JP2012514202A - ヌクレオチドコンジュゲートを使用する免疫測定法のための方法及び装置 - Google Patents

Abstract

第１のヌクレオチドと共有結合したシグナル抗体、例えばＦＡＢ断片、及び第２のヌクレオチドとそれぞれ共有結合した１種又は複数種のシグナル成分、例えばＡＬＰなどのシグナル酵素又は蛍光染料を含み、第１のヌクレオチドが１つ又は複数の反復配列を有し、第２のヌクレオチドが前記第１のヌクレオチド上の１つ又は複数の反復配列の１つに結合しており、シグナル抗体とシグナル成分との比が、反復配列の数によって調節される、免疫測定装置及び方法において使用するための組成物。

Description

本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２００８年１２月３１日出願の米国仮出願第６１／１４２，０４８号の優先権を主張する。

本発明は、ヌクレオチドコンジュゲートを使用する、試料中の被験物の存在を決定するための様々なアッセイを実施する方法及び装置に関する。

低濃度におけるいくつかの標的被験物の検出は、一部の病気の早期診断にとって重要である。例えば、最近の調査により、典型的な市販のアッセイのレベルより低いレベルにおける心筋トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）の測定は、臨床医に価値のある情報を提供することが示唆されている。ｃＴｎＩのレベルが非常に低くても、すなわち、急性心筋梗塞を示しているとみなされるレベルより低くても、将来の有害な心血管状態を示している可能性があることに留意されたい。例えば、Ｚｅｔｈｅｌｉｕｓら、（２００６年、「冠動脈心疾患の予測因子としてのトロポニンＩ及び７０歳男性における死亡率：地域社会に基づくコホート研究（Ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｉ ａｓ ａ ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ ｏｆ Ｃｏｒｏｎａｒｙ Ｈｅａｒｔ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ｉｎ ７０−ｙｅａｒ−ｏｌｄ ｍｅｎ：Ａ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ−ｂａｓｅｄ ｃｏｈｏｒｔ ｓｔｕｄｙ）」、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１１３巻：１０７１〜１０７８頁）は、心筋ＴｎＩ濃度と将来の冠動脈心疾患の予測との相関を調べるための研究を実施した。Ｚｅｔｈｅｌｉｕｓらは、心血管疾患の臨床兆候を全く示さなかったが、わずかに高い心筋ＴｎＩを示した７０歳の男性において、やがて現れる冠動脈心疾患事象を予測できたことを観察した。さらに、Ａｐｐｌｅら（２００８年、「急性冠症候群の症状を呈する患者における心筋梗塞及び有害事象の検出のためのＣｅｎｔａｕｒ ＴｎＩ−Ｕｌｔｒａアッセイの使用（Ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｎｔａｕｒ ＴｎＩ−Ｕｌｔｒａ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ Ｉｎｆｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｄｖｅｒｓｅ Ｅｖｅｎｔｓ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ Ｗｉｔｈ Ｓｙｍｐｔｏｍｓ Ｓｕｇｇｅｓｔｉｖｅ ｏｆ Ａｃｕｔｅ Ｃｏｒｏｎａｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）」、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、５４巻（４）：７２３〜７２８頁）は、高感度トロポニンアッセイにおける研究を実施して、検出限界のｃＴｎＩ値及び９９番目のパーセンタイル基準値に基づいて短期有害事象の危険性を評価する予後値を評価した。Ａｐｐｌｅらは、「著者らのデータは、ＬｏＤ［検出レベル］が低い、改善された強力な分析能力を持つｃＴｎアッセイによって、任意の測定可能なｃＴｎＩが、アッセイのＬｏＤを下回るｃＴｎＩ濃度より高い危険性を示すという増えつつある証拠の１つとなる、」と結論付けた。

最新のポイント・オブ・ケア免疫測定技術は、様々な標的被験物の存在及び濃度を測定する能力において非常に有益であるが、ｃＴｎＩなどの非常に低レベルの標的被験物を確実に検出する能力において、いくらか制限されている。したがって、ｃＴｎＩなどの低レベルの標的被験物を確実に検出する、特に、ポイント・オブ・ケア免疫測定被験物を確実に検出する装置の必要性が存在する。

その全体が本明細書に参照により組み込まれる、米国特許第７，４１９，８２１号は、２種の捕捉抗体を電極に固定し、２種のシグナル抗体、例えばＦＡＢ（Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｂｉｎｄｉｎｇ）抗体断片を、シグナル酵素、例えばアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）を用いて標識し、シグナルコンジュゲートを形成する、サンドイッチアッセイを利用する。被験物、例えばｃＴｎＩなどの抗原は捕捉抗体及びシグナル抗体と結合し、被験物の存在を示すシグナルを提供するサンドイッチアッセイを形成する。通常、シグナル抗体はシグナル酵素と結合して、架橋技術を介してシグナルコンジュゲートを形成する。これらの合成条件は、広範囲のシグナル抗体対標識酵素の比率並びシグナルコンジュゲート当たりのシグナル酵素の数及びコンジュゲート当たりのシグナル抗体の数をもたらす。ＦＡＢ抗体断片に関して、例えば、ＦＡＢなし（０）からシグナルコンジュゲート当たりおよそ１５ＦＡＢまでを有する、シグナルコンジュゲートの統計集団がある。結果として、合成シグナルコンジュゲートは、サイズ排除クロマトグラフィーにより通常精製され、シグナルコンジュゲート当たりのシグナル抗体、例えばＦＡＢ分子の数の範囲がより狭いシグナルコンジュゲート集合を作り出す。しかし、このような精製技術は、（ｉ）シグナル抗体対シグナル酵素（例えば、ＦＡＢ対ＡＬＰ）；（ｉｉ）シグナル酵素対シグナルコンジュゲート及び（ｉｉｉ）シグナル抗体対シグナルコンジュゲートの低い予測可能性及び様々な比率を、残念ながらもたらす。これらの様々な比率は、試料中の非常に低レベルの対象被験物を確実に検出するサンドイッチアッセイの能力を制限する。

酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）に基づくアッセイは、体液及び環境試料を含む被験物、例えば試料中の抗原分子の濃度を評価するために使用され、通常、シグナル抗体とシグナル酵素とが共有結合してアッセイの検出成分を生み出す能力を必要とする。この技術の歴史及び総括は、Ｌｅｑｕｉｎ（２００５年、Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（ＥＩＡ）／Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、５１巻（１２）：２４１５〜２４１８頁）に見出すことができる。いくつかの抗原は非常に低濃度で存在するので、ＥＬＩＳＡアッセイの感度を増加させる必要性がある。

米国特許第５，１６４，３１１号は、スルフヒドリル基を抗体に加え、マレイミジル基を酵素に加えて、修飾された抗体及び酵素を作製すること、及び修飾された抗体と酵素を反応させてコンジュゲートを作製することによって作製された抗体−酵素コンジュゲートを開示する。その実施において、第３１１号特許は、「直接抗体−酵素コンジュゲートは酵素対抗体の高い比率を達成でき、したがってアビジン−ビオチン標識系に近い又はそれと同等の高い度合の感度を提供する標識系を提供することが有利であろう。このような改善された直接抗体−酵素コンジュゲートは、ビオチン−アビジン標識系が必要とするような、さらなるインキュベーションステップ及び洗浄ステップを必要としないものである。」と述べている。第‘３１１号特許は、ＳＰＤＰなどの架橋剤及び酵素−抗体コンジュゲートのためにスルフヒドリル基及びマレイミド基を架橋する能力を有する架橋分子の使用を記載しているが、合成オリゴヌクレオチドに対するこの使用に関しては述べていない。

酵素及び合成オリゴヌクレオチドに基づくコンジュゲートの合成は、サザンハイブリダイゼーションなどのＤＮＡのハイブリダイゼーション技術の分子生物学適用のために開発された（Ｒｅｙｅｓ＆Ｃｏｃｋｅｒｅｌｌ、１９９３年、「純粋オリゴヌクレオチド−アルカリホスファターゼコンジュゲートの調製（Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｕｒｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２１巻（２３）：５５３２〜５５３３頁）。これらのコンジュゲートの適用は、ＥＬＩＳＡに基づくアッセイに対するそれらの使用を予測していない。

きわめて感度が高いＤＮＡ増幅戦略、例えば、米国特許第５，６５６，４９３号及び他により取り扱われるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の開発に伴って、ＥＬＩＳＡ及びＰＣＲの組み合わせは検出感度を向上させることができることが認識されている。例えば、Ｓａｎｏら（２０００年、「イムノＰＣＲ：特定の抗体−ＤＮＡコンジュゲートを用いる高感度抗原検出（Ｉｍｍｕｎｏ−ＰＣＲ：ｖｅｒｙ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｍｅａｎｓ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ＤＮＡ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５８巻（５０７９）：１２０〜１２２頁）は、抗原検出にこの戦略を最も早く適用した一例を記載している。Ｋｏｚｌｏｖら、（２００４年、「高感度タンパク質検出を可能にする、オリゴヌクレオチドと抗体のコンジュゲーションのための有効な戦略（Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｔｏ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｅｎａｂｌｉｎｇ Ｈｉｇｈｌｙ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）」、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、７３巻：６２１〜６３０頁）を含むこの取り組みの適用に関する多くの文献があり、Ｋｏｚｌｏｖらは、合成オリゴヌクレオチド抗体コンジュゲーションの合成戦略と共に高感度検出のためのこれらの特定のコンジュゲートの適用を記載している。この取り組みは、合成オリゴヌクレオチドはその後のＤＮＡの増幅に使用されるので、高感度検出の取り組みとして使用される本発明とは異なる。

ＰＣＲなどのＤＮＡ増幅の使用は、既存のＥＬＩＳＡ系に使用される合成オリゴヌクレオチド−抗体コンジュゲートの使用ができない場合に限られており、専用の装置を必要とする温度サイクル機能の使用をさらに必要とする。Ａｄｌｅｒは、ＷＯ２００８／１２２３１０において、免疫測定法に関連するＰＣＲによる取り組みを記載している。多くの関連戦略が、Ａｄｌｅｒら（２００８年、「組み合わせによる感度：イムノＰＣＲ及び関連技術（Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｂｙ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ： ｉｍｍｕｎｏ−ＰＣＲ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）」Ａｎａｌｙｓｔ、１３３巻：７０２〜７１８頁）；及びＮｉｅｍｅｙｅｒら（２００５年、「イムノＰＣＲ：核酸増幅によるタンパク質の高感度検出（Ｉｍｍｕｎｏ−ＰＣＲ：ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２３巻（４）：２０８〜２１６頁）により検討されている。

Ｃａｎｔｏｒ及びＣｈｕｃｋ（米国特許第５，６３５，６０２号）は、アビジン／ストレプトアビジン結合を使用するビスタンパク質コンジュゲートを記載し、免疫測定法及びＰＣＲアッセイに関して教示する。例えば、一次抗体はジスルフィド結合によりＤＮＡと結合し、他方の末端において相補的ＤＮＡをビオチンで標識する。ビオチンは、ビオチン化ホースラッディシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とも結合するストレプトアビジンと結合できる。ビオチン化ホースラッディシュペルオキシダーゼは、基質と反応し、化学発光シグナルを発生できる。この開示は、多価ストレプトアビジン分子と比較して高度の調節ができないビオチン−ストレプトアビジン部分の使用を教示しないので、異なる。

Ｔｅｎｎｉｌａら、（２００８年、「ペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、抗体及びＤＮＡを有する安定且つ選択的複合体を形成する（Ｐｅｐｔｉｄｅ−ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｆｏｒｍ ｓｔａｂｌｅ ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｗｉｔｈ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ ＤＮＡ）」、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９巻（７）：１３６１〜１３６７頁）は、抗体のエピトープマッピングに使用される合成オリゴヌクレオチドとコンジュゲートした短鎖オリゴペプチドを記載している。Ｔｅｎｎｉｌａらは、ＥＬＩＳＡアッセイに関しては述べていない。

Ｋｅｔｏｍａｋｉ及びＬｏｎｎｂｅｒｇ、２００６年、（「蛍光タグ付けし、ＰＮＡをコンジュゲートした抗体のペプチドエピトープの同時結合に基づく混合相免疫測定法：ＰＮＡで被覆した微粒子の定量化（Ａ Ｍｉｘｅｄ−Ｐｈａｓｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｌｙ Ｔａｇｇｅｄ ａｎｄ ＰＮＡ−Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ Ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｏｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｎ ＰＮＡ−Ｃｏａｔｅｄ Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）」、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１７巻：１０６３〜６８巻。）は、一方のＦ（ａｂ）結合部位が蛍光タグを有するペプチドと結合し、他方のＦ（ａｂ）結合部位が核酸配列（ＰＮＡ）を有するペプチド配列と結合する完全抗体（２Ｆ（ａｂ）結合部位を有する）系を記載している。ＰＮＡは、微粒子上で相補的ＰＮＡと結合する。これらの著者は、酵素又は抗体のどちらかとの共有結合の使用を記載しておらず、むしろ抗体と、微粒子と結合した分子との非共有結合の使用を記載している。別の非共有結合方法は、シグナルを発生する抗体に関して使用される。

Ｗａｃｋｅｒら（２００４年、「ＤＮＡ指向固定化、直接スポッティング又はストレプトアビジン−ビオチン結合のいずれかにより組み立てられる抗体マイクロアレイの性能：比較研究（Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ ｆａｂｒｉｃａｔｅｄ ｂｙ ｅｉｔｈｅｒ ＤＮＡ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ， ｄｉｒｅｃｔ ｓｐｏｔｔｉｎｇ， ｏｒ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｂｉｏｔｉｎ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ： ａ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｙ）」、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３３０巻：２８１〜２８７頁）は、抗体アレイを作製するための捕捉抗体に共有結合した合成オリゴヌクレオチドの使用を記載しており、これをＷａｃｋｅｒらはＤＮＡ指向固定化（ＤＤＩ）と定義している。合成オリゴヌクレオチド−抗体コンジュゲートの別の適用は、固体支持体上への捕捉抗体の固定である（Ｊｕｎｇら、２００８年、「固体支持体上への抗体の固定方法における最新の進歩（Ｒｅｃｅｎｔ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｏｎ ｓｏｌｉｄ ｓｕｐｐｏｒｔｓ）」、Ａｎａｌｙｓｔ、１３３巻：６９７〜７０１頁）。この適用は、固体支持体への抗体の固定を教示しない点で本取り組みとは異なる。Ｌｏｖｒｉｎｏｖｉｃら、（２００２年、「発現タンパク質のライゲーションによる、タンパク質−核酸コンジュゲートの合成（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｎｕｃｌｅｉｃ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｂｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｇａｔｉｏｎ）」、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、７版：８２２〜８２３頁）は、組み換えタンパク質が、ＤＮＡ指向固定化を使用してインテイン配列を含めて設計されるタンパク質−核酸コンジュゲートを開示している。インテインは、「隣接するポリペプチド（エクステイン）の同時ライゲーションとともに、一次翻訳産物から」それ自体を削除できる、およそ１５０アミノ酸のポリペプチド配列である（Ｃｏｏｋら、１９９５年、「光化学的に開始されたタンパク質のスプライシング（Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｉｎｉｔｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｐｌｉｃｉｎｇ）」、 Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ ｉｎ Ｅｎｇｌｉｓｈ、３４巻（１５）：１６２９〜１６３０頁）。この論文において、Ｌｏｖｒｉｎｏｖｉｃは、共有結合したインテイン配列を有する組み換えタンパク質と、その後にキチン結合ドメインを含有する発現タンパク質を使用した。この多機能タンパク質ハイブリッド分子を、キチンカラムにおいてキチン結合ドメインを使用してまず精製した。合成オリゴヌクレオチド配列に共有結合した、化学的に合成されたシステインペプチドを含有するさらなる分子を精製後の反応物に加え、エステル交換によりインテイン領域の削除後組み換えタンパク質のカルボキシ末端に結合させ、その後化学的にライゲーションしたシステイン−合成オリゴヌクレオチドハイブリッドとライゲーションする。ここで、これにより、インテイン配列を含まないシステイン−合成オリゴヌクレオチドハイブリッドに共有結合した組み換えタンパク質を有する分子が作製される。次いで、この新しい分子を使用して、抗原（組み換えタンパク質）と、固体支持体に結合した相補的合成オリゴヌクレオチドとを結合でき、抗原又は組み換えタンパク質分子を用いるこの適用において、抗体が置換されるＤＤＩ技術と非常に似ている。

Ｆａｎら、２００８年（「マイクロリットル量の血液中のタンパク質を迅速に多重分析するための集積バーコードチップ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｂａｒｃｏｄｅ ｃｈｉｐｓ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ， ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｍｉｃｒｏｌｉｔｅｒ ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ ｏｆ ｂｌｏｏｄ）」、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ａｄｖａｎｃｅ Ｏｎｌｉｎｅ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ）は、このＤＤＩ技術のさらに別の変形を記載している。

Ｈｅｙｄｕｋら（２００８年、「分子はさみ：抗体ベースの同一タンパク質センサー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｉｎｃｅｒｓ： Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｂａｓｅｄ Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｎｓｏｒｓ）」、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、８０巻：５１５２〜５１５９頁）は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に基づく抗体検出技術を記載しており、この抗体検出技術において、１種の抗体分子がドナー発色団を保有する関連する第１の合成オリゴヌクレオチドを伴い、二次抗体分子は同じ抗原と、抗原の別の部位で結合し、アクセプター発色団を保有する第１の合成オリゴヌクレオチドと相補的な関連する第２の合成オリゴヌクレオチドを保有する。抗原上の非常に近接する２種の抗体は、合成オリゴヌクレオチドのハイブリダイズを可能にし、次いでドナー発色団及びアクセプター発色団を互いに非常に近接させ、結果として生じる蛍光が減少する。これが同一抗原検出の取り組みであり、捕捉抗体は用いない。

Ｎｉｅｍｅｙｅｒら（２００２年、インビボビオチニル化ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ由来の二酵素複合体のＤＮＡ指向性アセンブリ：ＦＭＮオキシドレダクターゼ及びルシフェラーゼ「（ＤＮＡ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ Ｂｉｅｎｚｙｍｉｃ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｆｒｏｍ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：ＦＭＮ Ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ ａｎｄ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）」、（ＣｈｅｍＢｉｏ Ｃｈｅｍ、０２〜０３番： ２４２〜２４５頁）は、ＤＮＡ指向性組織化を使用した空間的に規則的な多酵素複合体（ＭＥＣ）を記載しているが、ＥＬＩＳＡ及びより感度の高い免疫測定試験の開発については述べていない。

Ｓｅｅｍａｎ（１９９９年、「ＤＮＡ工学及びナノテクノロジーへのその適用（ＤＮＡ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、ＴＩＢＴＥＣＨ、１７巻：４３７〜４４３頁）はＤＮＡ足場の適用を記載しており、相補的合成オリゴヌクレオチド配列が特有の構造を生み出すために設計され得るが、ＥＬＩＳＡアッセイについては述べていない。

Ｎｉｅｍｅｙｅｒ（２０００年、「ＤＮＡに基づく自己組織化ナノ構造：ナノバイオテクノロジーの開発に向けて（Ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ＤＮＡ： ｔｏｗａｒｄｓ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｎａｎｏｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、４巻：６０９〜６１８頁）は、規則構造の足場骨格を生み出すためのＤＮＡの適用を記載しているが、ＥＬＩＳＡ及びより感度の高い他の免疫測定試験については述べていない。

Ｓｔｏｒｈｏｆｆ＆Ｍｉｒｋｉｎ（１９９９年、「ＤＮＡを用いたプログラム化材料の合成（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｗｉｔｈ ＤＮＡ）」、（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ、９９巻：１８４９〜１８６２頁）は、足場材料としてのＤＮＡの使用を記載しているが、ＥＬＩＳＡアッセイのためのその使用については述べていない。

Ｎｉｅｍｅｙｅｒら、（１９９８年、「新規なバイメタルナノ構造のための積み木としてのＤＮＡ‐ストレプトアビジン共有コンジュゲート（Ｃｏｖａｌｅｎｔ ＤＮＡ−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ａｓ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ Ｂｌｏｃｋｓ ｆｏｒ ｎｏｖｅｌ Ｂｉｏｍｅｔａｌｌｉｃ Ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ）」、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．、３７巻（１６）：２２６５〜２２６８頁）は、バイオメタル凝集体の多ストレプトアビジン凝集体に結合したビオチンストレプトアビジン免疫グロブリンを使用する、多ストレプトアビジン分子凝集体を有する構造化分子を作製するためのＤＮＡ足場の使用を記載している。

Ｔｏｍｋｉｎｓら（２００１年、「分子の足場としてＤＮＡを用いる、対称な、及び非対称なＤＮＡ−タンパク質コンジュゲートの調製（Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｙｍｍｅｔｒｉｃａｌ ａｎｄ Ｕｎｓｙｍｍｅｔｒｉｃａｌ ＤＮＡ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｗｉｔｈ ＤＮＡ ａｓ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃａｆｆｏｌｄ）」、ＣｈｅｍＢｉｏ Ｃｈｅｍ、５版：３７５〜３７８頁）は、ストレプトアビジン−ＤＮＡダンベルに関する原子間力顕微鏡法により観測された、ストレプトアビジン−ＤＮＡコンジュゲートの作製を記載している。この参考文献は、ＥＬＩＳＡ及びより感度の高い他の免疫測定試験については述べていない。

Ｔａｋｅｄａら、（２００８年、「オリゴヌクレオチドによるタンパク質のＮ末端特異的修飾を介して作成される、分割タンパク質断片−ＤＮＡの共有結合ハイブリッド（Ｃｏｖａｌｅｎｔ ｓｐｌｉｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ−ＤＮＡ ｈｙｂｒｉｄｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎｕｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）」、Ｏｒｇａｎｉｃ ａｎｄ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、６巻：２１８７〜２１９４頁）は、活性酵素分子の形成のための、分割タンパク質に結合したＤＮＡハイブリッドの使用を記載しているが、ＥＬＩＳＡ又は他の感度の高い免疫測定法については予測していない。

Ｎｉｅｍｅｙｅｒら（１９９４年、「タンパク質のオリゴヌクレオチド指向性自己集合：巨視的アレイの作製及び超分子バイオコンジュゲート構築のためのコネクタとしての、半合成ＤＮＡ−ストレプトアビジンハイブリッド分子（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ： ｓｅｍｉ−ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＤＮＡ−ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ｈｙｂｒｉｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｓ ｃｏｎｎｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｃｒｏｓｃｏｐｉｃ ａｒｒａｙｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２２巻（２５）：５５３０〜５５３９号）は、ビオチン化抗体並びにビオチン化アルカリホスファターゼ及び２つのＤＮＡ配列に結合したストレプトアビジンを使用する、抗体とＡＬＰ酵素とのハイブリッドを記載しており、この２つのタンパク質は、互いにビオチン−ストレプトアビジン結合を介して結合している。この発明は、ビオチン化抗体及びアルカリホスファターゼ分子に結合する末端ストレプトアビジン分子を使用して、ＤＮＡのハイブリダイゼーションを介して直接共に足場を組まれる２つの分子を記載している。末端結合部位はストレプトアビジンであるので、共有結合した合成オリゴヌクレオチド配列に見出されるような制御合成のレベルは得られない、例えば、多価ストレプトアビジン分子は、ビオチン化された抗体又はアルカリホスファターゼ分子のどちらとも結合できる。

Ｄｕｃｋｗｏｒｔｈら（２００７年、「タンパク質ナノ構造の作出において使用するための共有タンパク質−ＤＮＡコンジュゲートの調製のための普遍的方法（Ａ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ−ＤＮＡ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｆｏｒ ｕｓｅ ｉｎ Ｃｒｅａｔｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ）」、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４６巻：８８１９〜８８２２頁）は、緑色蛍光タンパク質を正確に結合する足場構造としてのＤＮＡ−タンパク質構造の使用を記載しているが、ＥＬＩＳＡ及び他の免疫測定技術については述べていない。

Ｎｉｅｍｅｙｅｒ（２０００年、「ＤＮＡに基づく自己組織化ナノ構造：ナノバイオテクノロジーの開発に向けて（Ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ＤＮＡ： ｔｏｗａｒｄｓ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｎａｎｏｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、４巻：６０９〜６１８頁）は、共有結合したＤＮＡを使用するタンパク質の組織化構造について記載しているが、ＥＬＩＳＡ及び他の免疫測定技術については述べていない。

Ｋａｗａｂａｔａら（２００５年、「ＤＮＡ結合抗体及びキャピラリーチップ電気泳動を使用する、アルファ胎児タンパク質の液相結合アッセイ（Ｌｉｑｕｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｓｓａｙ ｏｆ ａｌｐｈａ−Ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｕｓｉｎｇ ＤＮＡ−Ｃｏｕｐｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｃｈｉｐ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）」、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、７７巻：５５７９〜５５８２頁）は、クロマトグラフィーに基づく免疫測定法を開発し、このアッセイにおいてＫａｗａｂａｔａらは、ＤＮＡコンジュゲート抗体分子と抗原を加え、クロマトグラフィー後の分子量の増加により抗原の結合の存在を決定し、この特定のアッセイにおいて、Ｋａｗａｂａｔａらはキャピラリー電気泳動を使用した。この方法は、捕捉抗体を使用せず、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて使用されるような酵素結合コンジュゲートも使用せず、したがって本発明とは異なる。

Ｚｈａｎｇ＆Ｇｕｏ（２００７年、「蛍光免疫測定法における感度の改善のための、染料／ＤＮＡによる多重標識抗体コンジュゲート（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗｉｔｈ Ｄｙｅ／ＤＮＡ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｆｏｒ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｉｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）」、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１８巻（５）：１６６８〜１６７２頁）は、まず抗原の固体支持体への固定を必要とし、その後ビオチン化抗体を加え、次いで蛍光標識した合成オリゴヌクレオチドに結合した、ビオチン−ストレプトアビジン−ビオチン部分を使用する、免疫検出の方法を記載している。このコンセプトは本発明とは異なる。

Ｚｈｕら（２００８年、「抗体の多重標識としてＤＮＡ／染料コンジュゲートを使用する競合的蛍光免疫測定法による、エストラジオールの１兆分の１レベルの検出（Ｐａｒｔ−ｐｅｒ−ｔｒｉｌｌｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｓｔｒａｄｉｏｌ ｂｙ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｕｓｉｎｇ ＤＮＡ／ｄｙｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ａｓ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｌａｂｅｌｓ）」、Ａｎａｌｙｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ、６２４巻：１４１〜１４６頁）は、蛍光タグ付したＤＮＡを使用してシグナルを増加させた。合成オリゴヌクレオチドは、多重蛍光タグ及びストレプトアビジンに結合したビオチンを含有し、合成オリゴヌクレオチドは、次いで、ビオチン化抗体に結合する。この構築体の目的は、抗体に付随する蛍光タグの数を増加させ、次いでシグナルレベルを増加させることである。これは、少なくとも合成オリゴヌクレオチドが抗体と共有結合しているという理由で、本発明とは異なる。

Ｎｉｅｍｅｙｅｒら（２００１年「共有オリゴヌクレオチド−ストレプトアビジンコンジュゲートからなるＤＮＡ−タンパク質集合体（Ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ ＤＮＡ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ Ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｏｔｉｄｅ−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）」、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１２巻（３）：３６４〜３７１頁）は、イムノＰＣＲ反応において使用するための構造を作製するためにビオチン化抗体に結合する、ストレプトアビジン−ビオチン−ＤＮＡ−ビオチン−ストレプトアビジン−ビオチン−ＤＮＡ−ビオチン−ストレプトアビジンのマルチマーのナノ構造を作製した。これは本発明とは異なる。

Ｋｕｊｉｐｅｒｓら（１９９３年、「放射標識されたアンチセンスヌクレオチドによる、抗体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの特異的認識：癌の２段階放射免疫療法のための新規な手法（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｂｙ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ： Ａ Ｎｏｖｅｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ Ｔｗｏ−Ｓｔｅｐ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ）」、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４巻：９４〜１０２頁）は、がん患者の「プレターゲット」放射性免疫療法に使用される、ＤＮＡ抗体コンジュゲートを作製した。これは、非放射性ＤＮＡ抗体コンジュゲートの標的部位への付加、その後、非常に特異的な放射線療法を可能にする、放射標識された相補性ＤＮＡの付加を可能にした。本発明は、放射免疫測定法は取り扱わない。

第１の態様において、本発明は、標的被験物、例えば抗原を含有することが疑われる生物試料を受け入れるための試料注入口、電極を含有する導管、洗浄液を含有する領域及び廃液チャンバーを含む、免疫測定法を実施するための単回使用カートリッジを対象とする。サンドイッチアッセイは、電極上で形成される。サンドイッチアッセイは、標的被験物、例えば抗原に結合した固定化一次抗体、第１の一本鎖ヌクレオチドと結合した、標的被験物、例えば抗原に対する二次抗体、及び第１の一本鎖ヌクレオチドと相補的な塩基対を有する第２の一本鎖ヌクレオチドとそれぞれ結合した１種又は複数種のシグナル成分（例えば、シグナル酵素又は蛍光染料）を含む。洗浄液は、導管の中の電極から廃液チャンバーへと生物試料を洗浄することができる。シグナル成分がシグナル酵素である実施形態において、カートリッジは、シグナル酵素と反応して、生物試料中の標的抗原の量に比例して電極においてシグナルを発生させることができる酵素基質を含有する領域をさらに含む。

本発明の第２の態様において、第１のヌクレオチドと共有結合したＦＡＢ断片、及び第２のヌクレオチドとそれぞれ共有結合した１種又は複数種のシグナル成分（例えばシグナル酵素又は蛍光染料）を含み、前記第１のヌクレオチドが１つ又は複数の反復配列を有し、第２のヌクレオチドが前記第１のヌクレオチド上の１つ又は複数の反復配列の１つに結合しており、ＦＡＢ断片とシグナル成分との比が反復配列の数によって調節される、免疫測定法において使用するための組成物が提供される。

本発明の第３の態様において、被験物が固定化された一次抗体及び二次抗体と結合するように生物試料を接触させて、免疫測定法を形成するステップであって、二次抗体が合成ヌクレオチド架橋を介して少なくとも１種のシグナル酵素と結合する上記ステップ、前記コンジュゲートから前記生物試料を洗浄するステップ、及びシグナル酵素との反応により発生したシグナルに基づいて被験物の存在を決定するステップを含む、生物試料中の被験物の存在を決定する方法を提供する。

第４の態様において、（ａ）患者由来の試料を、ｃＴｎＩ上の第１のエピトープと結合することができる一次抗体が結合された表面に適用するステップ、（ｂ）ｃＴｎＩ上の第２のエピトープと結合することができる二次抗体を加えるステップであって、この二次抗体が、シグナル成分（例えば、シグナル酵素又は染料）と結合した１つ又は複数の第２の鎖ポリヌクレオチドと結合した第１の鎖ポリヌクレオチド配列をさらに含む上記ステップ、及び（ｃ）少なくとも二次抗体の結合の程度を決定するステップを含む、患者が心筋梗塞を患っている可能性があるかどうかを決定する方法を提供する。

本発明の前述及び他の目的及び有利性は、本発明の限定されない好ましい実施形態の添付図面と関連して作成された、以下の説明からより十分に現れると思われ、同様の文字は、図面を通して同じ又は類似の部分を指す。

対象となる被験物を検出するための、標準的サンドイッチアッセイを表す図である。 対象となる被験物を検出するための、標準的ＤＮＡ指向性固定化を表す図である。 対象となる被験物を検出するための、標準的ＤＮＡ指向性固定化を表す図である。 ビーズに固定された核酸を有する、標準的検出アッセイを表す図である。 本発明の実施形態に従って、ＤＮＡコンジュゲートを使用する、被験物の電気化学的検出を表す図である。 本発明の実施形態に従って、コンジュゲートとして複数の酵素種と組み合わせたポリマーＤＮＡ足場を使用する、被験物の電気化学的検出を表す図である。 本発明の実施形態に従って、検出抗体及びシグナル酵素と結合したＤＮＡを使用する、被験物の電気化学的検出を表す図である。 本発明の実施形態に従って、ＤＮＡを使用して共有結合した抗体種を表す図である。 本発明の実施形態に従って、ＤＮＡを使用して酵素と結合した、共有結合した抗体種を表す図である。 本発明の実施形態に従って、ＤＮＡを使用して、個々の種に結合したＤＮＡ足場を有する共有結合した抗体種を表す図である。 本発明の実施形態に従って、酵素コンジュゲート集合を表す図である。 本発明の実施形態に従って、コンジュゲートとして、様々な酵素種と組み合わせたポリマーＤＮＡ足場を使用する、被験物の電気化学的検出を表す図である。 本発明の実施形態に従って、コンジュゲートとして様々な酵素種と組み合わせたポリマーＤＮＡ足場を使用する、被験物の電気化学的検出を表す図である。 本発明の実施形態に従って、多重抗原検出アッセイを表す図である。 本発明の実施形態に従って、抗原結合に依存する、ハイブリダイゼーション種の作製を表す図である。 本発明の実施形態に従って、抗原結合に依存する、ハイブリダイゼーション種の作製を表す図である。 本発明の実施形態に従って、抗原結合に依存する、ハイブリダイゼーション種の作製を表す図である。 本発明の実施形態に従って、抗原結合に依存する、ハイブリダイゼーション種の作製を表す図である。 核酸鎖置換ステップによるシグナル増幅に基づく抗原の分析的検出を表す図である。 イムノセンサーカートリッジのカバーの等角上面図である。 イムノセンサーカートリッジのカバーの等角底面図である。 イムノセンサーカートリッジのためのテープガスケットのレイアウトの上面図である。 イムノセンサーカートリッジのベースの等角上面図である。 イムノセンサーカートリッジのレイアウトの略図である。 乾燥試薬により流体を修正する部位を含む、イムノセンサーカートリッジ内部の流体路及び空気路の略図である。 本発明の実施形態に従うサイズ排除カラムからの蛍光画分の図である。 ＡＬＰ ＬＣ−ＳＰＤＰ反応からのＳ３００カラムの画分の図である。 ＤＴＴ処理合成オリゴヌクレオチドと反応したＡＬＰ ＬＣ−ＳＰＤＰからのＳ３００カラムの画分の図である。 ＷｉｎＩＳＤソフトウェアを使用して、ｉ−ＳＴＡＴ「イムノ」カートリッジを含有する「Ａ」において試験した、ＡＬＰ−Ａ’コンジュゲートの３つの希釈液（１０−１（３７．３ｎｇ）、１０−２（３．７３ｎｇ）、１０−３（０．３７ｎｇ）の時間電流測定プロットである。 ＬＣ−ＳＰＤＰと反応したＰＥＰ−３Ｆ（ａｂ’）２からのＳ３００カラムの画分の図である。 ＤＴＴ処理したＡ合成オリゴヌクレオチドと反応したＰＥＰ−３Ｆ（ａｂ’）２ ＬＣ−ＳＰＤＰからのＳ３００カラムの画分の図である。 遊離の抗体又はコンジュゲートを使用した試料に添加することによる被験物の競合を使用する、ｃＴｎＩカートリッジの生産バージョンの時間電流測定プロットである。［１］ＭＷＣ９２３５３を２．５９ｎｇ／ｍｌに希釈し、２μＬ［５．２ｐｇ］を使用。［２］被験物に４９．２ｎｇのＰＥＰ−３Ｆ（ａｂ）を添加、［３］被験物に６１．８ｎｇのＰＥＰ−４Ｆ（ａｂ）を添加、［４］被験物に１０９ｎｇのＥ００３１コンジュゲートを添加。 ［２］抗原とともに、及び［１］ＭＷＣ抗原なしで、Ｅ００３０［７４７ｎｇ］＝Ｅ００３１［２１８ｎｇ］を加えた、ｃＴｎＩ捕捉ビーズを含みコンジュゲートを含まないｉ−ＳＴＡＴイムノカートリッジの時間電流測定結果を示す図である。 推定されるクローンの制限消化の図である。

様々な実施形態において、本発明は、相補的ヌクレオチド配列の装飾された鎖を使用することによる、実質的に狭い及び／又は調節可能な比率又は化学量を有するシグナルコンジュゲートの作製及び使用のための装置及び方法を対象とする。シグナル抗体は、好ましくはＤＮＡの相補鎖を有するシグナル成分と結合することが好ましい。本明細書において「シグナルコンジュゲート」という用語は、１種又は複数種のシグナル成分と結合した、１種又は複数種のシグナル抗体を指す。「シグナル成分」は、シグナル抗体を介して被験物と結合した場合、被験物、例えば抗原の存在を示すことができる成分を意味する。シグナル成分の例は、例えばアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）などのシグナル酵素及び蛍光染料を含む。好ましい実施形態において、シグナルコンジュゲートは、１つ又は複数のＡＬＰ分子と結合した、１つ又は複数の（好ましくは１対の）抗原結合断片（ＦＡＢ）抗体の断片を含む。本標識方法は、シグナル抗体、例えばＦＡＢ断片対シグナル成分、例えばＡＬＰなどのシグナル酵素又は蛍光染料、対シグナルコンジュゲート当たりのシグナル抗体の数及び対シグナルコンジュゲート当たりのシグナル成分の数の比にわたって高度の調節をもたらす。

伝統的なサンドイッチアッセイは、普通、個々のＦＡＢに対する０〜１５ＡＬＰのシグナル抗体対シグナル成分（例えばＦＡＢ対ＡＬＰ）の比及びシグナルコンジュゲート当たりのシグナル抗体及びシグナル成分のそれぞれの数は可変である。これらの可変比により、生物試料中の低レベルの被験物に対してより感度の高いと思われる予測可能なシグナルを得ることは難しい。

一実施形態において、シグナル成分、例えばＡＬＰなどのシグナル酵素又は蛍光染料のシグナルコンジュゲート当たりの平均数は、約１から約１００まで、例えば１から約５まで、例えば約５から約１０まで、又は約１０から約１００までに及び、大型の凝集体と比較して高い拡散係数を保有している。好ましくは、これらの範囲は、シグナルコンジュゲートを分離するステップなしに、例えばサイズ排除クロマトグラフィーを介して達成可能であり、所望のシグナルコンジュゲート当たりのシグナル成分数を有するシグナルコンジュゲートに到達する。さらに、このようなシグナルコンジュゲート、例えばＦＡＢ−ＡＬＰコンジュゲートは、ＡＬＰ対ＦＡＢの比が調節可能であるためにオペレーターが高度に予測可能な結果を得ることができる免疫測定法において、有用であり得る。予測可能な結果によって、免疫測定法の感度の改善をもたらすことができ、したがってｃＴｎＩなどの低レベルの標的被験物の信頼できる検出をもたらすことができる。

シグナルコンジュゲートは、シグナル成分対シグナルコンジュゲートの比の分布が狭いことがさらに好ましく、このことは検出装置及び検出方法の精度の改善をもたらす。例えば、様々な実施形態において、この検出装置又は検出方法において形成された、又は使用されたシグナルコンジュゲートの少なくとも５０ｗｔ．％、例えば少なくとも７０ｗｔ．％、少なくとも９０ｗｔ．％又は少なくとも９５ｗｔ．％は、シグナルコンジュゲート当たり５から１０のシグナル成分を有する。別の実施形態において、この検出装置又は検出方法において形成された、又は使用されたシグナルコンジュゲートの少なくとも５０ｗｔ．％、例えば少なくとも７０ｗｔ．％、少なくとも９０ｗｔ．％又は少なくとも９５ｗｔ．％は、シグナルコンジュゲート当たり１から５のシグナル成分を有する。さらに別の実施形態において、この検出装置又は検出方法において形成された、又は使用されたシグナルコンジュゲートの少なくとも５０ｗｔ．％、例えば少なくとも７０ｗｔ．％、少なくとも９０ｗｔ．％又は少なくとも９５ｗｔ．％は、シグナルコンジュゲート当たり１０から１００のシグナル成分を有する。

さらに、縮小Ｆ（ａｂ）’２シグナルコンジュゲートは、シグナルコンジュゲートにつき単一のシグナル抗体を含有することが好ましい。しかし、シグナルコンジュゲートを形成する従来の技術は、シグナルコンジュゲート当たりのシグナル抗体の数（例えば０〜４又はそれより多く）の分布が広いシグナルコンジュゲートの形成をもたらし得る。本発明の方法及び装置に従った、シグナルコンジュゲート当たりのシグナル抗体の平均数、例えば、縮小Ｆ（ａｂ）’２断片の平均数は、図５に例示するように、１から４までの範囲が好ましく、好ましくは２である。好ましくは、これらの範囲は、シグナルコンジュゲートを分離するステップなしに、例えばサイズ排除クロマトグラフィーを介して達成可能であり、所望のシグナルコンジュゲート当たりのシグナル成分数を有するシグナルコンジュゲートに到達する。

シグナルコンジュゲートは、シグナル抗体対シグナルコンジュゲートの比の分布が狭いことがさらに好ましく、このことは検出装置及び検出方法の精度の改善を提供する。例えば、様々な実施形態において、この検出装置又は検出方法において形成された、又は使用されたシグナルコンジュゲートの少なくとも５０ｗｔ．％、例えば少なくとも７０ｗｔ．％、少なくとも９０ｗｔ．％又は少なくとも９５ｗｔ．％は、シグナルコンジュゲート当たり１から４のシグナル抗体を有する。好ましい実施形態において、この検出装置又は検出方法において形成された、又は使用されたシグナルコンジュゲートの少なくとも５０ｗｔ．％、例えば少なくとも７０ｗｔ．％、少なくとも９０ｗｔ．％又は少なくとも９５ｗｔ．％は、シグナルコンジュゲート当たり２つのシグナル抗体を有する。

本発明の様々な実施形態に従って、シグナルコンジュゲートは、シグナルコンジュゲートの集団中で、シグナル成分対シグナル抗体の全体の比において高度の調節可能性を有することがさらに好ましい。いくつかの例示的実施形態において、シグナル成分、例えばＡＬＰ又は蛍光染料などのシグナル酵素の、シグナル抗体、例えばＦＡＢ断片に対する比の平均数は、個別に、及びシグナルコンジュゲートの全体集団において、０．５から１００まで、例えば０．５から５まで、例えば５から１０まで、又は１０から１００までに及ぶ。この場合も同様に、好ましくは、これらの範囲は、シグナルコンジュゲートを分離するステップなしに、例えばサイズ排除クロマトグラフィーを介して達成可能であり、所望のシグナル成分対シグナル抗体の比を有するシグナルコンジュゲートに到達する。

シグナルコンジュゲートは、シグナルコンジュゲート当たりのシグナル成分対シグナル抗体の数の比の分布が狭いことがさらに好ましく、このことは検出装置及び検出方法の精度の改善をもたらす。例えば、様々な実施形態において、この検出装置又は検出方法において形成された、又は使用されたシグナルコンジュゲートの少なくとも５０ｗｔ．％、例えば少なくとも７０ｗｔ．％、少なくとも９０ｗｔ．％又は少なくとも９５ｗｔ．％は、１から５までの範囲のシグナル成分対シグナル抗体の数の比を有する。好ましい実施形態において、この検出装置又は検出方法において形成された、又は使用されたシグナルコンジュゲートの少なくとも５０ｗｔ．％、例えば少なくとも７０ｗｔ．％、少なくとも９０ｗｔ．％又は少なくとも９５ｗｔ．％は、５から１０までの範囲のシグナル成分対シグナル抗体の数の比を有する。別の実施形態において、この検出装置又は検出方法において形成された、又は使用されたシグナルコンジュゲートの少なくとも５０ｗｔ．％、例えば少なくとも７０ｗｔ．％、少なくとも９０ｗｔ．％又は少なくとも９５ｗｔ．％は、１０から１００までの範囲のシグナル成分対シグナル抗体の数の比を有する。

シグナルコンジュゲートの拡散係数は、検出装置中でシグナルコンジュゲートの効率的な輸送を提供するために十分低いことが好ましい。拡散係数が低いほど、サンドイッチ免疫測定法の形成に必要な時間を減少させる。免疫測定法の形成時間の減少は、感度も増加させながら、リアルタイムで試験の効率を改善する。いくつかの例示的実施形態において、シグナルコンジュゲートの拡散係数は、約１×１０^−８から約１×１０^−６ｃｍ^２／秒に及ぶ（Ｂｒｕｎｅ＆Ｋｉｍ、１９９３年、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、９０巻：３８３５〜３８３９頁）。

検出される標的被験物は変化に富む場合がある。いくつかの例示的実施形態において、被験物は、ＴｎＩ、ＴｎＴ、ＴｎＣ、ＣＫ−Ｍ、ＣＫ−Ｂ、ＣＫ−ＭＢ、ミオグロビン、ＴＳＨ、ＦＳＨ、ＣＲＰ、ＢＮＰ、ｐｒｏ−ＢＮＰ、ＰＳＡ、ＰＣＡ、アポリポタンパク質及びそれらの組み合わせから選択される。標的被験物は抗原であってよい。本発明は、標的被験物としてｃＴｎＩに関して記載されるが、本発明の実施形態はｃＴｎＩの検出に限定されるものではなく、当業者には明らかであるように、本発明は他の被験物の検出にも同様に用いることができる。本発明の実施形態は、血液試料を含む生物試料中の心筋トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）を測定するための、センサー装置の改善及び感度が増加した方法に全般に関する。

ｃＴｎＩは、活動性の心筋梗塞（ＭＩ）後すぐに血清中で検出可能であり、ＭＩの発症後２〜３日より長く存在し続ける、正確な心臓特異的生物学的パラメーターとして使用される。トロポニンは、３つのサブユニット：トロポミオシン結合サブユニットであるトロポニンＴ（「ＴｎＴ」）、Ｃａ^２＋結合サブユニットであるトロポニンＣ（「ＴｎＣ」）及びアクトミオシンＭｇ^２＋ ＡＴＰａｓｅを阻害するサブユニットであるトロポニンＩ（「ＴｎＩ」）の複合体として心臓組織に存在する。ＴｎＩは、細フィラメントの調節タンパク質複合体であり、心筋及び横紋筋にカルシウム感受性をもたらす。心筋ＴｎＩは、存在する唯一のイソ型である心筋中に特有に局在する。心筋ＴｎＩは、ＭＩ後迅速に（およそ４から６時間以内）ヒト血清中に出現する。１８〜２４時間後にピークレベルに達し、６〜１０日まで血流中でレベルが上昇したままである。結果として、心筋から循環に放出されたｃＴｎＩは、心臓の損傷に非常に特異的である。一実施形態において、本発明のセンサー及び装置は、より高いレベルの感度を必要とする、非常に低レベルのｃＴｎＩの検出において有用である。上述のように、非常に低レベルのｃＴｎＩであっても、すなわち、急性心筋梗塞を示していると思われるレベルより低くても、将来の有害な心血管状態を示している可能性がある。いくつかの例示的実施形態において、本発明は１０ｐｇ／ｍＬ未満の量のｃＴｎＩ、例えば、１ｐｇ／ｍＬ未満又は０．１ｐｇ／ｍＬ未満を検出できる装置及び方法を提供し、その結果、心筋梗塞を予測する能力を提供する。

抗原及び／又は被験物（Ａｎ）１０１は、米国特許公開第２００４／００１８５７７号に記載のように、図１に示すようなサンドイッチアッセイ１００に基づくシステム及び処理によって従来から検出されており、米国特許公開第２００４／００１８５７７号の全体は、参照により本明細書に組み込まれる。本出願の目的のために、抗原及び／又は被験物１０１は、トロポニンｃＴｎＩを全般にさすが、他の型の抗原及び／又は被験物もアッセイによって検出できる。共有結合した捕捉抗体（Ａｂ１）１０４を有するカルボキシ誘導体化ポリスチレンビーズ１０３又は抗体若しくはそれらの結合断片を含む捕捉ビーズ１０２は、通常金又はプラチナで作られた金属電極１０５の上に位置する。分析アッセイの間に、血液などの被験試料中に見出される抗原１０１は捕捉抗体１０４に結合される。検出抗体（Ａｂ２）１０６、抗体又はそれらの結合断片は、シグナル発生酵素（ＥＮＺ）１０７、例えばアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）とコンジュゲートされる。従来のシグナル成分に関して、架橋剤、例えばスクシンイミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチル］−シクロヘキサン−１−カルボキシ［６−アミド−カプロエート］、グルタルアルデヒド、アジピン酸ジヒドラジド、ビス−ジアゾ化ベンチジン、１，４−ブタンジグリシジルエーテル、ビス−マレイミドヘキサン、スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート又はＮ−ヒドロキシスクシンイミジル４−アジドサリチル酸は、ＥＮＺを用いてＡｂ２を標識するために使用できる。市販の免疫測定製品及びそれらが基づく技術に関するさらなる情報に関しては、参照により本明細書に組み込まれる、Ｗｉｌｄ（編）、Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ Ｎ．Ｙ．、１９９４年を参照されたい。検出抗体１０６及び酵素１０７は、共有結合しており、検出抗体コンジュゲート１０８を形成する。コンジュゲートの集団１０８は、上で参照した米国特許第７，４１９，８２１号に記載の酵素１０７により発生された起電性種が、金属電極１０５に近接し、次いで発生されるべき電気化学シグナルを発生可能にする。Ａｎは、エピトープ（ｅ１及びｅ２）を介してそれぞれＡｂ１及びＡｂ２に結合する。

ＤＮＡ指向性固定化（ＤＮＡ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ：ＤＤＩ）は、抗原１０１の別の従来の検出系であり、図２に表される。共有結合した核酸１１１を有するカルボキシ誘導体化ポリスチレンビーズ１０３を含む捕捉ビーズ１０２は、通常金又はプラチナで作られた金属電極１０５の上に位置する。捕捉抗体１０４（単数又は複数）又はそれらの結合断片は、核酸１１０と共有結合している。１１０及び１１１で表される核酸は、ハイブリダイズされた二本鎖ＤＮＡの安定な領域を生み出す相補的な領域を有する。タンパク質及び核酸の共有結合が、５’若しくは３’末端において、又は１つ若しくは複数の塩基の修飾を介して起こりうることは、当業者に理解されるであろう。ＤＤＩを使用する分析アッセイ中、検出は、図１に記載の処理と同様である。検出コンジュゲート１０８の検出抗体１０６は、抗原１０１と結合し、酵素１０７は、電極１０５により検出されるシグナルを発生する。

別の従来の検出系は、図３に表されているＤＮＡ指向性固定化により示される。共有結合した核酸１１１を有するカルボキシ誘導体化ポリスチレンビーズ１０３を含む捕捉ビーズ１０２は、通常金又はプラチナで作られた金属電極１０５の上に位置する。核酸配列１１２は、捕捉ビーズ１０３と結合した核酸１１１とハイブリダイゼーションすることができる領域１１０’、図１を参照して上記で説明された抗体サンドイッチ構造１００と結合した相補的核酸配列１１４とハイブリダイゼーションする配列１１３、及び任意選択のスペーサー配列１１５を有することが特徴である。図３に示すように、複数配列１１３’、相補的核酸配列１１４’とハイブリダイズする１１３”、複数のサンドイッチ構造と結合するための１１４”が存在し得る。さらなるスペーサー配列１１５’は核酸１１２の個々の配列１１３を分離し得る。３つのサンドイッチ構造１００を図３に示すが、他のＤＮＡ指向性固定化において、核酸配列１１２を介して結合した、より多くのサンドイッチ構造１００が存在し得る。捕捉抗体１０４は、核酸配列１１４と共有結合している。上記のように、抗原１０１は捕捉抗体１０４により捕捉され、酵素１０７を有する検出抗体１０６は捕捉抗原１０１と結合する。

従来の検出アッセイの１つの派生物を図４に示す。核酸１１６は電極１０５上のビーズ１０３と共有結合している。捕捉抗体１０４は、核酸１１６と共有結合しており、この捕捉種にさらなる可撓性をもたらす。抗原１０１は、上記のように検出抗体１０６及び酵素１０７により検出される。

本発明の一実施形態において、分析スキームは、低濃度の免疫活性被験物、例えばｃＴｎＩの検出のために提供される。この分析スキームは、１つ又は複数のシグナル抗体（好ましくは１対のシグナル抗体）が、ＤＮＡ架橋を介して１つ又は複数のシグナル成分と結合する、シグナルコンジュゲートの形成によるものである。シグナルコンジュゲート中のシグナル抗体は被験物と結合し、これが次いで捕捉抗体と結合して「サンドイッチ」複合体を形成する。用いるシグナル成分に依存して、試料中の被験物の濃度は、比例するシグナルに変換され得る。例えば、シグナル成分がＡＬＰなどのシグナル酵素を含む場合は、試料中の被験物の濃度は、比例するシグナル酵素の表面濃度に変換され得る。酵素は、基質を検出可能な生成物に変換することによって、被験物の化学的シグナルを増幅することができる。例えば、ＡＬＰが酵素の場合、単一酵素分子は、１分間で約９０００の検出可能分子を生成することができ、電気活性種が、アルカリホスファターゼの代わりに抗体に結合するスキームと比較して、被験物の検出能において数桁の改善をもたらす。

低レベルの被験物２０１、例えばｃＴｎＩを検出するために、図５及び６に示すような新規な捕捉抗体方法を用いてもよい。示すように、共有結合した捕捉抗体２０４を有するカルボキシ誘導体化ポリスチレンビーズ２０３を含む捕捉ビーズ２０２は、金属電極２０５の上に位置する。「捕捉抗体」２０２又は「捕捉試薬」は、対象の被験物２０１のエピトープと特異的に結合する抗体を意味し、捕捉抗体２０４は、対象の被験物２０１と（ｉ）結合前、（ｉｉ）結合後、又は（ｉｉｉ）結合中にビーズ２０３に固定される。ビーズ２０３に固定されていない検出抗体又はシグナル抗体２０６は、生物試料中に存在するのであれば、対象の被験物２０１のさらなるエピトープと結合する。初めに、シグナル抗体２０６は、装置の導管内（例えば、試料が装置に導入される下流であるが、固定された捕捉抗体の上流）で、試料が可溶化剤に接触するとき、シグナル抗体２０６が試料に可溶化されるように、可溶化剤、例えば糖マトリックス中に配置できる。本発明に使用する抗体２０４、２０６は、完全長抗体、一本鎖抗体又はＦＡＢ断片などの抗体断片を含むことができる。当業者は、対象被験物２０１のエピトープと特異的に結合できる任意の結合メンバーを使用することによって、本明細書に記載の発明が対象被験物２０１を検出できることを認識するであろう。結合メンバーは、限定するものではないが、細胞外又は細胞内の受容体、ポリヌクレオチド、ペプチド核酸及びそれらの誘導体を含む。

第１の一本鎖ヌクレオチド２１０は、シグナル抗体２０６に共有結合している。シグナル成分２０７、例えば蛍光染料のシグナル酵素は、第１の一本鎖ヌクレオチド２１０と相補的である第２の一本鎖ヌクレオチド２１１と共有結合している。第１の一本鎖ヌクレオチド２１０及び第２の一本鎖ヌクレオチド２１１は合成ヌクレオチドであり、５’末端、３’末端又はヌクレオチド配列内部にカップリング部分を含有することができる。カップリング部分は、アミノ修飾因子、チオール修飾因子及びジチオールからなる群から選択される修飾ホスホラミダイトから作製され得る。合成オリゴヌクレオチドの３’末端又は５’末端は、保護化学基、例えばホスホロチオエート（又はＳ−オリゴ）を組み込むことによって、試料中の内因性エキソヌクレアーゼ活性から保護される。抗体２０６、酵素２０７、第１の一本鎖ヌクレオチド２１０及び第２の一本鎖ヌクレオチド２１１は、検出抗体コンジュゲート２０８を含む。

シグナル成分がシグナル酵素である実施形態において、シグナル酵素は、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、グルコースオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、ウレアーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ及びベータガラクトシダーゼからなる群から選択されることが好ましい。好ましい実施形態において、ＡＬＰはシグナル酵素である。

様々な代替の実施形態において、１種又は複数種のシグナル成分は、１種又は複数種の非酵素的検出部分を含む。非酵素的検出部分の例は、蛍光、色及び放射性の成分、種又は染料を含み、これらの具体例は６−ＦＡＭ（６−カルボキシフルオロセイン）、放射能又は量子ドットを含む。

一実施形態において、第１及び第２の鎖ヌクレオチドは、１８〜１０，０００塩基の残基を有する合成オリゴヌクレオチドである。好ましい一実施形態において、個々の配列はスペーサー、例えば反復塩基残基を有し、シグナルコンジュゲート、例えばＦＡＢ−ＡＬＰコンジュゲートを形成することができる。図５に示すように、第１及び第２の鎖ヌクレオチドはハイブリダイズして、シグナル抗体と、シグナル成分、例えばＡＬＰとの間に架橋を形成する。

一実施形態において、図６に示すように、反復する第１の鎖ヌクレオチド２１０、２１０’の一部は複数の第２の鎖ヌクレオチド２１１、２１１’と結合して、ＤＮＡ足場又はマルチマー構造２１２を形成する。第１の鎖ヌクレオチド２１０、２１０’の各部分は、反復配列であってもよい。第２の鎖ヌクレオチド２１１、２１１’は、第１の鎖ヌクレオチド２１０、２１０’の利用可能部分と結合する。例えば、ＦＡＢ：ＡＬＰコンジュゲートの場合、１：５（ＦＡＢ：ＡＬＰ）の比は、ＡＬＰ２０７、２０７’にそれぞれ結合した５つの第２の配列２１１、２１１’と結合する５つの反復配列を有する、第１の鎖ヌクレオチド２１０、２１０’によって達成され得る。一実施形態において、第１のヌクレオチド２１０は、少なくとも３つの１種又は複数種のシグナル酵素２０７の、少なくとも３つの第２の配列２１１と結合する、少なくとも３つの反復配列を有する。一実施形態において、第１のヌクレオチド２１０は、少なくとも３つの１種又は複数種のシグナル酵素２０７の、少なくとも５つの第２の配列２１１と結合する、少なくとも５つの反復配列を有する。一実施形態において、異なるシグナル成分２０７、例えばシグナル酵素又は蛍光染料と結合するための、第１の鎖ヌクレオチド２１０の少なくとも２つの異なる部分が存在する。

場合により、１つ又は複数のスペーサー配列（図示せず）が、第１の鎖ヌクレオチド２１０、２１０’及び／又は第２の鎖ヌクレオチド２１１、２１１’を分離し得る。第２の鎖ヌクレオチド２１１、２１１’は、酵素２０７に結合するスペーサー配列２１３、２１３’もまた有し得る。

一実施形態において、図６のＤＮＡ足場２１２は、検出抗体２０６が抗原２０１に結合した場合、酵素２０７、２０７’により発生されたシグナルを増幅できる。

図７は、検出抗体２０６が核酸配列２１４と共有結合しており、核酸配列２１４が他の末端において酵素２０７とさらに共有結合している本発明の実施形態を表す。これにより、この構造の柔軟性を増加させる。

図８は、抗体３００の詳細な表示である。抗体３００は、本出願の全体で記載している検出抗体又は捕捉抗体であってよい。抗体３００は、２種の抗体種３０１及び３０２を含む。２種の抗体種３０１、３０２はそれぞれ、長鎖又は断片３０３、３０４及び軽鎖３０５、３０６を含む。抗体種３０１は、核酸配列３０９と共有結合している。抗体種３０２は、核酸配列３１０と共有結合している。核酸配列３０９及び３１０は、ハイブリダイズ可能な結合領域を有する。一実施形態において、抗体種は異なり、ハイブリダイゼーション事象を介して１つにつながる。抗体種３０１及び３０２は、同じエピトープ、同じ抗原上の異なるエピトープ又は異なる抗原を認識できる。

図９は、酵素３０７を有するコンジュゲート３０８を含む抗体３００の別の詳細な表示である。種３０２の長鎖３０４は核酸配列３１３と共有結合している。酵素３０７は、核酸配列３１４と共有結合している。核酸配列３１３及び核酸配列３１４は、ハイブリダイズ可能な結合領域を有する。当業者には、核酸配列がいずれかの種の長鎖と共有結合できることは理解されるであろう。さらに、図９に示した抗体種の両方が、それらと共有結合した異なる配列又は同じ配列を有することができる。この配列が異なる場合、機能性を伴う異なる相補的配列、例えば異なる酵素コンジュゲートを使用できる。

一実施形態において、図１０に示すように、第１の鎖ヌクレオチド３１３の一部は複数の第２の鎖ヌクレオチド３１４、３１５、３１５’と結合して、ＤＮＡ足場又はマルチマー構造３１２を形成する。各抗体種３０１、３０２は、それぞれＤＮＡ足場３１２、３２２と結合している。ＤＮＡ足場３１２は、核酸３１６、３１６’とハイブリダイズ可能な結合領域をそれぞれ有する反復核酸３１５、３１５’を含む。核酸３１６、３１６’は、スペーサー配列３１７、３１７’を使用して酵素３０７、３０７’と結合している。同様に、ＤＮＡ足場３２２は、核酸３２４、３２４’とハイブリダイズ可能な結合領域をそれぞれ有する反復する核酸３２３、３２３’を含む。核酸３２４、３２４’は、スペーサー配列３２５、３２５’を使用して酵素３１８、３１８と結合している。ＤＮＡ足場３２２は、種３０１と共有結合している核酸３１９とハイブリダイズする結合領域を有する核酸３２０をさらに含む。いくつかの実施形態において、核酸と酵素との間にスペーサーは使用されない。他の実施形態において、それぞれの足場３１２及び３２２において反復する核酸の間にさらなるスペーサーが提供される。

図１１は、本発明の一実施形態に従う酵素コンジュゲート集合４００を表す。酵素コンジュゲート集合４００は、４種の抗体４０１、４０２、４０３及び４０４並びに２種の酵素４０５及び４０６を含む。酵素４０５は、それに結合する核酸４０７を有する。酵素４０６は、それに結合する核酸４０８を有する。抗体４０１に関しては、２つの異なる核酸配列、４１０及び４１１が共有結合している。抗体４０２は、２つの核酸配列、４２０及び４２１が共有結合している。抗体種４０３は、２つの核酸配列、４３０及び４３１が共有結合している。抗体種４０４は、２つの核酸配列、４４０及び４４１が共有結合している。核酸配列対は、以下の結合対を形成している：４０７と４１０、４１１と４２０、４２１と４３０、４３１と４４０及び４４１と４０８。

図６に戻ると、同じ型の多数の酵素を有する１つのＤＮＡ足場が示されている。一実施形態において、ＤＮＡ足場は、図１２に示すように異なる型の酵素を有することができる。図１２において捕捉ビーズ２０２は、共有結合している捕捉抗体２０４を有するカルボキシ誘導体化ポリスチレンビーズ２０３を、電極２０５上に含む。この描写において抗原がトロポニンｃＴｎＩである場合、分析アッセイの間に血液などの被験試料中に見出される抗原２０１は、捕捉抗体２０４に結合される。検出抗体（単数又は複数）又はそれらの結合断片２０６は、結合領域２１０、２１０’及び２２０、２２０’の交互の反復により構成されるＤＮＡ足場２１２の一部である核酸配列２１０にコンジュゲートしている。２種の異なる核酸コンジュゲートが、この分析アッセイに使用される。グルコースオキシダーゼ酵素２１７、２１７’は、スペーサー配列２１３、２１３’を用いて核酸配列２１１、２１１’にコンジュゲートしている。ホースラディッシュペルオキシダーゼ酵素２１８、２１８’は、スペーサー配列２２３、２２３’を用いて核酸配列２２１、２２１’にコンジュゲートしている。核酸配列２１１、２１１’は、それぞれ核酸配列２１０、２１０’と結合している。核酸配列２２１、２２１’は、それぞれ核酸配列２２０、２２０’と結合している。この分析アッセイにおいて、グルコースは、グルコースオキシダーゼにより過酸化水素に変換される。過酸化水素は、基質のテトラメチルベンジジンの存在下でシグナルを示す青色の化学種に変換される。

図１３は、異なる型の酵素を有する別のＤＮＡ足場２１２を表す。Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ［ＥＣ１．１．２．７］２２７、２２７’は、スペーサー配列２１３、２１３’を使用して核酸配列２１１、２１１’と共有結合している。ピルビン酸オキシダーゼ［ＥＣ１．２．３．３］２２８、２２８’は、スペーサー配列２２３、２２３’を使用して核酸配列２２１、２２１’と共有結合している。核酸配列２１１、２１１’及び２２１、２２１’は、それぞれ核酸配列２１０、２１０’及び２２０、２２０’と結合している。乳酸は、乳酸デヒドロゲナーゼによりピルビン酸に変換される。ピルビン酸は、ピルビン酸オキシダーゼにより過酸化水素に変換される。これらの成分の集合により、酵素２２７、２２７’及び２２８、２２８’により発生される起電性種の過酸化水素が金属電極２０５に非常に近接して存在し、次いで電気化学的シグナルを発生させることを可能にする。

図１４は多重抗原検出（ＭＡＤ）アッセイを表す。このようなＭＡＤアッセイは、米国特許公開番号２００５／００９５６２７号にさらに記載されており、この内容及び開示の全体は参照により本明細書に組み込まれる。抗体種５０１は、核酸５０２と共有結合している。抗体種５０３は、核酸５０４と共有結合している。抗原断片又は抗原種５０５及び５０６が互いに結合しており、抗体５０１及び５０３がそれら各自の抗原断片又は抗原種５０５及び５０６とそれぞれ結合している場合、核酸配列５０２及び５０４は、相補的領域において互いに結合している。

図１５Ａ〜１５Ｄは、抗原６０３の２つの異なる位置において２つの抗体６０１、６０２と結合する抗原６０３に依存する、ハイブリダイゼーション種の作製を表す。核酸のハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション領域に基づき非効率的であり、抗体の相互作用の高い熱力学的安定性を必要とする。抗体種６０１及び６０２は、２つの異なる位置において抗原６０３と結合している。各抗体種６０１及び６０２は、重鎖６０４及び軽鎖６０５を含有する。抗体種６０１は、核酸配列６０６と共有結合している。抗体種６０２は、核酸配列６０７と共有結合している。核酸配列６０６は、スペーサー領域６１０、結合領域６１１、結合領域６１２及びＤＮＡ重合化ブロッキングヌクレオチド６１３、例えばジデオキシヌクレオチド塩基又はアシクロヌクレオチド塩基から構成される。核酸配列６０７は、スペーサー領域６１５、結合領域６１６、結合領域６１７及びＤＮＡ重合化ブロッキングヌクレオチド６１８から構成される。結合配列６１２及び６１７は、互いにハイブリダイズする。スペーサー配列６１０及び６１５はハイブリダイズしない。

次いで、図１５Ａのこの構造は、制限エンドヌクレアーゼを用いて処理され、図１５Ｂに示す構造を作り出す。抗体種６０１は、元の核酸配列６０６から、ハイブリダイゼーション及び制限エンドヌクレアーゼによる酵素的切断により作製された核酸６２０と共有結合している。抗体種６０２は、元の核酸配列６０７から、ハイブリダイゼーション及び制限エンドヌクレアーゼによる酵素的切断により作製された核酸配列６２１と共有結合している。核酸配列６２０及び６２１の両方は、３’末端ヒドロキシ基を含有する。核酸構造６３０は、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社製のＣｉｒｃＬｉｇａｓｅを用いて環状化された合成オリゴヌクレオチド又は一本鎖ファージ若しくはファージミドから作製された一本鎖環状核酸である。核酸構造６３０は、６１１とハイブリダイズした結合領域６３１並びに結合領域６３２、６３３及び６３４の成分を含有する。結合領域６１１において、遊離の３’−ヒドロキシにより結合している一本鎖プライマー配列６２０は、鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ及びｄＮＴＰによるＤＮＡ合成の鋳型として環状構造６３０を使用できる。結果として生じる構造を図１５Ｃに記載する。

図１５Ｃの構造６４０は、抗体種６０２に共有結合した核酸配列６２１、トロポニン抗原６０３、核酸配列６４１に共有結合した抗体種６０１から構成される。核酸配列６４１は、結合配列６１１、６４２、６４３及び６４４の反復単位から構成される。環状核酸種６３０に由来する結合領域６３２は、結合領域６４４においてハイブリダイズする。

構造６５０に示すように、結合配列６４２とハイブリダイズする合成オリゴヌクレオチド配列６５１を反応に加える。制限エンドヌクレアーゼを、構造６６０を作り出す構造６５０を用いる反応に加える。分子は分断されて、互いに共有結合した核酸配列６２１及び抗体種６０２を有する分子と、抗体種６０２に結合したトロポニン抗原６０３とになるであろう。抗原６０３はまた、核酸配列６１１と共有結合した抗体種６０１とさらに結合するであろう。結合領域６４３、６４４及び６１１を含有するさらなる断片６６１及び６６２が生み出される。分析的検出ステップにおけるこれらの断片６６１、６６２を、図１５Ｄに記載する。

図１５Ｄは、核酸配列６７３とハイブリダイズする副成分６４３を有する断片６６１が、金属電極６７１の上部に位置するカルボキシポリスチレンビーズ６７２と共有結合した、検出ステップを表す。断片６６１は、アルカリホスファターゼ６７５と共有結合する核酸配列６７４とハイブリダイズする領域６４４をさらに有する。これらの成分の集合により、酵素６７５により発生される起電性種が金属電極６７１に非常に近接して存在し、次いで発生されるべき電気化学的シグナルが発生させることを可能にする。

図１６は、核酸鎖置換ステップによるシグナル増幅に基づく抗原の分析検出を表す。図１６Ａから開始すると、捕捉ビーズ７０３は捕捉抗体７０４に共有結合している。抗原７０１は、抗体種７０４に結合している。結合配列７１１、７１２及び７１３からなり、検出抗体７０６に共有結合している核酸配列７１０は、抗原７０１と結合している。

試料を洗浄し、その後結合配列７１０と相補的な核酸配列７２０を加え、その後、図１６Ｂに示すように、構造７１５を生み出す新しい合成配列を作製するＤＮＡの重合を実施する。核酸配列７２０は、それぞれ７１１、７１２及び７１３と指定された、核酸配列７１０上の結合成分とハイブリダイズ可能な、結合成分７２１、７２２及び７２３を含有する。

図１６Ｃに示すように、鎖置換反応は、結合成分７２２及び７２３を含有する核酸配列７２５を生み出す。核酸配列７２２は、第２の捕捉部位において反応したカルボキシポリスチレンビーズ７３０と共有結合した相補的結合配列７０８と結合する。核酸配列７０９は核酸結合配列７２３と共有結合し、核酸配列７０９がアルカリホスファターゼ酵素７０７と結合される。

これらの成分の集合により、上記‘８２１の参考文献に記載されている酵素７０７により発生される起電性種が金属電極（図示せず）に非常に近接して存在し、次いで発生されるべき電気化学的シグナルが発生されることを可能にする。

第１及び第２の鎖ヌクレオチドの結合は、シグナル抗体とシグナル成分とを結合するために従来使用されてきた架橋剤に取って代わることは理解されるべきである。したがって、本発明の好ましい実施形態は、架橋剤を必要とせず、又は用いず、このような架橋剤を実質的に又は完全に含まなくてもよい。

抗体が被験物の２つのエピトープと結合することに関して上に記載しているが、いくつかの実施形態において、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開番号第２００４／００１８５７７号に記載のように、被験物の３つのエピトープと結合する３つの抗体が存在してもよい。対象の被験物及びそれらの１種又は複数種のサブフォームは、（ｉ）サンドイッチの捕捉側、（ｉｉ）サンドイッチのシグナル側、（ｉｉｉ）又は両方のいずれかの被験物上の複数のエピトープに特異的な抗体を使用する免疫測定法を実施することによって検出できる。全体で、対象の被験物上の少なくとも３つのエピトープを標的化することにより、特定のエピトープがサブフォームにおいて結合に利用できない場合であっても、捕捉抗体により結合可能な少なくとも１つのエピトープ及びシグナル抗体による結合に利用できる少なくとも１つのエピトープが存在する限り、本発明の多重サンドイッチアッセイは、被験物及びそれらのサブフォームの存在を検出できる。

図１〜１６が系の様々な部分の機能性を概念的に表す目的であることにもまた留意するべきである。例えば、被験物がＦ（ａｂ）分子間のポケットに結合する抗体分子が示されているが、被験物は、個々のＦ（ａｂ）断片の結合領域と結合することが当分野において知られている。

イムノセンサーの実施形態において、まずセンサーと試料を接触させ、次いで洗浄液を接触させ、その後センサーからの反応を記録することは有利である。洗浄は、電極に結合していない生物試料、すなわち対象でない試料を除去するために使用できる。特定の実施形態において、試料は、試料内の対象の被験物と結合する（シグナル抗体（単数又は複数）とシグナル成分（単数又は複数）との間の上記のヌクレオチド架橋を有する）シグナルコンジュゲートを用いて修正され、その後修正試料とセンサーとを接触させる。試料における結合反応は、被験物／シグナルコンジュゲート複合体を生成する。センサーは、電極表面に密着させた、被験物に対する固定化抗体を含む。センサーの接触において、被験物／シグナルコンジュゲート複合体は電極表面近くの固定化抗体と結合する。この時点において、電極の近くからできる限り多くの結合していない抗体を除去し、センサーからのバックグラウンドシグナルを最小化することは有利である。シグナル成分が、ＡＬＰなどのシグナル酵素を含む場合、シグナルコンジュゲート複合体は、流体中に提供された基質を有利に変換することができ、電気化学的に活性な種を生成する。この活性種は、電極近くに生成され、適切な電位が印加された場合（電流測定操作）、電極での酸化還元反応によるいずれかの電流を提供する。或いは、電気活性種がイオンである場合、それを電位差滴定で測定できる。電流測定において、電位は、測定の間固定されていても、又は所定の波型に従って変動してもよい。例えば、サイクリックボルタンメトリーのよく知られている技術において使用されるように、三角波を使用して制限の間で電位を掃引できる。或いは、矩形波などのデジタル技術を使用して、電極に近接する電気活性種の検出における感度を改善できる。電流又は電圧測定により、試料中の被験物の量又は存在を計算できる。このシグナルは、生物試料中の対象の被験物の量に比例する。これら及び他の分析電気化学法は、当分野においてよく知られている。

カートリッジがイムノセンサーを含む実施形態において、イムノセンサーは、非反応性金属、例えば金、プラチナ又はイリジウムのセンサーベース及び微粒子、例えばラテックス粒子に結合する生物活性層を重ねた多孔質の選択透過性の層から有利に微細加工される。この微粒子は、電極表面を覆っている多孔質層上に分配され、接着した多孔質生物活性層を形成する。生物活性層は、対象被験物に特異的に結合する特性、又は被験物が存在する場合、検出可能な変化を明らかにする特性を有し、被験物に対する最も好ましい固定化抗体である。

本発明の装置は、カートリッジ、カラム、注射器、キュベット又は他の分析装置又は当分野において知られている系を含む。カートリッジは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，４１９，８２１号及び第５，０９６，６６９号に記載された型のカートリッジであってもよい。他のカートリッジの形状の例は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，４１６，０２６号、第５，５９３，６３８号、第５，４４７，４４０号、第５，６２８，９６１号、第５，５１４，２５３号、第５，６０９，８２４号、第５，６０５，６６４号、第５，６１４，４１６号、第５，７８９，２５３号、第６，０３０，８２７及び第６，３７９，８８３号に見出される。さらに他のカートリッジの形状は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ／ＵＳ００／３１１５８、ＰＣＴ／ＵＳ０１／０４３４５、ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０４６７７２及び米国特許公開番号第２００７／０１５４９２２号、第２００５／００５４０７８号、第２００４／００１８５７７号及び第２００６／０１６０１６４号に記載されている。好ましい実施形態において、適切なカートリッジは、ｉ−Ｓｔａｔにより製造されるｉ−ＳＴＡＴ ｃＴｎｌを含み、ｉ−ＳＴＡＴ ｃＴｎｌは、ｉ−ＳＴＡＴ Ｐｏｒｔａｂｌｅ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ、ｉ−ＳＴＡＴ１Ａｎａｌｙｚｅｒ及びＰｈｉｌｉｐｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｌｏｏｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｍｏｄｕｌｅと一緒に使用できる。

本発明の例示的実施形態において、内蔵型の検知装置及びリーダーを提供する。内蔵型の検知装置は、使い捨て、又は単回使用のカートリッジであってよい。このリーダーは、画面又はプリンターなどの出力装置を有するハンドヘルドリーダーであってよい。操作者、例えば医師、看護師また又は技術者は、被験試料を検知装置に配置し、検知装置をリーダーに挿入する。工程が完了したら、操作者はリーダーから装置を取り外し、それを廃棄するだけである。その後リーダーは、別の検知装置の挿入により開始される別の測定を実施できる状態になる。

適切な単回使用カートリッジは、生物試料を受け入れる試料流入口を有するハウジングを含む。試料は、存在する場合、標的被験物を含有する。試料流入口は１つ又は複数の電極を有する導管と接続される。電極には、捕捉抗体が結合されている。導管は、流入口と、上記のように可溶化剤、例えば糖マトリックス内の固定化捕捉抗体との間に配置されるシグナルコンジュゲートを含むことが好ましい。ハウジングは、洗浄液を含有する領域、（シグナル成分がシグナル酵素を含む実施形態において）酵素基質を含有する領域及び廃液チャンバーをさらに含む。これらの領域及び廃液チャンバーは、洗浄液が、これらの領域から導管にポンプ輸送又は吸引により輸送され、導管から廃液チャンバーに生物試料が除去され得るように導管に接続される。さらに、シグナルコンジュゲートがシグナル酵素を含む実施形態において、酵素基質を含有する領域は、酵素基質が、電極においてシグナル発生するシグナル酵素と反応できるように導管と接続される。これらの特徴に加えて、カートリッジは、以下にさらに記載するような１つ又は複数のさらなる特徴を含むことができる。

カートリッジに関する図面は、図１７〜２２に示され、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，４１９，８２１号及び米国特許公開番号第２００６／０１６０１６４号及び第２００５／００５４０７８号にさらに記載されている。一実施形態において、検知装置は、本発明のカートリッジを含むことができる。このカートリッジは、図１７及び１８に示すようなカバー、図２０に示すベース、及びベースとカバーとの間に配置される図１９に示す薄膜接着ガスケットを含む。ここで図１７を参照すると、カバー１は、可撓性のヒンジ領域５、９、１０において亀裂なしに繰り返し変形可能な剛体材料、好ましくはプラスチックで作られる。カバーは、可撓性のヒンジ９によりカバーの本体とつながっている蓋２を含む。操作において、試料を試料保持チャンバー３４に導入後、蓋を試料流入口４の入り口の上に締め付けることができ、試料の漏れを防ぎ、蓋はフック３により適切な位置に保たれる。一実施形態において、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許公開番号第２００５／００５４０７８号に記載のように、カバーはスライド可能な閉鎖用具を含む。カバーは、カバーの本体に呼応して動くことができ、可撓性のヒンジ領域５、１０によりカバーにつながっている２つのパドル６、７をさらに含む。

操作において、ポンプ手段により操作される場合、パドル６は、薄膜ガスケット２１により覆われている空洞４３に含まれる気胞に対して力を加え、カートリッジの導管内の流体を置換する。第２のポンプ手段により操作される場合、パドル７は、ガスケット２１に対して力を加え、ガスケット２１は切り込まれたスリット２２のため変形できる。カートリッジは、読み取り機器への挿入に適合し、したがって、この目的のための複数の機械的及び電気的接続を有する。カートリッジの手動操作が可能なことも明らかであるはずである。従って、カートリッジの読み取り機器への挿入において、ガスケットは、空洞４２に位置する、およそ１３０μｌの分析／洗浄溶液（「流体」）で満たされた、流体含有ホイルパック上に圧力を伝え、スパイク３８上のパッケージを破壊し、流体を、ベース中の短い横断導管を介してセンサー導管に接続される導管３９に放出する。分析液は、キャピラリーストップとして作用するテープガスケット中の小型の開口部に流体を最初に押し出す分析導管の前面に満たされる。カートリッジに適用される分析器の機構の他の動作を使用して、１つ又は複数のセグメントを、分析導管内の調節位置において分析液に注入する。これらのセグメントを使用して、センサー表面及び周囲の導管を最小の流体で洗浄することを助ける。

カバーは、柔軟な薄膜８により覆われた穴をさらに含む。操作において、膜にかけられた圧力は、１つ又は複数の空気セグメントを、ガスケット中の小孔２８を介して導管２０内に放出する。

図１８を参照すると、ベースの下面は第２の導管１１及び第１の導管１５をさらに含む。第２の導管１１は狭窄部１２を含み、これは、流体の流れに対する抵抗性を提供することによって流体流を調節する。任意選択のコーティング１３、１４は疎水性表面を提供し、ガスケットの孔３１、３２と一緒に導管１１、１５の間の液流を調節する。ベース中のくぼみ１７は、導管３４中の空気を、ガスケット中の孔２７を介して導管３４へ通過させる経路を提供する。

図１９を参照すると、薄膜ガスケット２１は、様々な孔及びスリットを含み、ベース及びカバー内の導管の間の流体輸送を容易にし、必要に応じて圧力下のガスケットの変形を可能にする。従って、孔２４は、流体が導管１１から廃液チャンバー４４へ流れることを可能にし、孔２５は、導管３４及び１１の間のキャピラリーストップを含み、孔２６は、空気がくぼみ１８と導管４０との間を流れることを可能にし、孔２７は、くぼみ１７と導管３４との間の空気の動きを提供し、孔２８は、任意選択の閉鎖可能なバルブ４１を介して、導管１９から廃液チャンバー４４に流体が流れることを可能にする。孔３０及び３３は、それぞれカッタウェイ３５及び３７内に収容された複数の電極が導管１５内で流体に接触することを可能にする。特定の実施形態において、カッタウェイ３７は、接地電極及び／又は対向−参照電極を収容し、カッタウェイ３５は、少なくとも１つの被験物センサー及び場合により電気伝導度センサーを収容する。図１９の構成要素２９は、図１７のカバー及び図１８のベース中の領域に接触するテープの開口として機能する。孔９２は、流体が、流入口４から導管３４に流れることを可能にする。

図２０を参照すると、導管３４は、組み立てられたカートリッジにおいて試料流入口４と第１の導管１１とを接続する試料保持チャンバーである。カッタウェイ３５は、被験物センサー（単数又は複数）又は被験物応答性表面を、任意選択の電気伝導度センサー（単数又は複数）と一緒に収容する。カッタウェイ３７は、電気化学的センサーのリターン電流路として必要であれば接地電極を収容し、任意選択の電気伝導度センサーもさらに収容できる。カッタウェイ３６は、流体が第１の導管と第２の導管との間を通れるような、ガスケットの孔３１と３２との間の流体路を提供する。くぼみ４２は、組み立てられたカートリッジにおいて、読み取り機器内への挿入においてパドル７にかかる圧力のためスパイク３８により孔をあけられる流体含有パッケージ、例えば、破裂可能な小袋を収容する。孔をあけられたパッケージから流体は、３９において第２の導管に流れる。気胞は、上面がガスケット２１により密閉されているくぼみ４３に含まれる。気胞は、ポンプ手段の一実施形態であり、導管４０において空気を移動させ、その結果試料を試料チャンバー３４から第１の導管１５に移動させるパドル６にかけられた圧力により作動する。

空気が気胞から試料チャンバー（ガスケットの孔２７）に流入する位置及びキャピラリーストップ２５は、試料チャンバーの所定の容量を一緒に規定する。パドル６が押し下げられる時、この容量に応じた量の試料が第１の導管に移動する。したがって、この構成は、未測定試料の一定量をカートリッジの導管に送達する、測定手段の実施形態の一候補である。

本カートリッジにおいて、試料のセグメントを測定する手段を、ベースのプラスチック部分において提供する。セグメントサイズはベース中のコンパートメントのサイズ及びテープガスケット中のキャピラリーストップ及び空気パイプ孔の位置により調節される。この容量は、２から２００μリットルまで容易に変動させることができる。試料サイズのこの範囲の拡大は、本発明の背景において可能である。

流体は、試薬（例えば、粒子又は可溶性分子）を修正するために使用できる予備分析導管１１を介して試料中に押し出され、次いでセンサー導管１９に提示される。又は、修正試薬は、１６部分を超えて１５部分に位置してもよい。予備分析導管からの試料の押し出しは、隔膜ポンプのパドル７に張力を導入するようにも機能し、これにより流体移動を起こす際のパドルの応答性が改善する。

いくつかのアッセイにおいて、被験物の定量が必要な場合、測定は有利である。試料及び／又は導管から排出される流体用の廃液チャンバー４４を提供し、カートリッジの外側表面の汚染を防ぐ。廃液チャンバーから外気に接続した脱気口４５もさらに提供する。カートリッジの特徴は、一度試料を添加したら、分析は完了し、操作者又は他者が試料に接触することなくカートリッジを廃棄できることである。

図２１を参照すると、カートリッジ及び構成要素の特徴の概略図が提供され、５１〜５７は、試料又は流体を修正するための、場合によって可溶化剤中にある乾燥試薬、例えばシグナルコンジュゲートで場合によってはコーティングされ得る導管部分及び試料チャンバーである。試料又は流体は、少なくとも１回は乾燥試薬の中を通り、それを溶解する。試料又は流体を修正するために使用するカートリッジ内の試薬は、シグナルコンジュゲート、又はアッセイ化合物の中で特異的又は非特異的ないずれかの結合反応を防ぐブロッキング剤を含む。可溶性ではないが、アッセイ成分がカートリッジの内部表面に非特異的に吸着することを防ぐのに役立つ表面コーティングもまた提供できる。

試料又は流体のセグメント内で、修正物質は優先的に溶解され、セグメントの所定の領域内で濃縮され得る。このことは、セグメントの位置及び動きの調節を介して達成される。したがって、例えば、セグメントの一部、例えば最先端だけが修正物質に対して交換された場合、その場合は、高い局所濃度の物質が、最先端の近くにおいて達成され得る。或いは、物質の均一な分布が所望の場合、例えば、定量分析において既知の濃度の修正物質が必要な場合、その場合は、試料又は流体のさらなる交換が混合及びさらには分配においてもたらされるであろう。

特定の実施形態において、閉鎖可能なバルブは、第１の導管と廃液チャンバーとの間に提供される。一実施形態において、このバルブ５８は、不浸透性物質によりコーティングされた乾燥スポンジ材料を含む。操作において、スポンジ材料と試料又は流体とを接触させることにより、スポンジの膨潤がもたらされ、空洞４１を満たし、その結果実質的に廃液チャンバー４４へのさらなる液体の流れが実質的にブロックされる。さらに、濡れたバルブは第１の導管と廃液チャンバーとの間の空気の流れもブロックし、このことにより試料チャンバーと接続された第１のポンプ手段が、第２の導管内の流体を移動させることを可能にし、次の様式で第２の導管から第１の導管へ流体を移動させる。試料が制御された時間センサーに曝露された後、試料は別の試薬により修正され得る分析後導管１９に移動される。その後、センサーに戻ることができ、第２の反応期間が開始され得る。又は、分析後導管は、単にセンサーから試料セグメントを分離するために機能し得る。この分析後導管内には、センサー導管の空気脱気口と隔膜空気ポンプとを接続する単一の閉鎖可能なバルブが存在する。このバルブを閉鎖した場合、試料は分析後導管に閉じ込められ、センサーチップには戻ることができない。このバルブには、本発明の範囲内に包含されるいくつかの異なる設計がある。いくつかの設計は機械的に活性化されるが、他は液体の接触により活性化する。本発明に包含される閉鎖可能なバルブの他の型は、限定するものではないが、可溶性の接着剤又はゲル化ポリマーにより開放状態が保たれ、又は流体若しくは試料と接触して膨潤し、したがってフラップが閉鎖される柔軟なフラップ、或いは特定の一実施形態において、紙が、乾燥していると空気に対して透過性であるが、濡れると非透過性であるような、導管と廃液チャンバー又は周囲空気のどちらかとの間に差し込まれた多孔質紙又は同様の材料の薄層を含む。後者の事例において、バルブは閉鎖前に液体をほとんど又は全く通過させないので、閉鎖可能なバルブを導管と廃液チャンバーの間に差し込む必要はなく、そのためバルブは、導管とカートリッジを取り巻く周囲空気との間に位置する場合、適切に配置される。実用的構造において、１枚のろ紙を、調節される流体経路中のテープガスケットの開口に配置する。空気はこの媒体を容易に進むことができ、流体は流体路を進むことができる。流体がこのフィルターを押した場合、フィルター媒体は液体で満たされ、液体路を通るさらなる動きは停止される。一度フィルターが濡れると、液体がフィルターの孔を進むためにはかなりの圧力が必要であると思われる。フィルターの外に液体を押し出すためにかなり高い圧力が必要なため、フィルターを通る空気流もまた妨げられる。このバルブの実施形態は、バルブを作動させるために必要な液体は非常に少なく、作動は迅速且つ確実に起こる。材料、それらの面積、孔隙率、湿潤性、膨潤特性及び関連するパラメーターが、迅速な閉鎖、試料との最初の接触後１秒以内又はそれより遅い、例えば６０秒までを、特定の所望の閉鎖時間にしたがって提供するために選択される。

或いは、閉鎖可能なバルブは機械的バルブである。この実施形態において、ラテックスの隔膜を、特別に構築されたウェルの上部の気胞の底部に配置する。このウェルは、脱気口と試料導管とを流体的に接続する２つの開口部を含む。分析器のプランジャーは気胞の底部を押すので、裏が接着性であるこのラテックス隔膜を圧迫し、２つの穴の間の接続を密閉する。これにより試料の脱気口がブロックされ、試料はその場に閉じ込められる。

図２２を参照すると、これは、イムノセンサーカートリッジの配置図を例示し、３つのポンプ手段、６１〜６３が提供される。これらのポンプは、特定の実施形態の観点から記載されるが、ポンプ手段６１〜６３のそれぞれの機能を実施できる任意のポンプ手段が本発明において使用できることは、容易に理解されるであろう。したがって、ポンプ手段１、６１は、試料保持チャンバーから第１の導管へ試料を移動できなければならず、ポンプ手段２、６２は、流体を第２の導管へ移動できなければならず、ポンプ手段３、６３は、少なくとも１つのセグメントを第２の導管に挿入できなければならない。本出願において想定されるポンプの他の型は、限定するものではないが、圧力が空気袋にかかる、空気圧手段と接触する前記空気袋、可撓性の隔膜、ピストン及びシリンダー、電気力学的ポンプ及び音波ポンプを含む。ポンプ手段３、６３に関して、「ポンプ手段」という用語は、１つ又は複数のセグメントが第２の導管に挿入されるすべての方法、例えば、空気を空気袋から移動させる空気圧手段、溶解した場合ガスを発生する粉末薬品又は電流供給源と動作可能に接続された複数の電気分解用電極を含む。特定の実施形態において、セグメントは、複数の気胞又はチャンバーを有することができる、機械的セグメントを作製する隔膜を使用して作り出される。ウェル８は、内部隔膜ポンプと接続する単一の開口部及びセグメントが注入される流体で満たされた導管２０を有する。隔膜は、多数のセグメントを作製するために分割され、流体で満たされた導管内の特定の位置にそれぞれが注入され得る。

代替の実施形態において、セグメントは、受動的な特徴を使用して注入される。カートリッジのベース中のウェルは、テープガスケットにより密閉される。ウェルを覆うテープガスケットは、どちらかの端に２つの小さな穴を有する。１つの穴は開放されているが、他方は、流体と接触すると濡れるフィルター材料で覆われている。ウェルは、セルロース繊維のフィルター、ろ紙又はグラスファイバーフィルターなどの遊離した親水性材料で満たされている。この親水性材料は、毛細管現象を介してベース中のウェルに液体を引き込み、もともとウェル内にあった空気を移動させる。空気は、容量がウェルの容量及び遊離した親水性材料の容量によって決定されるセグメントを生み出す、テープガスケット中の開口部を介して放出される。ベース中のウェルへの注入口の１つを覆うために使用されるフィルターは、流体がウェルを満たす速度を測定し、それによりセグメントがカバー中の導管に注入される速度を調節するために選択され得る。この受動的特徴は、任意の数の調節されたセグメントが流体路内の特定の位置に注入されることを可能にし、必要とする空間は最小である。

本発明の実施形態は、シグナルを訂正する技術をさらに使用する。適切な技術は、米国特許第２００６／０１６０１６４号に記載され、この全体は参照により本明細書に組み込まれる。

この実施形態の使用は医療環境において特に有利であり、その関連で記載されるが、この実施形態は、リアルタイムに匹敵する速度において流体試料の化学分析を実施することが望まれる任意の状況において実践できることは理解されるであろう。例えば、このように具現化された方法及び装置を使用し、患者が心筋梗塞を患うかどうか、又は患者が心筋梗塞を患っているかどうかを決定できる。

本発明は、以下の限定されない例によりさらによく理解されるであろう。

（例１）
第１の例は、図５に示すように、被験物のためのコンジュゲートとして検出抗体及びＡＬＰ酵素を架橋する合成オリゴヌクレオチドに基づく酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）である。

この例は、ＡＬＰ酵素分子が、ＥＬＩＳＡ試験における使用のために検出Ａｂ又は縮小Ｆ（ａｂ）分子と結合するためのＤＮＡ足場を使用するという、この系の基本構想を実証する。より複雑な足場分子を、この構想の系から開発できる。

以下に示す合成オリゴヌクレオチド配列Ａ及びＡ’が好ましい。
Ａ（ＤＥ） ５’−アミノＣ１２−（Ｔ）２０−ＴＧＡＴＣＧＣＴＡＣＧＧＴＧＧＴＡＴＴＧＴ−３’（配列番号１） ６−ＦＡＭ、ここでＦＡＭは蛍光標識である
Ａ’（ＡＰ） ５’−チオール修飾因子Ｃ６ Ｓ−Ｓ−（Ｔ）２０−ＡＣＡＡＴＡＣＣＡＣＣＧＴＡＧＣＧＡＴＣ^＊Ａ−３’６ＦＡＭ（配列番号２）（ＦＡＭは蛍光標識である）
^＊はホスホロチオエート結合を表す
（Ｔ）２０は、２０個の「Ｔ」残基を表す

全体の系を実証するために、個々の成分を、下記のように作製し、それらの機能性に関して試験した。

一連の実験を実施し、以下のようにＡＬＰ−Ａ’ＤＮＡタンパク質コンジュゲートの作製を実証した。

合成オリゴヌクレオチドビーズ：
下記のＡＬＰ−ＤＮＡコンジュゲートのための試験系として、相補的合成オリゴヌクレオチド配列と結合したビーズを作製した。

２０μＬの０．３３ｕｍカルボン酸ビーズ（最終固体２％）（Ｂａｎｇｓ Ｌａｂ）を、シラン処理された０．５ｍＬの微小遠心管に移した。これを１２５００ＲＰＭで１分、微量遠心分離し、チューブを１８０°回転させ、次いでさらに４分間微量遠心分離した。上清を取り除き、９５μＬの１００ｍＭのＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）、ｐＨ７．１を加えた。ビーズを、上記のように微量遠心分離し、上清を取り除いた。次に、７．５ｍｇのＥＤＡＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）を、３００μＬのＭＥＳ緩衝液、ｐＨ７．１に加えた。ＥＤＡＣは、アミノ基をカップリングするカルボキシ基の活性化因子である。この処理における第１ステップは、カルボキシ基が、利用可能なアミン基とその後反応できるｏ−アシルイソ尿素基に活性化され、これが合成オリゴヌクレオチド（Ａ）に合成され、合成オリゴヌクレオチドとカルボキシビーズ上のカルボキシ基との共有結合を形成することである。これをビーズに加え、溶液をボルテックスにかけ、よく混合した。次いでビーズを、超音波処理槽において１０分間超音波処理した。ビーズを、上記のように微量遠心分離によりペレット化し、上清を取り除いた。次に、２８８μＬのＭＥＳ、ｐＨ７．１を加え、ピペッティングにより混合した。１２μＬの１００ｕＭのアミン修飾オリゴヌクレオチドをチューブに加えた。この溶液をボルテックスにかけ、よく混合した。次いで、溶液を、超音波処理槽において１０分間超音波処理した。その後、チューブを、室温でインキュベーターにおいて２時間混合させた。ビーズを、上記のように微量遠心分離により濃縮した。９５μＬのクエンチ緩衝液（５０ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ７．１、３５ｍＭのグリシン、０．２５％のＢＳＡ、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０、０．０５％のＮａＮ_３）を加え、溶液をピペッティングにより混合した。グリシンはアミノ基を含有し、アミノ基は任意のカップリングしていないＥＤＡＣ活性化カルボキシ基と反応し、ＥＤＡＣ活性化カルボキシ基をブロックし、反応におけるさらなるクロスカップリングを防ぐため、この緩衝液を加えた。チューブを、Ｃｌａｙ Ａｄａｍｓ（商標）ｎｕｔａｔｏｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）において混合し、室温において３０分間、複数方向に連続混合した。ビーズを、上記のようにペレット化した。９５μＬの保存緩衝液（５０ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ７．１、０．０５％のＢＳＡ、０．０５％ＮａＮ_３）を加え、ビーズをピペッティングにより混合した。チューブをパラフィルムで覆い、乾燥を避け、次いで−８０℃において長期保存した（又は４度において短期保存した）。

バイオセンサー電極上への微量塗布用に調製する場合、チューブを解凍し、その後上記のように、ビーズを微量遠心分離によりペレット化した。９５μＬの、オートクレーブにかけ、脱イオン化した水を加え、ビーズをピペッティングにより混合した。次いで、図５に示すように、これらのビーズをバイオセンサー電極、例えばＰｔ及びＡｕの金属電極表面に微量塗布した。

バックグラウンドシグナル検出器として使用する参照ビーズは、米国特許公開番号第２００６／０１６０１６４号に記載されており、この内容及び開示の全体は参照により本明細書に組み込まれる。参照ビーズは、微量塗布用に調製される。

合成オリゴヌクレオチド処理：
タンパク質−ＤＮＡのコンジュゲーションのために、チオール修飾合成オリゴヌクレオチドを、メルカプタン（ＤＴＴ）を用いて処理し、遊離のスルフヒドリル基を作り出し、遊離のスルフヒドリル基はその後、そのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル基を介してタンパク質のアミン基と結合したＬＣ−ＳＰＤＰ（スクシンイミジル６−［３’−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド）ヘキサノエートクロスリンカーの２−ピリジルジチオ基と反応させることができる。

この手順は、通常、可能な限り短時間で実施することに留意するべきである。この合成オリゴヌクレオチドは蛍光タグを含有するので、反応及びカラムはアルミホイル下又は暗くした室内において実施する。およそ５０，０００ｐｍｏｌのＡ’合成オリゴヌクレオチドを、１０μＬの１×ＰＢＳＥ（１３６ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、１０．１ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４、１．８ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４、５ｍＭのＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ｐＨ７．４）に再懸濁し、オートクレーブにかけ、脱イオン化した水中の１ＭのＤＴＴ（ジチオスレイトール）、２０μＬを加えた。反応を、室温において１５分間進行させる。この反応が完了したら、５０μＬの１×ＰＢＳＥを加え、全反応液をサイズ排除カラムに添加する。

未反応のＤＴＴはその後のステップに干渉すると思われるので、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して除去する。

Ｐ−６（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）サイズ排除カラムを、「０」（ｍＬ）のマークで切り取った５ｍＬのプラスチックピペットを使用して調製し、シリコン処理したグラスウールを、ピペットのチップ内に配置し、オートクレーブにかけ、脱イオン化した水中の、事前に膨潤させたＰ−６スラリーを、カラムの樹脂が「１」（ｍＬ）のマークに満ちるまで加えた。カラムを、オートクレーブにかけ、脱イオン化した５ｍＬの水ですすいだ。このカラムに、ＤＴＴ処理した合成オリゴヌクレオチドを添加した。１４の２００μＬの画分を、水を緩衝液として使用して、個別の微小遠心分離管に回収した。合成オリゴヌクレオチドを含有する画分を、特徴的な黄色により決定した。さらに、１μＬの試料を各画分から採取し、ＵＶトランスイルミネーターの上端に配置されたサランラップの上にスポットした。図２３に示すように、明るく蛍光発光したスポットが、蛍光部分を伴う合成オリゴヌクレオチドを含有した。

サイズ排除カラムにおいて、大型分子（合成オリゴヌクレオチド）は、小型分子（ＤＴＴ）より早く溶出される。小型分子であるＤＴＴが溶出された画分には、蛍光標識された合成オリゴヌクレオチドは見出されなかった。黄色及び蛍光発光した画分では、合成オリゴヌクレオチドに共有結合した６−ＦＡＭ（６−カルボキシフルオロセイン）蛍光染料を含有する合成オリゴヌクレオチドの存在が確認される。

蛍光発光材料を含有する画分（図２３）を合わせ、暗所において６０℃で真空遠心分離して乾燥させた。

ＡＬＰ酵素処理：
オリゴヌクレオチドを含有するスルフヒドリルを処理する間、ＬＣ−ＳＰＤＰクロスリンカーのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル部分は、タンパク質分子上のアミン基と反応し、クロスリンカーとタンパク質との共有結合を形成し、ＤＴＴと反応した合成オリゴヌクレオチドと反応させるために後で使用される、露出された２−ピリジルジチオ基が残る。

Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中２０ｍＭのＬＣ−ＳＰＤＰ溶液（Ｐｉｅｒｃｅ）を調製し、５μＬを、１ｍｇのＣａｌｆ Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌアルカリホスファターゼ［Ｅ．Ｃ．３．１．３．１］（ＡＬＰ）酵素に加え、１×ＰＢＳＥ中１００μＬにした。この反応を、振とうしながら室温において１時間進行させた。この材料を、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に結合したＳ−３００サイズ排除カラムに添加し、データ収集のためにＰｒｉｍｅＶｉｅｗソフトウェアを使用した。未反応のＬＣ−ＳＰＤＰクロスリンカーを反応したタンパク質試料から除去して、未反応のクロスリンカーと、この処理の次のステップにおいて加えられる、活性化タンパク質分子と反応するべきであるが未反応のクロスリンカーとは反応するべきではない合成オリゴヌクレオチドとの混入反応を避ける。１／５×ＰＢＳＥ（２７．２ｍＭのＮａＣｌ、０．５４ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４、０．４ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）を、緩衝液として使用した。図２４に示すように、カラムを、２ｍＬ／分で４ｍＬの画分３０個で処理した。

得られたカラムのデータを、画分の番号と吸光度を関連付けるソフトウェアを使用して示した。

この例において、１１から１４及び１５から１８の画分を別個に組み合わせた。試料を、ＵＬＴＲＡ−１５ １０ＭＷＣＯ透析ろ過カラム（Ａｍｉｃｏｎ）において３５分間４，０００ＲＰＭで遠心分離することによって、画分を約２００〜３００μＬまで濃縮した。

酵素活性画分を確認するために、各画分の１μＬを、１．２Ｍのジエタノールアミン、０．５ｍＭのＭｇＣｌ_２、１９ｍＭの４−ニトロフェノールリン酸に加えた。活性酵素画分（画分１５から１８）は、５分以内に黄色に変わり、ＡＬＰ酵素活性を示し、次の処理に使用した。

活性酵素活性を含有し、かなりのＬＣ−ＳＰＤＰコンジュゲートタンパク質を含有することが予測される濃縮画分の１５から１８を、乾燥させたＤＴＴ処理合成オリゴヌクレオチドに直接加えた。乾燥合成オリゴヌクレオチドの使用は、反応物質の濃度の増加を助ける。上記のように、共有結合したＬＣ−ＳＰＤＰクロスリンカーの２−ピリジルジチオ基は、ＤＴＴ処理合成オリゴヌクレオチド上のスルフヒドリルと反応するであろう。この溶液を穏やかにピペッティングし、乾燥合成オリゴヌクレオチドの溶解を確実にした。振とうしながら４℃において一晩反応させた。

図２５に示すように、ＤＴＴ処理合成オリゴヌクレオチドと反応したＬＣ−ＳＰＤＰ活性化ＡＬＰを、次いでＳ３００カラムに添加し、上記のように処理した。

画分１５から２１の主要なピークを組み合わせ、上記のように透析ろ過によって濃縮した。材料を、４℃においてアルミホイル内で保存した。

この材料を試験し、Ａ’合成オリゴヌクレオチドの結合を確認した。この材料の一連の希釈液を作製した。２μＬのこの材料を、１８μＬの１×ＰＢＳＥ（１０−１）に加え、２μＬの１０−１を、１８μＬの１×ＰＢＳＥ（１０−２）に加え、２μＬの１０−２を１×ＰＢＳＥ（１０−３）に加えた。これらの希釈液のそれぞれ２μＬを、１８μＬの血漿に加え、Ａ合成オリゴヌクレオチドと結合したビーズを含有する修飾ｉ−ＳＴＡＴ「イムノ」カートリッジ（上記）において試験した。カートリッジは、電極にビーズが固定化されていることを除いて市販のｃＴｎＩ装置と同じであり、市販のｃＴｎＩ装置は、ビーズに結合した合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドを有し、ＡＬＰ酵素活性は、ＡＬＰ分子とコンジュゲートしたＤＮＡにより供給される。ＡＬＰの切断後、起電性基質（ｐ−アミノフェノールリン酸）の存在下でビーズ上のＡ配列と結合する、Ａ’合成オリゴヌクレオチドを有するＡＬＰの存在が、検出される電流測定シグナルを発生させる（図２６を参照されたい）。

Ｅ００３０と名付けたこのＤＮＡコンジュゲートを酵素活性及びタンパク質濃度に関して、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法を使用して試験した。結果を以下の表に示す。

検出抗体処理：
この項では、抗体構成オリゴヌクレオチドコンジュゲートの合成について記載する。

合成オリゴヌクレオチド処理：
上記のように、合成オリゴヌクレオチドを、メルカプタンを用いて処理し、遊離のスルフヒドリル基を作製する。

およそ５０，０００ｐｍｏｌのＡ合成オリゴヌクレオチドをオートクレーブにかけ、脱イオン化した水に再懸濁した。次いで、１０μＬの１×ＰＢＳＥ（１３６ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、１０．１ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４、１．８ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）及びオートクレーブにかけ、脱イオン化した水中１Ｍの２０μＬのＤＴＴを加えた。反応を、室温において１５分間進行させる。この反応が完了したら、２０μＬの１×ＰＢＳＥを加え、全反応液をサイズ排除カラムに添加する。

上記のように、サイズ排除クロマトグラフィーにより合成オリゴヌクレオチドからＤＴＴを取り除き、タンパク質分子の還元を防ぐ。

Ｐ−６（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）サイズ排除カラムを、「０」（ｍＬ）のマークで切り取った５ｍＬのプラスチックピペットを使用して調製し、シラン処理したグラスウールを、ピペットのチップ内に配置し、オートクレーブにかけ、脱イオン化した水中の、事前に膨潤させたＰ−６スラリーを、カラムの樹脂が「１」（ｍＬ）のマークに満ちるまで加えた。カラムを、オートクレーブにかけ、脱イオン化した５ｍＬの水ですすいだ。このカラムに、ＤＴＴ処理した合成オリゴヌクレオチドを添加した。１４の２００μＬの画分を、水を緩衝液として使用して、個別の微小遠心分離管に回収した。合成オリゴヌクレオチドを含有する画分を、特徴的な黄色により決定した。さらに、１μＬの試料を各画分から採取し、ＵＶトランスイルミネーターの上部に配置されたサランラップの上にスポットした。明るく蛍光発光したスポットが、合成オリゴヌクレオチドを含有した。

蛍光発光材料を含有する画分を合わせ、暗所において６０℃で真空遠心分離して乾燥させた。

ＰＥＰ−３ Ｆ（ａｂ’）２処理：
ＰＥＰ−３ Ｆ（ａｂ’）２を、当業者にはよく知られている標準的手順を使用して、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃのヤギ抗ＴＮＩペプチド３抗体、カタログ番号Ｇ−１２９−Ｃのペプシン切断により調製した。およそ２００μＬ中１ｍｇのこのタンパク質を、１０μＬの２０ｍＭのＬＣ−ＳＰＤＰと、室温において混合しながら１．５時間反応させた。次いで、先に記載したように、Ｓ−３００カラムに試料を添加し、処理した。

画分１６から１９（図２７）を合わせ、上記のように透析ろ過により最終容量約５００μＬまで濃縮した。濃縮したＬＣ−ＳＰＤＰ活性化ＰＥＰ−３Ｆ（ａｂ’）２を、乾燥させ、メルカプタン処理したチオールＡ合成オリゴヌクレオチドに直接加えた。この溶液を穏やかにピペッティングし、乾燥合成オリゴヌクレオチドの適切な溶解を確実にした。反応液を、振とうしながら４℃において一晩インキュベートした。この材料を、先に記載のようにＳ−３００カラムにおいて精製した（図２８）。

画分を、（チューブをＵＶトランスイルミネーター上に配置することによって）ＵＶ蛍光の決定によって確認した。画分１８から２１（図２８）を合わせ、上記のように透析ろ過によって濃縮した。Ｅ００３１と名付けたこの抗体−ＤＮＡコンジュゲートを、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法を使用してタンパク質濃度に関して試験し、タンパク質濃度が５４．５ｕｇ／ｍＬであることを決定した。このタンパク質試料の黄色及びＵＶ蛍光により、合成オリゴヌクレオチドの結合を確認した。

ＤＮＡに基づくコンジュゲートによる被験物の検出：
標準的なｃＴｎＩカートリッジを使用すること及び、コンジュゲート試料を含む又は含まないＭＷＣ ｃＴｎＩ被験物を使用することにより抗体競合アッセイを実施した。シグナルの減少は、被験物がＤＮＡコンジュゲートのＦ（ａｂ）分子又はＦ（ａｂ）分子を含有する標準的コンジュゲートにより結合されていることを示す。図２９において観察されるように、上で作製されたＤＮＡ−コンジュゲートはシグナルを減少させ、被験物を結合させる能力を有することが予想される。

被験物結合能力の試験：
ＤＮＡに基づくコンジュゲートによる被験物の検出：
４μＬのＰＥＰ−３Ｆ（ａｂ’）２−Ａ［Ｅ００３１］を、４μＬのＡＬＰ−Ａ’［Ｅ００３０］コンジュゲートに加え、５１．９ｐｇのｃＴｎＩ ＭＷＣ（Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｒ’ｓ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ：製造業者実用キャリブレータ）を、１６μＬの血漿に加え、コンジュゲートを含まない「イムノ」ｉ−ＳＴＡＴカートリッジ（捕捉抗体と結合したビーズ、起電性基質を含有するが、ｃＴｎＩ検出コンジュゲートは含有しない標準的ｃＴｎＩカートリッジ、この能力は上記の新たに合成されたコンジュゲートにより供給される）において試験した。ＭＷＣを含まない対照もまた実施した。

図３０は、図５に記載の二重コンジュゲート（ＡＬＰ−Ａ’＋抗体−Ａ）が捕捉ビーズに結合し、低いシグナルを発生することを示唆する。参照ビーズはいずれの試料においても有意なシグナルを発生しなかった。

（例２）
本発明の第２の例は、図６に示すように、被験物のためのポリマーコンジュゲートとして検出抗体及びＡＬＰ酵素を架橋する合成オリゴヌクレオチドに基づく酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）である。この例において、シグナルコンジュゲートは、被験物が存在する場合、捕捉部位におけるシグナル発生の可能性を増加させる、多数のＡＬＰ−合成オリゴヌクレオチドコンジュゲートとその後ハイブリダイズする、抗体に結合した反復する相補的ＤＮＡ配列により作製される。反復する相補的ＤＮＡ配列は、環状の合成ＤＮＡを作ることにより作製され、その後５’−チオール含有合成オリゴヌクレオチドをプライマー配列として使用し、ローリングサークル型増幅に使用されるＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼを使用して、この配列の相補的マルチマーＤＮＡを作製する。次いで、特定のＤＮＡ配列を抗体分子にコンジュゲートし、その後相補的合成オリゴヌクレオチドとコンジュゲートしたＡＬＰ分子とハイブリダイズする。

光パターン化金属の作製、捕捉抗体のビーズへのコンジュゲーション、カートリッジの設計及び組み立て並びに微量塗布は、すでに上に記載している。
合成オリゴヌクレオチド配列
Ａ（ＤＥ） ５’−−チオール修飾因子Ｃ６ Ｓ−Ｓ−（Ｔ）２０−ＴＧＡＴＣＧＣＴＡＣＧＧＴＧＧＴＡＴＴＧＴ−３’（配列番号３）
Ａ’（ＡＰ）５’−チオール修飾因子Ｃ６ Ｓ−Ｓ−（Ｔ）２０−ＡＣＡＡＴＡＣＣＡＣＣＧＴＡＧＣＧＡＴＣ^＊Ａ−３’（配列番号２）６ＦＡＭ
Ｘ ５’−ｐＡＣＡＡＴＡＣＣＡＣＣＧＴＡＧＣＧＡＴＣＡＡＧＴＴＡＴＧＣＡＡＣＧＣＧＧＧＡＧＴＴＧＴＧＴＡＴＧＡＡＧＴ−３’（配列番号４）
^＊は、ホスホロチオエート結合を表す
（Ｔ）２０は、２０個の「Ｔ」残基を表す
ｐは、リン酸化５’を表す

ＡＬＰ−Ａ’ ＤＮＡタンパク質コンジュゲートの作製
ＡＬＰ−Ａ’ ＤＮＡタンパク質コンジュゲートを作製するために例１に記載した同じ方法を、例２にも使用する。このコンジュゲートは、Ｅ００３０と名付ける。

ＰＥＰ−３Ｆ（ａｂ’）２ ＤＮＡタンパク質コンジュゲートの作製
合成オリゴヌクレオチドサークルの構築：
１００，０００ｐｍｏｌの合成オリゴヌクレオチドＸを、０．０５Ｍ ＭＯＰＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）、ｐＨ７．５、０．０１ＭのＫＣＬ、５ｍＭのＭｇＣｌ_２、１．０ｍＭのＤＴＴ、０．０５ｍＭのＡＴＰ、２．５ｍＭのＭｎＣｌ_２及び２０，０００単位のＣｉｒｃｌａｓｅ ｓｓＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）中でインキュベートした。反応を、６０℃において一晩進行させる。この材料のアリコートを、後のゲル分析のために４℃に配置する。次いで、処理した合成オリゴヌクレオチドを、１０，０００単位の個々のＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅＩ及びＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅＩＩＩを用いて、３７℃において４５分間処理し、その後９０℃に１０分間加熱することによって不活性化する。処理したオリゴヌクレオチドを、上記のようにＰ−６樹脂（ＢｉｏＲａｄ）を使用してサイズ排除クロマトグラフィーによって精製する。次いで、処理したオリゴヌクレオチドを、２０％のアクリルアミド／７Ｍの尿素変性ゲルにおけるゲル電気泳動により、環状であることを確認する。未処理の合成オリゴヌクレオチドと比較した電気泳動の変化により、環状化を確認する。

５０，０００ｐｍｏｌ量の合成オリゴヌクレオチドＡを、１×ＰＢＳＥ中の調製した合成オリゴヌクレオチドＸのサークルに加える。混合物を６５℃に加熱し、１００ｍＬの水を含むビーカーにおいて、１時間かけて室温にゆっくりと冷却させる。このことにより、遊離の３’−ヒドロキシを有するチオール含有合成オリゴヌクレオチドと、上で調製した環状ＤＮＡ構造とは効率的にアニーリングされる。

アニーリングした反応液を、最終濃度が４０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、５ｍＭの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、４ｍＭのＤＴＴ及び２０００単位のＲｅｐｌｉＰＨＩ Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ並びにそれぞれ４０ｎｍｏｌのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ．を含有する緩衝液に加える。これにより、チオール含有合成オリゴヌクレオチドは３’ヒドロキシルにおいて伸長され、環状鋳型に基づく確定した相補的マルチマーが作製される。個々のこれらのマルチマーは、５’−チオール及び環状ＤＮＡの反復する相補的配列を含有し、「テール付き合成オリゴヌクレオチド」と称される。

テール付き合成オリゴヌクレオチド処理：
タンパク質−ＤＮＡのコンジュゲーションのために、テール付き合成オリゴヌクレオチドのチオール修飾部分を、メルカプタン（ＤＴＴ）を用いて処理し、遊離のスルフヒドリル基を作り出し、遊離のスルフヒドリル基はその後、そのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル基を介してタンパク質のアミン基と結合したＬＣ−ＳＰＤＰ（スクシンイミジル６−［３’−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド）ヘキサンノエートクロスリンカーの２−ピリジルジチオ基と反応させることができる。

この手順は、通常、可能な限り短時間で実施することに留意するべきである。およそ５０，０００ｐｍｏｌのテール付きＡ’合成オリゴヌクレオチドを、１０μＬの１×ＰＢＳＥ（１３６ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、１０．１ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４、１．８ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）に再懸濁し、オートクレーブにかけ、脱イオン化した水中の１ＭのＤＴＴ（ジチオスレイトール）、２０μＬを加えた。反応を、室温において１５分間進行させる。この反応が完了したら、５０μＬの１×ＰＢＳＥを加え、全反応液をサイズ排除カラムに添加する。

未反応のＤＴＴはその後のステップに干渉すると思われるので、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して除去する。

Ｐ−１００（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）サイズ排除カラムを、「０」（ｍＬ）のマークで切り取った５ｍＬのプラスチックピペットを使用して調製し、シリコン処理したグラスウールを、ピペットのチップ内に配置し、オートクレーブにかけ、脱イオン化した水中の、事前に膨潤させたＰ−１００スラリーを、カラムの樹脂が「１」（ｍＬ）のマークに満ちるまで加えた。カラムを、オートクレーブにかけ、脱イオン化した５ｍＬの水ですすいだ。このカラムに、ＤＴＴ処理した合成オリゴヌクレオチドを添加した。１４の２００μＬの画分を、水を緩衝液として使用して、個別の微小遠心分離管に回収した。ＤＮＡは２６０ｎｍの波長において吸光度を有するので、この波長において吸光度を有する試料を組み合わせた。ＤＮＡを吸収する画分を合わせ、６０℃において真空遠心分離で乾燥させた。

ＰＥＰ−３Ｆ（ａｂ’）２処理：
ＰＥＰ−３Ｆ（ａｂ’）２を、標準的手順を使用して、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃのヤギ抗ＴＮＩペプチド３抗体、カタログ番号Ｇ−１２９−Ｃのペプシン切断により調製した。およそ２００μＬ中１ｍｇのこのタンパク質を、１０μＬの２０ｍＭのＬＣ−ＳＰＤＰと、室温において混合しながら１．５時間反応させた。次いで、先に記載したように、Ｓ−３００カラムに試料を添加し、処理した。

最大の吸収ピークを含む画分を合わせ、上記のように、最終容量約５００μＬまで透析ろ過により濃縮した。濃縮ＬＣ−ＳＰＤＰ活性化ＰＥＰ−３Ｆ（ａｂ’）２を、乾燥させ、メルカプタン処理したチオールＡテール付き合成オリゴヌクレオチドに直接加えた。この溶液を穏やかにピペッティングし、乾燥ＤＮＡの溶解を確実にした。反応液を、振とうしながら４℃において一晩インキュベートした。この材料を、先に記載のようにＳ−３００カラムにおいて精製した。

ＤＮＡに基づくコンジュゲートによる被験物の検出：
４μＬのＰＥＰ−３Ｆ（ａｂ’）２−テール付きオリゴヌクレオチドを、４μＬのＡＬＰ−Ａ’［Ｅ００３０］コンジュゲートに加え、５１．９ｐｇのｃＴｎＩ ＭＷＣ（製造業者実用キャリブレータ）を、１６μＬの血漿に加え、コンジュゲートを含まない「イムノ」ｉ−ＳＴＡＴカートリッジ（捕捉抗体と結合したビーズ、起電性基質を含有するが、ｃＴｎＩ検出コンジュゲートは含有しない標準的ｃＴｎＩカートリッジ、この能力は上記の新たに合成されたコンジュゲートにより供給される）において試験した。ＭＷＣを含まない対照もまた実施した。

（例３）
本発明の別の例は、図６に示すように、被験物のためのポリマーコンジュゲートとして検出抗体及びＡＬＰ酵素を架橋する合成オリゴヌクレオチドに基づく酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）である。この例において、コンジュゲートは、被験物が存在する場合、捕捉部位におけるシグナル発生の可能性を増加させる、多数のＡＬＰ−合成オリゴヌクレオチドコンジュゲートとその後ハイブリダイズする、抗体に結合した反復する相補的ＤＮＡ配列により作製される。反復する相補的ＤＮＡ配列は、合成オリゴヌクレオチドをファージミドにクローニングし、当業者によく知られている技術によって一本鎖ＤＮＡを単離し、その後５’−チオール含有合成オリゴヌクレオチドをプライマー配列として使用し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（又は鎖置換能を有する任意の他のＤＮＡポリメラーゼ）を使用してこの配列の相補的マルチマーＤＮＡを作製する。次いで、特定のＤＮＡ配列を抗体分子にコンジュゲートし、その後相補的合成オリゴヌクレオチドとコンジュゲートしたＡＬＰ分子とハイブリダイズする。

光パターン化金属の作製、捕捉抗体のビーズへのコンジュゲーション、カートリッジの設計及び組み立て並びに微量塗布は、すでに上に記載している。
合成オリゴヌクレオチド配列
Ａ（ＤＥ） ５’−−チオール修飾因子Ｃ６ Ｓ−Ｓ−（Ｔ）２０−ＴＧＡＴＣＧＣＴＡＣＧＧＴＧＧＴＡＴＴＧＴ−３’（配列番号３）
Ａ’（ＡＰ） ５’−チオール修飾因子Ｃ６ Ｓ−Ｓ−（Ｔ）２０−ＡＣＡＡＴＡＣＣＡＣＣＧＴＡＧＣＧＡＴＣ^＊Ａ−３’６ＦＡＭ（配列番号２）
Ｙ ５’−ＡＡＴＴＡＣＡＡＴＡＣＣＡＣＣＧＴＡＧＣＧＡＴＣＡＣＴＡＣＴ−３’（配列番号５）
Ｙ’ ５’−ＡＧＣＴＡＧＴＡＧＴＧＡＴＣＧＣＴＡＣＧＧＴＧＧＴＡＴＴＧＴ−３’（配列番号６）
^＊は、ホスホロチオエート結合を表す
（Ｔ）２０は、２０個の「Ｔ」残基を表す
ｐは、リン酸化５’を表す

ＡＬＰ−Ａ’ ＤＮＡタンパク質コンジュゲートの作製
ＡＬＰ−Ａ’ ＤＮＡタンパク質コンジュゲートを作製するために例１に記載した同じ方法を、例３にも使用する。このコンジュゲートは、Ｅ００３０と名付ける。

一本鎖環状ＤＮＡ鋳型のクローニング及び作製
ＤＮＡプラスミドを利用して、特定のＤＮＡ断片をそれらの中にクローニングできる環状ＤＮＡ断片を作製する。ｆ１複製起点を含むファージミドのプラスミドは、ヘルパーファージを使用して一本鎖ＤＮＡに変換できる。この一本鎖ＤＮＡは、容易に拡大、単離及び精製できる。すべてのプロトコルは当業者にはよく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ（２００１年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に見出されるプロトコルに基づく。次いで、この材料をその後使用して、Ｐｈｉ２９又はＴ４ ＤＮＡポリメラーゼなどの鎖置換ＤＮＡポリメラーゼを使用して、ＥＬＩＳＡアッセイに使用するテール付きＤＮＡ断片を作製できる。

１０ｕｇのプラスミドｐＧＥＭ １１Ｚｆ＋（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ、Ｇｅｎｂａｎｋ配列情報：Ｘ６５３１３）を、それぞれ１００ＵのＲ．ＥｃｏＲＩ及びＲ．ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて、ＮＥＢｕｆｆｅｒ２を使用して、３７℃において１時間制限消化した。次いで制限消化されたＤＮＡを、１００ＵのＡｎｔａｒｃｔｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＮＥＢ）を用いて、３７℃において１時間処理し、その後６５℃において５分間熱不活性化した。この材料を、低融点のアガロースゲルを使用してゲル精製し、その後ベータアガラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用し、ＤＮＡのエタノール沈殿のための製造業者のプロトコルを使用して、アガロースを除去した。このＤＮＡを、６０℃において真空内で乾燥させ、その後２０ｕＬの水に再懸濁した。

１００ｐｍｏｌの合成オリゴヌクレオチドＹ及びＹ’を組み合わせ、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．６、０．１ｍＭのＥＤＴＡ）において、まず６５℃に加熱し、１００ｍＬの水の中で室温までゆっくりと約１時間冷却することによってハイブリダイズさせる。次いで、ハイブリダイズさせた合成オリゴヌクレオチドを、上で調製した制限消化したプラスミドに加える。ＤＮＡを、１００ＵのＴ４ ＤＮＡリガーゼを使用して、１４℃において一晩ライゲーションする。そして、ライゲーションは、それぞれ２０単位のＲ．ＥｃｏＲＩ及びＲ．ＨｉｎｄＩＩＩを含有した。非切断材料のバックグラウンドを減少させるために、その後、ライゲーションした混合物を、Ｒ．ＢａｍＨＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて３７℃において１時間、製造業者の指示書に従って制限消化した。反応液を、フェノール／エーテル抽出し、次いでエタノール沈殿によって濃縮し、その後上記のようにゲル精製する。

精製したＤＮＡを、次いで、Ｈａｎａｈａｎらのプロトコル（１９９１年、「大腸菌及び他の細菌のプラスミドの形質転換（Ｐｌａｓｍｉｄ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｂａｃｔｅｒｉａ）」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２０４巻：６３〜１１３頁）に従って、コンピテントＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｔｏｐ１０Ｆ’コンピテント細菌細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換する。これらの細胞は、ＤＮＡの取り込みに対してコンピテントである。これらの細胞は、相補的ｌａｃＺ遺伝子において欠失を含有し、アンピシリン、テトラサイクリン及びカナマイシンに感受性であり、テトラサイクリンにより選択可能であり、ファージミドによる一本鎖ＤＮＡの作製を可能にする雄Ｆ’−エピソームを含有し、ＩＰＴＧにより堅固に抑制解除され得るｌａｃＩｑリプレッサー及びエンドヌクレアーゼ活性の減少のためのｅｎｄＡ１を含有する。形質転換材料を、１０ｕｇ／ｍＬアンピシリンを含む２ｘＹＴ培地プレートに播種し、３７℃において一晩成長させる。１２の単一コロニーを選択し、１００ｕｇ／ｍＬアンピシリンを含む５ｍＬの２ｘＹＴブロス中で３７℃において一晩成長させた。プラスミドＤＮＡを、迅速なプラスミド調製法（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ＆Ｄｏｌｙ、１９７９年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、７巻（６）：１５１３〜１５２３頁）を使用して調製した。ＤＮＡを、２０ｕＬの水に再懸濁した。５ｕＬの各コロニーのＤＮＡ調製品を、１０単位のＲ．ＢａｍＨＩを用いて３７℃において約２時間、制限消化した。制限消化したＤＮＡを、０．５％アガロースゲル（１×ＴＢＥ）において電気泳動させた。Ｒ．ＢａｍＨＩによって切断されていないことが観察されたＤＮＡ及び明らかな共有結合閉環状（ＣＣＣ）ＤＮＡのバンドを有するＤＮＡを、ＤＮＡの配列決定のために選択した（図３１）。これらのクローンを、Ｍ１３フォワードプライマー（配列番号７）を使用して配列決定した。

推定クローン由来の一本鎖ＤＮＡ及び未処理ファージミドクローンを、６０ｕｇ／ｍＬのアンピシリン、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーバクテリオファージ及び２５ｕｇ／ｍＬのカナマイシンを含む、５ｍｌの２×ＹＴブロスにおいて成長させた細胞から、Ｓａｍｂｒｏｏｋ＆Ｒｕｓｓｅｌｌのプロトコル（上記）を使用して調製する。これらの一本鎖調製物を、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ標識合成オリゴヌクレオチドＡからドットブロット法を使用して作製された、アルファ−３２Ｐ放射性標識プローブを使用してスクリーニングする。

ドットブロット分析の２つの陽性クローンを、１０×５００ｍＬまで拡大し、一本鎖ＤＮＡを、これらのブロスから上記のように調製して、約１ｍｇの一本鎖鋳型ＤＮＡを作製した。

ＰＥＰ−３Ｆ（ａｂ’）２ＤＮＡタンパク質コンジュゲートの作製
５，０００ｐｍｏｌ量の合成オリゴヌクレオチドＡを、１×ＰＢＳＥ中の調製した一本鎖ＤＮＡ鋳型に加える。混合物を６５℃に加熱し、１００ｍＬの水を含むビーカーにおいて、１時間かけて室温にゆっくりと冷却させる。このことにより、遊離の３’−ヒドロキシを有するチオール含有合成オリゴヌクレオチドと、上で調製した環状ＤＮＡ構造とは効率的にアニーリングされる。

アニーリングした反応液を、最終濃度が４０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、５ｍＭの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、４ｍＭのＤＴＴ及び２０００単位のＲｅｐｌｉＰＨＩ Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ並びにそれぞれ４０ｎｍｏｌのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを含有する緩衝液に加える。これにより、チオール含有合成オリゴヌクレオチドは３’ヒドロキシルにおいて伸長され、環状鋳型に基づく確定した相補的マルチマーが作製される。個々のこれらのマルチマーは、５’−チオール及び環状ＤＮＡの反復する相補的配列を含有し、「テール付き合成オリゴヌクレオチド」と称される。

テール付き合成オリゴヌクレオチド処理：
タンパク質−ＤＮＡのコンジュゲーションのために、テール付き合成オリゴヌクレオチドのチオール修飾部分を、メルカプタン（ＤＴＴ）を用いて処理し、遊離のスルフヒドリル基を作り出し、遊離のスルフヒドリル基はその後、そのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル基を介してタンパク質のアミン基と結合したＬＣ−ＳＰＤＰ（スクシンイミジル６−［３’−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド）ヘキサノエートクロスリンカーの２−ピリジルジチオ基と反応させることができる。

この手順は、通常、可能な限り短時間で実施することに留意するべきである。およそ５，０００ｐｍｏｌのテール付きＡ’合成オリゴヌクレオチドを、１０μＬの１×ＰＢＳＥ（１３６ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、１０．１ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４、１．８ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）に再懸濁し、オートクレーブにかけ、脱イオン化した水中の１ＭＤＴＴ（ジチオスレイトール）、２０μＬを加えた。反応を、室温において１５分間進行させる。この反応が完了したら、５０μＬの１×ＰＢＳＥを加え、全反応液をサイズ排除カラムに添加する。

未反応のＤＴＴはその後のステップに干渉すると思われるので、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して除去する。

Ｐ−１００（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）サイズ排除カラムを、「０」（ｍＬ）のマークで切り取った５ｍＬのプラスチックピペットを使用して調製し、シリコン処理したグラスウールを、ピペットのチップ内に配置し、オートクレーブにかけ、脱イオン化した水中の、事前に膨潤させたＰ−１００スラリーを、カラムの樹脂が「１」（ｍＬ）のマークに満ちるまで加えた。カラムを、オートクレーブにかけ、脱イオン化した５ｍＬの水ですすいだ。このカラムに、ＤＴＴ処理した合成オリゴヌクレオチドを添加した。１４の２００μＬの画分を、水を緩衝液として使用して、個別の微小遠心分離管に回収した。ＤＮＡは２６０ｎｍの波長において吸光度を有するので、この波長において吸光度を有する試料を組み合わせた。ＤＮＡを吸収する画分を合わせ、６０℃において真空遠心分離で乾燥させた。

ＰＥＰ−３Ｆ（ａｂ’）２処理：
ＰＥＰ−３Ｆ（ａｂ’）２を、標準的手順を使用して、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃのヤギ抗ＴＮＩペプチド３抗体、カタログ番号Ｇ−１２９−Ｃのペプシン切断により調製した。およそ２００μＬ中１００ｕｇのこのタンパク質を、１０μＬの２０ｍＭのＬＣ−ＳＰＤＰと、室温において混合しながら１．５時間反応させた。次いで、先に記載したように、Ｓ−３００カラムに試料を添加し、処理した。

最大の吸収ピークを含む画分を合わせ、上記のように、最終容量約５００μＬまで透析ろ過により濃縮した。濃縮ＬＣ−ＳＰＤＰ活性化ＰＥＰ−３Ｆ（ａｂ’）２を、乾燥させ、メルカプタン処理したチオールＡテール付きＤＮＡに直接加えた。この溶液を穏やかにピペッティングし、乾燥ＤＮＡの溶解を確実にした。反応液を、振とうしながら４℃において一晩インキュベートした。この材料を、先に記載のようにＳ−３００カラムにおいて精製した。

ＤＮＡに基づくコンジュゲートによる被験物の検出：
４μＬのＰＥＰ−３Ｆ（ａｂ’）２−テール付きＤＮＡを、４μＬのＡＬＰ−Ａ’［Ｅ００３０］コンジュゲートに加え、５１．９ｐｇのｃＴｎＩＭＷＣ（製造業者実用キャリブレータ）を、１６μＬの血漿に加え、コンジュゲートを含まない「イムノ」ｉ−ＳＴＡＴカートリッジ（捕捉抗体と結合したビーズ、起電性基質を含有するが、ｃＴｎＩ検出コンジュゲートは含有しない標準的ｃＴｎＩカートリッジ、この能力は上記の新たに合成されたコンジュゲートにより供給される）において試験した。ＭＷＣを含まない対照もまた実施した。

本発明を、例示的実施形態及び例を参照して記載してきたが、この記載は限定の意味で解釈されることは意図していない。したがって、例示的実施形態及び本発明の他の実施形態の様々な変更は、この記載を参照すれば当業者には明らかであると思われる。したがって、添付の特許請求の範囲が任意のこのような変更形態又は実施形態を含むであろうことが企図される。本明細書において言及したすべての公報、特許及び特許出願は、各個々の公報、特許又は特許出願が具体的且つ個別に、その全体が参照により組み込まれることを示したのと同じ程度に、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (26)

1. 標的被験物を含有することが疑われる生物試料を受け入れるための試料流入口、
   電極を含有する導管、
   洗浄液を含有する領域、及び
   廃液チャンバー、
   を含み、
   前記電極上で免疫測定法が形成され、この免疫測定法が、
   前記標的被験物に結合した固定化一次抗体、
   第１の一本鎖ヌクレオチドに結合した、前記標的被験物に対する二次抗体、及び
   第１の一本鎖ヌクレオチドと相補的な塩基対を有する第２の一本鎖ヌクレオチドとそれぞれ結合した１種又は複数種のシグナル成分、
   を含み、
   洗浄液が、前記導管の中の前記電極から前記廃液チャンバーへと前記生物試料を洗浄することができる、免疫測定法を実施するための単回使用カートリッジ。
2. １種又は複数種のシグナル成分が、蛍光成分、色成分及び放射性成分からなる群から選択される非酵素的検出部分を含む、請求項１に記載のカートリッジ。
3. １種又は複数種のシグナル成分が１種又は複数種のシグナル酵素を含み、カートリッジが、
   酵素基質を含有する領域をさらに含み、
   前記酵素基質が前記１種又は複数種のシグナル酵素と反応して、前記生物試料中の前記標的被験物の量に比例して前記電極においてシグナルを発生させることができる、請求項１に記載のカートリッジ。
4. 一次抗体が標的被験物の第１のエピトープと結合する、請求項３に記載のカートリッジ。
5. 二次抗体が標的被験物の第２のエピトープと結合する、請求項３に記載のカートリッジ。
6. １種又は複数種のシグナル酵素が、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、ウレアーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ及びベータガラクトシダーゼからなる群から選択される、請求項３に記載のカートリッジ。
7. 第１のヌクレオチドと共有結合したＦＡＢ断片、及び
   第２のヌクレオチドとそれぞれ共有結合した１種又は複数種のシグナル成分、
   を含み、
   前記第１のヌクレオチドが１つ又は複数の反復配列を有し、第２のヌクレオチドが前記第１のヌクレオチド上の１つ又は複数の反復配列の１つに結合しており、ＦＡＢ断片とシグナル成分との比が反復配列の数によって調節される、免疫測定法において使用するための組成物。
8. １種又は複数種のシグナル成分が、蛍光成分、色成分及び放射性成分からなる群から選択される非酵素的検出部分を含む、請求項７に記載の組成物。
9. １種又は複数種のシグナル成分が、１種又は複数種のシグナル酵素を含む、請求項７に記載の組成物。
10. 第１のヌクレオチド及び第２のヌクレオチドが、５’末端、３’末端又はヌクレオチド配列内部にカップリング部分を含有する、請求項９に記載の組成物。
11. カップリング部分が、アミノ修飾因子、チオール修飾因子及びジチオールからなる群から選択される修飾ホスホラミダイトから作製される、請求項１０に記載の組成物。
12. 合成オリゴヌクレオチドの３’末端又は５’末端が、保護化学基を組み込むことによって、試料中の内因性エキソヌクレアーゼ活性から保護される、請求項９に記載の組成物。
13. 保護化学基がホスホロチオエートである、請求項１２に記載の組成物。
14. １種又は複数種のシグナル酵素が、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、ウレアーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ及びベータガラクトシダーゼからなる群から選択される、請求項９に記載の組成物。
15. 第１のヌクレオチドが、少なくとも３つの１種又は複数種のシグナル酵素の、少なくとも３つの第２の配列と結合する少なくとも３つの反復配列を有する、請求項９に記載の組成物。
16. 第１のヌクレオチドが、少なくとも３つの１種又は複数種のシグナル酵素の、少なくとも５つの第２の配列と結合する少なくとも５つの反復配列を有する、請求項９に記載の組成物。
17. 被験物が固定化された一次抗体及び二次抗体と結合するように生物試料を接触させて、免疫測定法を形成するステップであって、二次抗体が合成ヌクレオチド架橋を介して少なくとも１種のシグナル酵素と結合する上記ステップ、
    前記免疫測定法から前記生物試料を洗浄するステップ、及び
    シグナル酵素との反応により発生したシグナルに基づいて被験物の存在を決定するステップ、
    を含む、生物試料中の被験物の存在を決定する方法。
18. （ａ）患者由来の試料を、ｃＴｎＩ上の第１のエピトープと結合することができる一次抗体が結合された表面に適用するステップ、
    （ｂ）ｃＴｎＩ上の第２のエピトープと結合することができる二次抗体を加えるステップであって、この二次抗体が、シグナル成分と結合した１つ又は複数の第２の鎖ポリヌクレオチドと結合した第１の鎖ポリヌクレオチド配列をさらに含む上記ステップ、及び
    （ｃ）二次抗体の結合の程度を決定するステップ、
    を含む、患者が心筋梗塞を患っている可能性があるかどうかを決定する方法。
19. シグナル成分がシグナル酵素を含む、請求項１８に記載の方法。
20. ステップ（ａ）より前に患者が心筋梗塞を患っていない、請求項１８に記載の方法。
21. シグナルコンジュゲートの少なくとも８０ｍｏｌ％が、シグナルコンジュゲート当たり２から２０のシグナル成分を有するシグナルコンジュゲートを含む、シグナルコンジュゲートのバッチ。
22. シグナルコンジュゲートの少なくとも８０ｍｏｌ％が、シグナルコンジュゲート当たり５から１０のシグナル成分を有する、請求項２１に記載のシグナルコンジュゲートのバッチ。
23. シグナルコンジュゲートの少なくとも８０ｍｏｌ％が、シグナルコンジュゲート当たり１から４のシグナル抗体を有するシグナルコンジュゲートを含む、シグナルコンジュゲートのバッチ。
24. シグナルコンジュゲートの少なくとも８０ｍｏｌ％が、シグナルコンジュゲート当たり２のシグナル抗体を有する、請求項２３に記載のシグナルコンジュゲートのバッチ。
25. シグナルコンジュゲートの少なくとも８０ｍｏｌ％が、０．５から２０までのシグナル成分対シグナル抗体のモル比を有するシグナルコンジュゲートを含む、シグナルコンジュゲートのバッチ。
26. シグナルコンジュゲートの少なくとも８０ｍｏｌ％が、０．５から５までのシグナル成分対シグナル抗体のモル比を有する、請求項２５に記載のシグナルコンジュゲートのバッチ。