SE535918C2

SE535918C2 - Detektion av magnetiskt inmärkta biologiska komponenter

Info

Publication number: SE535918C2
Application number: SE1050593A
Authority: SE
Inventors: Annika Petersson
Original assignee: Hemocue Ab
Priority date: 2010-06-10
Filing date: 2010-06-10
Publication date: 2013-02-19
Also published as: EP2580571A4; SE1050593A1; US20130122513A1; EP2580571A1; WO2011155890A1; ZA201209329B

Abstract

En provtagningsanordning för detektion av biologiskakomponenter i ett vätskeformigt prov visas, innefattande enmätkavitet för mottagande av ett vätskeformigt prov och ettreagens innefattande en antikropp bunden till en magnetiskpartikel och arrangerad i en torr form inuti mätkaviteten.Ett förfarande visas vidare, innefattande att man blandarreagenset med det vätskeformiga provet, att man inför detvätskeformiga provet in i mätkaviteten, att man applicerarett magnetfält över vätskan så att den magnetiska partikelnförflyttas i magnetfältet och därigenom förflyttar denbiologiska komponenten till vilken de magnetiskt inmärktaantikropparna är bunden till, att man förvärvar åtminstone endigital bild efter att magnetfältet har förflyttats bort, attman digitalt analyserar den åtminstone en digitala bilden iavsikt att identifiera biologiska komponenter och att mandetekterar de magnetiskt inmärkta biologiska komponenterna i mätkaviteten. Ett system innefattande provtagningsanordningen och mätanordningen visas också.

Description

25 30 535 918 I US 2006/0024756 visas en anordning, förfarande och algoritm för läsning av fluorescensmärkta och magnetiskt inmärkta celler. I enlighet med det visade förfarandet fluorescensmärks samtliga celler, men endast målcellerna är även magnetiskt inmärkta. Det inmärkta cellprovet placeras i en kammare eller kuvett mellan två kilformade magneter för att selektivt förflytta de magnetiskt inmärkta cellerna till en observationsyta hos kuvetten. En LED belyser cellerna och en CCD-kamera fångar bilderna av det fluorescerande ljuset vilket utsänds av målcellerna. Märkning av cellerna kan ske i kuvetten eller kammaren som används för analys, eller kan provet förflyttas till en sådan kuvett eller kammare efter att tillräcklig tid förflutit för att medge cellmärkning.

Kuvettens volym är känd och används för att bestämma absoluta koncentrationen av målcellerna i blodprovet. Detta kräver dock att man väntar tills samtliga celler har förflyttats magnetiskt till en observationsyta innan de kan detekteras och räknas.

I US-patent nr. 4,910,148 visas ett förfarande och en anordning för att separera magnetiserade partiklar från biologiska vätskor i en provbehállare. Celler, såsom cancerceller, kan således separeras från andra celler genom att till vätskan tillsätta monoklonala antikroppar, bundna till järninnehållande polymerpartiklar. Med hjälp av en magnet, placerad på utsidan av behållaren, stannar de celler vilka har bundit till antikroppen kvar i behållaren då vätskan hälls av från behållaren.

Magnetiska polymerpartiklar och förfarandet för deras tillverkning visas i US~patent nr. 4,654,267. De magnetiska polymerpartiklarna tillverkas genom att blanda en lösning av järn(II)-salter, en vattendispersion av filtrerbara polymerpartiklar och en bas för att öka pH i lösningen. 10 15 20 25 30 535 918 Processen sker i avsaknad av syre och järn(II)-föreningen oxideras till järn(III)-föreningen vilka transporteras in i polymerpartiklarna och gör partiklarna paramagnetiska.

WO 2008/010761, vilken ingår häri genom hänvisning, visar en anordning och ett förfarande för räkning och bestämning av partiklar i ett prov. Förfarandet innefattar stegen förvärvning av minst en förstorad digital bild av provet, identifiering av partiklar som är avbildade i fokus i bilden och bestämning av typ och antal av dessa partiklar.

Mätanordningen för räkning av partiklar eller vita blodkroppar i ett prov innefattar en hållare, vilken är anordnad att mottaga en provtagningsanordning vilken är anordnad att ta emot ett prov, ett bildsystem, innefattande ett förstoringsorgan och minst en anordning för förvårvning av minst en digital bild av provet, och en bildanalysator vilken är anordnad att analysera den digitala bilden för identifiering av partiklar och bestämning av antalet partiklar och anordnad att analysera den digitala bilden för identifiering av partiklar vilka är avbildade i fokus, bestämning av partiklarnas typer, varvid typerna särskiljs genom de fysiska egenskaperna och bestämningen av förhållandet mellan olika typer av partiklar.

WO 2006/096126, vilken ingår häri genom hänvisning, visar ett förfarande och ett system för volymetrisk bestämning av antalet vita blodkroppar. Förfarandet innefattar tagning av ett blodprov in i en mätkavitet hos en provtagningsanordning, varvid mätkaviteten i innefattar ett reagens innefattande ett hemolyseringsmedel och ett infärgningsmedel vilket ska reagera med provet varvid de vita blodkropparna infärgas. Förfarandet innefattar vidare bestrálning av provet, förvärvning av en digital bild av en förstoring av det bestràlade provet i mätkaviteten, varvid de 10 15 20 25 30 535 918 vita blodkropparna i provet särskiljs genom den selektiva infärgningen och därefter digital analysering av den digitala bilden för identifiering av de vita blodkropparna och bestämning av antalet vita blodkroppar i provet. Den digitala bilden är förvärvad med ett skårpedjup vilket åtminstone motsvarar tjockleken hos mätkaviteten och ett tillräckligt fokus uppnås för hela provtjockleken så att hela tjockleken hos mätkaviteten kan analyseras samtidigt i den digitala bilden av provet. Genom att välja att inte fokusera väldigt skarpt på en specifik del av provet kan tillräcklig fokus uppnås i hela provtjockleken vilket medger identifiering av antalet vita blodkroppar i provet.

Sammanfattning av uppfinningen Ett syfte med uppfinningen är att tillhandahålla en enkel analys för detektion av magnetiskt inmärkta biologiska komponenter i ett vätskeformigt prov.

Enligt en aspekt av uppfinningen är syftet att tillhandahålla en enkel analys för volymetrisk bestämning av magnetiskt inmärkta biologiska komponenter i ett vätskeformigt prov.

Ett ytterligare syfte med uppfinningen är att tillhandahålla en snabb analys utan behov av komplicerade anordningar eller omfattande provberedningar.

Dessa syften uppnås delvis eller helt med en provtagningsanordning, ett förfarande och ett system enligt de oberoende kraven. Föredragna utföringsformer framgår av de beroende kraven.

Sålunda tillhandahålls, enligt en aspekt av uppfinningen, en provtagningsanordning för detektion av 10 15 20 25 30 535 918 biologiska komponenter i ett vätskeformigt prov.

Provtagningsanordningen innefattar en mâtkavitet för mottagande av ett vätskeformigt prov, varvid mätkaviteten har en förutbestämd fix tjocklek definierad mellan innerväggarna hos mätkaviteten. Provtagningsanordningen innefattar också ett reagens vilket är anordnat i en torr form inuti mätkaviteten, varvid nämnda reagens innefattar en antikropp bunden till en magnetisk partikel.

Det vätskeformiga provet kan till exempel vara en kroppsvätska, såsom outspätt helblod, urin eller spinalvätska; eller en cellkultur, såsom en cellkultur från däggdjur eller en bakteriekultur. Det vätskeformiga provet kan vara en outspädd biologisk vätska vilken inte har genomgått någon förbehandling. Förbehandling av biologiska prov, såsom utspädning, centrifugering och lysering leder till en lägre precision i relationen mellan bestämda celler och analyserad volym. Ju fler förbehandlingssteg desto lägre blir precisionen i bestâmningen. Genom att inte genomföra någon slags förbehandling innan provet tas upp i den för användning färdiga provtagningsanordningen, är förfarandet ytterligare förenklad. Det är således möjligt att detektera närvaron och mängden av till exempel en specifik cellsort i ett blodprov.

De biologiska komponenterna i det vätskeformiga provet kan till exempel vara eukaryota celler såsom däggdjursceller (t.ex. leukocyter och trombocyter), bakterier, virus och makromolekyler såsom DNA.

Reagenset i provtagningsanordningen kan innefattar vidare ett hemolyseringsmedel för lysering av röda blodkroppar i ett blodprov och/eller ett infärgningsmedel för selektiv infärgning av specifika celler i ett vätskeformigt 10 15 20 25 30 535 918 prov.

Hemolyseringsmedlet kan vara ett kvarternärt ammoniumsalt, ett saponin, en gallsyra såsom en deoxykolsyra. ett digitoxin, ett ormgift, en glykopyranosid eller en nonjonaktiv detergent av typen Triton@. Dock torde det inses att hemolyseringsmedlet inte är begränsat till denna grupp, utan många andra ämnen kan övervägas.

Infärgningsmedlet kan vara något ut gruppen hematoxylin, methylenblått, methylengrönt, methylenazur, kresolviolett- acetat, eosin Y eller eosin B, toluidinblått, gentiana- violett, sudananaloger, gallocyanin och fuksinanaloger eller kombinationer därav. Dock torde det inses att infärgningsmedlet inte är begränsat till denna grupp, utan många andra ämnen kan övervägas.

Provtagningsanordningen tillhandahåller en möjlighet att direkt erhålla ett helblodsprov in i mätkaviteten och tillhandahålla det for analys. Det finns inget behov för provpreparation; ett blodprov kan sugas in i mätkaviteten direkt från en patients stuckna finger. Att man försett provtagningsanordningen med ett reagens möjliggör en reaktion i provtagningsanordningen som färdigställer provet för en analys. Reaktionen påbörjas när blodprovet kommer i kontakt med reagenset. Det finns således inget behov för manuell preparation av provet, vilket gör analysen särskilt lämpad att utföras direkt i ett undersökningsrum medan patienten väntar.

Eftersom reagenset tillhandahålls i en torr form kan provtagningsanordningen transporters och lagras under en läng tid utan att provtagningsanordningens användbarhet påverkas.

Provtagningsanordningen med reagenset kan således tillverkas 10 15 20 25 30 535 918 och prepareras lång tid innan man utför analysen av blodprovet.

Provtagningsanordningen enligt föreliggande uppfinning kan således enkelt och reproducerbart användas även av en otränad person, och även inte nödvändigtvis i en vanlig standardiserad laboratoriemiljö, eftersom provtagnings- anordningen kan utgöra ett kit som är färdigt att använda, varvid provinloppet hos provtagningsanordningen endast behöver föras i kontakt med provet för att tillhandahålla prov i en form som är redo att analyseras.

Mätkaviteten kan således ha en tillräcklig tjocklek för att tillåta en ganska stor volym av det vätskeformiga provet att analyseras och medger därför tillförlitliga värden vid volymbestämningen av magnetiskt inmärkta biologiska komponenter. Antalet magnetiskt inmärkta biologiska komponenter kan således erhållas genom summering av de individuellt bestämda magnetiskt inmärkta biologiska komponenterna vilka har förflyttats mot ett applicerat magnetfält i en definierad volym.

Provtagningsanordningen kan innefatta en stomme som har två plana ytor som definierar nämnda mätkavitet. De plana ytorna kan vara anordnade på ett förbestämt avstånd från varandra så att de bestämmer en provtjocklek for en optisk mätning. Detta medför att provtagningsanordningen tillhandahåller en väldefinierad tjocklek för den optiska mätningen, vilken kan användas för att korrekt bestämma antalet magnetiskt inmärkta biologiska komponenter per volymetrisk enhet av det vätskeformiga provet. En volym av ett analyserat vätskeformigt prov är väldefinierat genom mätkavitetens tjocklek och den area av provet som avbildas.

Således kan den väldefinierade volymen användas till att 10 15 20 25 30 535 918 sätta antalet magnetiskt inmärkta biologiska komponenter i relation till volymen av provet på så sätt att det volymetriska antalet magnetiskt inmärkta biologiska komponenter bestäms.

Mätkaviteten har företrädesvis en likformig tjocklek på 50-500 mikrometer. En tjocklek pá minst 50 mikrometer medför att mätkaviteten inte tvingar ett vätskeformigt prov, såsom ett cellprov, att smetas ut till ett monolager och medger att en större volym våtskeformigt prov analyseras över en liten tvärsnittsarea. Således kan en tillräckligt stor volym av det vätskeformiga provet analyseras i avsikt att ge tillförlitliga värden pà antalet magnetiskt inmärkta biologiska komponenter med användning av en relativt liten bild av cellprovet. Tjockleken är mer företrädesvis minst 100 mikrometer, vilket medger att en ännu mindre tvärsnittsarea analyseras eller att en större provvolym analyseras. Vidare så förenklar även en tjocklek på minst 50 mikrometer och mer föredraget 100 mikrometer också tillverkning av mätkaviteten som har en väldefinierad tjocklek mellan de två plana ytorna.

För de flesta prov, t.ex. ett blodprov, anordnat i en kavitet som har en tjocklek på inte mer än 500 mikrometer så år antalet magnetiskt inmärkta biologiska komponenter, såsom celler i ett blodprov, så litet att det endast kommer förekomma mindre avvikelser pá grund av att komponenter är anordnade överlappande varandra. Effekten av sådana avdikelser kommer dock att hänföra sig till antalet magnetiskt inmärkta biologiska komponenter och kan således, åtminstone i viss utsträckning, hanteras med hjälp av att man statistiskt korrigerar resultatet. Denna statistiska korrigering kan baseras pá kalibreringar av mätapparaturen.

Avvikelserna kommer vara ännu mindre för en mätkavitet som har en tjocklek på inte mer än 200 mikrometer, varvid en 10 15 20 25 30 535 918 enklare kalibrering kan användas. Denna tjocklek behöver eventuellt inte ens någon kalibrering för överlappande biologiska komponenter. Tjockleken hos mätkaviteten är tillräckligt liten för att möjliggöra för mätanordningen att förvärva en digital bild sä att hela mätkavitetens djup kan analyseras samtidigt.

Provupptagningsanordningen kan förses med ett reagens som anbringats ytan genom införsel in i mätkaviteten.

Reagenset är med fördel löst i en flyktig vätska vilken har avdunstat och kvarlämnat reagenset i en torr form. Detta medför att vätska pá ett effektivt sätt kan avdunstas frán det tränga utrymmet hos mätkaviteten vid tillverkning och preparation av provtagningsanordningen.

Reagenset kan med fördel lösas i ett organiskt lösningsmedel och mer företrädesvis lösas i metanol. Sådana lösningsmedel är flyktiga och kan lämpligen användas till att torka reagenset pà en yta hos mätkaviteten.

Den föreliggande uppfinningens reagens, inklusive alla sina beståndsdelar, är företrädesvis lösbart och/eller suspenderbart i det vätskeformiga provet vilket ska analyseras och stannar företrädesvis kvar i lösningen/suspensionen under hela analysen. Användandet av ett upplösningsbart/suspenderbart reagens, företrädesvis ett enkelt upplösningsbart/suspenderbart reagens, underlättar blandningen av reagenset med det vätskeformiga provet och påskyndar eventuella reaktioner mellan reagenset och det vätskeformiga provet inklusive den biologiska komponenten vilken ska mätas.

Den föreliggande uppfinningens reagens innefattar en antikropp bunden till en magnetisk partikel. Antikroppen 10 15 20 25 30 535 918 10 bunden till en magnetisk partikel är företrädesvis anordnad att binda till en specifik molekylär struktur hos en biologisk komponent. Exempel på sådana molekyler inkluderar antigener såsom, men inte begränsat till, ligander, receptorer, antikroppar och antikroppfragment. Exempel på antikroppfragment är till exempel antigenbindande fragment (fragment antigen binding region, Fab), kristalliserbara fragment (fragment crystallizable region, Fc) och varierbart enkelkedjefragment (singel chain fragement Variable).

Den molekylära strukturen kan vara vilken som helst specifik molekylär struktur hos en biologisk komponent, till exempel en markör på cellytan såsom CD4 och CD8, eller en intracellulär struktur såsom DNA. En markör på cellytan definieras häri som vilken som molekylär karakteristika hos en cells plasmamembran som är tillgänglig från cellens utsida, såsom ett antigen. Detta medför att vilka som helst celltyper kan detekteras för vilket syfte som helst, såsom detektering och bestämning av CD4-positiva celler för att övervaka en HIV-infektion.

Mängden antikroppar bundna till magnetiska partiklar är företrädesvis valt så att det finns en tillräcklig mängd att binda till de biologiska komponenterna. I avsikt att säkerställa att väsentligen samtliga sökta biologiska molekyler märks tillräckligt av antikroppen inom rimlig tid så måste antikropparna bundna till magnetiska partiklar förekomma i överskott. Det kommer dock fortfarande att förekomma obundna antikroppar bundna till magnetiska partiklar i det blandade provet och det är önskvärt att denna obundna koncentration hålls tillräckligt låg för att hålla nere bakgrunden när provet analyseras. Således bör antikropparna bundna till magnetiska partiklar inte förekomma i för stort överskott. Förhållandet mellan bundna och obundna 10 15 20 25 30 535 918 11 antikroppar är beroende av affiniteten mellan antikroppen och den biologiska komponenten, och den tid som avsatts för att blanda antikropparna med den biologiska komponenten.

Provtagningsanordningen kan vidare innefatta ett provinlopp vilken gör att mätkaviteten står i förbindelse med provtagningsanordningens utsida, varvid nämnda inlopp är anordnat att mottaga ett vätskeformigt prov. Provinloppet kan vara anordnat att dra upp ett vätskeformigt prov genom kapillârkraft och mätkaviteten kan vidare dra vätska från inloppet in i kaviteten. Som ett resultat härav kan det vätskeformiga provet lätt erhållas in i mätkaviteten genom att man helt enkelt för provinloppet i kontakt med vätskan.

Sedan drar provinloppets och mätkavitetens kapillärkrafter upp en väldefinierad mängd av vätska in i mätkaviteten.

Alternativt sä kan det vâtskeformiga provet sugas eller dras in i mätkaviteten genom att man anbringar en extern pumpkraft på provtagningsanordningen. I enlighet med ett ytterligare alternativ så kan det vätskeformiga provet erhållas in i en pipett och sedan införas in i mätkaviteten med hjälp av pipetten.

Provtagningsanordningen kan vara av engángstyp, dvs. den är anordnad att användas endast en gäng. Provtagnings- anordningen tillhandahåller ett kit för utförande av räkning av magnetiskt inmärkta biologiska komponenter, eftersom provtagningsanordningen är i stånd att mottaga ett vätskeformigt prov och häller samtliga reagens som behövs för att överlämna provet till beräkning. Detta är särskilt möjliggjort eftersom provtagningsanordningen är anpassad för användning endast en gång och kan formas utan att man behöver tänka pä möjligheterna att tvätta provtagningsanordningen och sedan àterapplicera ett reagens. Vidare kan provtagnings- anordningen formas i ett plastmaterial och därigenom 10 15 20 25 30 535 918 12 tillverkas till en låg kostnad. Sålunda kan det fortfarande vara kostnadseffektivt att använda en provtagningsanordning av engàngstyp.

I enlighet med en annan aspekt hänför sig föreliggande uppfinning till ett förfarande för detektion av magnetiskt inmärkta biologiska komponenter i ett vâtskeformigt prov.

Förfarandet innefattar att man blandar ett reagens innefattande en antikropp bunden till en magnetisk partikel med ett vätskeformigt prov på så sätt att antikroppen binder till en specifik molekylär struktur hos en biologisk komponent i det vätskeformiga provet; att man inför det vätskeformiga provet in i en mätkavitet hos provtagningsanordningen, varvid nämnda mätkavitet har en förbestämd fix tjocklek; att man valfritt förvärvar åtminstone en digital bild av en förstoring av den bestrålade arean i mätkaviteten; att man applicerar ett magnetfält över det vätskeformiga provet i mätkaviteten, så att den magnetiska partikeln förflyttas mot magnetfältet och därigenom förflyttar den biologiska komponenten till vilken den magnetiskt inmärkta antikroppen är bunden till; att man förvärvar åtminstone en digital bild av en förstoring av den besträlade arean i mätkaviteten efter att magnetfältet har förflyttats bort från nämnda mätkavitet; att man digitalt analyserar den åtminstone en digitala bilden för att identifiera biologiska komponenter vilka är avbildade i fokus och bestämmer positioner, typer och antal av dessa biologiska komponenter, där positionerna bestäms av de fysiska egenskaperna hos den digital bilden och typerna särskiljs genom komponenternas fysiska egenskaperna; och att man detekterar de magnetiskt inmärkta biologiska komponenterna i mätkaviteten, varvid nämnda detektion innefattar identifiering i den åtminstone en digitala bilden av de magnetiskt inmärkta biologiska komponenterna positionerade 10 15 20 25 30 535 9¶8 13 vid en av mätkavitetens plana ytor.

I enlighet med en utföringsform av förfarandet för detektion av magnetiskt inmärkta biologiska komponenter i ett vätskeformigt prov innefattar detektionen av de magnetiskt inmärkta biologiska komponenterna i mätkaviteten identifiering av de magnetiskt inmärkta biologiska komponenterna vilka har förflyttats mot det pålagda magnetfältet, varvid identifieringen innefattar jämförelse av positionerna i den åtminstone först förvärvade digitala bilden med positionerna i den åtminstone andra förvärvade digitala bilden, varvid de magnetiskt inmärkta biologiska komponenterna har förändrat sina positioner från den åtminstone först förvärvade digitala bilden till den åtminstone andra förvärvade digitala bilden.

I enlighet med en utföringsform av förfarandet för detektion av magnetiskt inmärkta biologiska komponenter i ett vätskeformigt prov förflyttas det pålagda magnetfältet utmed den plana mätkaviteten, dvs. vinkelrät mot mätkavitetens bestrålningsriktning. Förflyttningen av magnetfältet över mätkavitetens bestrålade area kan vara med konstant, ökande eller minskade hastighet. När det pàlagda magnetfältet förflyttas vinkelrät mot mätkavitetens besträlningsriktning, förflyttas de magnetiskt inmärkta biologiska komponenterna ut ur den följande åtminstone andra förvärvade bilden vilket gör det enkelt att detektera de biologiska komponenter vilka är magnetiskt inmärkta när den åtminstone först förvärvade bilden jämförs med den åtminstone andra förvärvade bilden.

I enlighet med en utföringsform av förfarandet för detektion av magnetiskt inmärkta biologiska komponenter i ett vätskeformigt prov innefattar den digitala analysen av den åtminstone en digitala bilden innefattar bestämning av 10 15 20 25 30 535 918 14 positioner och antalet av de biologiska komponenter vilka är avbildade tillräckligt i fokus i hela provtjockleken varvid den åtminstone en digitala bilden är förvärvad med ett skårpedjup motsvarande åtminstone tjockleken hos mätkaviteten.

I det här sammanhanget innebär "skärpedjup” en utsträckning i en riktning utmed den optiska axeln som avbildas i tillräcklig fokus för möjliggörande av bildanalys för att identifiera celler belägna inom denna längd. Detta "skärpedjup” kan vara större än ett sedvanligt skärpedjup definierat av de optiska inställningarna.

I enlighet med en utföringsform av förfarandet för detektion av magnetiskt inmärkta biologiska komponenter i ett vätskeformigt prov innefattar provtagningsanordningen ett reagens, vilket är anordnat i en torr form inuti mätkaviteten, varvid reagenset innefattar en antikropp bunden till en magnetisk partikel. Sedan åstadkoms omblandningen genom att man inför det vâtskeformiga provet in i mätkaviteten så att det kommer i kontakt med reagenset. Detta medför att det inte finns något behov av att förbehandla provet. En reaktion kan påbörjas när blodprovet kommer i kontakt med reagenset. Således finns det inget behov av att manuellt preparera provet, vilket medför att analysen är särskilt lämpad för att utföras direkt i ett undersökningsrum medan patienten väntar.

I enlighet med en alternativ utföringsform kan dock blandningen av reagenset med det vâtskeformiga provet utföras innan det vâtskeformiga provet införs in i mätkaviteten. I enlighet med ett annat alternativ kan omblandningen utföras i minst två steg, varvid ett första steg utförs innan provet införs in i mätkaviteten och det andra steget utförs i 10 15 20 25 30 535 918 15 mätkaviteten. Detta medför att preparationen av provet åtminstone delvis utförs utanför provtagningsanordningen.

Fördelen med att använda en provtagningsanordning vilken har en mätkavitet med en fix tjocklek kvarstår dock fortfarande.

Således tillhandahåller förfarandet en möjlighet att bestämma antalet biologiska komponenter per volymetrisk enhet av det vätskeformiga provet.

Det vätskeformiga provet införs företrädesvis in i mätkaviteten hos provtagningsanordningen genom ett kapillärt provinlopp med hjälp av kapillärkraft.

Den åtminstone en digital bild för bestämning av positioner, typer och antal av de biologiska komponenterna kan förvärvas av en mätanordning i enlighet med den i WO 2008/010761 visade, dvs. förvärvning av åtminstone en digital bild av ett bildsystem vilket använder en förstoringsgrad av omkring 10x med ett skärpedjup i området 8-10 mikrometer.

Den åtminstone en digital bild för bestämning av positioner och antal av de biologiska komponenterna kan förvärvas av en mätanordning i enlighet med den i WO 2006/096126 visade, dvs. förvärvning av den åtminstone en digitala bilden av ett bildsystem vilket använder en förstoringsgrad av omkring 3-4x med ett skärpedjup i området 140-170 mikrometer.

Mätanordningarna enligt WO 2008/010761 och WO 2006/096126 kan förändras för att användas i förfarandet enligt uppfinningen genom att lägga till medel för att generera ett magnetfält på endera eller båda sidorna av mätkaviteten. Magnetfältet kan genereras genom placering av en permanent magnet och/eller en elektromagnet på endera sida eller båda sidorna av provtagningsanordningen innefattande 10 15 20 25 30 535 518 16 mätkaviteten. Det pålagda magnetfältet kan då påverka de magnetiskt inmärkta biologiska komponenterna under en lämpligt lång tidsperiod, företrädesvis kortare än 10 minuter. De magnetiskt inmärkta biologiska komponenterna i det vätskeformiga provet förflyttas då mot magnetens magnetfält. Den permanenta magneten kan också förses med medel för att kunna ändra sin position, från att påverka de magnetiskt inmärkta biologiska komponenterna i mätkaviteten till en position där magnetens magnetfält inte påverkar de magnetiskt inmärkta biologiska komponenterna i mätkaviteten.

När magnetfältet genereras av en elektromagnet kan magnetfältet stängas av när det inte behövs längre. Den permanenta magneten eller elektromagneten placerad på en eller båda sidor om mätkaviteten kan också förses med medel för att kunna förflyttas längs med mätkaviteten. Den permanenta magneten eller elektromagneten kan förflyttas med konstant, ökande eller minskande hastighet och således också förflytta det pålagda magnetfältet.

Analyseringen kan vidare innefatta att man elektroniskt förstorar den åtminstone en förvärvade digitala bilden. Medan provet förstoras för förvärvande av en förstorad digital bild av provet kan den förvärvade digitala bilden i sig elektroniskt förstoras i avsikt att förenkla urskiljandet av objekt vilka är avbildade väldigt nära varandra i den förvärvade digitala bilden.

I enlighet med ännu en annan utföringsform hänför sig föreliggande uppfinning till ett system för volymetrisk räkning av magnetiskt inmärkta biologiska komponenter i ett vätskeformigt prov, varvid nämnda system innefattar en provtagningsanordning såsom definierats ovan och en mätapparatur innefattande en provtagningsanordningshàllare anordnad att mottaga provtagningsanordningen vilka innehåller 10 15 20 25 30 535 918 17 ett vätskeformigt prov i mätkaviteten, en ljuskälla anordnad att bestråla det vätskeformiga provet med elektromagnetisk strålning av en förbestämd våglängd, ett avbildningssystem, innefattande ett digitalbildsförvärvningsorgan för förvärvande av åtminstone en digital bild av det bestrálade provet i mätkaviteten, varvid magnetiskt inmärkta biologiska komponenter urskiljs i den åtminstone en digitala bilden genom selektiv avbildning med avseende på elektromagnetisk våglängd, och en bildanalysator anordnad att analysera den åtminstone en förvärvade digitala bilden för identifiering av magnetiskt inmärkta biologiska komponenter och bestämning av antalet magnetiskt inmärkta biologiska komponenter i det vätskeformiga provet.

Bildsystemet kan vara anordnat att förvärva ett flertal digitala bilder av provet med användning av olika optiska inställningar, varvid bildanalysatorn är anordnad att analysera varje förvärvad digital bild för identifiering av biologiska komponenter eller infärgade vita blodkroppar och bestämning av antalet biologiska komponenter eller vita blodkroppar i provet, varvid bildanalystorn är anordnad att analysera varje förvärvad digital bild för identifiering av biologiska komponenter eller vita blodkroppar som avbildas i fokus och bestämning av typer och antal för dessa biologiska komponenter eller vita blodkroppar, varvid positionerna bestäms av de fysiska egenskaperna hos den digitala bilden och typerna särskiljs genom fysiska egenskaper hos biologiska komponenter eller de infârgade vita blodkropparna, varigenom förhållandet och positionerna mellan olika typer av biologiska komponenter eller vita blodkroppar i provet bestäms.

Genom förvärvning av flera digitala bilder vid olika nivåer i skärpedjupets riktning i provet, är det möjligt att 10 15 20 25 30 535 918 18 analysera en relativt stor provvolym även vid användning av en hög förstoring. En hög förstoring gör det, på grund av det resulterande lilla skärpedjupet, svårt att se hela volymen i en bild. Eftersom förstoringsnivån påverkar skärpedjupet, möjliggör steget att förvärva flera digitala bilder användningen av en större förstoring, vilken i sin tur möjliggör, i varje bild, särskiljning av olika sorter av biologiska komponenter eller vita blodkroppar beroende på, bland annat, formen, antalet eller storleken hos kärnorna.

Bildsystemet kan vara anordnat att förvärva en enstaka digital bild av provet förvärvad med ett skärpedjup av åtminstone tjockleken hos mätkaviteten. Ett tillräckligt fokus uppnås för hela provtjockleken, vilken sedan analyseras samtidigt i den enstaka digitala bilden av provet. Skarpt fokus föreligger inte på en specifik del av provet och ett tillräckligt fokus uppnås över hela provtjockleken.

Bildsystemet är anordnat att analysera den förvärvade digitala bilden för identifiering av biologiska komponenter eller infärgade vita blodkroppar och bestämma antalet och positionerna för de biologiska komponenterna eller vita blodkropparna i provet, varvid bildanalystorn är anordnad att analysera den förvärvade digitala bilden för identifiering av biologiska komponenter eller vita blodkroppar som avbildas i tillräcklig fokus och bestämning av positioner och antal för dessa biologiska komponenter eller vita blodkroppar, varvid positionerna särskiljs genom fysiska egenskaper hos den digitala bilden, varigenom förhållandet och positionerna mellan olika biologiska komponenter eller vita blodkroppar i provet bestäms.

Genom förvärvning av en enstaka digital bild av provet med ett skärpedjup av åtminstone tjockleken hos mätkaviteten kan hela provvolymen analyseras, dock utan möjligheten att 10 15 20 25 30 535 918 19 differentiera mellan olika slags biologiska komponenter eller vita blodkroppar, men med möjligheten att skilja ut de som inte längre finns närvarande i en andra förvärvad bild.

Mätapparaten kan använda provtagningsanordningens egenskaper såsom beskrivits ovan i avsikt att utföra en analys av ett vätskeformigt prov vilket har erhållits direkt in i mätkaviteten. Mätapparaten kan avbilda en bestämd volym av provet i avsikt att utföra en volymetrisk bestämning av biologiska komponenter i provet.

Kort beskrivning av ritningarna Uppfinningen kommer nu att beskrivas i ytterligare detalj med hjälp av exempel och med hänvisning till de bifogade ritningarna.

Fig. 1 är en schematisk vy av en provtagnings- anordning i enlighet med en utföringsform av uppfinningen.

Fig. 2 är ett flödesschema för ett förfarande enligt en utföringsform av uppfinningen.

Fig. 3 är ett flödesschema för ett förfarande enligt en annan utföringsform av uppfinningen.

Fig. 4 a. är en schematisk vy av en förvärvad bild med ett skârpedjup vilket åtminstone motsvarar mätkavitetents tjocklek, och b. är en schematisk vy av bilden i fig. 4 a efter att ett magnetfält har applicerats i rörelse över mätkaviteten.

Fig. 5 är en schematisk vy av ett mätsystem i enlighet med en utföringsform av uppfinningen. 10 15 20 25 30 535 918 20 Fig. 6 a. är en schematisk vy av ett mätsystem i enlighet med en annan utföringsform av uppfinningen, innan en analys av innehållet i mätkaviteten startats, b. är en schematisk vy av mätkaviteten efter att ett magnetfält har applicerats, och c. är en schematisk vy av mätkaviteten efter att ett rörligt magnetfält har applicerats.

Detaljerad beskrivning av en föredragen utföringsform Med hänvisning till fig. 1 kommer nu en provtagnings- anordning 10 i enlighet med en utföringsform av uppfinningen att beskrivas. Provtagningsanordningen 10 är av engàngstyp och kommer att kastas efter att ha använts för analys. Detta medför att provtagningsanordningen 10 inte erfordrar komplicerad hantering. Provtagningsanordningen 10 är utformad i ett plastmaterial och år tillverkad genom formsprutning.

Detta gör tillverkningen av provtagningsanordningen 10 enkel och billig, varigenom kostnaden for provtagningsanordningen 10 kan hållas nere.

Provtagningsanordningen 10 innefattar en stomdel 12, som har en bas 14, vilken kan vidröras av en operatör utan att orsaka någon störning av analysresultat. Basen 14 har projektioner 16 som passar en hållare i en analysapparat.

Projektionerna 16 är anordnade på sådant sätt att provtagningsanordningen 10 kommer att positioneras korrekt i analysapparaten.

Provtagningsanordningen 10 innefattar vidare ett provinlopp 18. Provinloppet 18 definieras mellan motstående väggar inom provtagningsanordningen 10, varvid väggarna är anordnade så pass nära varandra så att en kapillârkraft skapas i provinloppet 18. Provinloppet 18 kommunicerar med 10 15 20 25 30 535 918 21 provtagningsanordningens 10 utsida i avsikt att medge att blod dras in i provtagningsanordningen 10. Provtagnings- anordningen 10 innefattar vidare en kammare för räkning av magnetiskt inmärkta biologiska komponenter, såsom celler, i form av en mätkavitet 20 anordnad mellan motstående väggar inuti provtagningsanordningen 10. Mätkaviteten 20 är anordnad i kommunikation med provinloppet 18. Väggarna vilka definierar mätkaviteten 20 är anordnade närmare varandra än väggarna hos provinloppet 18, så att en kapillärkraft kan dra blod från provinloppet 18 in i mätkaviteten 20.

Mätkaviteten 20 är i kommunikation med provinloppet 18.

Mätkavitetens 20 väggar är anordnade vid ett avstånd från varandra på 50-500 mikrometer. Mätkaviteten 20 är mer föredraget åtminstone 100 mikrometer tjock. Vidare är mätkaviteten 20 mer föredraget inte mer än 250 mikrometer tjock. Avståndet är likformigt över hela mätkaviteten 20.

Mätkavitetens 20 generellt sett jämna tjocklek måste vara mycket exakt, dvs. bara mycket små variationer vad gäller tjockleken mellan väggarna är tillåtna hos olika provtagningsanordningar 10. Tjockleken medger att en relativt stor provvolym analyseras inom en liten area hos mätkaviteten 20 så att ett tillräckligt antal biologiska komponenter eller celler är tillgängliga för att räknas. Den totala tjockleken hos mätkaviteten 20 kan väljas så att den avbildas inom ett bildsystems skärpedjup. Då kan en bild analyseras och antalet biologiska komponenter eller vita blodkroppar närvarande i bilden kan räknas för att volymetriskt beräkna antalet biologiska komponenter eller vita blodkroppar.

Mätkaviteten 20 är också anpassad för bestämning av ett förhållande mellan olika typer av biologiska komponenter i ett prov eller vita blodkroppar i ett blodprov. Hela mätkavitetens 20 tjocklek är avsedd att avbildas inom ett 10 15 20 25 30 535 918 22 skärpedjup hos ett bildsystem. Då kan en bild analyseras och antalet biologiska komponenter eller vita blodkroppar av varje närvarande typ i bilden kan räknas för att volymetriskt bestämma förhållandet mellan av olika typer av biologiska komponenter eller vita blodkroppar.

Mätkaviteten 20 är avsedd att i sin helhet avbildas inom ett skärpedjup hos ett bildsystem. Således är alla biologiska komponenter eller vita blodkroppar i provet avbildade i fokus och analysen av provet försvåras inte av brus i bilden från delar av bilden som avbildas ur fokus. En förstoring kan vara nödvändig för att möjliggöra räkning av det totala antalet biologiska komponenter eller vita blodkroppar och för att också kunna bestämma typen av biologiska komponenter eller vita blodkroppar.

Provtagningsanordningen 10 är anpassad för mätning av magnetiskt inmärkta cellantal över 0,05 x 109celler/liter vätska eller blod. Vid lägre cellantal kommer provvolymen att vara för liten för att tillåta ett statistiskt signifikant antal celler att räknas. Vidare börjar, när det magnetiskt inmärkta cellantalet överskrider 30 x 10°celler/liter vätska eller blod, effekten av celler vilka är anordnade överlappande varandra bli signifikant i det uppmätta antalet celler. Vid detta antal magnetiskt inmärkta celler kommer de inmärkta cellerna täcka ungefär 8 % av tvärsnittet av provet som bestrålas när tjockleken hos mätkaviteten 20 är mindre än 200 mikrometer. Således, för att kunna uppnå korrekt antal magnetiskt inmärkta celler måste denna effekt räknas med.

Därför kan en statistisk korrigering av värden av antalet inmärkta celler över 12 x 10” inmärkta celler/liter vätska eller blod användas. Denna statistiska korrigering ökar med ökande antal magnetiskt inmärkta celler eftersom effekten av överlappande inmärkta celler blir större för större antal 10 15 20 25 30 535 918 23 celler. Den statistiska korrigeringen kan bestämmas genom kalibrering av en mätanordning. Som ett alternativ kan den statistiska korrigeringen bestämmas på en generell nivå genom inställning av mätanordningar för användning i anslutning till provtagningsanordningen 10. Provtagningsanordningen 10 är avsedd att kunna användas för analys då antalet magnetiskt inmärkta celler är så stort som 50 x 109 inmärkta celler/liter vätska eller blod.

I enlighet med en alternativ utföringsform används detektionen av magnetiskt inmärkta biologiska komponenter för att bestämma huruvida en specifik biologisk komponent förekommer i provet eller ej. I enlighet med denna utföringsform finns det inget behov att utföra en volymetrisk bestämning och således kan förekomsten av en biologisk komponent detekteras även för mycket små mängder av komponenten i provet.

En yta hos en vägg hos mätkaviteten 20 är åtminstone delvis belagd med ett reagens 22. Reagenset 22 kan vara frystorkat, värmetorkat eller vakuumtorkat och anbringas till ytan hos mätkaviteten 20. När ett prov införs in i mätkaviteten 20 kommer provet att komma i kontakt med det torkade reagenset 22 och påbörja en bindningsreaktion mellan reagenset 22 och provets komponenter.

Reagenset 22 anbringas genom att man inför reagenset 22 in i mätkaviteten 20 med användning av en pipett eller dispenser. Reagenset 22 är löst i metanol när det införs i mätkaviteten 20. Lösningsmedlet tillsammans med reagenset 22 fyller mätkaviteten 20. Därefter utförs torkning på sådant sätt att lösningsmedlet avdunstas och reagenset 22 anbringas ytornas hos mätkaviteten 20. 10 15 20 25 30 535 518 24 Eftersom reagenset skall torkas fast på en yta i ett trångt utrymme kommer vätskan att ha en mycket liten yta som är i kontakt med den omgivande atmosfären, varigenom det blir svårare att avdunsta vätskan. Det år således en fördel att använda en flyktig vätska, såsom metanol, vilken möjliggör att vätskan avdunstas på ett effektivt sätt fràn mätkavitetens smala utrymme.

I enlighet med en alternativ tillverkningsmetod så formas provtagningsanordningen 10 genom att man sammanför två delar med varandra, varvid en del bildar mätkavitetens 20 bottenvâgg och den andra delen bildar mätkavitetens 20 toppvägg. Detta medger att reagenset 22 torkas fast på en öppen yta innan de två delarna sätts ihop med varandra.

Således kan reagenset 22 lösas i vatten eftersom lösningsmedlet inte behöver vara flyktigt.

Reagenset 22 kan innefatta en eller flera antikroppar bundna till magnetiska partiklar. Antikropparna är anpassade till att binda till en specifik molekylär struktur- karakteristika hos den biologiska målkomponenten, såsom en cell. Strukturen kan vara en cellytmarkör, såsom CD4 eller CD8. När ett våtskeformigt prov kommer i kontakt med reagenset 22 kommer antikropparna att verka så att de binder till den specifika molekylära strukturen hos målcellerna, och ackumuleras på så sätt vid cellerna. Reagenset 22 bör företrädesvis innehålla tillräcklig mängd antikroppar för att tydligt inmärkta delar av màlcellerna som väsentligen täcker hela cellerna. Detta medför att väsentligen hela de märkta cellerna är magnetiska och kan således lätt detekteras i provet. Det kommer vidare ofta förekomma ett överskott av antikroppar med magnetiska partiklar som kommer att vara inblandade i vätskan, men kommer inte att utgöra något problem eftersom de obundna antikropparna är för små för att 10 15 20 25 30 535 918 25 kunna detekteras.

Reagenset 22 kan även innefatta andra beståndsdelar, vilka kan vara aktiva, dvs. ta del vid den kemiska inbindningen till t.ex. celler hos ett blodprov, eller icke- aktiva, dvs. inte ta del i inbindningen. De aktiva beståndsdelarna kan t.ex. vara anordnade att underlätta inbindningen av antikropparna till deras respektive molekylära målstrukturer. De icke-aktiva beståndsdelarna kan t.ex. vara anordnade att förbättra fästningen av reagenset 22 till ytan hos en vägg hos mätkaviteten 20.

Inom några minuter kommer blodprovet att ha reagerat med reagenset 22 pä sådant sätt att antikropparna med magnetiska partiklar har bundit till mälcellerna.

Med hänvisning till fig. 2 kommer nu ett förfarande för detektion av magnetiskt inmärkta biologiska komponenter i ett prov att beskrivas. Förfarandet kommer specifikt beskrivas med hänvisning till ett förfarande för detektion och volymetrisk bestämning av magnetiskt inmärkta CD4-positiva T- lymfocyter. Det är dock uppenbart för fackmannen inom teknikområdet att förfarandet kan modifieras för detektion och volymetrisk bestämning av andra biologiska komponenter.

Ett lämpligt reagens för magnetisk inmärkning av de biologiska komponenterna av intresse behöver användas och bestrálning och detektion behöver anpassas, vilket är uppenbart för fackmannen inom teknikomràdet.

Förfarandet för detektion och volymetrisk bestämning av magnetiskt inmärkta CD4-positiva T-lymfocyter innefattar att man inför ett blodprov in i en provtagningsanordning 10, steg 102, vilken har en fix tjocklek på mindre än 200 mikrometer.

Ett outspätt prov humant helblod införs i 10 15 20 25 30 535 918 26 provtagningsanordningen 10. Provet kan erhållas från kapillärt blod eller venöst blod. Ett prov av kapillärt blod kan dras in i mâtkaviteten 20 direkt från en patients stuckna finger. Blodprovet kommer i kontakt med reagenset 22 i provtagningsanordningen 10, varvid en bindningsreaktion påbörjas. Reagenset innefattar magnetiskt inmärkta anti-CD4- antikropp. Inom några minuter kommer blodprovet att ha reagerat med reagenset 22 på sådant sätt att de magnetiskt inmärkta antikropparna har bundit till CD4-markörerna hos T- hjälparlymfocyterna, och blodprovet är nu redo att bli analyserat. Provtagningsanordningen 10 placeras i en analysapparat, steg 104. En analys kan påbörjas genom att man trycker på en knapp på analysapparaten. Alternativt kan analysen påbörjas automatiskt genom att apparaten detekterar förekomsten av provtagningsanordningen 10.

Ett magnetfält appliceras på det reagerade blodprovet i provtagningsanordningen 10 för att flytta de magnetiskt inmärkta cellerna mot magnetfältet, steg 106. Provet bestrålas, steg 108, och en CCD-kamera används för förvärva ett flertal bilder av provet med olika optiska inställningar, steg 110.

De förvärvade digitala bilderna överförs till en bildanalysator, vilken utför en bildanalys med elektronisk förstoring, steg 112, i avsikt att räkna antalet mörka prickar positionerade vid en av mätkavitetens plana ytor i respektive digital bild. Bildanalysatorn är således i stånd att fastställa koncentrationen av CD4-positiva T- hjälparceller.

Alternativt kan det vätskeformiga provet, i detta fall helblod, bringas att reagera, eller delvis reagera, med reagenset 22 (magnetiskt inmärkta antikroppar) utanför 10 15 20 25 30 535 918 27 provtagningsanordningen 10, varefter det reagerade, eller delvis reagerade, provet kan införas in i provtagningsanordningen 10.

Med hänvisning till fig. 3 kommer nu ett alternativt förfarande för detektion av magnetiskt inmärkta biologiska komponenter i ett prov att beskrivas. Förfarandet kommer specifikt beskrivas med hänvisning till ett förfarande för detektion och volymetrisk bestämning av magnetiskt inmärkta CD4-positiva T-lymfocyter.

Förfarandet för detektion och volymetrisk bestämning av magnetiskt inmärkta CD4-positiva T-lymfocyter innefattar att man inför ett blodprov in i en provtagningsanordning 10, steg 202, vilken har en fix tjocklek pà mindre än 200 mikrometer.

Ett outspätt prov humant helblod införs i provtagnings- anordningen 10. Provet kan erhållas från kapillärt blod eller venöst blod. Ett prov av kapillärt blod kan dras in i mätkaviteten 20 direkt från en patients stuckna finger.

Blodprovet kommer i kontakt med reagenset 22 i provtagnings- anordningen 10, varvid en bindningsreaktion påbörjas.

Reagenset innefattar magnetiskt inmärkta anti-CD4-antikropp.

Inom några minuter kommer blodprovet att ha reagerat med reagenset 22 på sådant sätt att de magnetiskt inmärkta antikropparna har bundit till CD4-markörerna hos T- hjälparlymfocyterna, och blodprovet är nu redo att bli analyserat. Provtagningsanordningen 10 placeras i en analysapparat, steg 204. En analys kan påbörjas genom att man trycker på en knapp pá analysapparaten. Alternativt kan analysen påbörjas automatiskt genom att apparaten detekterar förekomsten av provtagningsanordningen 10. och en CCD-kamera används Provet bestrålas, steg 206, för förvärva ett flertal bilder av provet med olika optiska 10 15 20 25 30 535 918 28 inställningar, steg 208. Ett magnetfält appliceras därefter pà det reagerade blodprovet i provtagningsanordningen 10 för att flytta de magnetiskt inmärkta cellerna mot magnetfältet, steg 210. Provet bestràlas en andra gång, steg 212, och en CCD-kamera används för en andra gång förvärva ett flertal bilder av provet med olika optiska inställningar, steg 214.

De förvärvade digitala bilderna överförs till en bildanalysator, vilken utför en bildanalys med elektronisk förstoring, steg 216, i avsikt att jämföra positionerna av de identifierade cellerna i de först förvärvade flertalet bilderna med positionerna i de andra förvärvade flertalet bilderna. De magnetiskt inmärkta cellerna har förändrat sina positioner i mätkaviteten 20 från de först förvärvade flertalet bilderna jämfört med de andra förvärvade flertalet bilderna och identifiering är således erhàllen och bildanalysatorn kan därefter bestämma koncentrationen av CD4- positiva T-hjälparceller i blodprovet.

Alternativt kan det pälagda magnetfältet förflyttas längs den plana mätkaviteten 20, dvs. vinkelrät mot provtagningsanordningens 10 bestrálningsriktning.

Förflyttningen av magnetfältet kan vara med konstant, ökande eller minskade hastighet. När det pàlagda magnetfältet förflyttas vinkelrät mot mätkavitetens 20 bestràlnings- riktning, förflyttas de magnetiskt inmärkta biologiska komponenterna ut ur arean från vilken den digitala bilden av mätkaviteten 20 förvärvas. Inga magnetiskt inmärkta celler kan därför detekteras i de andra flertalet förvärvade bilderna. Detektionen av de magnetiskt inmärkta cellerna genomförs således genom identifiering av celler vilka inte är närvarande i de andra flertalet förvärvade bilderna jämfört med de första flertalet förvärvade bilderna. 10 15 20 25 30 535 918 29 Alternativt kan det vätskeformiga provet, i detta fall helblod, bringas att reagera, eller delvis reagera, med reagenset 22 (magnetiskt inmärkta antikroppar) utanför provtagningsanordningen 10, varefter det reagerade, eller delvis reagerade, provet kan införas in i provtagningsanordningen 10.

Alternativt kan en enstaka digital bild av en förstoring av det bestrålade provet i provtagningsanordningen 10 förvârvas i steg 208. Den enstaka digitala bilden förvârvas med ett skärpedjup vilket åtminstone motsvarar mätkavitetens 20 tjocklek. Ett tillräckligt fokus uppnås för hela provtjockleken, vilken sedan analyseras samtidigt i den enstaka digitala bilden av provet. Skarpt fokus föreligger inte på en specifik del av provet och ett tillräckligt fokus uppnås över hela provtjockleken, fig. 4a, och de magnetiskt inmärkta biologiska komponenterna ses i förstoringen som grå punkter, storleken förstorad jämfört med de övriga biologiska komponenterna för förtydligande. Magnetfältet appliceras, steg 210, i rörelse utmed den plana mätkaviteten 20, dvs. vinkelrät mot provtagningsanordningens 10 bestrålnings- riktning. Provet bestrålas igen, steg 212, efter att magnetfältet har tagits bort, och en andra enda digital bild förvärvas, steg 214, med ett skärpedjup vilket åtminstone motsvarar mätkavitetens 20 tjocklek, fig. 4b. Stora grå punkter kan således inte längre ses i fig. 4b. De två förvärvade digitala bilderna överförs till en bildanalysator, vilken utför en bildanalys med elektronisk förstoring, steg 216, i avsikt att jämföra antalet detekterade celler i den första digitala bilden, fig. 4a, med antalet detekterade celler i den andra digitala bilden, fig. 4b. Detektionen av de magnetiskt inmärkta cellerna genomförs således genom identifiering av celler vilka inte är närvarande i den andra bilden jämfört med den första bilden. 10 15 20 25 30 535 918 30 Med hänvisning till fig. 5 kommer nu ett system för volymetrisk bestämning av magnetiskt inmärkta biologiska komponenter i ett vätskeformigt prov att beskrivas. Systemet innefattar en provtagningsanordning 502, beskriven enligt ovan, och en mätanordning innefattande en provtagnings- anordningshàllare 504, anordnad att motta provtagnings- anordningen 502 vilken innehåller ett vätskeformigt prov i mätkaviteten, och medel för att applicera ett magnetfält över mätkaviteten, en ljuskälla 506 anordnad att bestråla det vätskeformiga provet med elektromagnetisk strålning med en förbestämd våglängd, ett optiskt system 508, en bländare 510 vilken riktar ljuset till en bildförvärvningsanordning S12 innefattande medel för förvärvande av åtminstone en digital bild av det bestrålade provet i mätkaviteten. De magnetiskt inmärkta biologiska komponenter är urskiljda i den åtminstone en digitala bilden genom selektiv avbildning med avseende på elektromagnetisk våglängd och en bildanalysator anordnad att analysera den åtminstone en digitala bilden för identifiering av magnetiskt inmärkta biologiska komponenter och bestämma antalet magnetiskt inmärkta biologiska komponenter i det vätskeformiga provet. De magnetiskt inmärkta biologiska komponenterna ses i en förstoring 514 av mätkaviteten som grå punkter, storleken förstorad jämfört med de övriga biologiska komponenterna för förtydligande, positionerade vid en av mätkavitetens väggar.

Med hänvisning till fig. 6 kommer nu ett alternativt system för volymetrisk bestämning av magnetiskt inmärkta biologiska komponenter i ett vätskeformigt prov att beskrivas. Systemet innefattar samma särdrag vilka definierats i fig. 5 med undantag av provtagnings- anordningshållaren 604. Provtagningsanordningshållaren 604 är anordnad att motta provtagningsanordningen 502 och anordnad 10 15 20 25 30 535 918 31 med medel för att applicera magnetfält över mätkaviteten båda sidor och med medel för förflyttning av magnetfältet längs mätkaviteten, fig. 6a, vinkelrät mot bestrålningsriktningen.

De magnetiskt inmärkta biologiska komponenter urskils i den åtminstone en digitala bilden genom selektiv avbildning med avseende på elektromagnetisk strålning och en bildanalysator anordnad att analysera den åtminstone en digitala bilden för identifiering av magnetiskt inmärkta biologiska komponenter och bestämma antalet magnetiskt inmärkta biologiska komponenter i det vätskeformiga provet. De magnetiskt inmärkta biologiska komponenterna ses i en förstoring 614a av mätkaviteten som grå punkter, storleken förstorad jämfört med de övriga biologiska komponenterna för förtydligande, positionerade vid en av mätkavitetens väggar. I fig. 6b visar förstoringen 614b av mätkaviteten de biologiska komponenterna efter applicering av magnetfältet och alla grå punkter, vilka symboliserar de magnetiskt inmärkta biologiska komponenterna, är positionerade vid en av mätkavitetens väggar. I fig. 6c syns inte längre några grå punkter, vilka symboliserar de magnetiskt inmärkta biologiska komponenterna, i förstoringen 614c av mätkaviteten efter applicering av magnetfältet vilket har förflyttats längs den plana mätkaviteten. Alla magnetiskt inmärkta biologiska komponenter har förflyttats från arean varifrån bilden av mätkaviteten förvärvas från.

Det bör betonas att de föredragna utföringsformerna beskrivna häri inte på något sätt är begränsande och att många utföringsformer är möjliga inom skyddsomfånget definierat av de bifogade kraven.

Claims

10 15 20 25 30 535 918 32 PATENTKRAV

1. Förfarande för detektion av magnetiskt inmärkta biologiska komponenter i ett vätskeformigt prov, varvid nämnda förfarande innefattar att man inför ett vätskeformigt prov in i en mätkavitet hos en provtagningsanordning, varvid nämnda mätkavitet har en förbestämd fix tjocklek definierad av två plana ytor arrangerade på ett förbestämt avstånd från varandra för att bestämma provtjockleken och varvid nämnda mätkavitet innefattar ett reagens, varvid reagenset innefattar en antikropp bunden till en magnetisk partikel och är anordnat i en torr form inuti mätkaviteten, att man blandar reagenset innefattande en antikropp bunden till en magnetisk partikel med det vätskeformiga provet så att antikroppen binder till en specifik molekylär struktur hos en biologisk komponent i det vätskeformiga provet, att en ljuskälla bestrålar det vätskeformiga provet med elektromagnetisk strålning av en förutbestämd våglängd, att man förvärvar en första åtminstone en digital bild av en förstoring av det bestrålade provet i mätkaviteten, att man applicerar ett magnetfält över det vätskeformiga provet i mätkaviteten, varvid det magnetiska fältet förflyttas vinkelrät mot provtagningsanordningens bestrålningsriktning längs mätkaviteten, varvid den magnetiska partikeln förflyttas i magnetfâltet och därigenom förflyttar den biologiska komponenten till vilken den magnetiskt inmärkta antikroppen är bunden till, att en ljuskälla bestràlar det vätskeformiga provet med elektromagnetisk strålning av en förutbestämd våglängd, att man förvärvar en andra åtminstone en digital bild av en förstoring av det bestrálade provet i mätkaviteten 10 15 20 25 30 535 918 33 efter att magnetfältet har förflyttats bort från nämnda mätkavitet, att man digitalt analyserar den första àtminstone en digitala bilden och den andra åtminstone en digitala bilden i avsikt att identifiera biologiska komponenter vilka är avbildade i fokus och bestämmer typ och antal av dessa biologiska komponenter, där typerna särskiljs genom komponenternas fysiska egenskaper, och att man detekterar biologiska komponenter vilka inte längre är närvarande i den andra åtminstone en digitala bilden, varvid nämnda detektion innefattar jämförelse av nämnda första åtminstone en digitala bilden och nämnda andra åtminstone en digitala bilden.

2. Förfarandet enligt krav 1, varvid biologiska komponenter vilka uppvisar den specifika molekylära strukturen för antikroppen att binda till särskiljs i de digitala bilderna som mörka punkter.

3. Förfarandet enligt krav 1, varvid den digitala bilden är förvärvad med användning av en optisk förstoring pá 3-50x, mer föredraget 3-l0x.

4. Förfarandet enligt krav 1, varvid nämnda analys innefattar identifiering av mörka punkter i den digitala bilden för att kunna bestämma antalet magnetiskt inmärkta biologiska komponenter.

5. Förfarandet enligt krav 4, varvid nämnda analys innefattar att man elektroniskt förstorar den förvärvade digitala bilden.

6. Förfarandet enligt något av kraven 1-5, varvid det vätskeformiga provet införs i mätkaviteten hos provtagningsanordningen genom ett kapillârt provinlopp med hjälp av kapillärkraft.

7. Förfarandet enligt nàgot av kraven 1-6, varvid nämnda första och nämnda andra digitala bilden är ett flertal bilder av provet med olika optiska inställningar. 10 15 20 25 30 535 918 34

8. Förfarandet enligt något av kraven 1-6, varvid nämnda digitala bild förvârvas med ett skärpedjup vilket åtminstone motsvarar mätkavitetens tjocklek.

9. Förfarandet enligt något av kraven 1-8, varvid en volym av det analyserade vätskeformiga provet är väldefinierad genom tjockleken hos mätkaviteten och en area av provet vilken avbildas.

10. Förfarandet enligt något av kraven 1-9, varvid nämnda bestrålning utförs med en ljuskälla vilken innefattar en lysdiod.

11. System för volymetrisk bestämning av magnetiskt inmärkta biologiska komponenter i ett vätskeformigt prov, varvid nämnda system innefattar: en provtagningsanordning innefattande: en mätkavitet för mottagande av ett vätskeformigt prov, varvid mätkaviteten har en förutbestämd fix tjocklek, och ett reagens vilket är anordnat i en torr form inuti mätkaviteten, varvid nämnda reagens innefattar en antikropp bunden till en magnetisk partikel, varvid antikroppen år anordnad att binda till en specifik molekylär struktur hos en biologisk komponent och varvid antikroppen bunden till en magnetisk partikel och den biologiska komponenten kan förflyttas genom att applicera ett magnetfält över mätkaviteten, och en mätanordning innefattande: en provtagningsanordningshållare, arrangerad att mottaga provtagningsanordningen vilken håller ett vätskeformigt prov i mätkaviteten, varvid provtagningsanordningshållaren innefattar medel för att applicera ett magnetfält som är flyttbart över mätkaviteten, en ljuskälla anordnad att bestråla det vätskeformiga provet med elektromagnetisk strålning med en förbestämd våglängd, 10 15 20 25 30 535 918 35 ett optiskt system, en bländare arrangerad att rikta ljuset, en bildförvärvningsanordning innefattande medel för förvärvande av åtminstone en digital bild av en förstoring av det bestràlade provet i mätkaviteten innan och efter magnetfältet har applicerats, varvid de magnetiskt inmärkta biologiska komponenterna är urskiljda i den digitala bilden genom selektiv avbildning med avseende på elektromagnetisk våglängd, och en bildanalysator anordnad att analysera den åtminstone en digitala bilden för identifiering av magnetiskt inmärkta biologiska komponenter vilka har förändrat sina positioner genom magnetfältet och bestämma antalet magnetiskt inmärkta biologiska komponenter i det vätskeformiga provet.

12. Systemet enligt krav ll, varvid bildförvärvnings- anordningen är arrangerad att förvärva ett flertal digitala bilder av det vätskeformiga provet med användning av olika optiska inställningar.

13. Systemet enligt krav 11, varvid bildförvärvnings- anordningen är arrangerad med ett skärpedjup av åtminstone tjockleken hos provtagningsanordningens mätkavitet.

14. Systemet enligt krav 11, varvid en volym av ett analyserat prov är väldefinierad genom tjockleken hos mätkaviteten och en area av provet vilken avbildas.

15. Systemet enligt något av kraven 11-14, varvid ljuskällan är arrangerad att bestråla med ljus av en våglängd vilken motsvarar en absorbanstopp hos infärgningsmedlet.

16. Systemet enligt något av kraven 11-15, varvid ljuskällan innefattar en lysdiod.

17. Systemet enligt något av kraven ll-16, varvid förstoringsanordningen har en förstoringsgrad av 3-50x, mer företrädesvis 3-10x.

18. Systemet enligt något av kraven 11-17, varvid bildanalysatorn är arrangerad att identifiera mörka punkter i 535 918 36 den digitala bilden.

19. Systemet enligt något av kraven 11-18, varvid bildanalysatorn är arrangerad att elektroniskt förstora den förvärvade digitala bilden.