测定法,其中所述荧光粒子是量子点。
17.根据权利要求14所述的测定法,其中所述酶是辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)。
18.根据权利要求1所述的测定法,其中所述检测步骤包括信号显影反应。
19.根据权利要求18所述的测定法,其中所述信号显影反应是化学发光反应或比色反应。
20.根据权利要求1-9中任一项所述的测定法,其中所述MNP具有小于50nm的直径。
21.根据权利要求20所述的测定法,其中所述MNP具有10nm、20nm、25nm或30nm的直径。
22.根据权利要求1-9中任一项所述的测定法,其中所述测定法用于斑点印迹分析、蛋白质印迹分析、狭缝印迹法、ELISA或RIA。
23.根据权利要求1-9中任一项所述的测定法,其中所述磁场是通过由呈棋盘式配置的小磁体构成的磁体阵列产生的。
24.一种用于检测靶分子的测定法,所述测定法包括:
a.提供被可检测地标记的磁性纳米粒子(MNP)复合体,其中所述MNP复合体包含与二级结合剂缔合的MNP,所述二级结合剂能够结合一级结合剂;
b.将所述MNP复合体与一级结合剂一起孵育,从而形成第二MNP复合体,所述第二MNP复合体包含MNP、二级结合剂、以及一级结合剂;
c.将潜在地包含至少一种靶分子的基质与所述第二MNP复合体一起孵育,其中在施加磁场的同时进行所述孵育;以及
d.对孵育过的样品进行检测反应;
借此检测信号的存在指示所述靶分子的存在并且所述信号的强度指示所述靶分子的量。
25.根据权利要求24所述的测定法,其中所述基质是多孔基质。
26.根据权利要求25所述的测定法,其中所述多孔基质的平均孔径大于所述MNP的平均直径。
27.根据权利要求24所述的测定法,其中所述基质是无孔基质。
28.根据权利要求24所述的测定法,其中所述一级结合剂是一抗。
29.根据权利要求28所述的测定法,其中所述二级结合剂是二抗。
30.根据权利要求24至29中任一项所述的测定法,其中所述MNP复合体中的所述MNP被可检测地标记。
31.根据权利要求24至29任一项所述的测定法,其中所述MNP复合体中的所述二级结合剂被可检测地标记。
32.根据权利要求24至29中任一项所述的测定法,其中所述MNP复合体被标记剂可检测地标记,所述标记剂选自由以下各项组成的组:荧光化合物;荧光粒子;酶;发色团;或电化学活性分子或放射性分子。
33.根据权利要求32所述的测定法,其中所述荧光化合物是荧光素、FITC或藻红蛋白(PE)。
34.根据权利要求32所述的测定法,其中所述荧光粒子是量子点。
35.根据权利要求32所述的测定法,其中所述酶是辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)。
36.根据权利要求24所述的测定法,其中所述检测步骤包括信号显影反应。
37.根据权利要求36所述的测定法,其中所述信号显影反应是化学发光反应或比色反应。
38.根据权利要求24所述的测定法,其中所述MNP具有小直径。
39.根据权利要求38所述的测定法,其中所述MNP具有小于50nm的直径。
40.根据权利要求39所述的测定法,其中所述MNP具有10nm、20nm、25nm或30nm的直径。
41.根据权利要求24所述的测定法,其中所述测定法用于斑点印迹分析、蛋白质印迹分析、狭缝印迹法、ELISA或RIA。
42.根据权利要求1或24所述的测定法,其中在将所述基质与所述MNP复合体一起孵育之前,使用封闭溶液对所述基质进行封闭。
43.根据权利要求42所述的测定法,其中在将所述基质与封闭溶液一起孵育之前,对所述基质进行干燥步骤。
44.根据权利要求43所述的测定法,其中所述干燥步骤通过加热、空气流动、浸泡在极性有机溶剂中、真空或其任何组合来执行。
45.根据权利要求24至29任一项所述的测定法,其中所述磁场是通过由呈棋盘式配置的小磁体构成的磁体阵列产生的。
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