CN113218844A - 一种用于分析待测样本中微粒的方法 - Google Patents
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Abstract
本说明书涉及一种用于分析待测样本中微粒的方法，所述方法包括：通过图像采集装置获取待测样本的全体积图像；所述全体积图像的成像视野能够反映所述待测样本在样本容器中的全部体积；至少基于所述全体积图像，确定待测样本中待分析微粒的分析参数，所述分析参数至少包括微粒数量。
Description
技术领域
本说明书涉及生物医药领域，特别涉及一种用于分析待测样本中微粒的方法。
背景技术
在生物医药、检验检测等技术领域，通常会涉及到对液体样本或半固体样本(如透明凝胶等)中的微粒进行检测，以确定样本中微粒的数量或浓度。传统的液体样本中微粒的检测方式是采用如微粒计数仪的方式进行抽样检测，以确定微粒数量，但抽样检测的方式无法很精准地反映样本中微粒的真实值，存在一定的误差。
因此亟需一种可实现待测样品中微粒的检测方法，以提高检测精度。
发明内容
本说明书实施例之一涉及一种用于分析待测样本中微粒的方法，其特征在于，所述方法包括：通过图像采集装置获取待测样本的全体积图像；所述全体积图像的成像视野能够反映所述待测样本在样本容器中的全部体积；至少基于所述全体积图像，确定待测样本中待分析微粒的分析参数，所述分析参数至少包括微粒数量。
本说明书实施例之一涉及一种用于分析待测样本中微粒的系统，所述系统包括：全体积图像获取模块，用于基于图像采集装置获取待测样本的全体积图像；所述全体积图像的成像视野能够反映所述待测样本在样本容器中的全部体积；分析参数获取模块，用于至少基于所述全体积图像，确定待测样本中待分析微粒的分析参数，所述分析参数至少包括微粒数量。
附图说明
本说明书将以示例性实施例的方式进一步说明，这些示例性实施例将通过附图进行详细描述。这些实施例并非限制性的，在这些实施例中，相同的编号表示相同的结构，其中：
图1是根据本说明书一些实施例所示的采用血球计数板方法进行微粒计数的示意图；
图2是根据本说明书一些实施例所示的分析待测样本中微粒的方法的示例性流程图；
图3是根据本说明书一些实施例所示的采用图像拼接的方法获取待测样本的全体积图像的示例性流程图；
图4为本说明书一些实施例所示的确定样本容器成像面上的成像视野的示意图；
图5是根据本说明书一些实施例所示的相邻检测图像进行拼接的示意图；以及
图6A-6B是根据本说明书一些实施例所示的待测样本微粒分析系统的系统框图。
具体实施方式
为了更清楚地说明本说明书实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本说明书的一些示例或实施例，对于本领域的普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图将本说明书应用于其它类似情景。除非从语言环境中显而易见或另做说明，图中相同标号代表相同结构或操作。
应当理解，本文使用的“系统”、“装置”、“单元”和/或“模块”是用于区分不同级别的不同组件、元件、部件、部分或装配的一种方法。然而，如果其他词语可实现相同的目的，则可通过其他表达来替换所述词语。
如本说明书和权利要求书中所示，除非上下文明确提示例外情形，“一”、“一个”、“一种”和/或“该”等词并非特指单数，也可包括复数。一般说来，术语“包括”与“包含”仅提示包括已明确标识的步骤和元素，而这些步骤和元素不构成一个排它性的罗列，方法或者设备也可能包含其它的步骤或元素。
本说明书中使用了流程图用来说明根据本说明书的实施例的系统所执行的操作。应当理解的是，前面或后面操作不一定按照顺序来精确地执行。相反，可以按照倒序或同时处理各个步骤。同时，也可以将其他操作添加到这些过程中，或从这些过程移除某一步或数步操作。
基于图像识别的微粒计数方法广泛应用于生物医药、检验检测领域。传统的计数方法可以结合血球计数板采用抽样-统计的方式进行。如图1所示为血球计数板上网格设置示意图，图中，计数板设有5*5共25个大方格，每个大方格中又可以如图所示设置有16个小方格。计数时，可通过人工计数或者计数器计数的方式抽样，再采用统计方法计算得到整个血球计数板上的微粒数量。具体地，选择若干大方格(示例性地，可以选择如图1所示阴影区域的B1、B2、B3、B4、B5这5个大方格)中微粒的数量，再基于选定的五个大方格得到每个大方格的微粒数量的平均值，进而确定整个血球计数板上的微粒数量。在一些实施例中，还可以在已知血球计数板体积的基础上，得到单位体积的微粒数量，即微粒浓度。假设图1中B1、B2、B3、B4、B5这5个大方格的微粒总数为1000，可以用1000/5*25＝5000个，以此得到血球计数板上微粒的总数；若计数板体积为1ml，则最终的微粒浓度为5000个/毫升。
但是，采用上述方法进行微粒计数统计时会产生两方面的误差。一方面是微粒在血球计数板内的分布误差。分布误差的产生与微粒在血球计数板中的微粒分布有关，由于微粒在血球计数板内的微粒分布是不均匀的，血球计数板中每个方格的微粒数量不尽相同，仅对部分体积中的微粒进行统计会产生误差。例如，仅对图1中B1、B2、B3、B4、B5这5个大方格体积对应的微粒数量进行统计时，由于微粒分布的不均匀性，这5个大方格中微粒的数量并不能真实反映血球计数板中微粒的实际数量。
另一方面的误差是来源于血球计数板的制作工艺误差。血球计数板的制作工艺误差会导致血球计数板中的液体体积与实际要求的体积有所差别，最终影响实际的计数结果。例如，假设我们需要得到的血球计数板的体积为1毫升，而由于制造精度误差，实际得到的血球计数板的体积可能有所偏差(示例性地，可能为1.1毫升)，在计算微粒浓度时，通过统计数量除以一个不精确的体积所得到的微粒浓度显然也是不精确的。
为解决以上存在的问题，在本说明书的一个或多个实施例中，提出了一种用于分析待测样本中微粒的方法，这种方法通过图像采集装置获取能够反映待测样本全部体积状态的图像(即获取全体积图像)，据此确定待测样本中待分析微粒的分析参数。采用这种方式，省去了采用血球计数板进行计数时抽样的环节，从而避免了由于微粒分布不均匀产生的误差。
同时，采用本说明书涉及的全体积图像获取分析参数的方法可以实现测量过程的定体积测量，从而避免了计数板的制作工艺误差。具体地，可以直接将需要测量体积(如1ml)的待测样本直接置于样本容器中，样本容器的制作工艺误差对浓度计算过程不产生影响，采用这种方式，可以避免计数板的制作工艺误差对计数过程的影响，提高计数精确度。
图2是根据本说明书一些实施例所示的分析待测样本中微粒的方法的示例性流程图。
在一些实施例中，如图所示的流程100可以由人工控制相关的硬件装置执行。在一些实施例中，流程100也可以由任意计算机处理设备执行。具体地，流程100可以由图6A所示的一个待测样本微粒分析系统400执行。
步骤110，通过图像采集装置获取待测样本的全体积图像。
图像采集装置可以包含任何类型的照相机，包括但不限于静止照相机、摄像机、高速摄像机、3D深度摄像机、红外摄像机等图像采集单元。图像采集装置可以进一步包括光学显微镜、放大镜、电子显微镜等放大成像单元，以观测并获得直径较小的微粒的图像。
在一些实施例中，待测样本可以是可被图像采集装置采集的液态、半固态(如凝胶)、以及固态(如透明固体)等。示例性地，待测样本可以是生物样本，例如，牛奶、尿液、脊髓液、或者其他含有细胞的组织(如血液)。
待测样本中包含有待测微粒。在一些实施例中，待测样本中的待分析微粒可以包括细胞，比如血红细胞、T细胞、人体白细胞等。在一些实施例中，待测样本中的待分析微粒还可以包括其他微粒，例如磁珠等。在一些实施例中，待分析微粒的直径取决于图像采集装置的放大倍数，因此，例如细菌、病毒、血小板等小直径的生物微粒也可以使用本说明涉及的方法进行观测。
全体积图像的成像视野能够反映待测样本在样本容器中的全部体积。例如，待测样本共1毫升，可以直接通用过图像采集装置获得1毫升待测样本在样本容器中的所有图像，以进行微粒计数。
在一些实施例中，步骤110可以由人工操作实现。如由人工通过控制图像采集装置的方式采集待测样本的图像。
在一些实施例中，也可以由自动控制模块实现，具体地，步骤110可以由全体积图像获取模块410执行。
在一些实施例中，当图像采集装置的成像视野可以覆盖全部体积的待测样本时，可以获取一张全体积图像。在一些实施例中，受限于图像采集装置的成像视野，样本容器中全部体积的样本需要通过多个视野对应的图片拼接而成。示例性地，可通过让样本容器在单一方向移动的方式连续多次成像，通过图片拼接方式得到所述目标图像。有关基于图像拼接获取到全体积图像的更多说明可参见图3的相应描述，在此不再赘述。
在一些实施例中，全体积图像可以通过明场成像的方式实现。明场成像是指在自然光(其为复合光)照射的条件下对目标物进行成像。明场中的光源和待分析微粒形成一定角度，使得大部分的光经由待分析微粒反射/透射到图像采集装置。明场视野中的背景是明亮的，待分析微粒的边缘是黑暗的。示例性地，假设待分析微粒为细胞，明场图像中的背景是明亮的，细胞、细胞碎片和杂质的边缘是黑暗的。基于全体积图像中目标物的形状，可以区分出细胞，进而确定细胞的数量。
在一些实施例中，全体积图像还可以通过荧光成像的方式实现。荧光成像是指对事先使用荧光染色剂进行染色的微粒进行成像。通过不同荧光染剂对不同待分析微粒的染色程度不同，从而使得不同待分析微粒在激发光源的激发下发射出不同波长的荧光，可以在图像采集装置采集到的图像中显示出不同的颜色，进而可以进行统计数量。仍以待分析微粒为细胞为示例，染色剂可以为吖啶橙(AO)。吖啶橙(AO)具有膜通透性，可以透过细胞的细胞膜，使活细胞显示绿色或黄绿色的均匀荧光，以此确定细胞的数量。
在一些实施例中，全体积图像还可以通过散射光方式进行成像。散射成像是一种利用光源发出的光照射微粒，基于微粒散射出来的散射光确定微粒数量的方法。利用光源发出的光照射待分析微粒时，透明微粒(如细胞)会同时发生透射和散射，而非透明微粒(如免疫磁珠等)只会发生散射。当光源的发光强度在一定范围内时，由于经过透明微粒的散射光太弱，因此图像采集装置不能检测到经过透明微粒的散射光而只能检测到经过非透明微粒的散射光并采集非透明微粒的图像，从而获得非透明微粒的全体积图像。在一些实施例中，光源可以包括单色光源或复色光源。在本说明书涉及的一个或多个实施例中，单色光源可以指其发出的光经三菱镜折射不会分离出其他颜色的光的光源。例如，其发出波长在0.77～0.622微米范围的光的光源可以称为红色光源。又例如，其发出波长只为0.66微米的光的光源也可以称为红色光源。复色光源可以指其发射的光包括两种或以上单色光的光源。示例性单色光源可以包括红色光源、橙色光源、黄色光源、绿色光源、青色光源、蓝色光源、紫色光源等。示例性复色光源可以包括红绿复色光源、黄紫复色光源、红蓝复色光源、蓝紫复色光源、白光光源等。散射成像的方式通常适用于区分透明微粒和非透明微粒(如免疫磁珠等)的实施场景。在一些实施例中，为了使透明微粒产生的散射光强度与非透明微粒产生的散射光强度之间具有较大差异，以使得图像采集装置只能检测到非透明微粒的散射光而检测不到透明微粒的散射光，或者使得图像采集装置检测到非透明微粒的散射光的强度大于透明微粒的散射光的强度，入射光(或光源发出的光)的强度不能太强。
步骤120，至少基于所述全体积图像，确定待测样本中待分析微粒的分析参数。
在一些实施例中，待分析微粒的分析参数至少包括微粒的数量。在一些实施例中，待分析微粒的分析参数还可以包括表征待测样本的微粒状态。具体地，微粒状态可以包括微粒的类型、微粒的形态参数、微粒的浓度和/或微粒在待测样本不同地方的分布情况等一种或多种组合。
微粒的类型可以包括微粒的属性，如微粒类型可以包括细胞、微珠等。示例性地，可以事先通过不同的荧光染色剂对细胞和微珠进行染色，并通过荧光成像来甄别细胞和微珠。又例如，可以通过微粒直径的大小区分不同的微粒类型。在一些实施例中，微粒的类型也可以是细分出来的属性。此处以细胞为例，微粒类型还可以具体包括细胞的种类，如红细胞、白细胞、血小板细胞等。进一步地，微粒类型还可以包括活细胞、凋亡细胞、坏死细胞、空泡细胞、细胞碎片和杂质等。示例性地，活细胞、凋亡细胞、坏死细胞、空泡细胞、细胞碎片和杂质等也可以通过荧光染色的方法进行甄别。例如，如采用吖啶橙(AO)和碘化丙啶(PI)对含有细胞的待测液体进行处理，AO可以穿透活细胞和死细胞对细胞核进行染色并发出绿色荧光，PI不具有膜透过性，只能进入细胞膜受损的死细胞进行染色并发出红色荧光；当两种染料同时存在于细胞核中时，PI能够通过荧光共振能量转移(FRET)引起AO荧光的减少，从而呈现红色。因此AO/PI可以准确区分活细胞与死细胞，而且可以排除杂质或者非特异细胞的干扰，进行精准的浓度活率检测。通过颜色的不同实现不同微粒的区分。在一些替代性实施例中，也可以基于微粒的尺寸的不同实现不同微粒的区分。
微粒的数量可以包括微粒的总数和/或每种微粒类型对应的细胞微粒数量。例如，每种微粒类型对应的数量可以包括细胞数量和/或磁珠数量。又例如，每种微粒类型对应的数量还可以包括活细胞数量、坏死细胞数量、凋亡细胞数量、空泡细胞数量、细胞碎片数量和杂质数量。在一些实施例中，还可以基于微粒类型对应的数量确定相对应的微粒浓度。
微粒的形态参数是表征微粒形态的参数，可以包括微粒直径、微粒的表面积和/或微粒的圆度、轮廓、聚团、折光度、突触长度等，其中，微粒圆度是指微粒接近于理论球形的程度。例如，可以通过全体积图像中微粒的尺寸得到微粒的实际尺寸(如直径、外轮廓周长)，进而获得微粒的表面积。又例如，可以通过微粒各个方向上直径的不同确定微粒的圆度。聚团是指两个或两个以上微粒聚集在一起的特征。突触长度指从神经细胞的胞体向外伸展的突触长度。
在一些实施例中，待分析微粒的分析参数还可以进一步包括每种微粒类型的百分比和/或微粒的浓度。如可以用存活率表示活细胞数量和细胞总数的百分比。又例如，可以获得待测样品中微粒的数量与待测样品的体积做比值，以确定微粒在待测样品中的浓度。
在一些实施例中，可以通过人工的方式实现以上待分析微粒分析参数的获取。以微粒数量为例，可以通过人工观察全体积图像以进行人工计数的方式确定待测样本中免疫磁珠的数量。
在一些实施例中，可以采用计算机算法处理全体积图像，以获取待分析微粒的分析参数。在一些实施例中，步骤120可以采用分析参数获取模块420执行。在一些实施例中，分析参数获取模块420可以采用一般软件算法(如要素提取分析法)实现微粒的技术。在一些实施例中，分析参数获取模块420可以是传统算法模型，即根据算法模型中的特征参数来进行识别和分割。示例性地，分析参数获取模块420可以采用图像识别模型确定微粒的分析参数。例如，可以将目标图像输入处理设备中，处理设备可以利用图像识别模型来确定非透明微粒的数量。示例性的图像识别模型还可以为机器学习模型，机器学习模型可以包括卷积神经网络(Convolutional Neural Network，CNN)模型、全卷积网络(FullyConvolutional Networks，FCN)模型等，或其任意组合。需要注意的是，本申请中处理设备可以处理与执行本申请中描述的一个或以上的功能有关的信息和/或数据。在一些实施例中，处理设备112可以包括一个或一个以上的处理单元(例如，单核处理引擎或多核处理引擎)。仅作为示例，处理设备112可以包括中央处理单元(CPU)、专用集成电路(ASIC)、专用指令集处理器(ASIP)、图形处理单元(GPU)、物理处理单元(PPU)、数字信号处理器(DSP)、现场可编程门阵列(FPGA)、可编程逻辑器件(PLD)、控制器、微控制器单元、精简指令集计算机(RISC)、微处理器等，或其任意组合。
示例性地，图像识别模型可以包括图像输入层、特征提取层以及分析层。在本说明书的实施例中，图像识别模型的输入为全体积图像，输出为待分析微粒的分析参数。图像输入层可以理解为整个模型的模型输入，其用于将全体积图像输入到图像识别模型中。
特征提取层的输入为全体积图像，输出为全体积图像中待分析微粒的形状特征。在一些实施例中，特征提取层的类型可以包括但不限于ResNet、ResNeXt、SE-Net、DenseNet、MobileNet、ShuffleNet、RegNet、EfficientNet或Inception等卷积神经网络(Convolutional Neural Networks,CNN)模型，或循环神经网络模型。形状特征是表征待分析微粒的轮廓的相关信息，间接反映待分析微粒的轮廓。示例性地，可以通过边界特征法、Hough变换检测平行直线法、边界方向直方图法、傅里叶形状描述符法(Fourier shapedeors)、形状参数法(shape factor)、有限元法(Finite Element Method或FEM)、旋转函数(Turning)和小波描述符(Wavelet Deor)等获取形状特征。
图像识别模型中的分析层可以基于所获得的形状特征，得到待分析微粒的分析参数。以分析参数为为例数量进行示例性说明。分析层可以基于待分析微粒的形状特征，以获得微粒的数量。例如，分析层可以基于轮廓类圆形的所有颗粒，获得所有微粒的数量。
在一些实施场景中，分析层也可以被配置为一个分类器模型。此时，分析层可以基于微粒的直径大小，外观形状等等要素对微粒进行分类，进而统计不同分类的微粒数量。以待测液体为人体血液为例，血小板的直径在1微米-4微米之间、形状为盘形，可以将满足上述要求的所有微粒进行统计，以此作为样本中血小板的数量。又例如，人体白细胞直径在7微米-20微米之间、形状为球形，可以将满足这些要求的所有微粒进行统计，以此作为样本中白细胞的数量。
在一些实施场景中，全体积图像基于荧光成像等方式得到。在该场景的实施例中，不同的微粒具有不同的荧光颜色。换言之，所得的全体积图像中不仅具有微粒的形状信息，还具有微粒的颜色信息。此时，特征提取层的输出还包括待分析微粒的颜色特征。示例性地，颜色特征可以用像素点对应的色度分量表示，如用红色分量R、绿色分量G和蓝色分量B进行表示。
颜色信息可以更加直观地反映微粒的类型。示例性地，如采用吖啶橙(AO)对含有细胞的待测液体进行处理，由于吖啶橙(AO)具有膜通透性，可以透过活细胞的细胞膜，使活细胞显示黄绿色的均匀荧光，此时，可以筛选出所有呈均匀黄绿色荧光的微粒，以此得到活细胞的数量。
进一步地，分析层还可以将所获得的形状特征以及颜色特征进行综合，以确定待分析微粒的数量。例如，通过荧光染剂吖啶橙(AO)获取的全体积图像中，分析层基于颜色特征(黄绿色的均匀荧光)确定活细胞的大致范围，而后匹配对应范围中待分析微粒的形状特征，以最终确定活细胞的数量。可以理解，单纯使用形状特征确定微粒数量时，由于微粒的轮廓不清晰等因素可能导致微粒计数不准确，并且可能引入其他微粒如死细胞、破裂细胞的感染。而采用形状特征结合颜色特征进行判定，可以更精准地确定微粒的数量。
需要说明的是，本领域技术人员可以在知悉本说明书实施例的基础上对本说明书的实施例进行任意地变换。例如，荧光染剂可以包括但不限于吖啶橙(AO)、碘化丙啶(PI)、溴化乙啶(EB)、异硫氰酸(FITC)等及其组合。类似这样的变化，依然在本说明保护的范围内。
在一些实施例中，图像识别模型的预置参数通过训练过程生成。例如，模型获取模块可以基于带有标签的多个训练样本，通过如梯度下降法等方式反复迭代训练初始图像识别模型，得到图像识别模型。训练样本包括带有标签的样本图像。训练样本的标签为样本图像中待分析微粒分析参数的值。在一些实施例中，训练样本的标签可以通过人工标注获取。在一些实施例中，图像识别模型可以由处理设备或第三方预先训练后保存在存储设备中，处理设备可以从存储设备中直接调用图像识别模型。
本说明书的一些实施例基于图像识别模型分析全体积图像，获取待分析微粒的分析参数，可以提高分析的效率；并且随着训练样本的标签的不同，可以获取对应不同的分析参数的图像识别模型，提高微粒分析的适用性和针对性。
在一些实际应用场景中，流程100所涉及的方法可以用来检测CD3/CD28免疫磁珠(以下简称磁珠)在待测样本中的数量。磁珠是由超顺磁性物质通过高分子材料进行表面覆盖包裹组成，利用表面功能基团如氨基、羧基、羟基等进行抗体的共价或非共价偶联，可结合相应抗原或抗体，以用于生物治疗。具体地，在利用磁珠生产CAR-T细胞制剂的过程中，为了满足CAR-T细胞的质量控制要求，需要检测溶液中磁珠的浓度。可以将待测样品中磁珠的数量与待测样品的体积做比值，以确定磁珠在待测样品中的浓度。进一步地，可以将磁珠在待测样品中的浓度与标准含量进行比较，确定待测样品是否合格。如当磁珠浓度小于标准浓度(例如，500个/mL)时，则表示该CAR-T细胞制剂合格。
在一些实施场景中，流程100所使用的待测样本中分布有多种类型的微粒，在该场景的实施例中，在步骤110之前，流程100还包括：步骤102，去除所述待测样本中除所述待分析微粒以外的其他微粒。
在一些实施例中，当待测样本中分布有两个及以上类型的微粒时，可以去除待测液体样本中除待分析微粒以外的其他微粒。在一些实施例中，待测样本中微粒的类型包括透明微粒和非透明微粒，且所述非透明微粒为待分析微粒时，可以去除所述待测液体样本中的非透明颗粒。示例性地，透明微粒可以包括细胞，非透明微粒包括磁珠。在该场景的实施例中，可以采用荧光成像，实现只对待测液体中某一种待分析微粒的全体积成像。示例性地，当待分析微粒为细胞时，可以通过添加荧光染色剂的方式使细胞进行染色，从而在全体积成像的图像上去除其他微粒的干扰。在一些其他实施场景中，当待分析微粒为非透明微粒(如磁珠)时，可以采用散射光成像的方式实现仅对非透明微粒进行成像，从而在全体积成像的图像上去除透明微粒(如细胞等)的干扰。有关荧光成像和散射光成像的更多说明可参见步骤110的相应描述，在此不再赘述。
在一些实施场景中，待测样本中包括透明微粒和非透明微粒，且非透明微粒为待分析微粒。在该场景的实施例中，还可以通过增加裂解液的方式裂解透明微粒，排除透明对微粒检测的干扰。示例性地，裂解液可以是20％SDS(十二烷基硫酸钠)水溶液，且使用的终浓度为1％～4％之间(终浓度是指SDS在加入待测样本后的在待测样本中的最终使用浓度)。示例性地，SDS(十二烷基硫酸钠)水溶液使用时的终浓度可以示例性地设置为1％、1.5％、2％、2.5％。在一些实施例中，在采用裂解液对透明微粒进行裂解时，还可以在分解时通过加温、搅拌、液体震荡(如涡旋仪或超声仪超声震荡待测液体)等方式加速裂解液的反应，以更快更好地裂解透明微粒。在一些实施例中，透明微粒可以示例性地为细胞，此时，采用SDS(十二烷基硫酸钠)水溶液作为裂解液，可以完全裂解细胞，避免细胞残留物对微粒检测的准确性的影响。
特别地，添加裂解液进行透明微粒裂解的方式具体地可以用于前述提及的CAR-T细胞制剂的检测场景中。在前述提及的在以CAR-T细胞制剂作为待测样本的实施场景中，CAR-T细胞制剂中不仅包含磁珠，还包括大量的细胞。此时，可以使用以上说明的裂解液(如十二烷基硫酸钠水溶液)裂解细胞，以得到仅保留磁珠的待测样本，通过这种方式去除细胞对磁珠数量统计的干扰。
在一些实施例中，在步骤110之前，流程100进一步包括步骤105，对待测样本进行富集处理，使得所述待测样本中的待分析微粒聚集于所述样本容器成像面(如样本容器底部)。富集处理可以包括离心处理、静置处理、磁吸处理等。在一些实施例中，离心处理可以是将装有待测样品的样本容器置于离心机内进行离心一定时间(例如，10秒、30秒、1分钟、1.5分钟、2分钟等)。在一些实施例中，静置处理可以是将装有待测样品的样本容器静置一定的时间(例如，30秒、1分钟、2分钟、5分钟、10分钟、30分钟、1小时等)，使得微粒沉积于样本容器底部。在一些实施例中，磁吸处理可以是当微粒为磁性微粒(例如，免疫磁珠)时，将装有待测样品的样本容器放置在磁性板(例如，永久磁铁)上一定的时间(例如，30秒、1分钟、2分钟、5分钟、10分钟、30分钟、1小时等)，使得微粒(如，磁珠)快速沉积于样本容器底部。
应当理解的是，上述关于流程100的描述仅为示例性的，并不用于限制本说明书的保护范围。对于本领域的技术人员来说，可以在本说明书的指导下做出多个修正和改变。然而，这些修正和改变不会脱离本说明书的保护范围。
图3是根据本说明书一些实施例所示的采用图像拼接的方法获取待测样本的全体积图像的示例性流程图。
如图所示的流程200可以由人工执行。在一些实施例中，流程200也可以由任意计算机处理设备执行。具体地，流程200可以由图6B所示的全体积图像获取模块410执行。
步骤210，确定所述图像采集装置在所述样本容器成像面上的多个成像视野。
在一些实施例中，图像采集装置的一个视野无法涵盖整个样本容器的成像面，此时，需要确定多个成像视野，进而采用图像拼接的方式获得全体积图像。成像视野是指图像采集装置观测和采集图像的区域。可以理解，在某些实施场景中，待测样本中的微粒尺寸很小，为了清楚地观测微粒，图像采集装置往往需要采用较大的放大倍数进行观测，而放大倍数越大，成像的清晰度越高，但成像视野也会随之减小。当成像视野减小到一定程度时，就无法涵盖整个样本容器的成像面，因此，需要在成像面上进行多次成像，并将多次成像所得的图像拼接在一起。
在一些实施例中，可以对不同的成像视野采用不同的成像倍数。此时，在后续进行拼接时，可以将不同成像视野采集的检测图像进行适应性地放大或者缩小，进而进行图像拼接。各个成像视野也可以采用不用的放大倍数以对部分细节区域进行更加细致地观测，以得到更加精确的测量结果。
在一些实施例中，为了便于拼接，可以对不同的成像视野采用相同的成像倍数。显然，由于成像倍数相同，成像视野大小也相同，可以直接基于获得的图像进行拼接。
可以理解，确定多个成像视野以及对不同的成像视野进行放大和缩小可以由人工完成，如人为确定放大的倍数(如10倍、20倍)并确定成像视野覆盖的区域。
在一些实施例中，步骤210也可以由自动控制的设备/软件执行。在一些实施例中，步骤210可以由成像视野确定单元412执行。
在本说明书的下述说明中，以不同的成像视野采用相同的成像倍数作为示例性说明。如图4所示为本说明书一些实施例所示的确定样本容器成像面上的成像视野的示意图。图4中，3表示样本容器，11、12、13、21、22、23、31、32、33分别代表同一放大倍数下(大小完全一致)的成像视野。显然，单一地成像视野仅能获取样本容器一部分区域的图像，而通过这些成像视野的拼接，可以获得覆盖样本容器3对应的整个成像面，进而获得全体积图像。
需要说明的是，如图4对应的成像视野的设置仅作为示例，并不会作为本说明书的任意限定。例如，不同成像视野的大小可以是不同的(如不同的图像放大倍数可以得到不同的成像视野大小；又例如，成像视野的排布可以采用任意均匀地排列(例如圆形阵列、方形阵列或三角形阵列等)；再例如，成像视野的排布可以是任意不均匀地排布。诸如此类地变化，依然在本说明书的保护范围内。
步骤220，在每个成像视野内获取所述待测样本的至少一张检测图像，且相邻的两个成像视野中所采集的检测图像具有重叠区域。
如图4所示，可以在每个成像视野内均获取所述待测样本的至少一张检测图像，且为了进行拼接，任意相邻的两个成像视野中所采集的图像具有重叠区域。例如，可以在11这个成像视野内获取至少一张检测图像，在12这个成像视野内获取至少一张检测图像，且11、12这两个成像视野采集的检测图像之间有重叠区域。重叠区域可作为在后续步骤中拼接的基础。又例如，成像视野22与其余的成像视野11、12、13、21、23、31、32、33均相邻，其采集的检测图像与上述成像视野对应的检测图像均有重叠区域。可以理解，在一些实施例中，步骤220涉及的检测图像的采集过程可以由人工执行，如人工调整好成像视野后利用图像采集装置进行拍照。
在一些实施例中，图像采集过程也可以由检测图像获取单元415执行。检测图像获取单元415可以基于预设好的程序在设定的位置获取对应的检测图像。进一步地，检测图像获取单元415可以实现图像采集装置与样本容器的相对移动，以此实现成像视野的切换(如实现视野11到视野12的切换)。图像采集装置与样本容器的相对移动可以采用任意可行地方式实现。例如，图像采集装置上可以设置有预设滑轨以及电机，电机基于所述预设滑轨按照预设方向驱动图像采集装置进行连续运动或者步进运动。进一步地，图像采集装置的移动轨迹以及每次停留的位置可以是预先设置好的，基于此，可以实现不同成像视野检测图像的自动采集。在一些实施例中，图像采集装置与样本容器的相对移动可以由人工实现。例如，图像采集装置上也可以不包括电机，使用手动方式控制图像采集装置的移动(如，螺母和螺纹杆可以分别设置在图像采集装置与样本容器上，通过人工旋转螺母的方式手动驱动图像采集装置的移动)。
需要说明的是，本领域技术人员可以在本说明书的基础上对本说明书的技术方案做出各种合理的变换。例如，图像采集装置可以是不可移动的，样本容器设置为可移动的；又例如，可以根据实际需要具体设置电机的数量、电机的布置方式和/或电机的种类。如，电机可以选择为步进电机、伺服电机、液压电机等。再例如，图像采集装置的移动可以包括带传动、链传动、螺杆传动等传动方式，通过简易地设置使其在电机的驱动下运动。类似这样的变换，仍处于本说明书的保护范围之内。
步骤230，基于所述检测图像中的重叠区域对所述检测图像进行拼接，以获取所述待测样本的全体积图像。在一些实施例中，步骤230可以由图像拼接单元417执行。
在一些实施例中，图像拼接单元417可以基于检测图像中的重叠区域进行拼接。在一些实施例中，图像拼接单元417可以基于图像重叠区域中本身具有的特征点进行拼接。特征点可以是待测样本中的同一空间点的像素点的特征，包括对应的颜色特征、纹理特征和形状特征等。颜色特征可以反映不同的微粒不同的荧光颜色在某一区域的分布规律信息；纹理信息可以反映图像中某一区域的灰度和/或颜色等的变化信息(如灰度分布、色彩稀疏度等)；而形状特征是指微粒的轮廓外形的特征(如微粒边界形状、多个微粒组合成的形状)。例如，检测图像A中某细胞的具有一个轮廓外形(形状特征)，则在检测图像B中也寻找同样细胞的同一形状特征，将两者匹配在一起以进行图像拼接。再例如，检测图像A中某区域具有一个纹理特征，则在检测图像B中也寻找同样的纹理特征，将两者匹配在一起以进行图像拼接。具体地，图像拼接单元417可以基于自动查找和半自动查找等方式匹配任意两幅检测图像中相同的特征点。
在一些实施例中，样本容器上可以设置有预设标记，且相邻视野检测图像的重叠区域中至少包括一个相同的预设标记。基于相邻视野内所述检测图像中的相同的预设标记依次进行图像拼接，以获取待测样本的全体积图像。
在一些实施例中，预设标记可以是与样本容器一体成型。在一些实施例中，预设标记也可以是在后续步骤中增加(如预设标记也可以采用可识别的亮片，通过粘贴的方式与样本容器连接)。预设标记可以设置在样本容器的任意可观测的部分。例如，预设标记可以设置在样本容器的底部。优选地，预设标记可以设置在样本容器的边缘(如图5所示)，在进行一体制造时方便生产和加工。
在一些实施例中，预设标记可以是任意规则的形状。规则形状的预设标记可以显而易见地与待测液体中的微粒进行区分，以方便识别。例如，预设标记可以是椭圆形、方形、多边形、异面多边形等其他形状。又例如，预设标记还可以是非对称的异形形状。
优选地，预设标记可以是半圆形的(如图5中的6、7、8、9所示)。半圆形的预设标记可以使得图像拼接时的边缘更加顺滑。在预设标记与样本容器一体成型时，圆形的预设标记对样本容器的强度影响较小，便于样本容器的加工制造。
在一些实施例中，样本容器上的预设标记有且可以仅有一个。此时，可以基于同一预设标记的整体形状(或者局部)进行图像对齐，以进行拼接。
在一些实施例中，样本容器上的预设标记可以设置有多个。在该场景的实施例中，任意两个相邻检测图像之间可以基于相同的预设标记进行图像拼接，进而得到拼接好的全体积图像。
图5是根据本说明书一些实施例所示的相邻检测图像进行拼接的示意图。图中，3为样本容器，6、7、8、9为个预设标记(其中7、8为重叠的预设标记)，图像A，B分别为视野相邻的两个检测图像。图5中预设标记的形状示例性设置为半圆形，W为检测图像对应的视野宽度，D为预设标记的间距，d为预设标记的宽度。
如图5所示，样本容器3的最大宽度可以略小于实际图像采集装置采集视野的长边宽度，以保证单个成像视野可完全覆盖样本容器3的宽度。样本容器3可以示例性地设置为长条形(如图5所示)。如图5所示，检测图像两侧均可设置有预设标记，以便于该图像与两侧相邻的检测图像实现拼接。
示例性地，图5中图像A和图像B中具有相同的预设标记7、8，可以基于相同的预设标记7、8将两个检测图像拼接在一起。具体地，包括以下过程：
步骤1：确定所述两个检测图像粗对齐的拼接范围，基于所述拼接范围将所述两个检测图像进行粗对齐。粗对齐是指将两幅检测图像拼接的范围、拼接的方向进行大致的确定。粗对齐的拼接范围是确定重复区域出现的范围。示例性地，以图5为例，可将图像A进行拆分，以得到若干子部分，将若干子部分的每一个与图像B中的对应大小的子部分依次进行匹配，以确定重叠区域。进而基于重叠区域进行图像拼接的大致匹配。在一些实施例中，两个检测图像对应视野的视野距离是确定的。在该场景的实施例中，可以将粗对齐的拼接范围设置为与该视野距离相关。续上例，假定图像A、B之间的视野间距为V，则说明图像A中移动距离为V的图像不会在图像B中出现，此时，可以仅比较图像A中剩余的部分(W-V的部分)与图像B之间的差异，以快速确定重叠区域。优选地，上述多个预设标记可以间隔设置在样本容器上，且每次相邻视野的移动距离均为预设标记的间隔距离D。更优选地，检测图像对应的视野宽度W满足D<W<D+d。此时，相邻检测图像对应的重叠区域出现在后一幅图像类似的区域，通过这样的设置，可以进一步加快重叠区域确定的效率。
步骤2：基于相同的预设标记对上述两个检测图像进行校准，得到拼接后的图像。仍以图5为例，可以基于相同的预设标记7、8对粗对齐后的检测图像A、B进行校准。进一步地，也可以对拼接边缘进行顺滑处理，以得到拼接后的图像。顺滑处理是指对拼接边缘进行柔化、灰度调整、线段粗细等方式进行调整，以使得拼接边缘可以圆滑过渡。
图6A-6B是根据本说明书一些实施例所示的一个待测样本微粒分析系统的系统框图。
在一些实施例中，流程100以及流程200的一个或多个步骤可以由计算机系统执行。示例性地，流程100以及流程200的一个或多个步骤可以由如图6A-6B所示的待测样本微粒分析系统执行。
如图6A所示，系统400布置可以布置在任意的计算系统上。系统400可以包括全体积图像获取模块410以及分析参数获取模块420。
全体积图像获取模块410，用于基于图像采集装置获取待测样本的全体积图像；所述全体积图像的成像视野能够反映所述待测样本在样本容器中的全部体积；
分析参数获取模块420，用于至少基于所述全体积图像，确定待测液体样本中待分析微粒的分析参数，所述分析参数至少包括微粒数量。
在一些实施例中，全体积图像获取模块410还用于基于样本容器成像面上的单个成像视野获取所述待测样本的全体积图像。
如图6B所示，在一些实施例中，所述全体积图像获取模块410进一步包括：成像视野确定单元412，用于确定所述图像采集装置在所述样本容器成像面上的多个成像视野；检测图像获取单元415，用于在每个成像视野内获取所述待测样本的至少一张检测图像，且相邻的两个成像视野中所采集的检测图像具有重叠区域；图像拼接单元417，用于基于所述检测图像中的重叠区域对所述检测图像进行拼接，以获取所述待测样本的全体积图像。
在一些实施例中，所述样本容器上设置有多个预设标记，且相邻两个检测图像的重叠区域中至少包括一个相同的预设标记，所述图像拼接单元417进一步用于：基于相邻两个检测图像中的相同的预设标记依次进行图像拼接，以获取所述待测样本的全体积图像。在一些实施例中，所述多个预设标记等间距设置在所述样本容器边缘上。
在一些实施例中，所述图像拼接单元417用于对任意相邻视野内的两个检测图像进行拼接，进一步包括：确定所述两个检测图像粗对齐的拼接范围，基于所述拼接范围将所述两个检测图像进行粗对齐；基于所述相同的预设标记对所述两个检测图像进行精对齐，得到拼接后的图像。
在一些实施例中，所述图像拼接单元417还用于基于两个检测图像所对应视野的视野距离，确定所述粗对齐的拼接范围，所述视野距离表示两个视野中心之间的间距。
在一些实施例中，所述全体积图像采集通过明场成像、荧光成像或单色光散射成像中的任一方式实现。
在一些实施例中，所述分析参数获取模块420还用于基于图像识别模型处理所述全体积图像，确定所述待分析微粒的分析参数；所述图像识别模型为机器学习模型。在一些实施例中，所述图像识别模型包括：图像输入层，用于获取所述全体积图像；特征提取层，用于提取所述全体积图像中待分析微粒的颜色和/或形状特征；分析层，用于基于所述目标图像的所述颜色和/或形状特征，输出所述待分析微粒的分析参数。
应当理解，图6A-6B所示的系统及其模块可以利用各种方式来实现。例如，在一些实施例中，装置及其模块可以通过硬件、软件或者软件和硬件的结合来实现。其中，硬件部分可以利用专用逻辑来实现；软件部分则可以存储在存储器中，由适当的指令执行装置，例如微处理器或者专用设计硬件来执行。本领域技术人员可以理解上述的方法和装置可以使用计算机可执行指令和/或包含在处理器控制代码中来实现，例如在诸如磁盘、CD或DVD-ROM的载体介质、诸如只读存储器(固件)的可编程的存储器或者诸如光学或电子信号载体的数据载体上提供了这样的代码。本说明书的装置及其模块不仅可以有诸如超大规模集成电路或门阵列、诸如逻辑芯片、晶体管等的半导体、或者诸如现场可编程门阵列、可编程逻辑设备等的可编程硬件设备的硬件电路实现，也可以用例如由各种类型的处理器所执行的软件实现，还可以由上述硬件电路和软件的结合(例如，固件)来实现。
本说明书实施例可能带来的有益效果包括但不限于：1)通过图像采集装置获取能够反映待测样本全部体积状态的图像(即全体积图像)，省去了采用传统计数方法中抽样-统计计数的步骤，消除了由于微粒分布不均匀产生的分布误差；2)通过全体积检测方式避免了计数板的制作工艺误差，提高了计数精确度；3)通过样本容器上的预设标识实现了多张检测图像的拼接识别。需要说明的是，本申请可根据应用需求调整应用需求调整计数板的相应尺寸，使其既可应用于微粒计数，也可用于各类细胞的精确计数和荧光分析，以及医疗临床分析中血细胞计数、尿液有形成分分析等领域。需要指出，不同实施例可能产生的有益效果不同，在不同的实施例里，可能产生的有益效果可以是以上任意一种或几种的组合，也可以是其他任何可能获得的有益效果。
上文已对基本概念做了描述，显然，对于本领域技术人员来说，上述详细披露仅仅作为示例，而并不构成对本说明书的限定。虽然此处并没有明确说明，本领域技术人员可能会对本说明书进行各种修改、改进和修正。该类修改、改进和修正在本说明书中被建议，所以该类修改、改进、修正仍属于本说明书示范实施例的精神和范围。
同时，本说明书使用了特定词语来描述本说明书的实施例。如“一个实施例”、“一实施例”、和/或“一些实施例”意指与本说明书至少一个实施例相关的某一特征、结构或特点。因此，应强调并注意的是，本说明书中在不同位置两次或多次提及的“一实施例”或“一个实施例”或“一个替代性实施例”并不一定是指同一实施例。此外，本说明书的一个或多个实施例中的某些特征、结构或特点可以进行适当的组合。
此外，除非权利要求中明确说明，本说明书所述处理元素和序列的顺序、数字字母的使用、或其他名称的使用，并非用于限定本说明书流程和方法的顺序。尽管上述披露中通过各种示例讨论了一些目前认为有用的发明实施例，但应当理解的是，该类细节仅起到说明的目的，附加的权利要求并不仅限于披露的实施例，相反，权利要求旨在覆盖所有符合本说明书实施例实质和范围的修正和等价组合。例如，虽然以上所描述的系统组件可以通过硬件设备实现，但是也可以只通过软件的解决方案得以实现，如在现有的服务器或移动设备上安装所描述的系统。
同理，应当注意的是，为了简化本说明书披露的表述，从而帮助对一个或多个发明实施例的理解，前文对本说明书实施例的描述中，有时会将多种特征归并至一个实施例、附图或对其的描述中。但是，这种披露方法并不意味着本说明书对象所需要的特征比权利要求中提及的特征多。实际上，实施例的特征要少于上述披露的单个实施例的全部特征。
一些实施例中使用了描述成分、属性数量的数字，应当理解的是，此类用于实施例描述的数字，在一些示例中使用了修饰词“大约”、“近似”或“大体上”来修饰。除非另外说明，“大约”、“近似”或“大体上”表明所述数字允许有±20％的变化。相应地，在一些实施例中，说明书和权利要求中使用的数值参数均为近似值，该近似值根据个别实施例所需特点可以发生改变。在一些实施例中，数值参数应考虑规定的有效数位并采用一般位数保留的方法。尽管本说明书一些实施例中用于确认其范围广度的数值域和参数为近似值，在具体实施例中，此类数值的设定在可行范围内尽可能精确。
针对本说明书引用的每个专利、专利申请、专利申请公开物和其他材料，如文章、书籍、说明书、出版物、文档等，特此将其全部内容并入本说明书作为参考。与本说明书内容不一致或产生冲突的申请历史文件除外，对本说明书权利要求最广范围有限制的文件(当前或之后附加于本说明书中的)也除外。需要说明的是，如果本说明书附属材料中的描述、定义、和/或术语的使用与本说明书所述内容有不一致或冲突的地方，以本说明书的描述、定义和/或术语的使用为准。
最后，应当理解的是，本说明书中所述实施例仅用以说明本说明书实施例的原则。其他的变形也可能属于本说明书的范围。因此，作为示例而非限制，本说明书实施例的替代配置可视为与本说明书的教导一致。相应地，本说明书的实施例不仅限于本说明书明确介绍和描述的实施例。
Claims (18)
1.一种用于分析待测样本中微粒的方法，其特征在于，所述方法包括：
通过图像采集装置获取待测样本的全体积图像；所述全体积图像的成像视野能够反映所述待测样本在样本容器中的全部体积；
至少基于所述全体积图像，确定待测液体样本中待分析微粒的分析参数，所述分析参数至少包括微粒数量。
2.根据权利要求1所述的方法，所述通过图像采集装置获取待测样本的全体积图像之前，所述方法还包括：
对待测液体样本进行富集处理，使得所述待测液体样本中的待分析微粒聚集于所述样本容器的底部。
3.根据权利要求2所述的方法，所述富集处理包括离心处理、自然沉降、磁化处理方式中至少一种。
4.根据权利要求1所述的方法，所述通过图像采集装置获取待测样本的全体积图像，进一步包括：基于所述样本容器成像面上的单个成像视野即可获取所述待测样本的全体积图像。
5.根据权利要求1所述的方法，所述通过图像采集装置获取待测样本的全体积图像，进一步包括：
确定所述图像采集装置在所述样本容器成像面上的多个成像视野；
在每个成像视野内获取所述待测样本的至少一张检测图像，且相邻的两个成像视野中所采集的检测图像具有重叠区域；
基于所述检测图像中的重叠区域对所述检测图像进行拼接，以获取所述待测样本的全体积图像。
6.根据权利要求5所述的方法，所述样本容器上设置有多个预设标记，且相邻两个检测图像的重叠区域中至少包括一个相同的预设标记；
所述基于所述检测图像中的重叠区域对所述检测图像进行拼接，以获取所述待测样本的全体积图像，进一步包括：
基于相邻两个检测图像中的相同的预设标记依次进行图像拼接，以获取所述待测样本的全体积图像。
7.根据权利要求6所述的方法，所述多个预设标记等间距设置在所述样本容器边缘上或所述样本容器底部。
8.根据权利要求6所述的方法，所述基于相邻两个检测图像中的相同的预设标记依次进行图像拼接，以获取所述待测样本的全体积图像，其中，任意相邻视野内的两个检测图像的拼接过程包括：
确定所述两个检测图像粗对齐的拼接范围，基于所述拼接范围将所述两个检测图像进行粗对齐；
基于所述相同的预设标记对所述两个检测图像进行精对齐，得到拼接后的图像。
9.根据权利要求8所述的方法，所述确定所述两个检测图像粗对齐的拼接范围，进一步包括：
基于两个检测图像所对应视野的视野距离，确定所述粗对齐的拼接范围，所述视野距离表示两个视野中心之间的间距。
10.根据权利要求1所述的方法，所述全体积图像采集通过明场成像、荧光成像或散射光成像中的任一方式实现。
11.根据权利要求1所述的方法，所述至少基于所述全体积图像，确定待测液体样本中待分析微粒的分析参数，包括：
基于图像识别模型处理所述全体积图像，确定所述待分析微粒的分析参数；所述图像识别模型为机器学习模型。
12.根据权利要求11所述的方法，所述图像识别模型包括：
图像输入层，用于获取所述全体积图像；
特征提取层，用于提取所述全体积图像中待分析微粒的颜色和/或形状特征；
分析层，用于基于所述目标图像的所述颜色和/或形状特征，输出所述待分析微粒的分析参数。
13.根据权利要求1所述的方法，当所述待测液体样本中分布有两个及以上类型的微粒时，在获取所述全体积图像之前，所述方法还包括：
去除所述待测液体样本中除所述待分析微粒以外的其他微粒。
14.根据权利要求13所述的方法，所述待测样本中微粒的类型包括透明微粒和非透明微粒，且所述非透明微粒为待分析微粒；所述去除所述待测液体样本中除所述待分析微粒以外的其他微粒还包括：
在所述待测样本中添加裂解液以裂解透明微粒。
15.根据权利要求14所述的方法，所述裂解液为十二烷基硫酸钠水溶液。
16.根据权利要求14所述的方法，所述透明微粒包括细胞，所述非透明微粒包括磁珠。
17.根据权利要求1所述的方法，所述待测液体样本中分布有两个及以上类型的微粒时，可通过荧光成像或散射光方式，实现只对待测液体中某一种待分析微粒的全体积成像。
18.根据权利要求1所述的方法，所述待测液体样本中包括细胞、微珠和其中任一组合。
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