JP2023512027A - 分析物検出 - Google Patents

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Abstract

本明細書中で、分析物検出に関する技術が提供され、ならびに詳細には、プローブの同じ分析物分子への累積した反復結合を統合する分子プローブを用いる、分析物の高特異性検出のための、組成物、方法、システム、及びキットに関する技術が提供されるが、これに限定されない。

Description

本出願は、２０２０年１月２９日出願の米国仮特許出願番号第６２／９６７，４３３号に対する優先権を主張し、これは、本明細書中でその全体が参考として組み込まれる。
連邦政府によって支援された研究及び開発に関する声明
本発明は、国立衛生研究所によって与えられた、ＣＡ２０４５６０及びＣＡ２２９０２３の下の政府の支援によってなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
分野
本明細書中において提供されるのは、分析物検出に関する技術であり、ならびに詳細には、プローブの同じ分析物分子への累積した反復結合を統合する、分子プローブを用いて分析物（例えば、核酸、タンパク質又は他の生体分子）を検出するか、性質決定するか、同定するか、及び／又は定量するための組成物、方法、システム及びキットを提供するが、これに限るものではない。
背景
分析物（例えば、生体分子（例えば、タンパク質、核酸及び脂質）及び低分子（例えば、薬物、代謝物、補因子など）が挙げられるが、これらに限定されない）の感度が高く特異性の高い検出は、生物医学的研究、インビトロ診断、及び臨床医学において、重要な役割を果たす。分析物検出は、一般に、目的の分析物について高い親和性及び特異性を有し、及び標的分析物の存在下でのみ検出可能なシグナルを発生させる分子試薬（例えば、抗体、ハイブリダイゼーションプローブなど）を用いて実施される。しかし、アフィニティープローブは、標的分析物について、限定的な特異性及び親和性しか有さない（例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１２）“Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．４，２０８－１４を参照されたい）ので、したがって、いくつかの分析物を高い信頼性で検出することは困難となる。ごく低濃度で存在する目的のバイオマーカーについては、このことは大きな問題である（例えば、フェムトモル濃度を下回る濃度；例えば、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．（２００１）“Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｉｎ ｐｌａｓｍａ ａｎｄ ｓｅｒｕｍ ｓａｍｐｌｅｓ：ｈｉｇｈｅｒ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｆｏｕｎｄ ｉｎ ｓｅｒｕｍ ｔｈａｎ ｉｎ ｐｌａｓｍａ．”Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ（Ｐａｒｉｓ）４１：２７６－８２；Ｍｉｔｃｈｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（２００８）“Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ａｓ ｓｔａｂｌｅ ｂｌｏｏｄ－ｂａｓｅｄ ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０５：１０５１３－１８；Ｂｅｔｔｅｇｏｗｄａ ｅｔ ａｌ．（２０１４）“Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ ｉｎ Ｅａｒｌｙ－ ａｎｄ Ｌａｔｅ－Ｓｔａｇｅ Ｈｕｍａｎ Ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ”Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．６：２２４ｒａ２４－２２４ｒａ２４；Ｈｕｓａｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１７）“Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｄａｉｌｙ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ Ｅａｒｌｙ Ｔｕｍｏｒ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｔｈｅｒａｐｙ ｂｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ ｉｎ Ｕｒｉｎｅ”Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２３：４７１６－２３を参照されたい）。
Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１２）"Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．４，２０８－１４ Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．（２００１）"Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｉｎ ｐｌａｓｍａ ａｎｄ ｓｅｒｕｍ ｓａｍｐｌｅｓ：ｈｉｇｈｅｒ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｆｏｕｎｄ ｉｎ ｓｅｒｕｍ ｔｈａｎ ｉｎ ｐｌａｓｍａ．"Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ（Ｐａｒｉｓ）４１：２７６－８２ Ｍｉｔｃｈｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（２００８）"Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ａｓ ｓｔａｂｌｅ ｂｌｏｏｄ－ｂａｓｅｄ ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ"Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０５：１０５１３－１８ Ｂｅｔｔｅｇｏｗｄａ ｅｔ ａｌ．（２０１４）"Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ ｉｎ Ｅａｒｌｙ－ ａｎｄ Ｌａｔｅ－Ｓｔａｇｅ Ｈｕｍａｎ Ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ"Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．６：２２４ｒａ２４－２２４ｒａ２４ Ｈｕｓａｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１７）"Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｄａｉｌｙ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ Ｅａｒｌｙ Ｔｕｍｏｒ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｔｈｅｒａｐｙ ｂｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ ｉｎ Ｕｒｉｎｅ"Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２３：４７１６－２３
分析物の多くのコピーを（例えば、ＰＣＲ及び他の核酸増幅技術によって）生成すること、シグナルを増幅すること、又はシグナルを記録するための長時間のアッセイ及び観察によって、感度を増大してもよいが、分析物検出技術は、より低い検出限界を有するエンドポイント検出技術を提供することによって、改善されるであろう。
要旨
したがって、本明細書中で、プローブの同じ分析物分子への累積した反復結合を統合する分子プローブを用いて分析物を検出するための技術が、提供される。いくつかの実施形態において、この技術は、平衡ポワソンサンプリングによる一分子認識（ＳｉＭＲＥＰＳ）に類似する。例えば、米国特許出願番号第１４／５８９，４６７号；及びＪｏｈｎｓｏｎ－Ｂｕｃｋ ｅｔ ａｌ．（２０１６）“Ｋｉｎｅｔｉｃ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ａｎｄ ｃｏｕｎｔ ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ”Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３３：７９０を参照されたい（これらの各々は、本明細書中でその全体が参考として組み込まれる）。
しかし、本明細書中で記載される技術は、１つのプローブ（例えば、本明細書中で記載される「タリー（ｔａｌｌｙ）」プローブであって、これは、ＳｉＭＲＥＰＳ「クエリ―（ｑｕｅｒｙ）」プローブに類似している）の反復結合が、別のプローブ（「インテグレーター（ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ）」プローブ）上への複数の標識の蓄積をもたらし、これが反復結合を記録するという点で、ＳｉＭＲＥＰＳとは異なっている。分析物の存在は、自身に結合している複数の（例えば、１つより多くの）標識を含む１つ以上のインテグレータープローブの存在によって示される。したがって、タリープローブの分析物への反復結合は、現行の技術において必ずしも実時間で観察されていないが、例えば、一分子レベルにて（例えば、蛍光顕微鏡検査を用いる）又はバルク方法（例えば、電気泳動、クロマトグラフィー、もしくは質量分析）を用いるかのいずれかで、各インテグレータープローブへ結合する標識の数によって（例えば、エンドポイント測定を用いて）検出される。
本技術の実施形態は、時間依存型実時間シグナルとしてよりもむしろ、エンドポイント測定を用いてデータを獲得できるので、したがって、いくつかの実施形態において、この技術は、改善された（例えば、加速された）、かつより単純な、データ獲得及び／又はデータ分析を提供する。しかし、この技術は、エンドポイント検出を用いることに限定されず、いくつかの実施形態が、例えば、シグナル及び／又は時間依存型シグナルを記録するための、実時間測定の使用を含む。いくつかの実施形態において、本技術は、例えば、既存の（例えば、実時間（例えば、ＳｉＭＲＥＰＳ））技術と比較してサンプル中の分析物のずっと大きな画分を検出することによって、既存の（例えば、実時間（例えば、ＳｉＭＲＥＰＳ））技術よりも低い検出下限を提供する。本明細書中で記載される技術は、例えば、診断、研究及び臨床医学において用途を見出し、及び、いくつかの実施形態において、標的化療法における分子認識の正確さを増大する。
したがって、本明細書中で提供されるのは、サンプル中の分析物を検出するための組成物の実施形態である。例えば、いくつかの実施形態において、この技術は、分析物に特異的なインテグレータープローブ及び上記分析物に特異的でありかつ標識を含むタリープローブを含む組成物を提供し、ここで、インテグレータープローブ及びタリープローブの両方が上記分析物に結合しているとき、上記標識は、タリープローブからインテグレータープローブへ不可逆的に（例えば、実質的に又は事実上不可逆的に）転移される。いくつかの実施形態において、上記インテグレータープローブは、上記分析物に安定的に結合する。いくつかの実施形態において、上記タリープローブは、上記分析物に一時的に結合する。いくつかの実施形態において、上記インテグレータープローブは、１つより多くの標識（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０、又はそれより多くの標識）に結合するように構成されている。したがって、いくつかの実施形態において、組成物は、複数の標識（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０、又はそれより多くの標識）を含むインテグレータープローブを含む。いくつかの実施形態において、本明細書中で記載される組成物は、分析物をさらに含む。いくつかの実施形態において、上記インテグレータープローブは、標識に、非共有結合的に結合する（例えば、不可逆的に、実質的に不可逆的に、及び／又は事実上不可逆的に、非共有結合的に結合する）ように構成されている。いくつかの実施形態において、上記インテグレータープローブは、標識に、共有結合する（例えば、不可逆的に、実質的に不可逆的に、及び／又は事実上不可逆的に共有結合する）ように構成されている。いくつかの実施形態において、上記分析物は、核酸、タンパク質、代謝物、低分子、脂質又は糖を含む。いくつかの詳細な実施形態において、上記インテグレータープローブは、核酸もしくはタンパク質（例えば、抗体）又は核酸及びタンパク質の両方を含む。いくつかの実施形態において、上記タリープローブは、核酸もしくはタンパク質（例えば、抗体）又は核酸及びタンパク質の両方を含む。いくつかの実施形態において、上記標識は、蛍光標識又は発光標識である。いくつかの実施形態において、上記組成物は、上記分析物に結合したタリープローブを、解離したタリープローブに変換する、タリープローブ開放構成要素をさらに含む。いくつかの実施形態において、上記タリープローブ開放構成要素は、タリープローブ－分析物複合体に特異的な酵素を含む。いくつかの実施形態において、上記インテグレータープローブは、第１官能基を含み、及び上記タリープローブの標識は、上記第１官能基に対して反応性である第２官能基を含む。いくつかの実施形態において、上記インテグレータープローブは、第１クリック反応物を含み、及び上記タリープローブの標識は、第２クリック反応物を含む。いくつかの実施形態において、上記インテグレータープローブは、第１アフィニティーリガンドを含み、及び上記タリープローブの標識は、上記第１アフィニティーリガンドに選択的に結合する第２アフィニティーリガンドを含む。いくつかの実施形態において、上記インテグレータープローブは、第１核酸配列を含み、及び上記タリープローブの標識は、上記第１核酸配列に対して相補的である第２核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、上記タリープローブから上記インテグレータープローブへの上記標識の転移は、トーホールド媒介鎖置換を介して起こる。いくつかの実施形態において、上記インテグレータープローブは、コンセンサスな標的アミノ酸又は核酸配列を含み、及び上記タリープローブの標識は、上記コンセンサス標的配列へ酵素的に転移されるリガンドを含む。いくつかの実施形態において、上記インテグレータープローブは、分離固相又は分離液相（例えば、コロイド粒子、液中液エマルジョンの液滴、又は水性二相系の相）を含み、この中に、上記タリープローブの標識が、上記分析物への上記タリープローブの結合の場合に選択的に区分される。
さらなる例では、いくつかの実施形態において、上記技術は、分析物に安定的に結合可能であるインテグレータープローブ；及び標識を含み、上記分析物と直接的に又は間接的に結合可能であるタリープローブを含む、組成物を提供し、ここで、上記タリープローブ及び上記インテグレータープローブの両方が上記分析物と結合しているときには、上記タリープローブ及び／又は上記インテグレータープローブが上記分析物から解離しているときよりも、上記タリープローブから上記インテグレータープローブへの上記標識の不可逆的な転移が、より迅速に及び／又はより効率的に起こる。いくつかの実施形態において、上記組成物は、上記分析物に結合可能であるアダプタープローブをさらに含み、ここで、上記タリープローブは、上記アダプタープローブと直接的に結合することにより、上記分析物と間接的に結合する。いくつかの実施形態において、上記タリープローブは、上記分析物に特異的であり、及び上記分析物と直接的に結合する。いくつかの実施形態において、上記インテグレータープローブは、上記分析物に特異的である。いくつかの実施形態において、上記タリープローブは、上記分析物に一時的に結合する。いくつかの実施形態において、上記タリープローブは、上記アダプタープローブに一時的に結合する。いくつかの実施形態において、上記インテグレータープローブは、１つより多くの標識に結合するように構成されている。いくつかの実施形態において、上記組成物は、複数の標識を含むインテグレータープローブを含む。いくつかの実施形態において、上記組成物は、分析物をさらに含む。いくつかの実施形態において、上記インテグレータープローブは、標識を非共有結合的に結合するように構成されている。いくつかの実施形態において、上記インテグレータープローブは、標識を共有結合するように構成されている。いくつかの実施形態において、上記分析物は、核酸、タンパク質、代謝物、低分子、脂質又は糖を含む。いくつかの実施形態において、上記インテグレータープローブは、物質分離相を含む。いくつかの実施形態において、上記物質分離相は、コロイド粒子、リポソーム、ミセル、又は乳化液滴である。例えば、いくつかの実施形態において、液滴又は粒子が、上記分析物を含み（例えば、上記分析物が、液滴又は粒子の上／中に捕捉される）、及び上記タリープローブの上記分析物への結合は、液滴又は粒子への標識の転移をもたらす。いくつかの実施形態において、上記インテグレータープローブは、核酸又はタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、上記タリープローブは、核酸又はタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、上記標識は、蛍光標識又は発光標識である。いくつかの実施形態において、上記組成物は、上記分析物に結合したタリープローブを、解離したタリープローブに変換する、タリープローブ開放構成要素をさらに含む。いくつかの実施形態において、上記タリープローブ開放構成要素は、タリープローブ－分析物複合体に特異的な酵素を含む。いくつかの実施形態において、上記インテグレータープローブは、第１官能基を含み、及び上記タリープローブの上記標識は、上記第１官能基と反応性である第２官能基を含む。いくつかの実施形態において、上記インテグレータープローブは、第１クリック反応物を含み、及び上記タリープローブの標識は、第２クリック反応物を含む。
その上さらに、いくつかの実施形態において、上記技術は、サンプル中の分析物を検出するシステムを提供する。例えば、いくつかの実施形態において、システムは、分析物に特異的なインテグレータープローブ；及び上記分析物に特異的でありかつ標識を含むタリープローブを含み、ここで、インテグレータープローブ及びタリープローブの両方が上記分析物に結合しているとき、上記標識は、タリープローブからインテグレータープローブへ不可逆的に（例えば、実質的に又は事実上不可逆的に）転移される。いくつかの実施形態において、上記インテグレータープローブは、上記分析物に安定的に結合する。いくつかの実施形態において、上記タリープローブは、上記分析物に一時的に結合する。いくつかの実施形態において、上記インテグレータープローブは、１つより多くの標識（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０、又はそれより多くの標識）に結合するように構成されている。いくつかの実施形態において、システムは、分析物をさらに含む。いくつかの実施形態において、上記分析物は、核酸、タンパク質、代謝物、低分子、脂質又は糖を含む。いくつかの実施形態において、上記インテグレータープローブは、核酸もしくはタンパク質（例えば、抗体）又は核酸及びタンパク質の両方を含む。いくつかの実施形態において、上記タリープローブは、核酸もしくはタンパク質（例えば、抗体）又は核酸及びタンパク質の両方を含む。いくつかの実施形態において、上記標識は、蛍光標識又は発光標識である。いくつかの実施形態において、システムは、複数の標識を含むインテグレータープローブによって発生したシグナル（例えば、蛍光シグナル、質量シグナル、電荷シグナル）を検出及び／又は定量するように構成されている検出構成要素をさらに含む。いくつかの実施形態において、システムは、マイクロプロセッサー（例えば、コンピューター）を含む。いくつかの実施形態において、システムは、インテグレータープローブによって発生したシグナルを記録するように構成されており、インテグレータープローブによって発生したシグナルを用いてサンプル中の分析物の存在を検出し及び／若しくは定量するように、ならびに／又はサンプル中の分析物の存在及び／もしくは量（例えば、分量及び／もしくは濃度）を述べる定性的及び／もしくは定量的な値を含む出力を作成するように構成されている、ソフトウェア構成要素を含む。いくつかの実施形態において、上記インテグレータープローブは、第１官能基を含み、及び上記タリープローブの標識は、上記第１官能基と反応性である第２官能基を含む。いくつかの実施形態において、上記インテグレータープローブは、第１クリック反応物を含み、及び上記タリープローブの標識は、第２クリック反応物を含む。いくつかの実施形態において、上記インテグレータープローブは、第１アフィニティーリガンドを含み、及び上記タリープローブの標識は、上記第１アフィニティーリガンドに選択的に結合する第２アフィニティーリガンドを含む。いくつかの実施形態において、上記インテグレータープローブは、第１核酸配列を含み、及び上記タリープローブの標識は、上記第１核酸配列に対して相補的である第２核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、上記タリープローブから上記インテグレータープローブへの上記標識の転移は、トーホールド媒介鎖置換を介して起こる。いくつかの実施形態において、上記インテグレータープローブは、コンセンサスな標的アミノ酸又は核酸配列を含み、及び上記タリープローブの標識は、上記コンセンサス標的配列へ酵素的に転移されるリガンドを含む。いくつかの実施形態において、システムは、上記分析物に結合したタリープローブを、解離したタリープローブに変換する、タリープローブ開放構成要素をさらに含む。いくつかの実施形態において、上記タリープローブ開放構成要素は、タリープローブ－分析物複合体に特異的な酵素を含む。いくつかの実施形態において、上記インテグレータープローブは、分離固相又は分離液相（例えば、コロイド粒子、液中液エマルジョンの液滴、又は水性二相系の相）を含み、この中に、上記タリープローブの標識が、上記分析物への上記タリープローブの結合の場合に選択的に区分される。
追加の実施形態において、上記技術は、分析物に安定的に結合可能であるインテグレータープローブ；及び標識を含み、上記分析物と直接的に又は間接的に結合可能であるタリープローブを含むシステムを提供し、ここで、上記タリープローブ及び上記インテグレータープローブの両方が上記分析物と結合しているときには、上記タリープローブ及び／又は上記インテグレータープローブが上記分析物から解離しているときよりも、上記タリープローブから上記インテグレータープローブへの上記標識の不可逆的な転移が、より迅速に及び／又はより効率的に起こる。いくつかの実施形態において、上記システムは、上記分析物に結合可能であるアダプタープローブをさらに含み、ここで、上記タリープローブは、上記アダプタープローブと直接的に結合することにより、上記分析物と間接的に結合する。いくつかの実施形態において、上記タリープローブは、上記分析物に特異的であり、及び上記分析物と直接的に結合する。いくつかの実施形態において、上記インテグレータープローブは、上記分析物に特異的である。いくつかの実施形態において、上記タリープローブは、上記分析物に一時的に結合する。いくつかの実施形態において、上記タリープローブは、上記アダプタープローブに一時的に結合する。いくつかの実施形態において、上記インテグレータープローブは、１つより多くの標識に結合するように構成されている。いくつかの実施形態において、上記システムは、複数の標識を含むインテグレータープローブを含む。いくつかの実施形態において、上記システムは、分析物をさらに含む。いくつかの実施形態において、上記インテグレータープローブは、標識を非共有結合的に結合するように構成されている。いくつかの実施形態において、上記インテグレータープローブは、標識を共有結合するように構成されている。いくつかの実施形態において、上記分析物は、核酸、タンパク質、代謝物、低分子、脂質又は糖を含む。いくつかの実施形態において、上記インテグレータープローブは、物質分離相を含む。いくつかの実施形態において、上記物質分離相は、コロイド粒子、リポソーム、ミセル、又は乳化液滴である。いくつかの実施形態において、上記インテグレータープローブは、核酸又はタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、上記タリープローブは、核酸又はタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、上記標識は、蛍光標識又は発光標識である。いくつかの実施形態において、上記システムは、上記分析物に結合したタリープローブを、解離したタリープローブに変換する、タリープローブ開放構成要素をさらに含む。いくつかの実施形態において、上記タリープローブ開放構成要素は、タリープローブ－分析物複合体に特異的な酵素を含む。いくつかの実施形態において、インテグレータープローブは、第１官能基を含み、及び上記タリープローブの標識は、上記第１官能基と反応性である第２官能基を含む。いくつかの実施形態において、上記インテグレータープローブは、第１クリック反応物を含み、及び上記タリープローブの標識は、第２クリック反応物を含む。いくつかの実施形態において、システムは、複数の標識を含むインテグレータープローブによって発生したシグナルを検出及び／又は定量するように構成されている検出構成要素をさらに含む。
いくつかの実施形態において、上記技術は、分析物を検出及び／又は定量する方法に関する。例えば、いくつかの実施形態において、方法は、分析物を含むサンプルを提供すること；上記分析物に特異的なインテグレータープローブを提供すること；及び上記分析物に特異的でありかつ標識を含むタリープローブを提供することを含む。いくつかの実施形態において、上記インテグレータープローブ及び蒸気タリープローブの両方が上記分析物に結合しているとき、上記標識は、上記タリープローブから上記インテグレータープローブへ不可逆的に（例えば、実質的に又は事実上不可逆的に）転移される。いくつかの実施形態において、上記インテグレータープローブは、上記分析物に安定的に結合する。いくつかの実施形態において、上記タリープローブは、上記分析物に一時的に結合する。いくつかの実施形態において、上記インテグレータープローブは、１つより多くの標識（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０、又はそれより多くの標識）に結合するように構成されている。いくつかの実施形態において、上記インテグレータープローブは、標識に、非共有結合的に結合する（例えば、不可逆的に、実質的に不可逆的に、及び／又は事実上不可逆的に、非共有結合的に結合する）ように構成されている。いくつかの実施形態において、上記インテグレータープローブは、標識に、共有結合する（例えば、不可逆的に、実質的に不可逆的に、及び／又は事実上不可逆的に共有結合する）ように構成されている。いくつかの実施形態において、上記分析物は、核酸、タンパク質、代謝物、低分子、脂質又は糖を含む。いくつかの実施形態において、上記インテグレータープローブは、核酸もしくはタンパク質（例えば、抗体）又は核酸及びタンパク質の両方を含む。いくつかの実施形態において、上記タリープローブは、核酸もしくはタンパク質（例えば、抗体）又は核酸及びタンパク質の両方を含む。いくつかの実施形態において、上記標識は、蛍光標識又は発光標識である。いくつかの実施形態において、方法は、上記分析物に結合したタリープローブを、解離したタリープローブに変換する、タリープローブ開放構成要素を提供することをさらに含む。いくつかの実施形態において、上記タリープローブ開放構成要素は、タリープローブ－分析物複合体に特異的な酵素を含む。いくつかの実施形態において、上記インテグレータープローブは、第１官能基を含み、及び上記タリープローブの標識は、上記第１官能基に対して反応性である第２官能基を含む。いくつかの実施形態において、上記インテグレータープローブは、第１クリック反応物を含み、及び上記タリープローブの標識は、第２クリック反応物を含む。いくつかの実施形態において、上記インテグレータープローブは、第１アフィニティーリガンドを含み、及び上記タリープローブの標識は、上記第１アフィニティーリガンドに選択的に結合する第２アフィニティーリガンドを含む。いくつかの実施形態において、上記インテグレータープローブは、第１核酸配列を含み、及び上記タリープローブの標識は、上記第１核酸配列に対して相補的である第２核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、上記タリープローブから上記インテグレータープローブへの上記標識の転移は、トーホールド媒介鎖置換を介して起こる。いくつかの実施形態において、上記インテグレータープローブは、コンセンサスな標的アミノ酸又は核酸配列を含み、及び上記タリープローブの標識は、上記コンセンサス標的配列へ酵素的に転移されるリガンドを含む。いくつかの実施形態において、上記インテグレータープローブは、分離固相又は分離液相（例えば、コロイド粒子、液中液エマルジョンの液滴、又は水性二相系の相）を含み、この中に、上記分析物への上記タリープローブの結合の場合に、上記タリープローブの標識が選択的に区分される。いくつかの実施形態において、上記分析物は、疾患についてのバイオマーカーである。いくつかの実施形態において、上記分析物は、がんについてのバイオマーカーである。いくつかの実施形態において、上記サンプルは、生物液である。いくつかの実施形態において、上記サンプルは、血液、尿、粘液、唾液、精液、又は組織を含み、及び/又はそれらから調製される。いくつかの実施形態において、上記サンプル中の分析物を検出すること及び／又は定量することは、対象が上記疾患を有することを示す。いくつかの実施形態において、方法は、上記サンプル中の上記分析物の存在及び／又は量を述べる結果を提供することをさらに含む。いくつかの実施形態において、方法は、陽性対照及び／又は陰性対照を提供することをさらに含む。いくつかの実施形態において、方法は、標準曲線を提供することをさらに含む。
さらなる実施形態は、分析物を含むサンプルを提供すること；分析物に安定的に結合可能であるインテグレータープローブを提供すること；及び標識を含み、上記分析物と直接的に又は間接的に結合可能であるタリープローブを提供することを含むことを提供する。いくつかの実施形態において、上記タリープローブ及び上記インテグレータープローブの両方が上記分析物と結合しているときには、上記タリープローブ及び／又は上記インテグレータープローブが上記分析物から解離しているときよりも、上記タリープローブから上記インテグレータープローブへの上記標識の不可逆的な転移は、より迅速に及び／又はより効率的に起こる。いくつかの実施形態において、方法は、上記分析物に結合可能であるアダプタープローブをさらに含み、ここで、上記タリープローブは、上記アダプタープローブと直接的に結合することにより、上記分析物と間接的に結合する。いくつかの実施形態において、上記タリープローブは、上記分析物に特異的であり、及び上記分析物と直接的に結合する。いくつかの実施形態において、上記インテグレータープローブは、上記分析物に特異的である。いくつかの実施形態において、上記タリープローブは、上記分析物に一時的に結合する。いくつかの実施形態において、上記タリープローブは、上記アダプタープローブに一時的に結合する。いくつかの実施形態において、上記インテグレータープローブは、１つより多くの標識に結合するように構成されている。いくつかの実施形態において、上記インテグレータープローブは、標識を非共有結合的に結合するように構成されている。いくつかの実施形態において、上記インテグレータープローブは、標識を共有結合するように構成されている。いくつかの実施形態において、上記分析物は、核酸、タンパク質、代謝物、低分子、脂質又は糖を含む。いくつかの実施形態において、上記インテグレータープローブは、物質分離相を含む。いくつかの実施形態において、上記物質分離相は、コロイド粒子、リポソーム、ミセル、又は乳化液滴である。いくつかの実施形態において、上記インテグレータープローブは、核酸又はタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、上記タリープローブは、核酸又はタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、上記標識は、蛍光標識又は発光標識である。いくつかの実施形態において、方法は、上記分析物に結合したタリープローブを、解離したタリープローブに変換する、タリープローブ開放構成要素を提供することをさらに含む。いくつかの実施形態において、上記タリープローブ開放構成要素は、タリープローブ－分析物複合体に特異的な酵素を含む。いくつかの実施形態において、上記インテグレータープローブは、第１官能基を含み、及び上記タリープローブの上記標識は、上記第１官能基と反応性である第２官能基を含む。いくつかの実施形態において、上記インテグレータープローブは、第１クリック反応物を含み、及び上記タリープローブの標識は、第２クリック反応物を含む。いくつかの実施形態において、上記分析物は、疾患についてのバイオマーカーであり、かつ／又はがんについてのバイオマーカーである。いくつかの実施形態において、上記サンプルは、生物液である。いくつかの実施形態において、上記サンプルは、血液、尿、粘液、唾液、精液、又は組織を含み、及び/又はそれらから調製される。いくつかの実施形態において、上記サンプル中の分析物を検出すること及び／又は定量することは、対象が上記疾患を有することを示す。いくつかの実施形態において、方法は、上記サンプル中の上記分析物の存在及び／又は量を述べる結果を提供することをさらに含む。いくつかの実施形態において、方法は、陽性対照及び／又は陰性対照を提供することをさらに含む。いくつかの実施形態において、方法は、標準曲線を提供することをさらに含む。
いくつかの実施形態において、上記技術は、サンプル中の分析物を検出するため、及び／又は定量するための、本明細書中で記載される組成物の使用に関する。いくつかの実施形態において、上記技術は、サンプル中の分析物を検出するため、及び／又は定量するための、本明細書中で記載されるシステムの使用に関する。
さらなる実施形態が、本明細書中に含まれる教示に基づいて、当該分野の当業者に明らかとなろう。
本技術のこれら及び他の特徴、局面及び利点は、以下の図面に関してよりよく理解されよう。
本明細書中で提供される、本技術の原則を示す模式図である。インテグレータープローブ（Ｉ）は、標的分析物（Ａ）に安定的に結合し、及びＡの同コピーへのタリープローブ（Ｔ）の反復結合が、ＴからＩへの標識Ｌ（黄色星）の転移を引き起こす。最初に、Ｉは、標識を含んでおらず、Ｉ０と名付けられる。ＴがＡに結合する複数の周期の後に、Ｉは、２以上のＮ個の標識によって修飾され、及びＩＮと名付けられる。偽の分析物（Ａ＊）の存在下では、Ｔ及び／又はＩのＡ＊への結合は弱く、したがって、ＴからＩへの標識の転移は、Ａの存在下よりもずっと遅い。Ｉの所定のコピーにおける複数の（例えば、２より多くの）標識の存在は、混合物中のＡの存在及び／又は量を示す特異的な指標を提供する。 核酸分析物の検出のために銅フリークリック化学及びＲＮａｓｅ Ｈを用いる、本技術の特定の例示的実施形態を示す模式図である。インテグレータープローブＩは、複数のテトラジン（Ｔｚ、オレンジ色六角形）部分を含み、ワトソン－クリック塩基対形成によってＡに安定的に結合する。タリープローブＴは、１つのトランス－シクロオクテン（ＴＣＯ、緑色八角形）部分を含み、Ａに一時的に結合する。これは、Ｔが、Ａに結合した後でＲＮａｓｅ Ｈによって選択的に分解される、Ａに相補的な一連のＲＮＡヌクレオチドを含むからである。局所的に高いＴＣＯ及びＴｚ標識の有効濃度に起因して、Ｉ及びＴがＡの同じコピーに結合した場合、ＲＮａｓｅ Ｈによる分解が起こる前に、ＴとＩとを共有結合させるクリック反応が起こる。ＲＮａｓｅ ＨがＴの結合したコピーを部分的に分解した後、ＴとＡとの間の相補的塩基対の数が減り、Ｔの新しいコピーがＡにハイブリダイズする。結合、クリック反応及び分解の複数の周期の後、部分的に分解されたＴの複数のコピー（標識Ｌを含む）が、Ｉの随伴するコピーに共有結合し、Ａの同じコピーに対する複数の結合事象の発生の永続的な記憶を保持する。多重標識されたインテグレータープローブの存在は、混合物中のＡの存在及び／又は量を示す特異的な指標を提供し、これは、変性ポリアクリルアミド電気泳動（ＰＡＧＥ）、蛍光顕微鏡検査、質量分析、及び／又はクロマトグラフィーなどの検出器によって検出され得る。本システムの他の実施形態は、まずＲＮＡヌクレオチド（左下）を含みかつ／又は他の種類の分析物（例えばタンパク質）に特異的であるアフィニティープローブに結合体化するＴプローブを用いる。 ３コピーまでのＴＣＯを含むインテグレータープローブ及びメチルテトラジンを含むタリープローブを用いて、４１ヌクレオチド突然変異核酸（ＭＵＴ）において点変異が検出される実験からの結果を示す、染色した変性ポリアクリルアミドゲルである。点変異を有さない対応する野生型（ＷＴ）配列は検出されず、点変異についてのアッセイの選択性を示している。 分析物ＤＮＡ配列の存在が一分子全反射照明蛍光（ＴＩＲＦ）顕微鏡検査によって検出される実験からの、データを示す。
図面は、必ずしも一定の縮尺で描かれているわけではなく、図中の物質もまた必ずしも互いに一定の縮尺関係で描かれているわけではないことが、理解されるべきである。図面は、本明細書中で開示される装置、システム及び方法の種々の実施形態を明らかにし及び理解することを意図して描かれている。可能な限り、同じ又は同様の部分を指すために、図面を通して同じ参照番号が使用される。さらに、図面は、本教示の範囲をいかなる意味にも限定することを意図されないことが、理解されるべきである。
詳細な説明
分析物検出に関する技術が本明細書中で提供され、及び詳細には、分析物（例えば、核酸、タンパク質又は他の生体分子）を、同じ分析物分子に対するプローブ（例えば、タリープローブ）の累積した反復結合を統合する分子プローブ（例えば、インテグレータープローブ）を用いて検出し、性質決定し、同定し、及び/又は定量するための、上述の組成物、方法、システム、キット及び使用に関する技術が、本明細書中で提供される。この技術の実施形態の開発の間、銅フリークリック化学を介してインテグレータープローブに結合した標識を用いてＤＮＡ点変異を検出し、及びゲル電気泳動後に蛍光染色によって可視化するためのシステムを、開発し及び試験するための実験を行った。いくつかの実施形態において、複数の標識を含むインテグレータープローブは、一分子方法又は他の検出方法を用いて検出される。この標識は、任意の検出可能な分子部分、例えばフルオロフォア、ＤＮＡ配列、アフィニティータグ、質量タグ、酵素、ハプテン、タンパク質タグなどであってもよく、及び、インテグレータープローブに共有結合し得るか又は非共有結合的に結合し得る。インテグレータープローブは、例えば、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド、コロイドナノ粒子、又は複数の液相を含むシステム内の分離相であってもよく、同じ分子の分析物へのタリープローブの反復結合の場合に複数の（例えば、少なくとも２つの）コピーの標識を受け入れる能力を有する。
種々の実施形態の詳細な説明において、説明を目的として、開示の実施形態の完全な理解を提供するために多くの特定の詳細が示される。しかし、当業者は、これらの種々の実施形態が、この特定の詳細を用いても用いなくても実施され得ることを、理解するであろう。他の例では、構造及びデバイスは、ブロック図形態で示される。その上さらに、方法が提示され実施される特定の並びは例示であり、この並びは変動し得なおかつ本明細書中で開示される種々の実施形態の精神及び範囲のうちに留まることが企図されていることを、当業者は容易に理解することができる。
本出願において引用された全ての文献及び類似の資料（特許、特許出願、記事、書籍、論文及びインターネットウェブページが挙げられるがこれらに限定されない）は、いかなる目的のためにも、その全体が例示的に参考として組み込まれる。別段に定義しない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本明細書中で記載される種々の実施形態が属する分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。組み込まれた文献における用語の定義が本教示において提示される定義と異なる場合には、本教示において提示される定義を採用する。本明細書中で使用されるセクションの表題は、編集目的のものであり、記載される主題を限定するとはいかなる意味でも解釈されるべきではない。
定義
本技術の理解を容易にするために、多くの用語及び語句が、以下に定義される。さらなる定義は、詳細な説明を通して示される。
本明細書及び特許請求の範囲を通じて、文脈が明らかに反対の指示をしない限り、以下の用語は、本明細書中で明示的に伴われる意味を採用する。語句「１つの実施形態において」は、本明細書中で使用される場合、必ずしも同じ実施形態を言及しないが、同じ実施形態を言及してもよい。その上さらに、語句「別の施形態において」は、本明細書中で使用される場合、必ずしも異なる実施形態を言及しないが、異なる実施形態を言及してもよい。したがって、以下に記載されるとおり、本発明の種々の実施形態が、本発明の範囲又は精神を逸脱することなく、容易に組み合わせられ得る。
加えて、本明細書中で使用される場合、用語「又は」は、「又は」の包括的な作用素であり、文脈が明らかに反対の指示をしない限り、用語「及び／又は」と同等である。用語「～に基づく」は、排除的ではなく、文脈が明らかに反対の指示をしない限り、記載されない追加の因子に基づくことを許可する。加えて、明細書を通じて、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」の意味は、複数の参照を含む。「ｉｎ」の意味は、「ｉｎ」及び「ｏｎ」を含む。
本明細書中で使用される場合、用語「約」、「およそ」、「実質的に」、及び「有意に」は、当業者に理解され、それらが使用される文脈上でいくらかの範囲まで変動する。例えば、用語「実質的に」は、本明細書中で使用される場合、広範な用語であり、通常の意味において使用され、この意味としては、特定されるものが大いにではあるが必ずしも完全にでなくてもよいことを含むが、これに限定されない。使用される文脈の当業者に明らかでないこれらの用語の使用があった場合は、「約」及び「およそ」は、特定の用語の±１０％以下を意味し、及び「実質的に」及び「有意に」は、特定の用語の±１０％以上を意味する。
本明細書中で使用される場合、開示の範囲は、開示する全ての値及びさらに全範囲内の分割範囲を含み、これは、その範囲についての終点及び部分範囲を含む。
本明細書中で使用される場合、接尾辞「～フリー」は、「～フリー」が付けられた語の基部の特徴を省いた、上記技術の実施形態をいう。すなわち、用語「Ｘフリー」は、本明細書中で使用される場合、「Ｘなし」を意味し、ここで、Ｘは、「Ｘフリー」技術において省かれた技術特徴をいう。例えば、「カルシウムフリー」組成物は、カルシウムを含有せず、「混合フリー」方法は、混合工程を含まない、などである。
用語「第１」、「第２」、「第３」などは、本明細書中で種々の工程、要素、組成物、構成要素、領域、層、及び／又はセクションを説明するために使用され得るが、別段に示されない限り、これらの工程、要素、組成物、構成要素、領域、層、及び／又はセクションは、これらの用語を限定するべきではない。これらの用語は、１つの工程、要素、組成物、構成要素、領域、層、及び／又はセクションを、別の工程、要素、組成物、構成要素、領域、層、及び／又はセクションから識別するために使用される。「第１」、「第２」などの用語及び他の数値用語は、本明細書中で使用される場合、文脈によって明示されない限り、並び又は順番を含まない。したがって、本明細書中で議論される第１の工程、要素、組成物、構成要素、領域、層、又はセクションは、技術から逸脱することなく、第２の工程、要素、組成物、構成要素、領域、層、又はセクションと呼ばれ得る。
本明細書中で使用される場合、語「存在」もしくは「非存在」（又は、代替的に、「存在する」もしくは「存在しない」）は、特定の実体（例えば、分析物）の量又はレベルをいう相対的な概念において使用される。例えば、分析物が、試験サンプル中に「存在する」といわれる場合、この分析物のレベル又は量が、所定の閾値を上回ることを意味する；逆にいえば、分析物が、試験サンプル中に「存在しない」といわれる場合、この分析物のレベル又は量が、所定の閾値を下回ることを意味する。所定の閾値は、この分析物を検出するために使用される特定の試験に関連する検出感度の閾値であっても、又は他の閾値であってもよい。分析物がサンプル中で「検出される」場合、それは、サンプル中に「存在する」；分析物が「検出されない」場合、それは、サンプルに「存在しない」。さらに、中で分析物が「検出される」か又は中にこの分析物が「存在する」サンプルは、この分析物について「陽性」であるサンプルである。中で分析物が「検出されない」か又は中にこの分析物が「存在しない」サンプルは、この分析物について「陰性」であるサンプルである。
本明細書中で使用される場合、用語「検出する」は、分析物の存在もしくは非存在、又は分析物の活性もしくは効果を検出することをいうか、あるいは分析物のバリアントの存在もしくは非存在を検出することをいう。
本明細書中で使用される場合、用語「検出アッセイ」は、分析物の存在もしくは非存在、又は分析物の活性もしくは効果を検出するためのアッセイをいうか、あるいは分析物のバリアントの存在もしくは非存在を検出するためのアッセイをいう。
本明細書中で使用される場合、用語「分析物」は、試験され、アッセイされ、検出され、画像化され、性質決定され、説明され、及び/又は定量される物質をいう。例示的な分析物としては、分子、原子、イオン、生体分子（例えば、本明細書中で記載され及び定義される核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ））、ポリペプチド（例えば、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質）、炭水化物、脂質、アミノ酸、低分子（薬物、生物活性薬剤、毒素、補因子、代謝物）などが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書中で使用される場合、「増大」又は「低減」は、それぞれ、以前に測定した変数の値に対する、事前に確立された値に対する、及び/又は標準対照に対する、変数の値での、検出可能な（例えば、測定された）正又は負の変化をいう。増大は、以前に測定した変数の値に対して、事前に確立された値に対して、及び/又は標準対照に対して、好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは５０％、なおより好ましくは２倍、さらにより好ましくは少なくとも５倍、及び最も好ましくは少なくとも１０倍の、正の変化をいう。同様に、低減は、以前に測定した変数の値に対して、事前に確立された値に対して、及び/又は標準対照に対して、好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは５０％、なおより好ましくは少なくとも８０％、及び最も好ましくは少なくとも９０％の、負の変化をいう。定量的変化又は相違を示す他の用語、例えば「より多い」又は「より少ない」は、本明細書中で、上述の様式と同じ様式で使用される。
本明細書中で使用される場合、「システム」は、共通する目的のために一緒に作動する、多くの実在的構成要素及び／又は観念的構成要素をいう。いくつかの実施形態において、「システム」は、ハードウェア構成要素及び／又はソフトウェア構成要素の統合された集合体である。いくつかの実施形態において、システムの各構成要素は、１つ以上の他の構成要素と相互作用するか、及び／又は１つ以上の構成要素に関わる。いくつかの実施形態において、システムは、方法を制御し及び命令するための構成要素及びソフトウェアの組み合わせをいう。
本明細書中で使用される場合、用語「サンプル」は、その広範な意味において使用される。いくつかの実施形態において、サンプルは、動物の細胞又は組織であるか、又はそれを含む。いくつかの実施形態において、サンプルは、任意の供給源から得られる標本又は培養物（例えば、微生物培養物）、ならびに生物学的サンプル及び環境サンプルを含む。生物学的サンプルは、植物又は動物（ヒトを含む）から得られてもよく、液体、固体、組織及び気体を包含する。環境サンプルとしては、例えば、環境物質、例えば表面物質、土壌、水及び産業的なサンプル、ならびに食品及び乳加工の機器、装置、設備、器具、使い捨て用品及び使い捨てではない用品から得られるサンプルが、挙げられる。これらの例は、本技術に適用可能なサンプルの種類を制限することを意図するものではない。
本明細書中で使用される場合、「生物学的サンプル」は、生物組織又は生物液のサンプルをいう。例えば、生物学的サンプルは、動物（ヒトを含む）から得られるサンプル；液体、固体又は組織サンプル；ならびに液体及び固体の食品及び飼料製品ならびに成分、例えば乳業品目、野菜、食肉及び食肉副産物、ならびに廃棄物であってもよい。生物学的サンプルは、種々の系統の家畜、ならびに野生化した（ｆｅｒａｌ）動物又は野生の（ｗｉｌｄ）動物（有蹄類、熊、魚、ウサギ類、げっ歯類などのような動物が挙げられるが、これらに限定されない）のいずれかから得られてもよい。生物学的サンプルの例としては、組織の部分、血液、血液画分、血漿、血清、尿、あるいは他の周辺供給源又は細胞培養物、細胞コロニー、一細胞もしくは一細胞収集物に由来するサンプルが、挙げられる。その上さらに、生物学的サンプルは、上述のサンプルのプール又は混合物を含む。生物学的サンプルは、対象から細胞のサンプルを取り出すことによって提供され得るが、以前に単離されたサンプルを用いることによって提供されてもよい。例えば、組織サンプルは、疾患を有する疑いのある対象から、従来的な政権技術によって取り出されてもよい。いくつかの実施形態において、血液サンプルが、対象から採取される。患者由来の生物学的サンプルは、疾患に罹患していることが疑われる対象由来のサンプルを意味する。
本明細書中で使用される場合、用語「生物液」は、生物学的液体（例えば、体液、身体的液体）をいう。例えば、いくつかの実施形態において、生物液は、排泄物（例えば、尿、汗、浸出液（例えば、植物浸出液を含む））であり、いくつかの実施形態において生物液は、分泌物（例えば、乳汁、胆汁）である。いくつかの実施形態において、生物液は、針を用いて得られる（例えば、血液、脳脊髄液、リンパ液）。いくつかの実施形態において、生物液は、病理学的プロセスの結果として生じる（例えば、水疱、嚢胞液）。いくつかの実施形態において、生物液は、別の生物液に由来する（例えば、血漿、血清）。例示的な生物液としては、羊水、房水、硝子体液、胆汁、血液、血漿、血清、乳汁、脳脊髄液、耳滓（耳垢）、乳び、キームス（ｃｈｉｍｅ）、内リンパ液、外リンパ液、浸出液、糞便、潮（ｆｅｍａｌｅ ｅｊａｃｕｌａｔｅ）、胃酸、胃液、リンパ液、粘液（例えば、鼻排液、痰（ｐｈｌｅｇｍ））、心膜液、腹水、胸水、膿、粘膜分泌物、唾液、皮脂（例えば、皮膚油）、漿液、精液、恥垢、痰（ｓｐｕｔｕｍ）、滑液、汗、涙、尿、膣分泌物、及び吐瀉物が挙げられるが、これらに限定されない。
用語「標識」は、本明細書中で使用される場合、検出可能な（例えば、定量化可能な）効果を提供するために使用され得、及びインテグレータープローブに結合することができ、かつタリープローブに（例えば、タリープローブの一部及び／又はリンカーもしくはその一部を用いて又は用いずに）転移することができる、任意の原子、分子、分子複合体（例えば、金属キレート）又はコロイド粒子（例えば、量子ドット、ナノ粒子、マイクロ粒子など）をいう。標識は、検出及び／又は単離の少なくとも１つの方法を受けることができ、異なる標識間で識別が可能である、化合物、構造又は要素である。本明細書中で提供される技術での使用を見出す例示的な標識としては、例えば、色素、蛍光標識、化学発光標識、消光剤、放射活性標識、又はこれらの組み合わせが挙げられる。標識としては、発光性（ｌｕｍｉｎｏｇｅｎｉｃ）分子及び／又は発光（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）分子、着色分子（例えば、色素原）、及びシンチラント（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ）が挙げられる。標識はまた、任意の有用なリンカー分子（例えばビオチン、アビジン、ジゴキシゲニン、ストレプトアビジン、ＨＲＰ、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、抗体又はその断片、Ｇｒｂ２、ポリヒスチジン、Ｎｉ２＋、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ）、重金属（例えば、金）、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、及びルシフェラーゼ）、電子ドナー／アクセプター、アクリジニウムエステル、及び熱量測定基質を含む。質量における変化が、検出可能な標識であると考えられ得ることもまた想定されており、例えば、表面プラズモン共鳴検出又は質量分析における用途を見出される。標識は、蛍光、発光、放射性、比色分析、重量分析、Ｘ線回折又は吸収、磁気、酵素活性、質量の性質又は質量によって影響を受ける挙動（例えば、質量分析；蛍光偏光）などによって検出可能なシグナルを、提供し得る。標識は、荷電部分（正又は負の荷電）であってもよく又は、代替的に、電荷中性であってもよい。標識は、標識を含む配列が検出可能である限り、核酸又はタンパク質配列を含むか又はこれらから成ってもよい。いくつかの実施形態において、標識は、蛍光標識（例えば、フルオロフォア）である。
本明細書中で使用される場合、用語「フルオロフォア」は、フルオロフォア及び発光団の両方、ならびに蛍光又は発光の放出を消光できる化学薬剤をいうと考えられる。さらに、本明細書中で使用される場合、「フルオロフォア」は、適切に刺激された場合に蛍光特性を有する任意の種をいう。蛍光を発する刺激は、代表的に照光である；しかし、他の種類の刺激（例えば、衝突による刺激）もまた、本明細書中で考慮される。用語「フルオロフォア」、「蛍光」、「蛍光部分」、「蛍光色素」、及び「蛍光基」は、相互交換可能に使用される。いくつかの実施形態において、蛍光標識は、「蛍光標識」と題されたセクションにおいて以下で記載されるように、フルオロフォアを含む。
本明細書中で使用される場合、「核酸」又は「核酸配列」は、ピリミジン塩基及び／又はプリン塩基のポリマー又はオリゴマーをいい、好ましくは、それぞれ、シトシン、チミン、及びウラシルならびにアデニン及びグアニンをいう（Ａｌｂｅｒｔ Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ａｔ ７９３－８００（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂ．１９８２）を参照されたい）。本技術は、任意のデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、又はペプチド核酸構成要素、及びそれらの任意の化学バリアント（例えば、これらの塩基のメチル化形態、ヒドロキシメチル化形態、又はグリコシル化形態）などを企図する。ポリマー又はオリゴマーは、組成物において異種であっても同種であってもよく、及び天然に存在する供給源から単離されてもよく、又は人工的にすなわち合成的に生成されてもよい。加えて、この核酸は、ＤＮＡであってももしくはＲＮＡであっても、又はそれらの混合物であってもよく、及び永続的に又は一時的に、一本鎖形態又は二本鎖形態で、ホモ二量体、ヘテロ二量体、及びハイブリッド状態で存在してもよい。いくつかの実施形態において、核酸又は核酸配列は、他の種類の核酸構造を含み、例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡヘリックス、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ、ロックド核酸（ＬＮＡ）、及び／又はリボザイムなどを含む。したがって、用語「核酸」又は「核酸配列」はまた、天然のヌクレオチドと同じ機能を示すことができる非天然のヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、及び／又は非ヌクレオチド構築ブロック（例えば、「ヌクレオチドアナログ」）を含む鎖をも包含し得る；さらに、用語「核酸配列」は、本明細書中で使用される場合オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド又はポリヌクレオチド、及びそれらの断片又は一部をいい、ならびに、ゲノム起源又は合成起源のＤＮＡ又はＲＮＡをいい、これは、一本鎖であっても又は二本鎖であってもよく、及びセンス鎖又はアンチセンス鎖を表す。
用語「ヌクレオチドアナログ」は、本明細書中で使用される場合、修飾されたか又は天然に存在しないヌクレオチドをいい、以下が挙げられるが、これらに限定されない：改変されたスタッキング相互作用を有するアナログ、例えば７－デアザプリン（例えば、７－デアザ－ｄＡＴＰ及び７－デアザ－ｄＧＴＰ）；代替の水素結合立体配置を有する塩基アナログ（例えば、Ｉｓｏ－Ｃ及びＩｓｏ－Ｇならびに他の標準的でない塩基対など、例えば、米国特許第６，００１，９８３号において記載されるもの、これは、参考として組み込まれる）；非水素結合アナログ（例えば、２，４－ジフルオロトルエンなどの非極性、芳香族ヌクレオシドアナログ、例えば、Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ ａｎｄ Ｋｏｏｌ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９４，５９，７２３８－７２４２、Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ ａｎｄ Ｋｏｏｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９５，１１７，１８６３－１８７２によって記載されるもの；これらの各々は、参考として組み込まれる）；５－ニトロインドール及び３－ニトロピロールなどの「汎用」塩基；ならびに汎用プリン及びピリミジン（例えばそれぞれ「Ｋ」及び「Ｐ」ヌクレオチド；Ｐ．Ｋｏｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９８９，１７，１０３７３－１０３８３、Ｐ．Ｋｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９２，２０，５１４９－５１５２、これらの各々は、参考として組み込まれる）。ヌクレオチドアナログとしては、糖部分において修飾を有するヌクレオチド、例えば、ジデオキシヌクレオチド及び２’－Ｏ－メチルヌクレオチドが挙げられる。ヌクレオチドアナログとしては、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドの修飾形態が挙げられる。
「ペプチド核酸」は、ペプチド様ポリアミド骨格を組み込んだＤＮＡ模倣物を意味する。
本明細書中で使用される場合、用語「相補的」又は「相補性」は、塩基対形成規則によって関係するポリヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチドタリープローブ、オリゴヌクレオチドインテグレータープローブ、又は核酸である標的分析物などのヌクレオチドの配列）を言及する場合に使用される。例えば、配列「５’－Ａ－Ｇ－Ｔ－３’」は、配列「３’－Ｔ－Ｃ－Ａ－５’」に対し相補性である。相補性は、「部分的」であってもよく、ここでは、いくつかの核酸の塩基のみが塩基対形成規則にしたがって適合している。又は、核酸同士の間に「完全な」もしくは「全体の」相補性が存在してもよい。核酸鎖の間の相補性の程度は、核酸鎖同士の間のハイブリダイゼーションの効率及び強度に対し有意な効果を有する。このことは、核酸同士の間の結合に依存する増幅反応及び検出方法において、特に重要である。どちらの用語も、個々のヌクレオチドに関して、特にポリヌクレオチドの文脈の中で使用され得る。例えば、オリゴヌクレオチドの中の特定のヌクレオチドが、別の核酸鎖の中のヌクレオチドに対して、残りのオリゴヌクレオチドと核酸鎖との間の相補性と対照的に又はそれと比較して、相補性であるか、又は相補性を欠くと言及されてもよい。
いくつかの文脈において、用語「相補性」及び関連する用語（例えば、「相補的」及び「相補鎖」）は、水素結合を通して別の核酸配列に結合可能である核酸配列のヌクレオチド、例えば、例えば、ワトソン－クリック塩基対形成又は他の塩基対形成によって塩基対形成することができるヌクレオチドをいう。塩基対を形成し得るヌクレオチド、例えば、たがいに相補的であるヌクレオチドは、以下の対である：シトシン及びグアニン、チミン及びアデニン、アデニン及びウラシル、及びグアニン及びウラシル。相補性百分率は、核酸配列の長さ全体にわたって計算される必要はない。相補性の百分率は、塩基対形成している核酸配列の特定の領域、例えば、第１の塩基対形成したヌクレオチドから始まって最後の塩基対形成したヌクレオチドで終わる領域に、限定されてもよい。核酸配列の相補鎖は、本明細書中で使用される場合、１つの配列の５’末端が他方の３’末端と対形成するように核酸配列を並べた場合に、「逆平衡関係」であるオリゴヌクレオチドをいう。天然の核酸において通常見いだされない特定の塩基が、本発明の核酸において含まれていてもよく、これは、例えば、イノシン及び７－デアザグアニンを含む。相補性は、完全である必要はない；安定的な二本鎖が、不適合な塩基対又は適合のない塩基を含んでいてもよい。核酸技術の当業者は、例えば以下を含む多くの変数を経験的に考慮して、二本鎖安定性を決定することができる：オリゴヌクレオチドの長さ、オリゴヌクレオチドの塩基組成、オリゴヌクレオチドの配列、オリゴヌクレオチドを含む組成物のイオン強度、及び２本のオリゴヌクレオチドの間の不適合な塩基対の発生率。
したがって、いくつかの実施形態において、「相補的」は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、又はそれより多い核酸塩基の領域にわたって、第２核酸配列の相補鎖に対し少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一である第１核酸配列、又は、２つの配列がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることをいう。「完全に相補的」は、第１核酸の各核酸塩基が、第２核酸において対応する位置にある各核酸塩基と対形成可能であることを意味する。例えば、特定の実施形態において、各核酸塩基がある核酸に対して相補性を有するオリゴヌクレオチドは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、又はそれより多い核酸塩基の領域にわたって、核酸の相補鎖に同一である核酸塩基配列を有する。
本明細書中で使用される場合、用語「不適合（ｍｉｓｍａｔｃｈ）」は、第２核酸の対応する位置における核酸塩基と対合できない、第１核酸の核酸塩基をいう。
本明細書中で使用される場合、用語「野生型」は、天然に存在する供給源から単離された場合の遺伝子又は遺伝子産物の特徴を有する、遺伝子又は遺伝子産物をいう。野生型遺伝子は、集団において最も頻繁にみられる遺伝子であり、したがって
恣意的に遺伝子の「通常の」又は「野生型」形態と名付けられている。対照的に、用語「修飾された」、「突然変異体」、「バリアント」、又は「多形の」は、野生型遺伝子又は遺伝子産物と比較した場合に、配列中の修飾及び／又は機能特性（例えば、改変された特性）を示す、遺伝子又は遺伝子産物をいう。天然に存在する突然変異体が単離され得るということに、留意されたい；これらは、野生型遺伝子又は遺伝子産物と比較した場合に、改変された特徴を有するという事実によって同定される。したがって、用語「バリアント」及び「突然変異体」は、ヌクレオチド配列に関して使用される場合、１つ以上のヌクレオチドによって別の核酸配列（通常は関連のヌクレオチド酸配列）と異なっている核酸配列をいう。「バリエーション」は、２つの異なるヌクレオチド配列の間の相違である；いくつかの実施形態において、１つの配列が、「参照配列」である。
本明細書中で使用される場合、用語「ハイブリダイゼーション」は、相補的核酸の対形成に関して使用される。ハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの強度（例えば、核酸同士の間の結合の強度）は、核酸同士の間の相補性の程度、関わる条件のストリンジェンシー、及び形成されたハイブリッドのＴｍなどの因子によって影響される。「ハイブリダイゼーション」方法は、１つの核酸を別の核酸（相補的核酸、例えば、相補的ヌクレオチド配列を有する核酸）にアニーリングすることを含む。相補的配列を含む核酸の２つのポリマーの、互いを見出し塩基対形成相互作用を介してアニーリングする能力は、充分に認識されている現象である。Ｍａｒｍｕｒ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ４６：４５３（１９６０）及びＤｏｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ４６：４６１（１９６０）（これらの各々は本明細書中で参考として組み込まれる）による「ハイブリダイゼーション」プロセスの最初の観察は、それに続き、このプロセスを近代生物学に必須のツールに仕立てるよう、改善を施されてきた。
本明細書中で使用される場合、用語「トーホールド」は、核酸二本鎖に隣接する短い（例えば、１～１０（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０ｎｔ）を含む）一本鎖核酸伸長部分をいい、これは、この二本鎖の鎖の１本に対する第３核酸の結合を促進し、及び第３核酸は元の二本鎖の１本の鎖を置き換える。したがって、「トーホールド」は、相補的核酸配列のハイブリダイゼーションを開始するように構成される核酸の核生成部位を提供し得る。いくつかの実施形態において、相補的オリゴヌクレオチド配列間のハイブリダイゼーションの速度定数は、トーホールド媒介鎖置換として公知の事象（例えば、Ｚｈａｎｇ ＆ Ｗｉｎｆｒｅｅ（２００９）“Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ＤＮＡ ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｕｓｉｎｇ ｔｏｅｈｏｌｄ ｅｘｃｈａｎｇｅ．”Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３１：１７３０３－１４を参照されたい、これは本明細書中で参考として組み込まれる）を用いておよそ百万倍の範囲にわたって操作され得る。
本明細書中で使用される場合、用語「置き換え」は、完全な置き換え及び少なくとも部分的な置き換えの両方を包含する。当業者に理解されるように、部分的置き換えは、本明細書中の種々の実施形態に充分である場合があり、及び/又は完全な置き換えが起こる前に起こり得る。完全又は部分的な置き換えは、機能を達成するために充分であろう。完全又は部分的な置き換えは、各々、用語「完全な」又は「部分的な」によって望まれるとおりに明示され得る。
本明細書中で使用される場合、用語「Ｔｍ」は、「溶融温度」に関して使用される。溶融温度は、二本鎖核酸分子の集団の半分が一本鎖に解離する温度である。核酸のＴｍを計算するためのいくつかの等式が、当該分野で周知である。標準対照によって示されるように、Ｔｍ値の簡易な概算は、以下の等式によって計算され得る：Ｔｍ＝８１．５＋０．４１＊（％Ｇ＋Ｃ）、ここで、核酸は、１Ｍ ＮａＣｌ水溶液中である（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ，“Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｆｉｌｔｅｒ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（１９８５）を参照されたい、これは本明細書中で参考として組み込まれる。他の参考文献（例えば、Ａｌｌａｗｉ ａｎｄ ＳａｎｔａＬｕｃｉａ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６：１０５８１－９４（１９９７）、これは本明細書中で参考として組み込まれる）は、Ｔｍを計算するために構造特徴、環境特徴、及び配列特徴を考慮する、より洗練された計算を含む。例えば、いくつかの実施形態において、これらの計算は、短い核酸プローブ及び標的についてのＴｍの改善された概算を提供する（例えば、実施例において使用されるとおりである）。
用語「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、ペプチド結合を介して連結したアミノ酸を含む化合物をいい、相互交換可能に使用される。遺伝子によってコードされる「タンパク質」又は「ポリペプチド」は、遺伝子によってコードされるアミノ酸配列に限定されず、タンパク質の翻訳後修飾を含む。タンパク質分子のアミノ酸配列をいうために用語「アミノ酸配列」が本明細書中で記載される場合、「アミノ酸配列」及び同様の用語、例えば「ポリペプチド」又は「タンパク質」は、このアミノ酸配列を、記載のタンパク質分子に関連する完全なネイティブのアミノ酸配列に限定することを意味しない。その上さらに、「アミノ酸配列」は、タンパク質をコードする核酸配列から推測され得る。従来の１文字アミノ酸コード及び３文字アミノ酸コードが、以下のように本明細書中で使用される－アラニン：Ａｌａ、Ａ；アルギニン：Ａｒｇ、Ｒ；アスパラギン：Ａｓｎ、Ｎ；アスパラギン酸：Ａｓｐ、Ｄ；システイン：Ｃｙｓ、Ｃ；グルタミン酸：Ｇｌｕ、Ｅ；グルタミン：Ｇｌｎ、Ｑ；グリシン：Ｇｌｙ、Ｇ；ヒスチジン：Ｈｉｓ、Ｈ；イソロイシン：Ｉｌｅ、Ｉ；ロイシン：Ｌｅｕ、Ｌ；リシン：Ｌｙｓ、Ｋ；メチオニン：Ｍｅｔ、Ｍ；フェニルアラニン：Ｐｈｅ、Ｆ；プロリン：Ｐｒｏ、Ｐ；セリン：Ｓｅｒ、Ｓ；トレオニン：Ｔｈｒ、Ｔ；トリプトファン：Ｔｒｐ、Ｗ；チロシン：Ｔｙｒ、Ｙ；バリン：Ｖａｌ、Ｖ。本明細書中で使用される場合、コードＸａａ及びＸは、任意のアミノ酸をいう。
用語「バリアント」及び「突然変異体」は、ポリペプチドに関して使用される場合、１つ以上のアミノ酸によって別のアミノ酸配列（通常は関連のポリペプチド）と異なっている、アミノ酸配列をいう。
本明細書中で使用される場合、「安定的な相互作用」又は「安定的に結合した」相互作用の言及は、相互作用の熱力学的平衡条件下で比較的持続的である、２つの物体又は構成要素の結合をいう。いくつかの実施形態において、「安定的な相互作用」は、およそ１０－９Ｍよりも小さいＫＤ、いくつかの実施形態においては１０－８Ｍよりも小さいＫＤを有する、２つの構成要素間の相互作用である。いくつかの実施形態において、「安定的な相互作用」は、１時間あたり１より小さい解離速度定数ｋｏｆｆ、いくつかの実施形態においては、１分間あたり１より小さい解離速度定数ｋｏｆｆを有する。いくつかの実施形態において、「安定的な相互作用」は、「一時的な相互作用」ではないと定義され、及び「一時的な相互作用」は、「安定的な相互作用」ではないと定義される。いくつかの実施形態において、「安定的な相互作用」は、代表的にはＫＤ値によって説明されないが各相互作用あたりおよそ１分間（例えば、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、又は１８０秒間）である２つの物体の間の平均結合寿命を含む、共有結合及び他の相互作用によって媒介される相互作用を含む。
いくつかの実施形態において、「安定的な相互作用」と「一時的な相互作用」との間の区別は、ＫＤ及び／又はｋｏｆｆ及び／又は結合を説明する別の動的もしくは熱力学的値のカットオフ値によって決定され、ここで、カットオフは、安定的な相互作用と一時的な相互作用との間を識別するために使用されるが、そうでない場合、ＫＤ及び／又はｋｏｆｆ及び／又は結合を説明する別の動的もしくは熱力学的値を絶対的に説明するならば、異なるとみなされる場合がある。例えば、ＫＤ値によって「安定的な相互作用」とみなされたものが、なおより安定的である別の相互作用の文脈では、「一時的な相互作用」ともみなされる場合がある。当業者は、安定的な相互作用と一時的な相互作用との他の相対的な比較を理解する（例えば、ＫＤ値によって「一時的な相互作用」とみなされたものが、なおより一時的な（安定性が低い）別の相互作用の文脈では、「安定的な相互作用」ともみなされる場合がある）。
本明細書中で使用される場合、用語「安定的な相互作用」、「安定的な結合（ｓｔａｂｌｅ ｂｉｎｄｉｎｇ）」及び「安定的な結合（ｓｔａｂｌｅ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）」は、相互交換可能に使用される。本明細書中で使用される場合、用語「一時的な相互作用」、「一時的な結合（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ）」及び「一時的な結合（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）」は、相互交換可能に使用される。
用語「特異的な結合」又は「特異的に結合する」は、互いに結合している２つの構成要素Ａ及びＢの相互作用に関連して使用される場合、Ａ又はＢと溶液中の他の類似の構成要素、例えば、溶液中のＡ又はＢではない少なくとも１つの他の分子種の相互作用についてのＫＤよりも小さいＫＤを有する、Ａ及びＢの結合をいう。
本明細書中で使用される場合、用語「親和性」は、１つの物体（例えば、分子）と別の物体（例えば、分子）との、例えば、抗体と抗原との相互作用（例えば、結合）の強さをいう。いくつかの実施形態において、親和性は、物体間の立体化学的適合性の近さ、それらの間の接触領域の大きさ、荷電した基及び疎水性の基の分布などに依存する。
本明細書中で使用される場合、用語「不可逆的な相互作用」は、インキュベーション時間よりも長い、例えば、いくつかの実施形態において、１～１０分間の（例えば、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、又は６００秒間、又はそれより長い）時間の解離半減期を有する、相互作用（例えば、結合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）、結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）など）をいう。
本明細書中で使用される場合、用語「感度」は、サンプルが分析物を含む場合にアッセイが分析物について陽性結果をもたらす可能性をいう。感度は、真の陽性及び偽陰性の合計によって除算した真の陽性結果の数として計算される。感度は、アッセイが分析物をどれほどよく検出したかの尺度である。
本明細書中で使用される場合、用語「特異性」は、サンプルが分析物を含んでいない場合にアッセイが陰性結果をもたらす可能性をいう。特異性は、真の陰性及び偽陽性の合計によって除算した真の陰性結果の数として計算される。特異性は、本発明の方法が、分析物を含むサンプルから分析物を含まないサンプルをどれほどよく除外したかの尺度である。
本明細書中で使用される場合、「平衡定数」（Ｋｅｑ）、「平衡結合定数（ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ）」（Ｋａ）及び「結合定数（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｏｎｓｔａｎｔ）」（又は「結合定数（ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｏｎｓｔａｎｔ）」（ＫＢ））は、以下の平衡しているＡ及びＢの結合反応について相互交換可能に使用される：
Figure 2023512027000002
 ここで、Ａ及びＢは、互いに結合している２つの物体（例えば、タリープローブ及び分析物、インテグレータープローブ及び分析物、標識及びインテグレータープローブ、標識及びタリープローブなど）であり、Ｋｅｑ＝［ＡＢ］／（［Ａ］×［Ｂ］）である。解離定数ＫＤ＝１／ＫＢである。ＫＤは、１つの結合パートナーであるＡの、Ａが結合しているパートナーＢについて親和性を述べるための有用な方法であり、例えば、数ＫＤは、有意な量のＡＢを生じるために必要であるＡ又はＢの濃度を表す。Ｋｅｑ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎ；ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎである。したがって、解離定数ＫＤ及び結合定数ＫＡは、親和性の定量的な尺度である。平衡において、Ａ及びＢは、Ａ－Ｂ複合体と並行しており、速度定数ｋａ及びｋｄは、平衡状態の個々の正反応及び逆反応の速度を定量する：
Figure 2023512027000003
 平衡において、ｋａ［Ａ］［Ｂ］＝ｋｄ［ＡＢ］である。解離定数ＫＤは、ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ＝［Ａ］［Ｂ］／［ＡＢ］によって得られる。ＫＤは、濃度の単位、例えば、Ｍ、ｍＭ、μＭ、ｎＭ、ｐＭなどを有する。ＫＤとして表される親和性を比較する場合、より大きな親和性は、より低い値で示される。結合定数ＫＡは、ＫＡ＝ＫＡ／ＫＤ＝［ＡＢ］／［Ａ］［Ｂによって得られる。ＫＡは、濃度の逆数の単位、最も代表的にはＭ－１、ｍＭ－１、μＭ－１、ｎＭ－１、ｐＭ－１などを有する。
本明細書中で使用される場合、「部分（ｍｏｉｅｔｙ）」は、２つ以上のパーツの１つをいい、このパーツは、何らかが、例えば、オリゴヌクレオチド、分子、化学基、ドメイン、プローブ、「Ｒ」基、ポリペプチドなどの種々のパーツなどに分割されたものであってもよい。
いくつかの実施形態において、この技術は、抗体構成要素又は抗体部分、例えば、抗体又はその断片もしくは誘導体を、含む。本明細書中で使用される場合、「抗体」は、「免疫グロブリン」（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ）としても知られ、ジスルフィド結合によって連結している２つの重鎖及び各々ジスルフィド結合によって重鎖に連結している２つの軽鎖を含む。抗体の特異性は、抗体の抗原結合部位（すなわちパラトープ）と抗原決定基（すなわちエピトープ）との間の構造的相補性にある。抗原結合部位は、まず、超可変領域すなわち相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する。往々にして、非超可変領域すなわちフレームワーク領域由来の残基は、ドメイン構造全体に、及びそれゆえに結合部位に、影響を及ぼす。いくつかの実施形態は、免疫グロブリン分子の少なくとも一部を含む、抗体の断片、例えば、任意のタンパク質又はポリペプチド含有分子を含み、それによって、上記分子と抗原との間の特異的相互作用を可能にする。免疫グロブリン分子の一部としては、以下が挙げられ得るがこれらに限定されない：重鎖及び軽鎖の少なくとも１つの相補性決定領域又はそのリガンド結合部分、重鎖又は軽鎖可変領域、重鎖又は軽鎖定常領域、フレームワーク領域、又はその任意の部分。このような断片は、当該分野で公知の及び／又は本明細書中で記載されるように、酵素的切断、合成又は組換え技術によって、生成され得る。抗体はまた、１つ以上の停止コドンが天然の停止コドンの上流に導入されている抗体遺伝子を用いることにより、種々の短縮形態で生成されてもよい。抗体の種々の部分が、従来技術によって化学的に結合されてもよく、又は遺伝子操作技術を用いて連続したタンパク質として調製されてもよい。
抗体の断片としては、Ｆａｂ断片（例えば、パパイン消化による）、Ｆ（ａｂ’）２断片（例えば、ペプシン消化による）、Ｆａｂ’（例えば、ペプシン消化及び部分的還元）及びＦｖ断片又はｓｃＦｖ断片（例えば、分子生物学技術による）が挙げられるが、これらに限定されない。Ｆａｂ断片は、プロテアーゼであるパパインで抗体を処理することによって得られ得る。また、Ｆａｂは、抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを原核生物発現系又は真核生物発現系のためのベクター内に挿入し、及びこのベクターを原核生物又は真核生物内に導入してＦａｂを発現させることによっても生成され得る。Ｆ（ａｂ’）２は、抗体をプロテアーゼであるペプシンで処理することによって得られ得る。また、Ｆ（ａｂ’）２は、Ｆａｂ’をチオエーテル結合又はジスルフィド結合を介して結合することによっても生成され得る。Ｆａｂは、Ｆ（ａｂ’）２を還元剤、例えば、ジチオトレイトールで処理することによって得られ得る。また、Ｆａｂ’は、抗体のＦａｂ’断片をコードするＤＮＡを原核生物のための発現ベクター又は真核生物のための発現ベクター内に挿入し、及びこのベクターを原核生物又は真核生物内に発現のために導入することによっても生成され得る。Ｆｖ断片は、例えば、４℃及びｐＨ４．０でのペプシンによる制限切断（「冷ペプシン消化」と呼ばれる方法）によって生成され得る。Ｆｖ断片は、強い非共有結合相互作用によって一緒になった重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）からなる。ｓｃＦｖ断片は、以前に述べたようにＶＨ及びＶＬドメインをコードするｃＤＮＡを得、このＤＮＡを原核生物のための発現ベクター又は真核生物のための発現ベクター内に挿入し、次いでこの発現ベクターを原核生物又は真核生物内にｓｃＦｖを発現させるために導入することによっても生成され得る。
一般に、抗体は、通常、現在当該分野で周知の多くの従来技術を用いて、任意の抗原に対して惹起され得る。
本明細書中で使用される場合、用語「結合体化した」は、１つの分子又は薬剤が物理的に又は科学的に別の分子又は薬剤にカップリングするか又は付着したときをいう。結合体化の例は、共有結合及び静電複合体化が挙げられる。用語「複合体化した」、「～と複合体化する」及び「結合体化した」は、相互交換可能に使用される。
本明細書中で使用される場合、用語「インキュベーション温度」は、インテグレータープローブ、タリープローブ、及びサンプルを含む組成物が、この組成物を観察して分析物がサンプル中に存在する場合にこれを検出し、性質決定し、及び/又は定量する（例えば、分析物がサンプル中に存在する場合にその存在、非存在、及び／又は量を示すデータを記録する）まで、インキュベートされる温度（例えば、一定に又は実質的に一定に又は事実上一定に保たれるか又は維持される）をいう。いくつかの実施形態において、「インキュベーション温度」は、積極的加熱及び冷却（例えば、ヒートポンプ、ペルチェ素子、水浴、又はサンプルの温度を維持するための（例えば、設定温度の０．１～０．５～１．０℃の範囲内の温度に維持するための）当該分野で公知の他の技術）を用いて制御される。いくつかの実施形態において、インキュベーション温度は、１０～１１０℃（例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、又は１１０℃）である。
本明細書中で使用される場合、用語「インキュベーション時間」は、インテグレータープローブ、タリープローブ、及びサンプルを含む組成物が、この組成物を観察して分析物がサンプル中に存在する場合にこれを検出し、性質決定し、及び/又は定量する（例えば、分析物がサンプル中に存在する場合にその存在、非存在、及び／又は量を示すデータを記録する）まで、インキュベート温度で維持される（例えば、一定に又は実質的に一定に又は事実上一定に保たれるか又は維持される）時間の長さをいう。インキュベーション時間は、分析物分子へのタリープローブ結合及びタリープローブからインテグレータープローブへの標識転移の複数の周期により、複数のコピーの標識によって標識されている１つ以上のコピーのインテグレータープローブを生成するために、充分である。いくつかの実施形態において、「インキュベーション時間」は、何十秒間から何百秒間から何千秒間、例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、又は６０秒間；例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、又は６０分間；例えば、１、１．５、２、２．５、又は３時間である時間の量をいう。いくつかの実施形態において、「インキュベーション時間」は、１～１０秒間から１～１０分間（例えば、およそ１～１００秒間、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００秒間、例えば、１～１００分間、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００分間）である時間の量をいう。いくつかの実施形態において、インキュベーション時間は、異なるインキュベーション温度（例えば、第１インキュベーション温度、第２インキュベーション温度、第３インキュベーション温度など）での複数のより短いインキュベーション時間（例えば、第１インキュベーション時間、第２インキュベーション時間、第３インキュベーション時間など）を含む。
本明細書中で使用される場合、用語「インテグレータープローブ」は、分析物に安定的に結合し及び１つ以上のタリープローブから不可逆的に（例えば、実質的に不可逆的に及び／又は事実上不可逆的に）複数の標識を受け入れる（例えば、安定的に共有結合するか又は安定的に非共有結合的に結合する）、任意の物体（例えば、分子、生体分子、コロイド粒子、液相など）をいう。いくつかの実施形態において、インテグレータープローブは、高い熱力学的安定性を有する（例えば、インキュベーション温度より１０℃を超えて高い融解温度を有するか、又はインキュベーション時間よりも長い平均寿命を有する）分析物に結合する。いくつかの実施形態において、インテグレータープローブは、多くの標識に共有結合している。いくつかの実施形態において、インテグレータープローブは、多くの標識に間接的に及び／又は非共有結合的に連結するか及び／又は結合している。いくつかの実施形態において、インテグレータープローブは、分析物を認識するタンパク質である。いくつかの実施形態において、インテグレータープローブは、分析物を認識する核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）。例えば、いくつかの実施形態において、インテグレータープローブは、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む核酸、修飾塩基を含む核酸及び／又は本明細書中で記載されるように、例えば、核酸などの塩基の間の修飾された連結を含む。いくつかの実施形態において、核酸インテグレータープローブは、核酸アプタマーを含む。いくつかの実施形態において、インテグレータープローブは、１つより多くの種類の分子（例えば、タンパク質、核酸、化学的リンカー、又は化学的部分の１つより多く）を含む。例えば、いくつかの実施形態において、インテグレータープローブは、タンパク質と核酸とを含む結合体（例えば、核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）がポリペプチド（例えば、タンパク質及び／又はペプチド）に共有結合してキメラ分子を提供する、タンパク質－核酸結合体）を含む。いくつかの実施形態において、インテグレータープローブは、抗体（例えば、モノクローナル抗体）又は抗体断片を含む。いくつかの実施形態において、インテグレータープローブは、ナノボディ、ＤＮＡ結合タンパク質、又はＤＮＡ結合タンパク質ドメインを含む。いくつかの実施形態において、インテグレータープローブは、有機低分子（例えば、およそ２０００ダルトン未満、例えば、２１００、２０５０、２０００、１９５０、１９００、１８５０、１８００、１７５０、１７００、１６５０、１６００、１５５０、１５００ダルトン未満、又はそれより少ない分子量を有する分子）である。いくつかの実施形態において、インテグレータープローブは、分析物に結合する前に標識される（例えば、いくつかの実施形態において、インテグレータープローブは、第１標識によって標識され、及び１つ以上のタリープローブから複数の第２標識を不可逆的に受け入れる（例えば、安定的に共有結合又は非共有結合的に結合する）ことができる）。分析物が炭水化物又は多糖類を含むいくつかの実施形態において、インテグレータープローブは、レクチンなどの炭水化物結合タンパク質又は炭水化物結合抗体を含む。いくつかの実施形態において、インテグレータープローブは、操作されていないバージョンと比較してその結合を強化するため、例えば、操作されていないバージョンと比較してより熱力学的に安定的な分析物との結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）及び／又は結合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）を提供するために、操作される。抗体を含むインテグレータープローブに加えて、実施形態は、標的分析物及びタンパク質であるインテグレータープローブを含む。すなわち、例えば、１つの結合パートナーがインテグレータープローブであり他の結合パートナーが測定される分析物である。実施形態は、任意のリガンドを結合するアプタマー、グリコシル化タンパク質を結合するレクチン、脂質などを結合するタンパク質又は他の分子の使用を含む。この技術は、本明細書中で記載される検出に好適である安定的な結合挙動を有する、任意の結合対の使用を含む。
本明細書中で使用される場合、用語「タリープローブ」は、分析物に一時的に結合し、かつタリープローブからインテグレータープローブへ不可逆的に（例えば、実質的に不可逆的に又は事実上不可逆的に）転移することができる標識を含む、任意の物体（例えば、分子、生体分子など）をいう。いくつかの実施形態において、タリープローブは、アッセイ条件下で（例えば、インキュベーション時間、プローブ濃度、ｐＨ、塩濃度、及び／又はタリープローブ開放構成要素の存在下で）、分析物について、およそ０．１ナノモル濃度を超える（例えば、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、又は５．０を超えるナノモル濃度又はそれより大きい）解離定数（ＫＤ）を有する。この技術は、広範な種類の分析物、広範な種類のタリープローブ、及びタリープローブと分析物との間の一時的な相互作用の広範な種類の結合及び／又は強度を企図する。したがって、いくつかの実施形態において、タリープローブは、アッセイ条件下で（例えば、インキュベーション時間、プローブ濃度、ｐＨ、塩濃度、及び／又はタリープローブ開放構成要素の存在下で）、分析物について、およそ０．１ｎｍ～およそ１００ｎｍ（例えば、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は１００ｎｍ）の範囲内である解離定数（ＫＤ）を有する。例えば、タリープローブが、例えばタリープローブ開放構成要素によって１つより多くの形態を有する（例えば、第１形態（例えば、分析物に結合した形態）から別の形態（例えば、分析物から解離した状態）に変換される）いくつかの実施形態において、タリープローブの第１形態は、アッセイ条件下で（例えば、インキュベーション時間、プローブ濃度、ｐＨ、塩濃度、及び／又はタリープローブ開放構成要素の存在下で）、分析物について、およそ１～およそ１００ピコモル濃度（例えば、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は１００ｎｍ）の範囲内の第１解離定数（ＫＤ）を有し、及びタリープローブの第２形態は、アッセイ条件下で（例えば、インキュベーション時間、プローブ濃度、ｐＨ、塩濃度、及び／又はタリープローブ開放構成要素の存在下で）、分析物について、およそ１０ｎｍ～およそ１０００ｎｍ（例えば、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００ｎｍ）の範囲内の第２解離定数（ＫＤ）を有する。
いくつかの実施形態において、タリープローブは、アッセイ条件下で（例えば、インキュベーション時間、プローブ濃度、ｐＨ、塩濃度、及び／又はタリープローブ開放構成要素の存在下で）、分析物について、およそ０．１ｍｉｎ－１より大きい（例えば、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、又は５．０ｍｉｎ－１より大きいか又はそれより大きい）結合速度定数及び／又は解離速度定数を有する。この技術は、広範な種類の分析物、広範な種類のタリープローブ、及びタリープローブと分析物との間の一時的な相互作用の広範な種類の結合及び／又は強度を企図する。したがって、いくつかの実施形態において、タリープローブは、アッセイ条件下で（例えば、インキュベーション時間、プローブ濃度、ｐＨ、塩濃度、及び／又はタリープローブ開放構成要素の存在下で）、分析物について、およそ０．１ｍｉｎ－１～１０ｍｉｎ－１の範囲内である（例えば、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、又は１０．０ｍｉｎ－１の）結合速度定数及び／又は解離速度定数を有する。例えば、タリープローブが、例えばタリープローブ開放構成要素によって１つより多くの形態を有する（例えば、第１形態（例えば、分析物に結合した形態）から別の形態（例えば、分析物から解離した状態）に変換される）いくつかの実施形態において、タリープローブの第１形態は、アッセイ条件下で（例えば、インキュベーション時間、プローブ濃度、ｐＨ、塩濃度、及び／又はタリープローブ開放構成要素の存在下で）、分析物について、およそ０．１ｍｉｎ－１未満（例えば、０．１０、０．０９、０．０８、０．０７、０．０６、０．０５、０．０４、０．０３、０．０２、０．０１、０．０１０、０．００９、０．００８、０．００７、０．００６、０．００５、０．００４、０．００３、０．００２、又は０．００１ｍｉｎ－１未満）である第１解離速度定数を有し、及びタリープローブの第２形態は、アッセイ条件下で（例えば、インキュベーション時間、プローブ濃度、ｐＨ、塩濃度、及び／又はタリープローブ開放構成要素の存在下で）、分析物について、およそ０．１ｍｉｎ－１～およそ１０ｍｉｎ－１の範囲内（例えば、１０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、又は１０．０ｍｉｎ－１）である第２解離速度定数を有する。いくつかの実施形態において、タリープローブと分析物の結合速度定数は、少なくとも１０５～１０６Ｍ－１ｓ－１である。
いくつかの実施形態において、タリープローブの一時的な結合は、例えば、分析物に安定的に結合したタリープローブを分析物から解離している一時的に結合したタリープローブに変換する酵素反応又は立体構造における変化によって、安定的に結合したタリープローブを分析物から解離している一時的に結合したタリープローブに変換することから、得られる。いくつかの実施形態において、タリープローブは、インテグレータープローブへ転移することができる標識に、共有結合する。いくつかの実施形態において、タリープローブは、インテグレータープローブへ転移することができる標識に、間接的に及び／又は非共有結合的に連結するか及び／又は結合する。いくつかの実施形態において、タリープローブは、分析物を認識するタンパク質である。いくつかの実施形態において、タリープローブは、分析物を認識する核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）である。例えば、いくつかの実施形態において、タリープローブは、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む核酸、修飾塩基を含む核酸及び／又は本明細書中で記載されるように、例えば、核酸などの塩基の間の修飾された連結を含む。いくつかの実施形態において、タリープローブは、ＤＮＡヌクレオチドを含む第一部分及びＲＮＡヌクレオチドを含む第２部分を含む。いくつかの実施形態において、タリープローブは、ＤＮＡヌクレオチド及びＲＮＡヌクレオチドを、およそ１０：１、５：１、２：１、１：１、１：２、１：５、又は１：１０の比率で含む。いくつかの実施形態において、核酸タリープローブは、核酸アプタマーを含む。いくつかの実施形態において、タリープローブは、１つより多くの種類の分子（例えば、タンパク質、核酸、化学的リンカー、又は化学的部分の１つより多く）を含む。いくつかの実施形態において、タリープローブは、抗体（例えば、モノクローナル抗体）又は抗体断片を含む。いくつかの実施形態において、タリープローブは、低親和性抗体（例えば、モノクローナル抗体）又は抗体断片を含む。いくつかの実施形態において、タリープローブは、ナノボディ、ＤＮＡ結合タンパク質、又はＤＮＡ結合タンパク質ドメインを含む。いくつかの実施形態において、タリープローブは、有機低分子（例えば、およそ２０００ダルトン未満、例えば、２１００、２０５０、２０００、１９５０、１９００、１８５０、１８００、１７５０、１７００、１６５０、１６００、１５５０、１５００ダルトン未満、又はそれより少ない分子量を有する分子）である。分析物が炭水化物又は多糖類を含むいくつかの実施形態において、タリープローブは、レクチンなどの炭水化物結合タンパク質又は炭水化物結合抗体を含む。いくつかの実施形態において、タリープローブは、操作されていないバージョンと比較してその結合を弱めるため、例えば、操作されていないバージョンと比較してより熱力学的に不安定な、かつ／又は操作されていないバージョンと比較してより一時的な、分析物との結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）及び／又は結合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）を提供するために、操作される。抗体を含むタリープローブに加えて、実施形態は、標的分析物及びタンパク質であるタリープローブを含む。例えば、すなわち、例えば、１つの結合パートナーがタリープローブであり他の結合パートナーが測定される分析物である。実施形態は、任意のリガンドを結合するアプタマー、グリコシル化タンパク質を結合するレクチン、脂質などを結合するタンパク質又は他の分子の使用を含む。この技術は、本明細書中で記載される検出に好適である一時的な結合挙動を有する、任意の結合対の使用を含む。
本明細書中で使用される場合、用語「タリープローブ開放構成要素」は、例えば、タリープローブからインテグレータープローブへの標識の転移の後で、タリープローブ－分析物複合体からのタリープローブの解離を促進する物体（例えば、分子、生体分子（例えば、酵素））をいう。すなわち、タリープローブ開放構成要素は、アッセイ条件下で（例えば、インキュベーション温度、プローブ濃度、ｐＨ及び／又は塩濃度）、分析物に結合したタリープローブを分析物から解離したタリープローブ又は分析物から迅速に（例えば、０．１ｍｉｎ－１～およそ１０ｍｉｎ－１（例えば、１０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、又は１０．０ｍｉｎ－１）の速度定数で）解離するタリープローブに変換する。いくつかの実施形態において、タリープローブの第１部分（例えば、標識を含む部分）は、インテグレータープローブに結合したまま残り、及びタリープローブの第２部分は、分析物から解離する。いくつかの実施形態において、タリープローブ開放構成要素は、タリープローブの一部（例えば、ＲＮＡを含むタリープローブの部分）を分析物（例えば、ＤＮＡ分析物）に結合したときに分解する酵素（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ）である。
本明細書中で使用される場合、用語「クリック化学」又は「クリック反応」は、望ましい化学収量を有し、生理的に安定した生成物をもたらし、及び１つの生成物を生じる「ばね仕掛け」反応に助力する大きな熱力学的推進力を示す、化学反応をいう。例えば、Ｈｕｉｓｇｅｎ（１９６１）“Ｃｅｎｔｅｎａｒｙ Ｌｅｃｔｕｒｅ－１，３－Ｄｉｐｏｌａｒ Ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎｓ”，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｌｏｎｄｏｎ ３５７；Ｋｏｌｂ，Ｆｉｎｎ，Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ（２００１）“Ｃｌｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｄｉｖｅｒｓｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ａ Ｆｅｗ Ｇｏｏｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ”，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ ４０（１１）：２００４－２０２１を参照されたい、これらの各々は、本明細書中で参考として組み込まれる。クリック化学は、ディールス－アルダー反応、チオール－イン反応、アジド－アルキン反応、テトラジン－トランス－シクロオクテン反応、それらの組み合わせ、又は望ましい化学収量及び（例えば「ばね仕掛け」反応において）大きな熱力学的推進力をもって１つの生理的に安定した（例えば、共有結合）生成物を形成する他の反応を、含み得る。例えば、基礎的なクリック反応は、アジド窒素とアルキル炭素との間に２つの共有結合を形成する、銅（Ｉ）によって触媒されたアジド－アルキン付加環化（「ＣｕＡＡＣ」）反応のアルキンとアジド基（例えば、Ｎ３、例えば、Ｎ＝Ｎ＝Ｎ）の反応である。この共有結合は、第１構成要素と第２構成要素との間に化学連結（例えば、５員のトリアゾール環を含む）を形成する（この第１構成要素及び第２構成要素は、連結前にはアジド部分及びアルキン部分を構成していた）。いくつかの実施形態において、この反応は、Ｃｕ／Ｃｕ（ＯＡｃ）２などの銅ベース触媒、トリス－（ベンジルトリアゾリルメチル）アミン（ＴＢＴＡ）などの第三級アミン、及び／又はテトラヒドロフラン及びアセトニトリル（ＴＨＦ／ＭｅＣＮ）を含む環境において実施される。いくつかの実施形態において、クリック反応は、銅フリークリック反応、例えば、テトラジン部分（例えば、４つの窒素原子を含む６員の芳香族環（Ｃ２Ｈ２Ｎ４）、例えば、１，２，３，４－テトラジン、１，２，３，５－テトラジン、又は１，２，４，５－テトラジン）とトランス－シクロオクテン部分（例えば、（ＣＨ２）６（ＣＨ）２）との間のクリック反応である。例えば、Ｊｅｗｅｔｔ ａｎｄ Ｂｅｒｔｏｚｚｉ（２０１０）“Ｃｕ－ｆｒｅｅ ｃｌｉｃｋ ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ” Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｒｅｖ ３９：１２７２－７９；Ｆｒｅｉｄｅｌ（２０１６）“Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｔａｇｓ ｆｏｒ ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｏｆ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ” Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ４８：１３５７－７２；及びＫｉｍ ａｎｄ Ｋｏｏ（２０１９）“Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃｏｐｐｅｒ－ｆｒｅｅ ｃｌｉｃｋ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：ｉｎ ｖｉｔｒｏ，ｉｎ ｖｉｖｏ，ａｎｄ ｅｘ ｖｉｖｏ” Ｃｈｅｍ Ｓｃｉ １０：７８３５－５１を参照されたい、これらの各々は、本明細書中で参考として組み込まれる。本明細書中で使用される場合、クリック反応において反応して生成物を形成するする２つの部分は、「第１クリック反応物」及び「第２クリック反応物」と呼ばれる。本明細書中で使用される場合、「第１クリック反応物」及び「第２クリック反応物」は、クリック反応において「クリック生成物」を形成する。いくつかの実施形態において、「クリック触媒」は、（例えば、クリック反応の活性化エネルギーを下げることによって）第１クリック反応物及び第２クリック反応物からのクリック生成物の形成を促進する
説明
本明細書中の開示は、説明の特定の実施形態に言及するが、これらの実施形態は、例として提示されているのであり、限定のためではないことが、理解されるべきである。
分析物検出のための組成物
いくつかの実施形態において、この技術は、インテグレータープローブ及びタリープローブを用いて分析物を検出するための組成物を、提供する。インテグレータープローブ（Ｉ）は、安定的に（例えば、熱力学的に安定して）分析物（Ａ）に結合し、及び不可逆的に及び／又は実質的に不可逆的に及び／又は事実上不可逆的に、複数のコピーの標識部分（Ｌ）に（例えば、共有結合的に又は非共有結合的に）結合することができる。タリープローブ（Ｔ）は、分析物（Ａ）に一時的に結合し、及び標識部分（Ｌ）を含む。タリープローブ（Ｔ）の分析物（Ａ）への結合の場合、タリープローブ（Ｔ）は、不可逆的に又は実質的に不可逆的に又は事実上不可逆的に、インテグレータープローブ（Ｉ）（例えば、インテグレータープローブ（Ｉ）の近接したコピー）に標識部分（Ｌ）を転移させる。すなわち、分析物（Ａ）に結合したタリープローブ（Ｔ）は、高い確率で、同じ分析物分子（Ａ）に結合したインテグレータープローブ（Ｉ）に標識部分（Ｌ）を転移させる。インテグレータープローブ（Ｉ）及びタリープローブ（Ｔ）は、分析物（Ａ）を含む組成物と共に、充分な長さの時間（例えば、インキュベーション時間）にわたってインキュベートされて、存在する分析物（Ａ）分子の各々へのタリープローブ（Ｔ）の結合の複数の周期を提供し、それによって、複数のコピーの標識部分（Ｌ）によって標識されているインテグレータープローブ（Ｉ）の、１つ以上のコピーを生成する。例えば、図１を参照されたい。
したがって、ａインテグレータープローブは、インテグレータープローブが分析物（図１）に結合したとき（例えば、仮に、及びその場合にのみ）に、高い確率で、複数（例えば、少なくとも２つ）の標識部分を不可逆的に結合する。分析物（Ａ）が存在しないか、又は偽の分析物（Ａ＊）の存在下で、ずっと低いバルク濃度のインテグレータープローブ及びタリープローブは、インテグレータープローブへの標識部分の転移が過度に稀な事象であること、及びインテグレータープローブの大多数が、わずかな数（例えば、０又は１）の標識部分を有することをもたらす（図１）。言い換えると、分析物の存在が、多重標識されたインテグレータープローブの生成を大いに促進する。これは、分析物が存在しないと非常にゆっくりとしか生成されない。この分析物は、少なくともＮ（例えば、少なくとも２）個のコピーの標識を有する１つ以上のコピーのインテグレータープローブの存在によって検出される。検出は、複数の標識部分を含むインテグレータープローブと標識部分を全く又はわずかにしか含まないインテグレータープローブとを見分けることができる任意の方法によって達成される。
図１に示されるように、インテグレータープローブＩは、分析物Ａに安定的に結合し、及びＡの同じコピーへのタリープローブＴの反復結合は、ＴからＩへの標識Ｌ（星）の転移を引き起こす。この標識の転移は、Ａの同じコピーへの結合によって生じた局所的に高いＩ及びＴの有効濃度に起因して、迅速である。最初は、Ｉは、Ｔの結合からの標識を含まず、Ｉ０と名付ける。Ｔ結合の複数の周期の後、Ｉは、２以上であるＮ個の標識によって修飾されており、ＩＮと名付けられる。したがって、Ｉは、結合しているＡのコピーに対して何回の周期のＴ結合が起こったかの記憶を保持している。分析物Ａの非存在下で（図１、ケース２）、ＴからＩへの標識の転移は、ＴとＩとが共存していないので、遅い（例えば、Ｔ及びＩの高い局所濃度が存在しないので、ＴからＩへの標識転移の増強がない）。偽の分析物Ａ＊（図１、ケース３）の存在下では、Ｔ及び／又はＩのＡ＊への結合が弱く、平衡が、２つのプローブ（Ｉ及びＴ）がＡ＊の同じコピーに対して自発的に結合しない状況を強化する。したがって、Ａ＊の存在下におけるＴからＩへの標識の転移は、Ａの存在下にあるよりもずっと遅い。したがって、Ｉの所定のコピーにおける複数の（例えば、２より多い）標識の存在は、混合物中のＡの存在を示す特異的な指標を提供する。
核酸（例えば、ＤＮＡ）分析物を検出するための技術の例示的な実施形態は、図２に示される。この例示的な実施形態において、各インテグレータープローブは、複数のテトラジン部分（Ｔｚ）を含み；各タリープローブは、ＲＮＡヌクレオチドの領域（「ＲＮＡトーホールド」）及び１つのトランス－シクロオクテン部分を含む。テトラジン部分（Ｔｚ）とトランス－シクロオクテン部分（ＴＣＯ）との間のクリック化学反応（例えば、銅フリークリック化学反応）を用いて、インテグレータープローブＩとタリープローブＴ（例えば、標識Ｌを含む）との間に、共有結合を形成する。ハイブリダイゼーションは、タリーＴと分析物Ａとの間の相互作用を媒介する。この相互作用は、分析物配列に対し相補的であるＲＮＡヌクレオチドを含むＴの部分を分解するＲＮａｓｅ Ｈの存在によって、一時的なものとされる。タリープローブ結合、クリック反応、及び分解の複数の周期の後、複数のコピーのＴ（ＲＮａｓｅ Ｈによって部分的に分解されている）は、各インテグレータープローブに共有結合している。分析物は、複数の（例えば、２より多い）部分的に分解されたタリープローブ分子（例えば、標識を含む）を含むインテグレータープローブを検出することによって、検出される。例えば、複数結合インテグレータープローブは、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）又は全反射照明蛍光（ＴＩＲＦ）顕微鏡検査によって決定され得る（図２）。この技術は、タリープローブと分析物との間の比較的長いか又は短い相互作用によって用いられ得、及び、他の種類の分析物、例えばタンパク質の検出のために適合され得る（図２）。
いくつかの実施形態において、タリープローブは、核酸又はアプタマーである。いくつかの実施形態において、タリープローブは、低い親和性の抗体、抗体断片、又はナノボディである。いくつかの実施形態において、タリープローブは、ＤＮＡ結合タンパク質、ＲＮＡ結合タンパク質、又はＤＮＡ結合リボ核タンパク質複合体である。いくつかの実施形態において、タリープローブは、本明細書中で記載される複数の種類の分子又は部分（例えば、核酸及びタンパク質）を含む。
いくつかの実施形態において、インテグレータープローブは、高い親和性の抗体、抗体断片、又はナノボディである。いくつかの実施形態において、インテグレータープローブは、核酸いくつかの実施形態において、インテグレータープローブは、本明細書中で記載される複数の種類の分子又は部分（例えば、核酸及びタンパク質）を含む。いくつかの実施形態において、インテグレータープローブは、バルク混合物から物質分離相、例えばコロイドナノ粒子又は液中液エマルジョンもしくは他の多相系の別個の相を含む。
分析物
この技術は、検出されるか、定量されるか、同定されるか、又は他の方法で性質決定される分析物（例えば、存在、非存在、量、濃度、状態）に限定されない。用語「分析物」は、本明細書中で使用される場合、広範な用語であり、その通常の意味で使用され、それには、分析され得る生物学的サンプル（例えば、例えば血液、間質液、脳脊髄液、リンパ液又は尿などの生物液）などのサンプル中の物質又は化学成分を言及することが含まれるが、これらに限定されない。分析物としては、天然に存在する物質、人工物質、代謝物、及び／又は反応生成物が挙げられる。いくつかの実施形態において、分析物は、塩、糖、タンパク質、脂質、ビタミン、又はホルモンを含む。いくつかの実施形態において、分析物は、生物学的サンプル中に天然で存在している（例えば、「内在性」である）；例えば、いくつかの実施形態において、分析物は、代謝産物、ホルモン、抗原、抗体などである。あるいは、いくつかの実施形態において、分析物は、生物中に導入されており（例えば、「外来性」である）、例えば、薬物、薬物代謝物、薬物前駆体（例えば、プロドラッグ）、画像化のための造影剤、放射性同位体、化学薬剤などである。薬物及び医薬組成物の代謝生成物もまた、企図される分析物である。
いくつかの実施形態において、分析物は、ポリペプチド、核酸、低分子、脂質、炭水化物、多糖類、脂肪酸、リン脂質、糖脂質、スフィンゴ脂質、有機分子、無機分子、補因子、医薬品、生物活性薬剤、細胞、組織、生物などである。いくつかの実施形態において、分析物は、ポリペプチド、核酸、低分子、脂質、炭水化物、多糖類、脂肪酸、リン脂質、糖脂質、スフィンゴ脂質、有機分子、無機分子、補因子、医薬品、生物活性薬剤、細胞、組織、生物などを含む。いくつかの実施形態において、分析物は、ポリペプチド、核酸、低分子、脂質、炭水化物、多糖類、脂肪酸、リン脂質、糖脂質、スフィンゴ脂質、有機分子、無機分子、補因子、医薬品、生物活性薬剤、細胞、組織、生物などの１つ以上の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態において、分析物は、本明細書中で記載される核酸である。いくつかの実施形態において、分析物は、突然変異（例えば、１ヌクレオチド多型、欠失、挿入、再編成、融合など）を含む核酸である。いくつかの実施形態において、分析物は、本明細書中で記載されるタンパク質である。いくつかの実施形態において、分析物は、アミノ酸置換を含むタンパク質である。
いくつかの実施形態において、分析物は、多分子複合体の一部であり、例えば、多タンパク質複合体、核酸／タンパク質複合体、分子機械、オルガネラ（例えば、例えば血漿中の、無細胞ミトコンドリア；プラスミド；ゴルジ体、小胞体、液胞、ペルオキシソーム、リソソーム、及び／又は核）、細胞、ウイルス粒子、組織、生物、又は任意の高分子複合体もしくは構造又は本明細書中で記載される技術によって分析を受けることができる他の物体（例えば、リボソーム、スプライソソーム、ヴォールト、プロテアソーム、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素、ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素、対称ウイルスカプシド、ＧｒｏＥＬ／ＧｒｏＥＳ；膜タンパク質複合体：光化学系Ｉ、ＡＴＰシンターゼ、ヌクレオソーム、中心小体及び微小管形成中心（ＭＴＯＣ）、細胞骨格、鞭毛、核小体、ストレス顆粒、生殖細胞顆粒、又はニューロン輸送顆粒）である。例えば、いくつかの実施形態において、多分子複合体は、分析物を含み、及びこの技術は、多分子複合体に関連する（例えば、その構成要素である）１つ以上の分子（分析物）の性質決定、同定、定量及び／又は検出における用途を見出す。いくつかの実施形態において、細胞外小胞は、単離され、及びこの技術は、小胞に関連する１つ以上の分子（分析物）の性質決定、同定、定量及び／又は検出における用途を見出す。いくつかの実施形態において、この技術は、タンパク質（例えば、表面タンパク質）及び／又は小胞の中に存在する分析物、例えば、タンパク質、核酸、又は本明細書中で記載される他の分析物の性質決定、同定、定量及び／又は検出における用途を見出す。いくつかの実施形態において、小胞は、分析の前に固定され、及び透過処理される。
いくつかの実施形態において、分析物とタリープローブとの間の相互作用は、分析物の共有結合性修飾によって識別可能に影響を受ける。例えば、いくつかの実施形態において、分析物は、翻訳後修飾を含むポリペプチド、例えば、翻訳後修飾を含むタンパク質又はペプチドである。いくつかの実施形態において、ポリペプチドの翻訳後修飾は、タリープローブの分析物との結合に作用し、例えば、インテグレータープローブシグナルは、ポリペプチドに対する翻訳後修飾の存在又は非存在に対応する。いくつかの実施形態において、翻訳後修飾を含む分析物とタリープローブとの間の相互作用は、化学アフィニティータグ、例えば、核酸を含む化学アフィニティータグによって、媒介される。例えば、いくつかの実施形態において、分析物は、後成的な修飾を含む核酸、例えば、メチル化した塩基を含む核酸である。いくつかの実施形態において、核酸の修飾は、分析物とのタリープローブの結合に影響を及ぼし、例えば、インテグレータープローブシグナルは、核酸における修飾の存在又は非存在に対応する。いくつかの実施形態において、分析物は、標的分析物の核酸塩基、リボース又はデオキシリボース部分に対する共有結合性修飾を含む核酸である。
いくつかの実施形態において、分析物は、インテグレータープローブ及び／又はタリープローブを提供する前に、担体の存在下で熱変性に供される。いくつかの実施形態において、分析物は、インテグレータープローブ及び／又はタリープローブを提供する前に、担体の存在下で化学変性に供され、例えば、分析物は、尿素、ホルムアミド、塩化グアジニウム、高イオン強度、低イオン強度、高ｐＨ、低ｐＨ又はドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの変性剤によって変性させられる。
本明細書中で使用される場合、「分析物を検出する」又は「物質を検出する」は、分析物自体の直接検出又は副生成物を検出することによる分析物の間接的検出を包含することが理解されるであろう。
蛍光標識及び蛍光部分
いくつかの実施形態において、この技術は、蛍光部分（例えば、蛍光発生色素、「フルオロフォア」又は「蛍光」とも呼ばれる）の使用を含む。例えば、いくつかの実施形態において、インテグレータープローブは、１つ以上の蛍光標識（例えば、蛍光部分を含む）を含む。いくつかの実施形態において、タリープローブは、蛍光標識（例えば、蛍光部分を含む）を含む。広範な種々の蛍光部分が、当該分野で公知であり、及び蛍光部分を分子（例えば、インテグレータープローブ及び／又はタリープローブ）に連結するための方法が、公知である。
蛍光部分として使用され得る化合物の例としては、キサンタン、アントラセン、シアニン、ポルフィリン、及びクマリン色素が挙げられるがこれらに限定されない。本技術での用途を見出すキサンタン色素の例としては、フルオレセイン、６－カルボキシフルオレセイン（６－ＦＡＭ）、５－カルボキシフルオレセイン（５－ＦＡＭ）、５－又は６－カルボキシ－４，７，２’，７’－テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、５－又は６－カルボキシ－２’，４，４’，５’，７，７’－ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、５’又は６’－カルボキシ－４’，５’－ジクロロ－２’，７’－ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、５－カルボキシ－２’，４’，５’，７’－テトラクロロフルオレセイン（ＺＯＥ）、ロドール、ローダミン、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、４，７－ジクロロテトラメチルローダミン（ＤＴＡＭＲＡ）、ローダミンＸ（ＲＯＸ）、及びテキサスレッドが挙げられるがこれらに限定されない。本発明での用途を見出すシアニン色素の例としては、Ｃｙ ３、Ｃｙ ３Ｂ、Ｃｙ ３．５、Ｃｙ ５、Ｃｙ ５．５、Ｃｙ ７及びＣｙ ７．５が挙げられるがこれらに限定されない。本技術での用途を見出す他の蛍光部分及び／又は色素としては、エネルギー転移色素、複合色素及び蛍光シグナルを生じる他の芳香族化合物が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、蛍光部分は、量子ドットを含む。
いくつかの実施形態において、蛍光部分は、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＧＦＰの改変誘導体（例えば、Ｓ６５Ｔを含むＧＦＰ、増強ＧＦＰ（例えば、Ｆ６４Ｌを含む））、又は他の当該分野で公知のもの、例えば、青色蛍光タンパク質（例えば、ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａ１）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２）、及び黄色蛍光タンパク質誘導体（例えば、ＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ）などを含む。実施形態は、蛍光タンパク質が、１つ以上のインテグレータープローブ及び／又はタリープローブに共有結合していても又は非共有結合的に結合していてもよいことを提示する。
蛍光色素としては、非限定で、以下が挙げられる：Ｃｙ５、ジクロロ［Ｒ１１０］、ジクロロ［Ｒ６Ｇ］、ジクロロ［ＴＡＭＲＡ］、ジクロロ［ＲＯＸ］などを含むｄ－ローダミンアクセプター色素、フルオレセイン、６－ＦＡＭ、５－ＦＡＭなどを含むフルオレセインドナー色素；アクリジンオレンジ、アクリジンイエロー、プロフラビン、ｐＨ７などを含むアクリジン；２－メチルベンゾオキサゾール、エチルｐ－ジメチルアミノベンゾエート、フェノール、ピロール、ベンゼン、トルエンなどを含む芳香族炭化水素；オーラミンＯ、クリスタルバイオレット、クリスタルバイオレット、グリセロール、マラカイトグリーンなどを含むアリールメチン色素；７－メトキシクマリン－４－酢酸、クマリン１、クマリン３０、クマリン３１４、クマリン３４３、クマリン６などを含むクマリン色素；１，１’－ジエチル－２，２’－シアニンヨージド、クリプトシアニン、インドカルボシアニン（Ｃ３）色素、インドジカルボシアニン（Ｃ５）色素、インドトリカルボシアニン（Ｃ７）色素、オキサカルボシアニン（Ｃ３）色素、オキサジカルボシアニン（Ｃ５）色素、オキサトリカルボシアニン（Ｃ７）色素、ピナシアノールヨージド、ステインオール、チアカルボシアニン（Ｃ３）色素、エタノール、チアカルボシアニン（Ｃ３）色素、ｎ－プロパノール、チアジカルボシアニン（Ｃ５）色素、チアトリカルボシアニン（Ｃ７）色素などを含むシアニン色素；Ｎ，Ｎ’－ジフルオロボリル－１，９－ジメチル－５－（４－ヨードフェニル）－ジプリン、Ｎ，Ｎ’－ジフルオロボリル－１，９－ジメチル－５－［（４－（２－トリメチルシリルエチニル）、Ｎ，Ｎ’－ジフルオロボリル－１，９－ジメチル－５－フェニジプリンなどを含むジプリン色素；４－（ジシアノメチレン）－２－メチル－６－（ｐ－ジメチルアミノスチリル）－４Ｈ－ピラン（ＤＣＭ）、アセトニトリル、４－（ジシアノメチレン）－２－メチル－６－（ｐ－ジメチルアミノスチリル）－４Ｈ－ピラン（ＤＣＭ）、メタノール、４－ジメチルアミノ－４’－ニトロスチルベン、メロシアニン５４０などを含むメロシアニン；４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、ジメチルスルホキシド、７－ベンジルアミノ－４－ニトロベンゾ－２－オキサ－１，３－ジアゾール、ダンシルグリシン、ダンシルグリシン、ジオキサン、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８、ＤＭＦ、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８、ルシファーイエローＣＨ、ピロキシカム、硫酸キニーネ、硫酸キニーネ、スクアリリウム色素ＩＩＩなどを含む様々な色素；２，５－ジフェニルオキサゾール（ＰＰＯ）、ビフェニル、ＰＯＰＯＰ、ｐ－クアテルフェニル、ｐ－テルフェニルなどを含むオリゴフェニレン；クレシルバイオレット過塩素酸塩、ナイルブルー、メタノール、ナイルレッド、エタノール、オキサジン１、オキサジン１７０などを含むオキサジン；９，１０－ビス（フェニルエチニル）アントラセン、９，１０－ジフェニルアントラセン、アントラセン、ナフタレン、ペリレン、ピレンなどを含む多環式芳香族炭化水素；１，２－ジフェニルアセチレン、１，４－ジフェニルブタジエン、１，４－ジフェニルブタジイン、１，６－ジフェニルヘキサトリエン、ベータ－カロテン、スチルベンなどを含むポリエン／ポリイン；アントラキノン、アゾベンゼン、ベンゾキノン、フェロセン、リボフラビン、トリス（２，２’－ビピリジプルテニウム（ＩＩ）、テトラピロール、ビリルビン、クロロフィルａ、ジエチルエーテル、クロロフィルａ、メタノール、クロロフィルｂ、ジプロトン化－テトラフェニルポルフィリン、ヘマチン、マグネシウムオクタエチルポルフィリン、マグネシウムオクタエチルポルフィリン（ＭｇＯＥＰ）、マグネシウムフタロシアニン（ＭｇＰｃ）、ＰｒＯＨ、マグネシウムフタロシアニン（ＭｇＰｃ）、ピリジン、マグネシウムテトラメシチルポルフィリン（ＭｇＴＭＰ）、マグネシウムテトラフェニルポルフィリン（ＭｇＴＰＰ）、オクタエチルポルフィリン、フタロシアニン（Ｐｃ）、ポルフィン、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡ、テトラ－ｔ－ブチルアザポルフィン、テトラ－ｔ－ブチルナフタロシアニン、テトラキス（２，６－ジクロロフェニル）ポルフィリン、テトラキス（ｏ－アミノフェニル）ポルフィリン、テトラメシチルポルフィリン（ＴＭＰ）、テトラフェニルポルフィリン（ＴＰＰ）、ビタミンＢ１２、亜鉛オクタエチルポルフィリン（ＺｎＯＥＰ）、亜鉛フタロシアニン（ＺｎＰｃ）、ピリジン、亜鉛テトラメシチルポルフィリン（ＺｎＴＭＰ）、亜鉛テトラメシチルポルフィリンラジカルカチオン、亜鉛テトラフェニルポルフィリン（ＺｎＴＰＰ）などを含む酸化還元活性発色団；エオシンＹ、フルオレセイン、塩基性エタノール、フルオレセイン、エタノール、ローダミン１２３、ローダミン６Ｇ、ローダミンＢ、ローズベンガル、スルホローダミン１０１などを含むキサンタン；あるいはこれらの混合物もしくは組み合わせ又はこれらの合成誘導体。
蛍光発生色素のいくつかのクラス及び特定の化合物は、この技術の詳細な実施形態のために適切であることが公知である：キサンタン誘導体、例えばフルオレセイン、ローダミン、オレゴングリーン、エオシン、及びテキサスレッド；シアニン誘導体、例えばシアニン、インドカルボシアニン、オキサカルボシアニン、チアカルボシアニン、及びメロシアニン；ナフタレン誘導体（ダンシル及びプロダン誘導体）；クマリン誘導体；オキサジアゾール誘導体、例えばピリジルオキサゾール、ニトロベンゾオキサジアゾール、及びベンゾオキサジアゾール；ピレン誘導体、例えばカスケードブルー；オキサジン誘導体、例えばナイルレッド、ナイルブルー、クレシルバイオレット、及びオキサジン１７０；アクリジン誘導体、例えばプロフラビン、アクリジンオレンジ、及びアクリジンイエロー；アリールメチン誘導体、例えばオーラミン、クリスタルバイオレット、及びマラカイトグリーン；ならびにテトラピロール誘導体、例えばポルフィン、フタロシアニン、ビリルビン。いくつかの実施形態において、蛍光部分は、色素、すなわち、キサンタン、フルオレセイン、ローダミン、ＢＯＤＩＰＹ、シアニン、クマリン、ピレン、フタロシアニン、フィコビリンタンパク質、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（Ｒ） ３５０、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（Ｒ） ４０５、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（Ｒ） ４３０、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（Ｒ） ４８８、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（Ｒ） ５１４、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（Ｒ） ５３２、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（Ｒ） ５４６、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（Ｒ） ５５５、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（Ｒ） ５６８、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（Ｒ） ５６８、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（Ｒ） ５９４、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（Ｒ） ６１０、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（Ｒ） ６３３、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（Ｒ） ６４７、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（Ｒ） ６６０、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（Ｒ） ６８０、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（Ｒ） ７００、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（Ｒ） ７５０、又はスクアライン色素である。いくつかの実施形態において、この標識は、蛍光的に検出可能な部分であり、例えば、Ｈａｕｇｌａｎｄ（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２００５）ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＢＥＳ ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＴ ＰＲＯＢＥＳ ＡＮＤ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ（１０ｔｈ ｅｄ．）において記載されるとおりであり、これは、その全体が本明細書中で参考として組み込まれる。
いくつかの実施形態において、標識（例えば、蛍光的に検出可能な標識）は、ＡＴＴＯ－ＴＥＣ ＧｍｂＨ（Ａｍ Ｅｉｃｈｅｎｈａｎｇ ５０，５７０７６ Ｓｉｅｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手可能であって、例えば、米国特許出願公開第２０１１０２２３６７７号、同第２０１１０１９０４８６号、同第２０１１０１７２４２０号、同第２００６０１７９５８５号、同第２００３０００３４８６号において、及び米国特許第７，９３５，８２２号において記載されるとおりであり、これらの全ては、本明細書中で参考として組み込まれる（例えば、ＡＴＴＯ ３９０、ＡＴＴＯ ４２５、ＡＴＴＯ ４６５、ＡＴＴＯ ４８８、ＡＴＴＯ ４９５、ＡＴＴＯ ５１４、ＡＴＴＯ ５２０、ＡＴＴＯ ５３２、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ６Ｇ、ＡＴＴＯ ５４２、ＡＴＴＯ ５５０、ＡＴＴＯ ５６５、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ３Ｂ、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１１、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１２、ＡＴＴＯ Ｔｈｉｏ１２、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１０１、ＡＴＴＯ ５９０、ＡＴＴＯ ５９４、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１３、ＡＴＴＯ ６１０、ＡＴＴＯ ６２０、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１４、ＡＴＴＯ ６３３、ＡＴＴＯ ６４７、ＡＴＴＯ ６４７Ｎ、ＡＴＴＯ ６５５、ＡＴＴＯ Ｏｘａ１２、ＡＴＴＯ ６６５、ＡＴＴＯ ６８０、ＡＴＴＯ ７００、ＡＴＴＯ ７２５、ＡＴＴＯ７４０）。
当業者は、これらの範囲外である最大放出を有する色素もまた使用され得ることを理解するであろう。いくつかの場合、５００ｎｍ～７００ｎｍの間の範囲に及ぶ色素は、可視スペクトルであり、光電子倍増管を用いて検出され得るという利点を有する。いくつかの実施形態において、広範な範囲の入手可能な色素が、検出範囲が広がった放出波長を有する色素セットの選択を可能にする。多くの色素を識別可能である検出システムが、当該分野で公知である。
標識転移
この技術の実施形態は、多くのタリープローブから１つのインテグレータープローブへの標識の転移（例えば、不可逆的な転移（例えば、実質的に不可逆的な転移及び／又は事実上不可逆的な転移））を含む。この技術は、タリープローブ及びインテグレータープローブが分析物分子に結合したときにタリープローブからインテグレータープローブへの標識の転移を提供する、組成物、分子、リンカー、非共有結合的結合及び／又は共有結合、化学反応などに限定されない。この技術は、タリープローブ及びインテグレータープローブが分析物に結合するまではタリープローブに安定的に結合している標識を含む、タリープローブを提供する。タリープローブ及びインテグレータープローブの分析物への結合の場合、標識は、インテグレータープローブに転移し、及びインテグレータープローブに安定的に結合する。したがって、いくつかの実施形態において、この技術は、標識を含むタリープローブ及びインテグレータープローブを提供し、ここで、未結合のタリープローブについての標識の親和性は、タリープローブを含む組成物中の任意の他の分子についての標識の親和性より高く、及び分析物に結合したタリープローブについての標識の親和性は、このタリープローブが結合しているものと同じ分析物に結合しているインテグレータープローブについての標識の親和性よりも低い。
いくつかの実施形態において、タリープローブは、共有結合した標識及びＤＮＡ分析物に相補的なＲＮＡヌクレオチドを含む部分を含み、この標識は、このタリープローブが結合しているものと同じ分析物に結合しているインテグレータープローブと（例えば、クリック化学反応によって）化学反応し、及びＲＮａｓｅ Ｈ酵素が、共有結合した標識とＤＮＡ分析物に相補的なＲＮＡヌクレオチドを含む部分とを含む別のタリープローブの結合を提供するためにＲＮＡヌクレオチドを含むタリープローブの部分を分解して、インテグレータープローブへの標識転移の第２周期を提供する。
いくつかの実施形態において、インテグレータープローブは、トーホールド配列を含む１つ以上の核酸二本鎖を含み、及びタリープローブは、トーホールド媒介鎖置換によってインテグレータープローブに転移する核酸を含む。
いくつかの実施形態において、インテグレータープローブは、多くの標識を含み、その各々は、第１状態にあり、及びインテグレータープローブが結合しているものと同じ分析物に結合したタリープローブによって、第２状態へと変換される。多くのインテグレーター標識の第１状態から第２状態への変換は、多くのタリープローブの分析物への結合の記録を提供する。
いくつかの実施形態において、タリープローブは、標識を結合している抗体を含み、及びインテグレータープローブは、各々がタリープローブの抗体が標識に結合するよりも高い親和性で標識を結合している多くの抗体を含む。
いくつかの実施形態において、インテグレータープローブは、インテグレータープローブへの１つ以上の標識の転移を触媒する１つ以上の酵素を含む。いくつかの実施形態において、タリープローブは、インテグレータープローブへの標識の転移を触媒する１つ以上の酵素を含む。
いくつかの実施形態において、タリープローブは、分析物に安定的に結合している別のアダプタープローブ（例えば、核酸プローブ、アプタマー、又は抗体）を介して、間接的に分析物と相互作用する。アダプタープローブの結合の場合、タリープローブは、分析物の同じ分子に結合した隣接するインテグレータープローブに標識を転移させ、次いで、アダプタープローブから解離する。多くの標識が、同じアダプタープローブを介して同じ分析物に順次結合するいくつかのタリープローブから、同じインテグレータープローブに転移してもよい。
いくつかの実施形態において、反応混合物中の物質分離相（例えば、コロイド粒子、脂質ナノ粒子、ミセル、又は液体－液体エマルジョンの分離相、コアセルベート又は水性二相系）に伴われる分析物へのタリープローブの結合は、物質分離相への標識の転移をもたらす。インテグレーターは、物質分離相を含む。
検出
いくつかの実施形態において、この技術は、多くの標識（例えば、少なくとも２つの標識）を含むインテグレータープローブの検出を含む。この技術は、例えば、分析物類似物の存在下、いくつかの実施形態においては、バックグラウンドノイズの存在下での、標的分析物の検出を提供する。この技術は、多くの標識を含むインテグレータープローブの検出において用途を見出す検出器又は他の検出技術に限定されない。いくつかの実施形態において、標識は、蛍光標識であり、多くの標識を含むインテグレータープローブの検出は、蛍光シグナルの検出を含み、このことは、インテグレータープローブが、多くの標識（例えば、１つより多くの蛍光標識を含むインテグレータープローブの存在を示す蛍光シグナル）を含むことを示す。いくつかの実施形態において、蛍光シグナルの強度は、インテグレータープローブに結合した標識の数を表す。いくつかの実施形態において、標識を含まないか又は１つしか含まないインテグレータープローブと２つより多い標識を含むインテグレータープローブとの間を識別するための、蛍光強度についての閾値（例えば、カットオフ値）が確立される。いくつかの実施形態において、分析物の非存在を示す（例えば、閾値カットオフ値未満の数の標識を含む）インテグレータープローブと分析物の存在を示す（例えば、少なくとも閾値である値の数の標識を含む）インテグレータープローブとの間を識別するための、蛍光強度についての閾値（例えば、カットオフ値）が確立される。いくつかの実施形態において、実験は、分析物の非存在（例えば、標識を含まないか又は１つしか含まないインテグレータープローブ）と分析物の存在（例えば、２つより多い標識を含むインテグレータープローブ）との間を識別する、蛍光強度及び／又は標識の数についての閾値（例えば、カットオフ値）を確立するための対照を用いて行われる。
いくつかの実施形態において、分析物の非存在から存在を示す標識の閾値数が、確立される。例えば、いくつかの実施形態において、２つよりも少ない標識（例えば、０又は１つの標識）は、分析物の非存在を示し、２つ以上の標識は、分析物の存在を示す。いくつかの実施形態において、３つよりも少ない標識（例えば、０、１、ｏｒ２標識）は、分析物の非存在を示し、３つ以上の標識は、分析物の存在を示す。いくつかの実施形態において、４つよりも少ない標識（例えば、０、１、２、又は３つの標識）は、分析物の非存在を示し、４つ以上の標識は、分析物の存在を示す（例えば、実施例２及び図４を参照されたい）。いくつかの実施形態において、５つよりも少ない標識（例えば、０、１、２、３、又は４つの標識）は、分析物の非存在を示し、５つ以上の標識は、分析物の存在を示す。いくつかの実施形態において、６つよりも少ない標識は、分析物の非存在を示し、６つ以上の標識は、分析物の存在を示す。いくつかの実施形態において、７つよりも少ない標識は、分析物の非存在を示し、７つ以上の標識は、分析物の存在を示す。いくつかの実施形態において、８つよりも少ない標識は、分析物の非存在を示し、８つ以上の標識は、分析物の存在を示す。いくつかの実施形態において、９つよりも少ない標識は、分析物の非存在を示し、９つ以上の標識は、分析物の存在を示す。いくつかの実施形態において、１０よりも少ない標識は、分析物の非存在を示し、１０以上の標識は、分析物の存在を示す。いくつかの実施形態において、閾値は、１０より多い標識のカットオフで設定される。
いくつかの実施形態において、分析物の存在を検出するために適切な標識の閾値数が、ブランク測定値又は対照測定値の統計分析によって（例えば、閾値をブランク測定値又は対照測定値について検出され、測定され、及び/又は記録されるインテグレーターあたりの標識の数の平均又は中央値より２、３、４、又は５標準偏差が高いと設定することによって）決定される。いくつかの実施形態において、分析物の存在を検出するために適切な標識の閾値数は、ブランク測定値又は対照測定値を減算して、ポアソン分布、二項分布、正規分布、又は他の適用可能な統計モデルによって統計的に分析し、容認できる一定のレベルを下回る偽陽性検出事象の確率で（例えば、分析物の検出が偽陽性である確率が０．０１、０．００１、０．０００１、０．００００１、又は０．０００００１である）分析物の存在を示す標識の閾値数を決定する（例えば、予測する）ことによって、決定される。
いくつかの実施形態において、標識は、インテグレータープローブの質量、電荷、比重又は流体力学半径を変え、及び多くの標識を含むインテグレータープローブの検出は、インテグレータープローブが多くの標識を含むことを示すインテグレータープローブの質量、電荷、比重又は流体力学半径の変化を検出すること（例えば、ゲル電気泳動、質量分析、勾配超遠心分離、クロマトグラフィー、電気化学アッセイの使用を含むアッセイ）を含む。いくつかの実施形態において、多くの標識を含むインテグレータープローブの検出は、電気泳動法及び／又はクロマトグラフィー法を用いて、移動性における変化を検出することを含む。例えば、図２及び図３を参照されたい。
いくつかの実施形態において、一分子検出法が、多くの標識を含むインテグレータープローブを検出するために使用される。例えば、いくつかの実施形態において、多くの標識を含むインテグレータープローブに由来するシグナルが、０の標識又は１つの標識を含むインテグレータープローブ及び／又は標識を含むタリープローブ及び／又は組成物中の遊離の標識から識別可能である。いくつかの実施形態において、多くの標識を含むインテグレータープローブを検出することは、例えば、全反射照明蛍光（ＴＩＲＦ）又はｎｅａｒ－ＴＩＲＦ顕微鏡検査、零式導波路（ｚｅｒｏ－ｍｏｄｅ ｗａｖｅｇｕｉｄｅｓ）（ＺＭＷｓ）、光シート顕微鏡検査、誘導放出抑制（ＳＴＥＤ）顕微鏡検査、又は共焦点顕微鏡検査などの技術の使用を含む。いくつかの実施形態において、インテグレータープローブは、多くの蛍光標識を含み、及び蛍光放出の強度は、インテグレータープローブに結合している蛍光標識の数に比例する。いくつかの実施形態において、インテグレータープローブからの蛍光放出の強度は、１つの標識を含むインテグレータープローブについての蛍光放出の強度の既知の値と比較される。１つの標識を含むインテグレータープローブについての値よりも大きい強度を有する蛍光の検出は、インテグレータープローブが多くの標識を含むこと及び分析物がサンプル中に存在することを示す。いくつかの実施形態において、多くの標識を含むインテグレータープローブの蛍光は、サンプル中の分析物の存在を示す所定の閾値よりも大きい。いくつかの実施形態において、多くの標識を含むインテグレータープローブの蛍光強度は、０又は１つの標識を含むインテグレータープローブ蛍光強度よりも又は所定の閾値よりも少なくとも１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、又は５．０以上標準偏差が高い蛍光強度を有し、サンプル中の分析物の存在を示す。
いくつかの実施形態において、インテグレータープローブに結合している標識の数は、インテグレータープローブが励起光に曝露されるときの蛍光強度における落ち込みの数を計数することによって（例えば、光退色工程の計数によって）、推論される。いくつかの実施形態において、多くの標識を含むインテグレータープローブは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０回の光退色工程を示し、サンプル中の分析物の存在を表している。いくつかの実施形態において、分析物の非存在下での対照実験において観察されたインテグレータープローブよりも多くの光退色工程を示すインテグレータープローブは、サンプル中の分析物の存在を表している。
いくつかの実施形態において、陽性及び／又は陰性対照サンプルは、測定される（例えば、分析物を含むか又は含まないことが既知である対照サンプル）。蛍光標識の使用を含む実施形態において、陰性対照サンプルにおいて検出された蛍光は、「バックグラウンド蛍光」すなわち「バックグラウンド（蛍光）強度」すなわち「ベースライン」である。
いくつかの実施形態において、データは、データにおけるパターン及び規則性を認識するアルゴリズムによって、例えば、人工知能、パターン認識、機械学習、統計的推論、ニューラルネットなどを用いて分析される。いくつかの実施形態において、分析は、頻度論者分析の使用を含み、及びいくつかの実施形態において、分析は、ベイジアン分析の使用を含む。いくつかの実施形態において、パターン認識システムは、既知の「トレーニング」データを用いて（例えば、教師あり学習を用いて）トレーニングされており、及びいくつかの実施形態において、アルゴリズムは、未知のパターンを発見するために使用される（例えば、教師なし学習）。例えば、Ｄｕｄａ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｐａｔｔｅｒｎ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ（２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｂｉｓｈｏｐ（２００６）Ｐａｔｔｅｒｎ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍａｃｈｉｎｅ Ｌｅａｒｎｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒを参照されたい。いくつかの実施形態において、パターン認識（例えば、トレーニングセット、教師つき学習、教師なし学習、及び未知のサンプルの分析を用いる）は、鑑定したパターンを分析物と関連付けることによって、特定のパターンが特定の分析物の「指紋」を提供し、これは、分析物の検出、定量及び同定における用途を見出す。いくつかの実施形態において、データは、統計を用いて処理されて、分析物がサンプル中に存在するか又は存在しない確率を決定する。
サンプル
いくつかの実施形態において、サンプル（例えば、生物学的サンプル及び／又は生物液）は、分析物を含む。いくつかの実施形態において、サンプルは、種々の他の分析物ではない構成要素、例えば核酸、タンパク質、脂質、及び代謝物をも含む。分析物及び分析物を含むサンプルは、動物、植物、細菌、古細菌、真菌、又は任意の他の生物から得られる任意の物質（例えば、細胞物質（生細胞又は死んだ細胞）、細胞外物質、ウイルス物質、環境サンプル（例えば、メタゲノムのサンプル）、及び／又は合成物質）から得られ得る。本技術における使用のための生物学的サンプルとしては、ウイルス粒子又はその調製物が挙げられる。分析物及び分析物を含むサンプルは、生物から直接的に得られても、又は生物から得られた生物学的サンプル（例えば、血液、尿、脳脊髄液、精液、唾液、痰、糞便、毛髪、汗、涙、皮膚及び組織）から得られてもよい。例示的なサンプルとしては、全血、リンパ液、血清、血漿、頬細胞、汗、涙、唾液、痰、毛髪、皮膚、生検、脳脊髄液（ＣＳＦ）、羊水、精液、膣分泌液、漿液、滑液、心膜液、腹水、胸水、漏出液、浸出液、嚢胞液、胆汁、尿、胃液、腸液、便サンプル、及びスワブ、吸引液（例えば、骨髄、微細針など）、洗浄液（例えば、口腔、鼻咽頭、気管支、気管支肺胞、眼、直腸、腸、膣、上皮など）、及び／又は他の標本が挙げられるが、これらに限定されない。
任意の組織又は体液標本が、この技術における使用のための分析物及び分析物を含むサンプルの供給源として使用されてもよく、これらとしては、法医学標本、保管標本、保存標本、及び／又は長期間保存された標本、例えば、新鮮凍結、メタノール／酢酸固定、又はホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）された標本及びサンプルが挙げられる。分析物及び分析物を含むサンプルはまた、初代細胞培養又は細胞株などの培養細胞から単離されてもよい。分析物及び分析物を含むサンプルが得られた細胞又は組織は、ウイルス又は他の細胞内病原体に感染している場合がある。
核酸分子は、、例えばＭａｎｉａｔｉｓ，ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（例えば、ｐｐ．２８０－２８１を参照されたい）によって記載されるような種々の技術による、例えば生物学的サンプルからの抽出によって、得られてもよい。サンプルは、生物標本から抽出されたＲＮＡ、ｃＤＮＡライブラリー、ウイルス核酸又はゲノムＤＮＡを含んでもよい。サンプルはまた、非細胞起源から単離されたＤＮＡ、例えば冷凍庫に保存されていた、増幅された／単離されたＤＮＡであってもよい。
いくつかの実施形態において、この技術は、インサイチュで分析物をふぉう呈するために使用される。詳細には、この技術の実施形態は、組織、細胞などから分析物を抽出することなく、組織、細胞などにおいて直接（例えば、組織、細胞などを透過処理した後に）分析物の同定を提供する。インサイチュ検出に関連する技術のいくつかの実施形態において、この技術は、インビボ、エキソビボ、及び／又はインビトロで適用される。いくつかの実施形態において、サンプルは、粗サンプル、最小処理した細胞溶解物、又は生物液溶解物である。いくつかの実施形態において、分析物は、核酸精製なしで、粗溶解物において検出される。
方法
いくつかの実施形態は、本明細書中で記載されるインテグレータープローブ及びタリープローブを用いて分析物を同定する方法を、提供する。例えば、いくつかの実施形態において、方法は、サンプル（例えば、生物学的サンプル（例えば、生物液））、例えば、分析物を含むサンプル及び／又は分析物を含むことが疑われるサンプルを得るか、又は提供することを含む。いくつかの実施形態において、サンプルは、分析物の存在、非存在、及び／又は量について試験する必要がある患者から得られるか、及び／又はその患者によって提供される。いくつかの実施形態において、患者から得られたか、及び／又はその患者によって提供されたサンプルを、分析物の存在、非存在、及び／又は量について試験することは、患者における分析物の状態（例えば、存在、非存在、及び／又は量）を示す。いくつかの実施形態において、サンプルは、分析物を単離するか又は分析物についてサンプルを富化するように設計された事前処理に供される。当業者に公知である種々の技術が、この目的にために使用されてもよく、これらとしては、遠心分離、免疫捕獲、細胞溶解、濾過、クロマトグラフィー、磁気ビーズの使用及び核酸標的捕獲が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、方法は、インテグレータープローブを提供すること及びタリープローブを提供することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、分析物を含む組成物を、インテグレータープローブ及び／又はタリープローブを含む１つ以上の組成物と混合することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、分析物を含む組成物をインテグレータープローブ及び多くのタリープローブと接触させて反応混合物を提供し、及びこの反応混合物をインキュベーション温度でインキュベーション時間にわたってインキュベートすることを含む。
いくつかの実施形態において、タリープローブを提供することは、タリープローブを合成することを含む。いくつかの実施形態において、タリープローブを合成することは、タリープローブを合成し、及び標識をタリープローブに付着させること（例えば、非共有結合的に又は共有結合によって付着させること）を含む。いくつかの実施形態において、方法は、標識を提供することを含む。いくつかの実施形態において、標識は、商用供給源によって提供され、及びいくつかの実施形態において、標識は、本明細書中で提供される方法の使用者によって合成される。いくつかの実施形態において、標識したタリープローブは、商用供給源によって提供される。いくつかの実施形態において、インテグレータープローブを提供することは、インテグレータープローブを合成することを含む。
いくつかの実施形態において、方法は、タリープローブ及びインテグレータープローブを含む組成物を、（例えば、インキュベーション温度である温度にて、及び／又はインキュベーション時間である時間の長さにわたって）インキュベートすることを含む。いくつかの実施形態において、方法は、タリープローブ及びインテグレータープローブを含む組成物を、インキュベーション温度で相当の時間にわたってインキュベートすることを含み、それによって、分析物（存在する場合）への複数の周期のタリープローブ結合が起こって、複数の標識を含むインテグレータープローブを生成する。いくつかの実施形態において、方法は、複数の標識を含むインテグレータープローブを検出することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、複数の標識を含むインテグレータープローブの数を定量すること及び／又はタリープローブから１つ以上のインテグレータープローブへ転移した標識（例えば、標識部分）の数を定量することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、複数の標識を含むインテグレータープローブの数を定量すること及び／又はタリープローブからインテグレータープローブへ転移した標識（例えば、標識部分）の数を定量することによって、サンプル中の分析物を定量することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、既知の量及び／又は濃度の分析物を含む１つ以上の組成物を、既知の条件下（例えば、既知のインキュベーション温度及び／又は既知のインキュベーション時間）で、複数の標識を含むインテグレータープローブの数を定量すること及び／又はタリープローブからインテグレータープローブへ転移した標識（例えば、標識部分）の数を定量することによって、標準曲線を作成することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、陰性対照を提供すること及び／又は陽性対照を提供することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、例えば、陰性対照及び／又は陽性対照、タリープローブ、及びインテグレータープローブを含む組成物を提供することにより、陰性対照及び／又は陽性対照を用いてアッセイ方法を行うことを含む。
いくつかの実施形態において、方法は、標識からのシグナルを検出することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、電磁放射線の供給源を提供することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、電磁放射線の検出器を提供することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、サンプルを（例えば、電磁放射線の供給源を用いて）照射することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、例えば、標識によって放出された電磁放射線照射の強度を、電磁放射線の検出器を用いて定量することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、標識によって（例えば、１つ以上の標識されたインテグレータープローブによって）生じたシグナルの強度を用いて、サンプル中の分析物の濃度又は量を計算することを含む。
いくつかの実施形態において、方法は、環境条件（例えば、温度、溶液条件（例えば、ｐＨ、緩衝化、塩、化学活性））、触媒、及び／又は反応性の化学構成要素を提供することにより、タリープローブ及びインテグレータープローブが同じ分析物に結合したときに、タリープローブからインテグレータープローブへ転移させることを含む。その上さらに、いくつかの実施形態において、方法は、環境条件（例えば、温度、溶液条件（例えば、ｐＨ、緩衝化、塩、化学活性））、触媒、及び／又は反応性の化学構成要素を提供することにより、インテグレータープローブが結合している分析物に標識を含むタリープローブが結合し、標識がタリープローブからインテグレータープローブへ転移して、及びタリープローブが分析物から解離することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、標識転移後の分析物からのタリープローブの解離を促進する酵素活性を提供することを含む。
キット
いくつかの実施形態において、この技術は、キットに関する。例えば、いくつかの実施形態において、キットは、標識及びインテグレータープローブを含むタリープローブを、例えば、１つ以上の組成物中に含む（例えば、標識を含む、タリープローブ及びインテグレータープローブを含む組成物；標識を含む、タリープローブ及びインテグレータープローブを含む第２組成物を含む第１組成物）。いくつかの実施形態において、キットは、陽性対照（例えば、既知の濃度及び／又は量の分析物を含む組成物）を含む。いくつかの実施形態において、キットは、陰性対照（例えば、分析物を含まないか又は検出不可能な量及び／又は濃度の分析物を含む組成物）を含む。いくつかの実施形態において、キットは、分析物を含む組成物を調製するための緩衝溶液を含む。いくつかの実施形態において、キットは、緩衝溶液及び患者からサンプルを調製するためのデバイスを含む。いくつかの実施形態において、キットは、対象由来のサンプルを含み及び本明細書中で記載されるアッセイが行われる容器を含む。
システム
この技術の実施形態は、分析物を検出するためのシステムに関する。例えば、いくつかの実施形態において、この技術は、１つ以上の標的分析物を定量するためのシステムを提供し、ここで、このシステムは、本明細書中で記載されるように、インテグレータープローブ及び標識を含むタリープローブを含む。その上さらに、いくつかのシステム実施形態は、（存在する場合は）分析物を含むサンプルと一緒の、インテグレータープローブ及びタリープローブのインキュベーションの後で、インテグレータープローブからのシグナルを記録する、検出構成要素を含む。例えば、いくつかの実施形態において、検出構成要素は、例えば、インテグレータープローブ及びタリープローブの分析物との相互作用の後で、インテグレータープローブから生じたシグナルを記録する。いくつかの実施形態において、検出構成要素は、多くの標識を含むインテグレータープローブによって提供されたシグナルの強度を記録する。
システム実施形態は、シグナル（例えば、多くの標識を含むインテグレータープローブ由来）を処理し、及びサンプルが分析物を含むサンプルであると同定する、分析プロセス（例えば、例えばソフトウェアにエンコードされている、マイクロプロセッサーに分析プロセスを実施させる一組の命令において、具体化される）を含む。いくつかの実施形態において、分析プロセスは、多くの標識を含むインテグレータープローブによって発生したシグナルの強度をインプットデータとして用いる。いくつかの実施形態において、システムは、分析物を含む。システムの実施形態は、検出される分析物に限定されない。例えば、いくつかの実施形態において、分析物は、ポリペプチド（例えば、タンパク質又はペプチド）である。いくつかの実施形態において、標的分析物は、核酸である。いくつかの実施形態において、標的分析物は、低分子又は本明細書中で記載される他の分子もしくは物体である。
この技術のいくつかのシステム実施形態は、分析物の検出及び低量のための構成要素を含む。いくつかのシステム実施形態は、インテグレータープローブの標識を励起するための照明構成を備えた蛍光顕微鏡である、検出構成要素を含む。いくつかの実施形態は、蛍光検出器、例えば、増強電荷結合素子（ＩＣＣＤ）、電子増倍電荷結合素子（ＥＭ－ＣＣＤ）、相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）、光電子増倍管（ＰＭＴ）、アバランシェ光ダイオード（ＡＰＤ）を備えた検出器、及び／又は１つの発色団からの蛍光放出を検出可能である別の検出器を含む。いくつかの特定の実施形態は、レンズフリー画像化のために構成されている構成要素（例えばレンズフリー顕微鏡、例えばレンズを用いることなく検出器で直接的に画像化するための検出及び／又は画像化構成要素（例えば、ＣＭＯＳ））を含む。
いくつかの実施形態は、コンピューター及びコンピューターが実施するための（例えば、データ獲得及び／又はデータ処理のための分析プロセスを制御するための）命令をエンコードしているソフトウェアを、含む。
いくつかの実施形態は、例えば特定の波長範囲内又は複数の波長範囲内の蛍光を選択的に検出するための、光学素子（レンズ、ミラー、ダイクロックミラー、光学フィルターなど）を含む。
例えば、いくつかの実施形態において、コンピューターベースの分析ソフトウェアが、検出アッセイによって得られた生データ（例えば、１つ以上の分析物の存在、非存在、又は量）を臨床医のための予測値のデータに翻訳するために使用される。臨床医は、任意の好適な手段を用いて予測データにアクセスできる。
いくつかのシステム実施形態は、本技術の実施形態が実装され得るコンピューターシステムを含む。種々の実施形態において、コンピューターシステムは、情報を通信するためのバス通信メカニズム又は他の通信メカニズム及び情報処理のためにバスと結合するプロセッサーを含む。種々の実施形態において、コンピューターシステムは、バスと結合するランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）であってもよいメモリ又は他の動的記憶装置、及びプロセッサーによって実行される命令を備える。メモリは、プロセッサーによって実行される命令の実行の間に、テンポラリ変数又は他の中間情報を保存するためにも使用され得る。種々の実施形態において、コンピューターシステムは、静的情報及びプロセッサーのための命令を保存するためにバスと結合するリードオンリーメモリ（ＲＯＭ）又は他の静的記憶装置を、さらに備えてもよい。磁気ディスク又は光学ディスクなどの記憶装置が、提供され、及び情報及び命令を保存するためにバスと結合してもよい。
種々の実施形態において、コンピューターシステムは、コンピューターユーザーに情報を表示するために、陰極線管（ＣＲＴ）又は液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）などのディスプレイと、バスを介して結合する。英数字及び他のキーを備えた入力機器が、プロセッサーに情報及びコマンド選択を伝達するためにバスと結合してもよい。別の種類のユーザー入力機器は、プロセッサーに情報及びコマンド選択を伝達し、及びディスプレイ上のカーソル移動を制御するための、マウス、トラックボールなどのカーソル制御、又はカーソル方向キーである。入力機器は、代表的に、第１軸（例えば、ｘ）及び第２軸（例えば、ｙ）の２つの軸において２つの自由度を有し、これにより、素子が平面上の位置を特定することを可能にする。
コンピューターシステムは、本技術の実施形態を実行することができる。本技術の特定の実装と一貫して、結果は、メモリに含まれる１つ以上の命令の１つ以上のシーケンスを実行するプロセッサーに応答して、コンピューターシステムによって提供され得る。そのような命令は、記憶装置などの別のコンピューター読み取り可能媒体から、メモリに読み込んでもよい。メモリに含まれる命令のシーケンスの実行は、本明細書中で記載されている方法をプロセッサーに実行させることができる。代替的に、本教示を実行するために、ソフトウェア命令の代わりに、又はソフトウェア命令と組み合わせて、配線回路が使用されてもよい。したがって、本技術の実装は、ハードウェア回路（ｈａｒｄｗａｒｅ
ｃｉｒｃｕｉｔｒｙ）及びソフトウェアの任意の特定の組み合わせに限定されない。
用語「コンピューター読み取り可能媒体」は、本明細書中で使用される場合、プロセッサーに実行のための命令の提供に携わる、任意の媒体をいう。このような媒体は、多くの形態を取り得、これらとしては、不揮発性媒体、揮発性媒体及び伝送媒体が挙げられるが、これらに限定されない。不揮発性媒体の例としては、記憶装置などの光学ディスク又は磁気ディスクが挙げられ得るが、これらに限定されない。揮発性媒体の例としては、動的メモリが挙げられ得るが、これらに限定されない。伝送媒体としては、同軸ケーブル、銅線及び光ファイバー（バスを備えたワイヤーを含む）が挙げられ得るが、これらに限定されない。
コンピューター読み取り可能媒体の一般的な形態としては、例えば、フロッピーディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、フラッシュ媒体、磁気テープ又は任意の他の磁気媒体、ＣＤ－ＲＯＭ、任意の他の光学媒体、パンチカード、紙テープ、穴のパターンを有する任意の他の物理媒体、ＲＡＭ、ＰＲＯＭ、及びＥＰＲＯＭ、ＦＬＡＳＨ－ＥＰＲＯＭ、任意の他のメモリーチップ又はカートリッジ、又はコンピューターが読み取ることができる任意の他の有形媒体が挙げられる。
種々の形態のコンピューター読み取り可能媒体が、プロセッサーに対する実行のための１つ以上の命令の１つ以上のシーケンスを運ぶことに関与してもよい。例えば、この命令は、最初、遠隔コンピューターの磁気ディスク上に載せられてもよい。この遠隔コンピューターは、この命令を動的メモリに載せて、及びこの命令をネットワーク接続（例えば、ＬＡＮ、ＷＡＮ、インターネット、電話回線）を通じて送ることができる。ローカルコンピューターシステムは、このデータを受信し、及びバスに送信してもよい。バスは、このデータをメモリに運んでもよく、このメモリから、プロセッサーは、この命令を回収し及び実行する。メモリによって受信されたこの命令は、プロセッサーによる実行の前又は後のどちらかで、任意選択的に記憶装置上に保存されてもよい。
種々の実施形態にしたがって、方法を実施するためにプロセッサーによって実行されるように構成されている命令が、コンピューター読み取り可能媒体上に保存される。コンピューター読み取り可能媒体は、デジタル情報を保存する機器であってもよい。例えば、コンピューター読み取り可能媒体としては、ソフトウェアを保存するために当該分野で公知である、コンパクトディスクリードオンリーメモリ（ＣＤ－ＲＯＭ）が挙げられる。コンピューター読み取り可能媒体は、実行されるように構成されている命令を実行するために好適なプロセッサーによってアクセスされる。
このようなコンピューターシステムにしたがって、本明細書中で提供される技術のいくつかの実施形態は、データ（例えば、分析物の存在、非存在、濃度）を収集し、保存し、及び/又は分析するための機能をさらに含む。例えば、いくつかの実施形態は、例えば、命令を保存し及び実行し、標識シグナル、シグナル強度、及び／又は検出データを分析し、このデータを用いて計算を実施し、このデータを変換し、及びこのデータを保存するための、プロセッサー、メモリ及び／又はデータベースを含む、システムを企図する。いくつかの実施形態において、アルゴリズムが、このデータに統計モデルを適用する。
多くの診断が、１つ以上の核酸の存在又はヌクレオチド配列を決定することを含む。
いくつかの実施形態において、１つ以上の分析物の存在、非存在、濃度、量、又は配列特性を表す変数を含む等式は、診断を行うか又は分析物の存在又は量を評価する場合の用途を見出す値を生じる。いくつかの実施形態において、この値自体が、素子により、例えば、結果に関するインジケーター（例えば、ＬＥＤ、ディスプレイ上のアイコン、音など）によって、提示される。いくつかの実施形態において、素子は、この値を保存し、この値を伝送し、又はさらなる計算にこの値を用いる。いくつかの実施形態において、等式は、１つ以上の分析物の存在、非存在、濃度、量、又は特性を表す変数を含む。
したがって、いくつかの実施形態において、本技術は、分析アッセイに熟達していない場合がある臨床医が生データを理解する必要がないという、さらなる利点を提供する。このデータは、最も有用な形態で、臨床医に直接提示される。いくつかの実施形態において、臨床医は、したがって、対象の世話を最適化するために情報を利用することができる。本技術は、アッセイを実施する実験室から、情報を受信し、処理し、及び情報提供者、医療関係者及び／又は対照に伝送することができる、任意の方法を企図する。例えば、本技術のいくつかの実施形態において、対象からサンプルが入手され、及び世界の任意の場所（例えば、対象が属する国又は情報が最終的に用いられる場所とは異なる国）に位置するプロファイリングサービス（例えば、病院の臨床検査室、ゲノムプロファイリング事業など）に提出されて、生データが作成される。サンプルが組織又は他の生物学的サンプルを含む場合、サンプルを採取してプロファイリングセンターに送るために、対象が医療センターを訪れてもよく、又は対照が自身でサンプルを収集し、プロファイリングセンターに直接送ってもよい。サンプルが以前に決定された生物学的情報を含む場合、この情報は、対象によってプロファイリングサービスに直接送られてもよい（例えば、情報を含む情報カードがコンピューターによってスキャンされ、及びこのデータが、電子通信システムを用いてプロファイリングセンターのコンピューターに伝送されてもよい）。プロファイリングサービスによって受信されると、サンプルは処理され、対象に望まれる診断情報又は予後情報に特異的なプロファイルが実施される。次いで、プロファイルデータは、取り扱う臨床医による解釈に好適な様式に整えらる。例えば、生データを提供するよりもむしろ、整えられた様式が、対象についての診断又はリスク評価を詳細な治療選択肢の勧めと共に提示してもよい。このデータは、好適な方法によって臨床医に表示され得る。例えば、いくつかの実施形態において、プロファイリングサービスは、臨床医のために（例えば、治療する場所で）印刷されてもよく又はコンピューターモニター上で臨床医に表示されてもよい、報告書を作成する。いくつかの実施形態において、この情報は、まず、治療する場所又は地域施設で分析される。次いで、生データは、さらなる分析のために、及び/又は生データを臨床医又は患者に有用な情報に変換するために、中央処理施設に送られる。中央処理施設は、プライバシー（全てのデータは、均一なセキュリティプロトコルで中央施設にて保存される）、スピード及びデータ分析の均一性の利点を提供する。次いで、中央処理施設は、対象の治療後のデータの最終結果を監督することができる。例えば、電子通信システムを用いて、中央施設は、データを臨床医、対象又は研究者に提供してもよい。いくつかの実施形態において、対象は、電子通信システムを用いて、データにアクセスすることができる。対象は、結果に基づき、さらなる介入又は相談を選択することができる。いくつかの実施形態において、このデータは、研究用途に用いられる。例えば、このデータは、疾患に関連する特定の症状の有用な指針としてのマーカーの算入又は除外をさらに最適化するために、使用されてもよい。
用途
この技術は、その用途に限定されない。例えば、この技術は、分析物の存在の検出について及び／又は分析物の定量についての研究における用途を見出す。いくつかの実施形態において、この技術は、例えば、患者が疾患、疾病、及び／又は病気を有することを示す、分析物の検出において、臨床医学における用途を見出す。
種々の実施形態は、広い範囲の分析物の検出に関する。例えば、いくつかの実施形態において、この技術は、核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）の検出における用途を見出す。いくつかの実施形態において、この技術は、特定の標的配列を含む核酸の検出における用途を見出す。いくつかの実施形態において、この技術は、特定の突然変異（例えば、１ヌクレオチド多型、挿入、欠失、ミスセンス変異、ナンセンス変異、遺伝子再編成、遺伝子融合など）を含む核酸の検出における用途を見出す。いくつかの実施形態において、この技術は、ポリペプチド（例えば、タンパク質、ペプチド）の検出における用途を見出す。いくつかの実施形態において、この技術は、突然変異を含む核酸によってコードされるポリペプチド（例えば、置換、を含むポリペプチド、短縮型ポリペプチド、突然変異体又はバリアントポリペプチド）の検出における用途を見出す。
いくつかの実施形態において、この技術は、ポリペプチドに対する翻訳後修飾（例えば、リン酸化、メチル化、アセチル化、グリコシル化（例えば、Ｏ連結型グリコシル化、Ｎ連結型グリコシル化、ユビキチン化、官能基の付着（例えば、ミリストイル化、パルミトイル化、イソプレニル化、プレニル化、ファルネシル化、ゲラニル化、ゲラニルゲラニル化、グリコシルホスファチジルイノシトール化（ｇｌｙｐｉａｔｉｏｎ）、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー形成）、水酸化、ビオチン化、ペグ化、酸化、ＳＵＭＯ化、ジスルフィド架橋形成、ジスルフィド架橋切断、タンパク質分解切断、アミド化、硫酸化、ピロリドンカルボン酸形成）の検出における用途を見出す。いくつかの実施形態において、この技術は、これらの特徴の喪失、例えば、脱リン酸化、脱メチル化、脱アセチル化、脱グリコシル化、脱アミド化、脱水酸化、脱ユビキチン化などの検出における用途を見出す。いくつかの実施形態において、この技術は、ＤＮＡ又はＲＮＡに対する後成的な修飾（例えば、メチル化（例えば、ＣｐＧ部位のメチル化）、ヒドロキシメチル化）の検出における用途を見出す。いくつかの実施形態において、この技術は、これらの特徴の喪失、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡの脱メチル化などの検出における用途を見出す。いくつかの実施形態において、この技術は、クロマチン構造、ヌクレオソーム構造、ヒストン修飾などにおける変更の検出、及び核酸に対する損傷の検出における用途を見出す。いくつかの実施形態において、この技術は、脂質、炭水化物、代謝物、及び／又は低分子の検出における用途を見出す。
いくつかの実施形態において、この技術は、分子診断アッセイとして、例えば、小標本容量しか有さないサンプル（例えば、例えば郵送型（ｍａｉｌ－ｉｎ）サービスのための、血液の液滴）をアッセイするための用途を見出す。いくつかの実施形態において、この技術は、非常に低含量の分析物バイオマーカーの感度の高い検出を用いる、がん又は感染性疾患の早期検出を提供する。いくつかの実施形態において、この技術は、タンパク質バイオマーカーの後成的な修飾（例えば、翻訳後修飾）をアッセイするための分子診断における用途を見出す。
いくつかの実施形態において、この技術は、多分子複合体、例えば、多タンパク質複合体、核酸／タンパク質複合体、分子機械、オルガネラ（例えば、例えば血漿中の、無細胞ミトコンドリア）、細胞、ウイルス粒子、生物、組織、又は本明細書中で記載される技術による分析を受けることができる任意の高分子構造もしくは物体の性質決定（例えば、多分子複合体の１つ以上の構成要素の性質決定）における用途を見出す。例えば、いくつかの実施形態において、多分子複合体は、単離され、及びこの技術は、多分子複合体に関連する１つ以上の分子（分析物）の性質決定、同定、定量、及び／又は検出における用途を見出す。いくつかの実施形態において、細胞外小胞が単離され、及び本技術は、小胞に関連する１つ以上の分子（分析物）の性質決定、同定、定量、及び／又は検出における用途を見出す。いくつかの実施形態において、この技術は、小胞内に存在するタンパク質（例えば、表面タンパク質）及び／又は分析物、例えば、タンパク質、核酸、又は本明細書中で記載される他の分析物の性質決定、同定、定量、及び／又は検出における用途を見出す。いくつかの実施形態において、小胞は、分析の前に、固定され、及び透過処理される。
実施例１
本明細書中で記載される技術の実施形態の開発の間、本明細書中で記載されるインテグレーター技術の実施形態を用いて核酸における点変異を検出するための実験を行った。この実験において、１つ以上の（例えば、１、２、又は３つの）トランス－シクロオクテン（ＴＣＯ）部分を含むインテグレータープローブ及びメチルテトラジン（ｍＴｚ）を含むタリープローブを用いて、上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）をコードする核酸におけるシトシンからチミンへの点変異を検出した。この突然変異は、ＥＧＦＲタンパク質（ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ）のアミノ酸配列中の７９０位置におけるトレオニンについてのメチオニンの置換を生じる。
例示的な実験において、ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ核酸（「ＭＵＴ」）は、４１ｂｐ長であった。タリープローブは、１ヌクレオチド変異を含む、ＭＵＴの部分に相補的な１０の連続するヌクレオチドを含んでいた。タリープローブ１０－ｎｔ相補的配列の６つのヌクレオチドは、ＲＮＡヌクレオチドであり、及びタリープローブのＭＵＴ核酸への結合の場合のＲＮａｓｅ Ｈによる分解を標的する領域を提示した。野生型（ＷＴ）ＥＧＦＲ配列に相補的である１０ＤＮＡヌクレオチドを含む野生型競合プローブを、提供した。競合プローブは、野生型配列への結合についてタリープローブと競合し、タリープローブの野生型核酸との相互作用によって生じ得る非特異的シグナルを抑制した。分析物（ＭＵＴ核酸）、インテグレータープローブ、タリープローブ、及び競合プローブを、ＲＮａｓｅ Ｈと共に、ＮＥＢｕｆｆｅｒ ３．１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）中で室温にて１～３０分間にわたりインキュベートし、その後、およそ２ｍＭ メチルテトラジンによってクリック反応をクエンチした。反応物を、変性ポリアクリルアミドゲル上で泳動させ、及びＳＹＢＲゴールド染色を用いて、ゲル内の拡散を可視化した（図３）。
上で説明した通り、タリープローブを、ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍをコードする核酸と１０塩基対を形成するように設計し、及びタリープローブの野生型核酸への結合を抑制するために、競合プローブを、野生型ヌクレオチド配列と１０塩基対を形成するように設計した。したがって、この実験を、突然変異体配列ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍが存在する場合にのみ、インテグレーターＴＣＯ部分が（例えば、クリック化学反応によって）複数のコピーのタリープローブと反応するように、及び野生型配列が存在する場合には反応しないように、設計した。実験の間に収集したデータは、この予想と一致していた。図３において示されるように、インテグレータープローブ、タリープローブ、野生型競合プローブ、及びＲＮａｓｅ Ｈのインキュベーションの場合に、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動実験上に移動度の低いバンドが現れ、これが、突然変異体核酸（ＭＵＴ）を有していた。これらの移動度の低いバンドは、２～３コピーのタリープローブに結合体化したインテグレータープローブの存在を示していた。対照的に、野生型配列しか存在しない場合、多重修飾したインテグレータープローブの形跡はなかった（図３）。このことは、本明細書中で記載される技術が、分析物（例えば、１ヌクレオチドほどの小ささで相違する配列を含む核酸）を識別する能力を、実証する。
実施例２
本明細書中で提供される技術の実施形態の開発の間、分析物である、ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ突然変異をコードするＤＮＡ配列を、１つのインテグレーター分子及び一分子全反射照明蛍光（ＴＩＲＦ）顕微鏡検査を用いて検出するために、この技術を使用した実験を行った。サンプルは、ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ突然変異をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡである標的分析物を含む（図４、下）か、又は、標的分析物を有していなかった（陰性対照；図４、上）。陰性対照の、ＥＧＦＲ突然変異をコードする配列に特異的なインテグレータープローブ、タリープローブ及びＲＮａｓｅ Ｈと一緒のインキュベーション後、インテグレータープローブは、代表的に、０、１、又は２つの蛍光標識のみを含み、及び３つを超える蛍光標識を含まないことが、観察された（図４、上）。対照的に、標的分析物を含むサンプルの、インテグレータープローブ、タリープローブ及びＲＮａｓｅ Ｈと一緒のインキュベーション後、インテグレータープローブのかなりの部分が、４、５、又は６つの標識を含んでいた。このことは、混合物中の標的配列の存在を示している（図４、下）。インキュベーション後に、各インテグレータープローブに結合している標的の数は、サンプルが励起光に曝される場合に各表面結合インテグレータープローブについて観察した蛍光の落ち込みの数（例えば、光退色工程に相当する）によって推測され得る。これらの実験で使用した特定のシステムにおいて、インテグレータープローブを、ＤＮＡ配列を含む６つもの標識に結合するように構成した。及び標識を、蛍光標識したＤＮＡプローブの標識への配列特異的ハイブリダイゼーションによって検出した。さらに、これらのデータは、本明細書中で提供される技術の実施形態が、インキュベーション時間の間に、１つの分析物分子に結合している１つのインテグレーター分子を（例えば、ＴＩＲＦ顕微鏡検査を用いて）検出することを示す。図４で示す通り、多重標識したインテグレータープローブは、顕微鏡画像においてより明るい点として現れ、１つのインテグレーター分子あたりの光退色工程の数を計数することによって検出することができる。
上記の明細書において言及した全ての刊行物及び特許が、全ての目的のために、本明細書中で参考として組み込まれる。記載の組成物、方法、及び技術の使用の種々の改変及び変更は、記載される技術の精神および範囲から逸脱することなく、当業者に明らかとなるであろう。この技術は、特定の例示的実施形態に関連して説明されているが、特許請求される本発明は、このような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことが、理解されるべきである。実際に、当業者に明らかである、本発明を実施するための記載の様式の種々の改変が、以下の特許請求の範囲内であることが意図されている。

Claims (73)

  1. 分析物に安定的に結合可能であるインテグレータープローブ；及び
    標識を含み、前記分析物と直接的に又は間接的に結合可能であるタリープローブ
    を含む、サンプル中の分析物を検出するための組成物であって、ここで、前記タリープローブ及び前記インテグレータープローブの両方が前記分析物と結合しているときには、前記タリープローブ及び／又は前記インテグレータープローブが前記分析物から解離しているときよりも、前記タリープローブから前記インテグレータープローブへの前記標識の不可逆的な転移が、より迅速に及び／又はより効率的に起こる、前記組成物。
  2. 前記分析物に結合可能であるアダプタープローブをさらに含み、ここで、前記タリープローブが、前記アダプタープローブと直接的に結合することにより、前記分析物と間接的に結合する、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記タリープローブが、前記分析物に特異的であり、及び前記分析物と直接的に結合する、請求項１に記載の組成物。
  4. 前記インテグレータープローブが、前記分析物に特異的である、請求項１に記載の組成物。
  5. 前記タリープローブが、前記分析物に一時的に結合する、請求項１に記載の組成物。
  6. 前記タリープローブが、前記アダプタープローブに一時的に結合する、請求項２に記載の組成物。
  7. 前記インテグレータープローブが、１つより多くの標識に結合するように構成されている、請求項１に記載の組成物。
  8. 複数の標識を含むインテグレータープローブを含む、請求項１に記載の組成物。
  9. 分析物をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
  10. 前記インテグレータープローブが、標識を非共有結合的に結合するように構成されている、請求項１に記載の組成物。
  11. 前記インテグレータープローブが、標識を共有結合するように構成されている、請求項１に記載の組成物。
  12. 前記分析物が、核酸、タンパク質、代謝物、低分子、脂質又は糖を含む、請求項１に記載の組成物。
  13. 前記インテグレータープローブが、物質分離相を含む、請求項１に記載の組成物。
  14. 前記物質分離相が、コロイド粒子、リポソーム、ミセル、又は乳化液滴である、請求項１３に記載の組成物。
  15. 前記インテグレータープローブが、核酸又はタンパク質を含む、請求項１に記載の組成物。
  16. 前記タリープローブが、核酸又はタンパク質を含む、請求項１に記載の組成物。
  17. 前記標識が、蛍光標識又は発光標識である、請求項１に記載の組成物。
  18. 前記分析物に結合したタリープローブを、解離したタリープローブに変換する、タリープローブ開放構成要素をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
  19. 前記タリープローブ開放構成要素が、タリープローブ－分析物複合体に特異的な酵素を含む、請求項１８に記載の組成物。
  20. 前記インテグレータープローブが、第１官能基を含み、及び前記タリープローブの前記標識が、前記第１官能基と反応性である第２官能基を含む、請求項１に記載の組成物。
  21. 前記インテグレータープローブは、第１クリック反応物を含み、及び前記タリープローブの前記標識は、第２クリック反応物を含む、請求項１に記載の組成物。
  22. 分析物に安定的に結合可能であるインテグレータープローブ；及び
    標識を含み、前記分析物と直接的に又は間接的に結合可能であるタリープローブ
    を含む、サンプル中の分析物を検出するためのシステムであって、ここで、前記タリープローブ及び前記インテグレータープローブの両方が前記分析物と結合しているときには、前記タリープローブ及び／又は前記インテグレータープローブが前記分析物から解離しているときよりも、前記タリープローブから前記インテグレータープローブへの前記標識の不可逆的な転移が、より迅速に及び／又はより効率的に起こる、前記システム。
  23. 前記分析物に結合可能であるアダプタープローブをさらに含み、ここで、前記タリープローブが、前記アダプタープローブと直接的に結合することにより、前記分析物と間接的に結合する、請求項２２に記載のシステム。
  24. 前記タリープローブが、前記分析物に特異的であり、及び前記分析物と直接的に結合する、請求項２２に記載のシステム。
  25. 前記インテグレータープローブが、前記分析物に特異的である、請求項２２に記載のシステム。
  26. 前記タリープローブが、前記分析物に一時的に結合する、請求項２２に記載のシステム。
  27. 前記タリープローブが、前記アダプタープローブに一時的に結合する、請求項２３に記載のシステム。
  28. 前記インテグレータープローブが、１つより多くの標識に結合するように構成されている、請求項２２に記載のシステム。
  29. 複数の標識を含むインテグレータープローブを含む、請求項２２に記載のシステム。
  30. 分析物をさらに含む、請求項２２に記載のシステム。
  31. 前記インテグレータープローブが、標識を非共有結合的に結合するように構成されている、請求項２２に記載のシステム。
  32. 前記インテグレータープローブが、標識を共有結合するように構成されている、請求項２２に記載のシステム。
  33. 前記分析物が、核酸、タンパク質、代謝物、低分子、脂質又は糖を含む、請求項２２に記載のシステム。
  34. 前記インテグレータープローブが、物質分離相を含む、請求項２２に記載のシステム。
  35. 前記物質分離相が、コロイド粒子、リポソーム、ミセル、又は乳化液滴である、請求項３４に記載のシステム。
  36. 前記インテグレータープローブが、核酸又はタンパク質を含む、請求項２２に記載のシステム。
  37. 前記タリープローブが、核酸又はタンパク質を含む、請求項２２に記載のシステム。
  38. 前記標識が、蛍光標識又は発光標識である、請求項２２に記載のシステム。
  39. 前記分析物に結合したタリープローブを、解離したタリープローブに変換する、タリープローブ開放構成要素をさらに含む、請求項２２に記載のシステム。
  40. 前記タリープローブ開放構成要素が、タリープローブ－分析物複合体に特異的な酵素を含む、請求項３９に記載のシステム。
  41. 前記インテグレータープローブが、第１官能基を含み、及び前記タリープローブの前記標識が、前記第１官能基と反応性である第２官能基を含む、請求項２２に記載のシステム。
  42. 前記インテグレータープローブは、第１クリック反応物を含み、及び前記タリープローブの前記標識は、第２クリック反応物を含む、請求項２２に記載のシステム。
  43. 複数の標識を含むインテグレータープローブによって発生したシグナルを検出及び／又は定量するように構成されている検出構成要素をさらに含む、請求項２２に記載のシステム。
  44. 分析物を含むサンプルを提供すること；
    分析物に安定的に結合可能であるインテグレータープローブを提供すること；及び
    標識を含み、前記分析物と直接的に又は間接的に結合可能であるタリープローブを提供すること
    を含む、分析物を検出及び／又は定量する方法。
  45. 前記タリープローブ及び前記インテグレータープローブの両方が前記分析物と結合しているときには、前記タリープローブ及び／又は前記インテグレータープローブが前記分析物から解離しているときよりも、前記タリープローブから前記インテグレータープローブへの前記標識の不可逆的な転移が、より迅速に及び／又はより効率的に起こる、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記分析物に結合可能であるアダプタープローブを提供することをさらに含み、ここで、前記タリープローブが、前記アダプタープローブと直接的に結合することにより、前記分析物と間接的に結合する、請求項４４に記載の方法。
  47. 前記タリープローブが、前記分析物に特異的であり、及び前記分析物と直接的に結合する、請求項４４に記載の方法。
  48. 前記インテグレータープローブが、前記分析物に特異的である、請求項４４に記載の方法。
  49. 前記タリープローブが、前記分析物に一時的に結合する、請求項４４に記載の方法。
  50. 前記タリープローブが、前記アダプタープローブに一時的に結合する、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記インテグレータープローブが、１つより多くの標識に結合するように構成されている、請求項４４に記載の方法。
  52. 前記インテグレータープローブが、標識を非共有結合的に結合するように構成されている、請求項４４に記載の方法。
  53. 前記インテグレータープローブが、標識を共有結合するように構成されている、請求項４４に記載の方法。
  54. 前記分析物が、核酸、タンパク質、代謝物、低分子、脂質又は糖を含む、請求項４４に記載の方法。
  55. 前記インテグレータープローブが、物質分離相を含む、請求項４４に記載の方法。
  56. 前記物質分離相が、コロイド粒子、リポソーム、ミセル、又は乳化液滴である、請求項５５に記載の方法。
  57. 前記インテグレータープローブが、核酸又はタンパク質を含む、請求項５５に記載の方法。
  58. 前記タリープローブが、核酸又はタンパク質を含む、請求項４４に記載の方法。
  59. 前記標識が、蛍光標識又は発光標識である、請求項４４に記載の方法。
  60. 前記分析物に結合したタリープローブを、解離したタリープローブに変換する、タリープローブ開放構成要素を提供することをさらに含む、請求項４４に記載の方法。
  61. 前記タリープローブ開放構成要素が、タリープローブ－分析物複合体に特異的な酵素を含む、請求項６０に記載の方法。
  62. 前記インテグレータープローブが、第１官能基を含み、及び前記タリープローブの前記標識が、前記第１官能基と反応性である第２官能基を含む、請求項４４に記載の方法。
  63. 前記インテグレータープローブは、第１クリック反応物を含み、及び前記タリープローブの前記標識は、第２クリック反応物を含む、請求項４４に記載の方法。
  64. 前記分析物が、疾患についてのバイオマーカーである、請求項４４に記載の方法。
  65. 前記分析物が、がんについてのバイオマーカーである、請求項４４に記載の方法。
  66. 前記サンプルが、生物液である、請求項４４に記載の方法。
  67. 前記サンプルが、血液、尿、粘液、唾液、精液、又は組織を含み、及び／又はそれらから調製される、請求項４４に記載の方法。
  68. 前記サンプル中の分析物を検出すること及び／又は定量することが、対象が前記疾患を有することを示す、請求項４４に記載の方法。
  69. 前記サンプル中の前記分析物の存在及び／又は量を述べる結果を提供することをさらに含む、請求項４４に記載の方法。
  70. 陽性対照及び／又は陰性対照を提供することをさらに含む、請求項４４に記載の方法。
  71. 標準曲線を提供することをさらに含む、請求項４４に記載の方法。
  72. サンプル中の分析物を検出するため、及び／又は定量するための、請求項１に記載の組成物の使用。
  73. サンプル中の分析物を検出するため、及び／又は定量するための、請求項２２に記載のシステムの使用。
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