JP2020016522A - 磁性粒子を用いた免疫染色法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、磁性粒子を用いた免疫染色法における処理時間の短縮化を行うことである。【解決手段】本発明による磁性粒子を用いた免疫染色法において、検出は酵素反応による染色を用い、染色迄の反応ステップ数を少なくし、磁性粒子においては、一次抗体反応時間を少なくすることにより、診断時間の迅速化を得る方法である。【選択図】図１

Description

本発明は、磁性粒子を用いた免疫染色法に関し従来よりも、特に、染色までの反応ステップ数（二次抗体反応）を従来よりも少なくし、反応時間を従来よりも短縮するための削減を行い、磁性粒子においては、一次抗体反応時間の短縮を行うことで、従来より迅速な診断を可能とするための新規な改良に関する。

従来、用いられていたこの種の免疫染色法としては、例えば、特許文献１として、「蛍光ナノ粒子標識体、多重免疫染色剤キットおよび多重免疫染色法」、特許文献２として、「微量タンパク質の高感度分析方法」、特許文献３として、「染色方法および観察方法」、特許文献４として、「組織切片から蛍光ナノ粒子の解離を防止する方法」を挙げることができる。

ＷＯ２０１５／０４５９６１Ａ１ 特開２００２−２４３６９６ 特開２０１７−１６６８９８ 特開２０１７−２２７５０２

従来、用いられ、又は、提案されていた前述の各特許文献１〜４における各方法の内容を各々簡単に述べると、以下の通りである。
すなわち、特許文献１の場合、化学発色を利用する免疫染色と、蛍光色素等の蛍光体の発光を利用する蛍光免疫染色とを併用した多重免疫染色法において、前記発光程度の低下を抑制することを目的とする。
すなわち、特許文献１の構成は、蛍光体を集積した状態で有する蛍光体集積ナノ粒子と、該蛍光体集積ナノ粒子の表面に結合した数平均分子量３０００以上の親水性高分子鎖と、該親水性高分子鎖の末端に結合した生体分子認識分子とを備えた多重免疫染色用の蛍光ナノ粒子標識体とすることで上記目的が達成される。そのため、処理時間に時間を要し、手術中の処理に、結果を得ることは困難であった。

また、特許文献２の場合、分析時間を短縮し、微量タンパク質の高感度分析を可能として、ベッドサイド等での患者の負担の少ない場所での迅速で簡便な高感度分析を可能とするために、酵素標識免疫抗体を固定した超常磁性ビーズでの抗原タンパク質による酵素標識免疫反応を、基板上に対局並びに参照電極とともに形成した、間隔を置いて互いに歯を挟み込んで対向させ、各々が独立した電位を与え得る作用電極として機能する一対の微小櫛型電極によって抗原タンパク質の濃度と電流値との相関性として検知し、電流値によってタンパク質濃度を判別可能としていた。そのため、段落００２２に開示されているように、高度の技術を用いた電気化学的検出器を利用するため、分析及び検出のためのコストが一般手術用に適用困難であった。

また、特許文献３の場合、試料をより深くまで染色することができる染色方法を提供するもので、特に、管腔構造を有する生体試料の染色方法であって、生体試料から試料切片を切り出す工程と、試料切片を、免疫染色する工程と、を含み、試料切片を切り出す工程では、前記試料切片の切断面に前記管腔構造の開口が形成されるように前記試料切片を切り出す。そのため、手術中でなければ、臓器摘出後に管腔構造の開口が形成されるように切り出すことは容易であるが、手術中に臓器の一部をサンプル摘出して免疫染色することは相当の時間を必要とし、例えば、ガンか否かの検出を迅速に行うことは困難であった。

また、特許文献４の場合、一枚の検体スライド（組織切片）上で、免疫染色法またはＦＩＳＨ法により、目的生体物質を蛍光ナノ粒子で標識する処理（蛍光標識処理）と、その他の溶液を用いた処理、例えば、形態観察用の染色液で染色する処理（染色処理）、ブロッキング処理、洗浄処理などとを行う場合に、目的生体物質を標識した蛍光ナノ粒子が解離して顕微鏡観察される蛍光輝点数が減少してしまうことを防止することのできる方法を提供するもので、蛍光標識処理の後、蛍光標識処理された組織切片を固定化試薬で固定する処理（蛍光ナノ粒子固定処理）を行い、その後に染色処理などを行う、組織切片から蛍光ナノ粒子の解離を防止する方法である。
そのため、この方法を採用した場合には、前述の従来構成よりもさらに処理時間を多く必要としていた。

また、前述の各従来方法において、免疫染色は抗体の特異性を利用して組織を染め分ける方法であり（図１１）、癌診断領域をはじめ様々な研究領域で使われている。従来の免疫染色の方法は、抗原に対する一次抗体５を数時間反応させ、酵素を標識した二次抗体５ａ（一次抗体５を認識）にて一次抗体５と反応させる。さらに、酵素と反応する基質を加えることによって染色を行うため、複数のステップと各ステップにおける反応時間を合わせて２〜４時間の時間を要する。また、抗原抗体反応が弱い組み合わせの場合は、抗原と一次抗体との反応に一晩を要する場合も珍しくない。近年では、手術中の迅速診断時に免疫染色を併用させる目的で、蛍光を含む粒子へ一次抗体５を固定化し、反応後に蛍光検出を行う方法や、磁性体を含んだ粒子を用いて、抗原へ抗体固定化粒子を磁気誘導で近づけることで抗原抗体反応の迅速化を行う新規技術が報告されている。
すなわち、前述の図１１の方法においては、前述のように、酵素と反応する基質を加えることによって染色を行うため、複数のステップと各ステップにおける反応時間を合わせて２〜４時間の時間を必要としていたため、手術中の検出は困難であった。

従来方法の課題は時間であり、抗原と一次抗体との反応時間は早ければ２〜４時間程度、場合により一晩かかる点が課題である。これにより研究者は実験に時間が取られ、病院では手術中の迅速診断時に免疫染色を併用できず、診断精度の向上が図れない問題がある。また、前記の新規技術などは、従来技術の課題を解決し得る一方で、病理診断の現場においては、その検出のための高額な装置や目視で観察出来ない点から受け入れられにくいことが課題となっている。

本発明は、以上のような課題を解決するためになされたもので、特に、染色までの反応ステップ数（二次抗体反応）と反応時間が従来よりも少なくなるようにし、磁性粒子においては、一次抗体反応時間を少なくし、従来よりも迅速な診断を可能とする磁性粒子を用いた免疫染色法を提供することを目的とする。

本発明による磁性粒子を用いた免疫染色法は
磁性粒子を用いた免疫染色法において、同一粒子上へ酵素またはポリマー酵素と抗体が固定化された磁性粒子を用いて対象物の検出を行い、前記検出は酵素反応による染色を用いる方法であり、また、
前記酵素または前記ポリマー酵素と前記抗体を前記磁性粒子上へ直接固定化する方法であり、
また、前記磁性粒子表面へポリマー酵素をリンカーとして導入し、前記磁性粒子表面へ前記抗体を固定化する方法であり、また、
前記酵素と抗体認識分子を直接前記磁性粒子上へ固定した後、固定化した前記抗体認識分子部分へ前記抗体を固定化する方法であり、また、
ポリマー酵素標識抗体認識分子を直接前記粒子へ固定化した後、固定化した前記ポリマー酵素標識抗体認識分子部分へ抗体を固定する方法であり、また
前記ポリマー酵素にて標識した抗体を前記粒子の表面へ直接固定化する方法であり、また、
前記抗体と抗体認識分子を直接前記粒子上へ固定した後、二次抗体（５ａ）を固定化する方法であり、また、
前記抗体認識分子が、タグ認識分子、アビジン類、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ、Ｇ、Ａ／Ｇ、Ｌ、ペプチド認識分子、二次抗体の何れか１つである方法であり、また、
前記ポリマー酵素標識抗体認識分子が、タグ認識分子、アビジン類、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ、Ｇ、Ａ／Ｇ、Ｌ、ペプチド認識分子、二次抗体の何れか１つである方法である。

本発明による磁性粒子を用いた免疫染色法は、以上のように構成されているため、次のような効果を得ることができる。
本発明では、病理診断の現場における従来の染色方法を採用しつつ、染色までの反応ステップ数（二次抗体反応）を従来よりも少なくし、磁性粒子においては一次抗体反応時間を従来よりも少なくすることで、より迅速な診断を可能とする。
また、具体的には以下のような用途での利用が想定される。
・研究用途では従来２日かかっていた免疫染色の時間が半日以内で終了できる事から、人件費の削減や研究成果の迅速化が期待できる。現在、キットとしての製品化についても検討しており、キット化できれば研究者が自由に迅速免疫染色可能となる。もちろん特殊で高価な器具は不要であり、コストも抑える事が可能である。
・病院での診断用途では手術中迅速病理診断が可能となる事により、リンパ節郭清の省略による低侵襲手術の実現や本診断を基軸にした新たな治療ストラテジーの構築が可能であり、将来的には治療ガイドラインも視野に戦略的な臨床研究計画の策定も可能である。また、各種免疫診断の迅速化による治療開始までの期間の短縮化が可能となり、免疫組織診断により治療開始できる場合は、その対象患者に対して療養期間の短縮が見込める可能性がある。
・免疫染色は世界中の病院や研究室で行われている汎用性の高い検査方法で、市場は大きいと考えられる。参考までに臨床検査用市場は約１００億円程度で増加傾向である。
すなわち、前述の同一粒子上の酵素と抗体が固定化された磁性粒子による免疫染色法によれば、図３に示されるように、例えば、図３において符号１で示されるものはＦｅからなる磁性体２を有する磁性粒子であり、この磁性粒子１には、ペルオキシダーゼ３、及び抗体認識分子４が固定されている。

図３における研究用（Ａ）としては、前記研究用（Ａ）の磁性粒子１には、手持ちの一次抗体５が用いられ、価格を抑えて研究者が自由に迅速免疫染色を行うことができる。

図３における臨床用（Ｂ）としては、前記臨床用（Ｂ）の磁性粒子１には、前述の磁性体２、ペルオキシダーゼ３、一次抗体５が固定されており、この磁性粒子１を用いてバリデーション（前向きな臨床試験）６を用いて、迅速免疫染色を手術などの治療戦略に組み込み、エビデンスを出して行くことができる。

本発明による同一粒子上へ酵素と抗体が固定化された磁性粒子による免疫染色法の概略を示す説明図である。 本発明における一次抗体反応から発色する状態から示す構成図である。 本発明の免疫染色を示す説明図である。 本発明における免疫染色の磁石なしで、反応時間３０分の場合を示す電子顕微鏡による拡大図である。 磁石ありで、反応時間２分の場合の拡大図である。 磁石ありで、反応時間４分の場合の拡大図である。 二次抗体なしの場合の拡大図である。 二次抗体ありの場合の拡大図である。 ポリマー化ＨＲＰ、二次抗体不使用の場合の拡大図である。 ポリマー化ＨＲＰ、事前に二次抗体を付加した場合の拡大図である。 従来方法を示すもので、一次抗体と二次抗体を示す。

本発明による磁性粒子を用いた免疫染色法において、染色までの反応ステップ数（二次抗体反応）を従来よりも少なくし、かつ、反応時間を従来よりも少なくし、磁性粒子においては、一次抗体反応時間の短縮を行うことで、従来より迅速な診断を可能とすることである。

以下、図面と共に本発明による磁性粒子を用いた免疫染色法の好適な実施の形態について説明する。
尚、従来例と同一又は同等部分には同一符号を付して説明すると共に、重複を避けるために説明済のものについては、その説明を省略する。
図１において、台７上には、スライドガラス８がスライド自在に設けられており、このスライドガラス８上にはカバーガラス９が設けられている。

さらに、前記カバーガラス９の下方位置には、ネオジウム磁石１０が設置され、染色イメージ（反応時間は２〜３分）が構成されている。
従来法からの置き換えのしやすさから、検出は従来の酵素反応による染色を用い、反応ステップ数の従来よりも削減と反応時間の短縮のため、酵素と一次抗体を同一粒子上に含む粒子を用いる。さらに、この粒子は磁性を有しており、磁気誘導による反応時間の更なる従来よりも短縮が可能である。

前述の図１の構成においては、まず、磁性粒子１に一次抗体５としてサイトケラチン（ＣＫ ｃｌｏｎｅ ＡＥＩ）を直接固定化したビーズ１すなわち、前記磁性粒子１と同じ形状を作成し、ペルオキシダーゼ３を付加せずに磁石により、抗原抗体反応が促進されるかを確かめた。図１のように、前記磁石１０を使わず３０分で静置したもの、磁石１０を用いたもの（反応時間２、４分）を作り、二次抗体は通常通り別途反応させ、ＤＡＢで染色し比較した。すると、３０分静置したものと比較して磁石１０を用いたものは強い染色性が認められ、磁力による抗原抗体反応の促進が確認された。尚、図２は図１方法の原理を単純化して示し、図３は、さらに、具体的な方法として示している。

次に、図４から図９までは、本発明による免疫染色法の実例について示している。図４は磁石なしで、反応時間３０分、図５は、磁石ありで、反応時間２分、図６は、磁石ありで、反応時間４分、図７は、二次抗体なしの状態、図８は、二次抗体あり、図９は、ポリマー化ＨＲＰ、二次抗体不使用の状態を示している。

すなわち、前述の図４から図１０においては、一次抗体とＨＲＰを直接固定化した磁性粒子を作製した。まず、染色性を確認するために、二次抗体の有無の違いによる染色性の確認を行った。すると下図のようにＨＲＰ標識二次抗体を付加しなければ、ＤＡＢでの染色性が得られない事が判明した。この理由としては磁性粒子にＨＲＰ単体を付けただけでは、視認できる量のＨＲＰとＤＡＢの反応性が得られない、つまりはＨＲＰの量が不十分である事が示唆された。
そこで、ポリマー化したＨＲＰを磁性粒子に付け、ＤＡＢとの反応性を向上させることにした。ポリマー化させたＨＲＰを磁性粒子につける事で、ＨＲＰ標識二次抗体を使わずともＤＡＢとの反応させる事に成功した（下図左）。また、二次抗体を事前に磁性粒子と混ぜた上で、反応させても強い染色性を得る事ができた（下図右）。以上より、磁性粒子に一次抗体とＨＲＰポリマーをつける事、もしくは磁性粒子に一次抗体をつけ、事前に二次抗体を混ぜておくことでも迅速免疫染色が可能となった。

以上により、本発明による免疫染色の一形態について述べたが、前述の一形態に対して、図１に従って９種の形態を用いることができる。
すなわち、同一粒子上への酵素と抗体の固定化方法として、次の第１から第９の方法を示すことができる。
（第１方法）
磁性粒子を用いた免疫染色法において、同一粒子上へ酵素またはポリマー酵素と抗体が固定化された磁性粒子（１）を用いて対象物の検出を行い、前記検出は酵素反応による染色を用いることを特徴とする磁性粒子を用いた免疫染色法。
（第２方法）
前記酵素または前記ポリマー酵素と前記抗体を前記磁性粒子（１）上へ直接固定化する
ことを特徴とする請求項１記載の磁性粒子を用いた免疫染色法。
（第３方法）
前記磁性粒子（１）表面へポリマー酵素をリンカーとして導入し、前記磁性粒子（１）表面へ前記抗体を固定化することを特徴とする請求項１記載の磁性粒子を用いた免疫染色法。
（第４方法）
前記酵素と抗体認識分子を直接前記磁性粒子上へ固定した後、固定化した前記抗体認識分子部分へ前記抗体を固定化することを特徴とする請求項１記載の磁性粒子を用いた免疫染色法。
（第５方法）
ポリマー酵素標識抗体認識分子を直接前記粒子へ固定化した後、固定化した前記ポリマー酵素標識抗体認識分子部分へ抗体を固定することを特徴とする請求項１記載の磁性粒子を用いた免疫染色法。
（第６方法）
前記ポリマー酵素にて標識した抗体を前記粒子の表面へ直接固定化することを特徴とする請求項１記載の磁性粒子を用いた免疫染色法。
（第７方法）
前記抗体と抗体認識分子を直接前記粒子上へ固定した後、二次抗体（５ａ）を固定化する方法ことを特徴とする請求項１記載の磁性粒子を用いた免疫染色法。
（第８方法）
前記抗体認識分子が、タグ認識分子、アビジン類、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ、Ｇ、Ａ／Ｇ、Ｌ、ペプチド認識分子、二次抗体の何れか１つであることを特徴とする請求項１記載の磁性粒子を用いた免疫染色法。
（第９方法）
前記ポリマー酵素標識抗体認識分子が、タグ認識分子、アビジン類、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ、Ｇ、Ａ／Ｇ、Ｌ、ペプチド認識分子、二次抗体の何れか１つであることを特徴とする請求項１記載の磁性粒子を用いた免疫染色法。

本発明による磁性粒子による免疫染色法は、染色までの反応ステップ数（二次抗体反応）を従来よりも少なくでき、反応時間を従来よりも少なくでき、磁性粒子においては、一次抗体反応時間の短縮を行うことで、従来より迅速な診断を可能とすることができる。

１ 磁性粒子
２ 磁性体
３ ペルオキシダーゼ

Claims (9)

1. 磁性粒子を用いた免疫染色法において、同一粒子上へ酵素またはポリマー酵素と抗体が固定化された磁性粒子（１）を用いて対象物の検出を行い、前記検出は酵素反応による染色を用いることを特徴とする磁性粒子を用いた免疫染色法。
2. 前記酵素または前記ポリマー酵素と前記抗体を前記磁性粒子（１）上へ直接固定化する
   ことを特徴とする請求項１記載の磁性粒子を用いた免疫染色法。
3. 前記磁性粒子（１）表面へポリマー酵素をリンカーとして導入し、前記磁性粒子（１）表面へ前記抗体を固定化することを特徴とする請求項１記載の磁性粒子を用いた免疫染色法。
4. 前記酵素と抗体認識分子を直接前記磁性粒子上へ固定した後、固定化した前記抗体認識分子部分へ前記抗体を固定化することを特徴とする請求項１記載の磁性粒子を用いた免疫染色法。
5. ポリマー酵素標識抗体認識分子を直接前記粒子へ固定化した後、固定化した前記ポリマー酵素標識抗体認識分子部分へ抗体を固定することを特徴とする請求項１記載の磁性粒子を用いた免疫染色法。
6. 前記ポリマー酵素にて標識した抗体を前記粒子の表面へ直接固定化することを特徴とする請求項１記載の磁性粒子を用いた免疫染色法。
7. 前記抗体と抗体認識分子を直接前記粒子上へ固定した後、二次抗体（５ａ）を固定化する方法ことを特徴とする請求項１記載の磁性粒子を用いた免疫染色法。
8. 前記抗体認識分子が、タグ認識分子、アビジン類、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ、Ｇ、Ａ／Ｇ、Ｌ、ペプチド認識分子、二次抗体の何れか１つであることを特徴とする請求項４又は７記載の磁性粒子を用いた免疫染色法。
9. 前記ポリマー酵素標識抗体認識分子が、タグ認識分子、アビジン類、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ、Ｇ、Ａ／Ｇ、Ｌ、ペプチド認識分子、二次抗体の何れか１つであることを特徴とする請求項５記載の磁性粒子を用いた免疫染色法。

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