KR20070090154A

KR20070090154A - 표적 물질의 검출 방법

Info

Publication number: KR20070090154A
Application number: KR1020077010904A
Authority: KR
Inventors: 후토시 시바사키; 가즈히코 사카타
Original assignee: 도쿄 메트로폴리탄 오거니제이션 포 메디칼 리서치; 신세라 테크놀로지즈 가부시키가이샤
Priority date: 2004-11-01
Filing date: 2005-11-01
Publication date: 2007-09-05
Also published as: WO2006049289A1; JP4111984B2; EP1813948A4; CN101142484A; AU2005301593A1; US20080318340A1; EP1813948A1; KR101290034B1; JPWO2006049289A1

Abstract

본 발명은, 피험 시료에 포함되는 복수 종류의 표적 물질을 식별하여 검출하는 방법으로서, 지지체에 고정된 표적 물질 및/또는 고정되어 있지 않은 표적 물질과, 당해 표적 물질의 종류에 대응하여 식별할 수 있도록 표지 처리된 결합 물질을 접촉시켜 당해 표적 물질과 당해 결합 물질과의 복합체를 형성시키는 공정, 및 상기 복합체를 형성한 결합 물질 중의 표지를 검출하는 공정을 포함한, 표적 물질의 검출 방법을 제공한다.

표적 물질, 결합 물질

Description

표적 물질의 검출 방법{METHOD OF DETECTING TARGET SUBSTANCES}

본 발명은, 표적 물질과 그것에 특이적으로 결합할 수 있는 물질과의 반응 (예를 들어 항원 항체 반응) 을 이용한 표적 물질의 검출 방법에 관한 것이다. 자세하게는, 피험 시료에 포함되는 복수 종류의 표적 물질을 식별하고 검출하는 방법에 관한 것이다.

모노클로날 항체 제작 기술의 확립에 의해, 특정한 항원에 대해서 특이적으로 반응할 수 있는 항체의 입수가 가능해져, 항원 항체 반응의 특이성을 이용한 항원 검출의 어세이계의 개발·개량이, 연구·임상 등의 모든 분야에 있어서도 불가결한 것으로 되어 있다. 이러한 어세이계에서는, 일반적으로, 항원에 반응시키는 항체에 특정한 표지를 실시하고, 반응 후에 당해 표지를 검출함으로써 항원의 검출을 대신한다는 것이다. 또, 검출 감도를 보다 높이기 위해, 표지의 종류나 검출 방법 등의 연구도 지금까지 다양하고 빈번하게 실시되고 있고, 예를 들어, 아비딘·비오틴 시스템, 형광 색소, 방사성 동위 원소를 사용하는 방법 외에, 보다 검출 감도를 높인 방법으로서, Immuno-PCR법 (예를 들어 「T.Sano et al., Science, vol.258, 120-122 (1992)」참조.), Double Determinant Immuno-PCR법 (예를 들어 「이마이 히로시, 스즈키 아사꼬, 히노다 유우지, Immuno-PCR 를 이용한 미량 항원 검출법, 단백질 핵산 효소, 요오도사, 1996년, Vol.41, No.5, p.614-617」참조.), 올리고뉴클레오티드와 DNA 덴드리머를 사용하고 웨스턴 블롯법을 이용하여 검출하는 방법 (예를 들어 「일본 특허공표공보 2001-503517호」참조.) 등을 들 수 있다.

발명의 개시

그러나, 상기 검출 방법은 모두, 피험 시료에 포함되는 복수 종류의 표적 물질 (항원) 중, 특정한 1종만이 검출 대상이 되는 방법으로서, 특정한 2종 이상의 표적 물질을 한번에 식별하여 검출할 수 있는 방법은 지금까지 없었다. 그로 인해, 이들 2종 이상의 표적 물질을 모두 검출하고자 하는 경우에는, 그 종류마다 별도의 검출계로 실시하지 않으면 안되고, 검출에 필요로 하는 시간이나 수고라는 검출 효율면에서 문제가 있었다. 현실적으로 봐도, 최근에는, 피험 시료로부터 다종 다양한 표적 물질 (바이오 마커, 원인 물질, 병원체 등) 의 검출이 요청되는 케이스가 매우 많아지고 있다. 예를 들어, 임상 검사의 분야에 있어서는, 암의 진단이나 항암제의 약효 평가, 뇌졸중이나 심근경색의 진단, 및 감염증에 있어서의 병원체의 특정 등의 케이스가 있고, 식품이나 환경의 분야에 있어서는, 잔류 농약이나 세균에 의한 식품 오염 물질의 특정, 및 다이옥신이나 폴리염화비페닐 (PCB) 등의 환경 오염 물질의 특정 등의 케이스가 있다. 이로 인해, 한번의 검사 처리에서 그들을 동시에 검출할 수 있는 방법이 갈망되고 있다.

그래서, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 피험 시료에 포함되는 복수 종류의 표적 물질을 한번에 식별하여 검출할 수 있는, 표적 물질의 검출 방법을 제공하는 것에 있다.

본 발명자는, 상기 과제를 해결할 수 있도록 예의 검토를 실시하였다. 그 결과, 피험 시료에 포함되는 복수 종류의 표적 물질 중, 검출하고자 하는 2종 이상의 표적 물질의 각각에 특이적으로 결합할 수 있는 물질 (결합 물질) 을 준비하고, 각각의 결합 물질은 표적 물질의 종류에 대응하여 식별할 수 있도록 표지 처리하고, 표적 물질과 결합 물질의 특이적 결합 반응에 의해 양물질의 복합체를 형성하도록 하면, 그 후의 검출 단계에 있어서 각각의 복합체에 고유의 표지를 동시 또한 명확하게 구별하여 검출할 수 있는 것 (이른바 동시 다항목 검출) 을 발견하여, 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명은 이하와 같다.

(1) 피험 시료에 포함되는 복수 종류의 표적 물질을 식별하고 검출하는 방법으로서,

(i) 지지체에 고정된 표적 물질 및/또는 고정되어 있지 않은 표적 물질과, 당해 표적 물질의 종류에 대응하여 식별할 수 있도록 표지 처리된 결합 물질을 접촉시켜 당해 표적 물질과 당해 결합 물질의 복합체를 형성시키는 공정 (이하, 표적 물질-결합 물질 복합체의 형성 공정), 및

(ii) 상기 복합체를 형성한 결합 물질 중의 표지를 검출하는 공정 (이하, 표지 검출 공정)

을 포함한, 상기 방법.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 결합 물질 중의 표지 부분은, 적어도 어댑터 부분을 개재하여 당해 결합 물질에 고정된 것이어도 된다. 당해 어댑터 부분으로서는, 예를 들어, 프로테인 G, 프로테인 A, 프로테인 L, 및 프로테인 A 와 프로테인 G 와의 융합 단백질로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종을 들 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 결합 물질로서는, 예를 들어, 표지 물질로서의 올리고뉴클레오티드 사슬과의 복합체 (올리고뉴클레오티드 복합체) 를 형성하는 것을 들 수 있다. 또 상기 표지 처리로서는, 예를 들어, 상기 올리고뉴클레오티드 사슬에 실시되는 하기 (i)~(ix) 의 처리를 들 수 있다.

(i) 제한 효소에 의한 절단 부위를 형성하는 처리

(ii) PCR 에서 증폭 가능한 영역을 형성하는 처리

(iii) 방사성 동위체 원소를 함유시키는 처리

(iv) 형광 색소를 결합시키는 처리

(v) 효소를 결합시키는 처리

(vi) 광조사에 의한 절단 부위를 형성하는 처리

(vii) 활성 산소에 의한 절단 부위를 형성하는 처리

(viii) 표지 처리 덴드리머를 결합시키는 처리

(ix) 염기의 종류에 있어서 적어도 1염기의 차이를 형성하는 처리

또한, 상기 표지를 검출하는 공정으로서는, 예를 들어, 상기 PCR 에 의해 증폭된 산물을 전기 영동에 의해 검출하는 공정을 들 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 결합 물질로서는, 예를 들어, 표지 물질로서의 올리고펩티드 사슬과의 복합체 (올리고펩티드 복합체) 를 형성하는 것을 들 수 있다. 또 상기 표지 처리로서는, 예를 들어, 상기 올리고펩티드 사슬에 실시되는 하기 (i)~(vii) 의 처리를 들 수 있다.

(i) 단백질 분해 효소에 의한 절단 부위를 형성하는 처리

(ii) 방사성 동위체 원소를 함유시키는 처리

(iii) 형광 색소를 결합시키는 처리

(iv) 효소를 결합시키는 처리

(v) 광조사에 의한 절단 부위를 형성하는 처리

(vi) 활성 산소에 의한 절단 부위를 형성하는 처리

(vii) 표지 처리 덴드리머를 결합시키는 처리

본 발명의 방법에 있어서, 상기 표적 물질로서는, 예를 들어 항원을 들 수 있고, 상기 결합 물질로서는, 예를 들어 항체를 들 수 있다.

(2) 표적 물질의 종류에 대응하여 식별할 수 있도록 표지 처리된 복수 종류의 결합 물질을 포함한, 표적 물질의 식별 검출용 키트.

도 1 은, 제한 효소 반응을 이용하여 항원을 식별 검출하는 하나의 실시예를 나타내는 모식 플로우도이다.

도 2 는, Immuno-PCR법을 이용하여 항원을 식별 검출하는 하나의 실시예를 나타내는 모식 플로우도이다.

도 3A 는, 프리라디칼을 이용하여 항원을 식별 검출하는 하나의 실시예를 나 타내는 개략도이다.

도 3B 는, 올리고펩티드 핵산사슬이 복합화된 항체를 이용하여 항원을 식별 검출하는 하나의 실시예를 나타내는 개략도이다.

도 4 는, 실시예 1 에 있어서 복합 항체의 검정을 실시했을 때의 아가로스 겔 전기 영동 후의 밴드를 나타내는 사진이다.

도 5 는, 실시예 1 에 있어서 복합 항체를 이용한 식별 검출을 실시했을 때의 아가로스 겔 전기 영동 후의 밴드를 나타내는 사진이다.

도 6 은, 실시예 2 에 있어서의 코스모아이 SV1210 에서의 측정 결과를 나타내는 차트이다. 또한, 차트에 있어서의 피크 상의 숫자는, 피크 면적 (올리고뉴클레오티드 농도) 을 나타내는 값이다.

도 7 은, 어댑터 부분을 통하여 올리고펩티드 핵산사슬이 복합화된 항체를 이용하고, 항원을 식별 검출하는 하나의 실시예를 나타내는 개략도이다.

도 8 은, 실시예 3 에 있어서 DNA 시퀀스 ABI-3100 에 의해 GeneScan 해석을 실시한 결과를 나타내는 차트이다.

도 9 는, 참고예 1 에 있어서의 ELISA법에서의 검출 결과를 나타내는 도면이다. (a) 는 각 웰에서의 발색 모습을 나타내는 사진이며, (b) 는 ELISA 리더에서의 측정 결과를 나타내는 그래프이다.

도 10 은, 참고예 1 에 있어서의 본 발명의 검출 방법에 의한 검출 결과 (DNA 시퀀스 ABI-3100 에 의한 GeneScan 해석의 결과) 를 나타내는 차트이다.

도 11 은, 도 10 과 동일하게, 참고예 1 에 있어서의 본 발명의 검출 방법에 의한 검출 결과 (DNA 시퀀스 ABI-3100 에 의한 GeneScan 해석의 결과) 를 나타내는 차트이다.

도 12 는, 참고예 2 에 있어서의 본 발명의 검출 방법에 의한 검출 결과 (DNA 시퀀스 ABI-3100 에 의한 GeneScan 해석의 결과) 를 나타내는 차트이다.

도 13 은, 도 12 에 나타내는 검출 결과의 플롯, 및 단백량 (항원량) 과 검출치 (시그널치) 와의 상관을 나타내는 그래프이다.

부호의 설명

1 ： 항원, 2 ： 웰 플레이트, 3 ： 표지 처리 항체, 4 ： 표지 처리 항체, 5 ： 뉴클레오티드 사슬, 6 ： 뉴클레오티드 사슬, 7 ： 제한 효소 사이트, 8 ： 제한 효소 사이트, 9 ： 항원-항체 복합체, 10 ： 항원-항체 복합체, 11 ： 뉴클레오티드 단편, 12 ： 뉴클레오티드 단편, 13 ： 표지 처리 항체, 14 ： 표지 처리 항체, 15 ： 뉴클레오티드 사슬, 16 ： 뉴클레오티드 사슬, 17 ： 항원-항체 복합체, 18 ： 항원-항체 복합체, 19 ： F 프라이머, 20 ： R 프라이머, 21 ： 뉴클레오티드 단편 (PCR 산물), 22 ： 뉴클레오티드 단편 (PCR 산물)

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

이하, 본 발명의 검출 방법에 대해 자세하게 설명하는데, 본 발명의 범위는 이들의 설명에 구속되지 않고, 이하의 예시 이외에 대해서도, 본 발명의 취지를 저해하지 않는 범위에서 적절히 변경하여 실시할 수 있다.

또한, 본 명세서에 있어서 인용된 모든 선행 기술 문헌, 그리고 공개 공보, 특허 공보 및 그 밖의 특허 문헌은, 참조로서 본 명세서에 편입시킬 수 있다.

1. 본 발명의 개요

본 발명의 검출 방법은, 상기 서술한 대로, 표적 물질-결합 물질 복합체의 형성 공정과, 표지 검출 공정을 포함한 방법인데, 우선 이하의 4가지의 실시 형태에 의해 본 발명의 방법 전체의 개요를 예시하고, 이어서 각 공정마다 자세하게 설명한다. 또한, 이하의 (1)~(4) 의 예시는, 모두, 표적 물질 및 결합 물질의 일례로서 항원 및 항체를 이용하여 설명한 것인데, 표적 물질 및 결합 물질이 항원 및 항체 이외의 경우에 대해서도 동일한 설명을 적용할 수 있다.

(1) 제 1 실시 형태는, 도 1 의 모식 플로우도에 나타내는 바와 같이, 우선, 지지체가 되는 웰 플레이트 (2) 에, 표적 물질로서 복수 종류 (도 1 에서는 4 종류) 의 항원 (1) 을 고정시키고 (도 1(a)), 이들 항원 (1) 에 대한 결합 물질로서, 올리고뉴클레오티드 복합 항체 (표지 처리 항체 ; 3, 4) 를 첨가한다 (도 1(b)). 항체 (3) 은, 올리고뉴클레오티드 사슬 (5) 와 복합체를 형성하는 것이며, 항체 (4) 는, 올리고뉴클레오티드 사슬 (6) 와 복합체를 형성하는 것이다. 항체 (3, 4) 는, 모두, 각각의 올리고뉴클레오티드 사슬 (5, 6) 중에 공통의 제한 효소 사이트 (7, 8 ;예를 들어, EcoRⅠ등) 를 갖는다. 올리고뉴클레오티드 사슬 (5, 6) 의 길이 (뉴클레오티드 배열) 는, 각각, 제한 효소 사이트 (7, 8) 로부터 말단 부분의 길이가 서로 상이하도록 설계 (또는 선택) 되어 있다. 도 1 에서는, 항체 (3) 인 쪽이 올리고뉴클레오티드 사슬의 길이가 짧다.

이어서, 항원 항체 반응에 의해, 항체 (3, 4) 를 각각 특정한 항원에 결합시켜, 항원-항체 복합체 (9, 10) 를 형성시킨다 (도 1(c)). 당해 복합체를 형성 하지 않았던 항원은, 세정에 의해 제거한다 (도 1(d)).

그 후, 제한 효소 사이트 (7, 8) 를 절단하는 제한 효소를 첨가하여 반응시키고, 항원-항체 복합체 (9, 10) 를 형성하는 항체 (3, 4) 중의 올리고뉴클레오티드 사슬 (5, 6) 의 각각으로부터, 길이가 상이한 뉴클레오티드 단편 (11, 12) 을 얻는다(도 1(e)). 얻어진 단편의 길이를, 아가로스 겔 등을 이용한 전기 영동법에 의해 식별 검출한다 (도 1(f)).

도 1(f) 에서는, 뉴클레오티드 단편 (11, 12) 에 대응하는 길이가 상이한 2종의 밴드가 검출되고 있다. 이로써, 4종의 항원을 포함한 피험 시료 중에는, 검출 대상이 되는 2종의 항원이 포함되어 있었던 것을 확인할 수 있다.

(2) 제 2 실시 형태는, 도 2 의 모식 플로우도에 나타내는 바와 같이, 우선, 지지체가 되는 웰 플레이트 (2) 에, 표적 물질로서 복수 종류 (도 2 에서는 4 종류) 의 항원 (1) 을 고정시키고 (도 2(a)), 이들 항원 (1) 에 대한 결합 물질로서, 올리고뉴클레오티드 복합 항체 (표지 처리 항체 ; 13, 14) 를 첨가한다 (도 2(b)). 항체 (13) 는, 올리고뉴클레오티드 사슬 (15) 와 복합체를 형성하는 것이며, 항체 (14) 는, 올리고뉴클레오티드 사슬 (16) 과 복합체를 형성하는 것이다. 항체 (13, 14) 는, 모두, 그 올리고뉴클레오티드 사슬 (15, 16) 중에, 공통되는 PCR 프라이머 (F 프라이머 (19), R 프라이머 (20)) 가 결합할 수 있는 배열을 갖는다. 올리고뉴클레오티드 사슬 (15, 16) 의 길이 (뉴클레오티드 배열) 는, 각각, PCR (Immuno-PCR) 에 의해 증폭되는 배열 (PCR 산물) 의 길이가 서로 상이하도록 설계 (또는 선택) 되어 있다. 구체적으로는, 도 2(e)(f) 에 나타내는 바와 같이, 항 체 (13) 중의 올리고뉴클레오티드 사슬 (15) 로부터는 αβ간의 배열이 증폭되고, 항체 (14) 중의 올리고뉴클레오티드 사슬 (16) 으로부터는 γδ간의 배열이 증폭되게 되어, αβ간의 배열인 쪽이 짧다.

이어서, 항원 항체 반응에 의해, 항체 (13, 14) 를 각각 특정한 항원에 결합시켜, 항원-항체 복합체 (17, 18) 를 형성시킨다 (도 2(c)). 당해 복합체를 형성하지 않았던 항원은, 세정에 의해 제거한다 (도 2(d)).

그 후, PCR 프라이머 (F 프라이머 (19), R 프라이머 (20)) 를 이용하여 PCR (Immuno-PCR) 을 실시하고 (도 2(e)), 항원-항체 복합체 (17, 18) 를 형성하는 항체 (13, 14) 중의 올리고뉴클레오티드 사슬 (15, 16) 의 각각으로부터, PCR 산물로서, 길이가 상이한 뉴클레오티드 단편 (21 ; αβ간을 증폭한 단편) 및 (22 ; γδ간을 증폭한 단편) 을 얻는다 (도 2(f)). 얻어진 단편의 길이를, 아가로스 겔 등을 이용한 전기 영동법에 의해 식별 검출한다 (도 2(g)).

도 2(g) 에서는, 뉴클레오티드 단편 (21, 22) 에 대응하는 길이가 상이한 2종의 밴드가 검출되고 있다. 이로써, 4종의 항원을 포함한 피험 시료 중에는, 검출 대상이 되는 2종의 항원이 포함되어 있었던 것을 확인할 수 있다.

(3) 제 3 실시 형태는, 도 3A 의 모식도 (상) 에 나타내는 바와 같이, 특정한 항원에 대해, 당해 항원 중의 상이한 에피토프를 각각 인식하는 항체 (항체 세트) 를 준비한다. 구체적으로는, 일방의 항체에는, HRP 나 Nitric oxide synthase 나 광증감제 등으로 수퍼옥사이드나 그 밖의 프리라디칼을 생성할 수 있는 효소 또는 화학 물질을 복합화시켜 둔다. 타방의 항체에는, 수퍼옥사이드나 그 밖의 프리라디칼로 개열 가능한 크로스 링커 (예를 들어 N-hydroxysuccinimide-4-azidobenzoate (HSAB)) 를 통하여 올리고뉴클레오티드 사슬 등을 복합화시킨다. 여기에서, 타방의 항체 중의 올리고뉴클레오티드 사슬 등은, 당해 항체가 인식하는 항원의 종류에 따라 상이한 길이가 되도록 설계한다.

우선, 지지체 (웰 플레이트 등) 에 고정된 및/또는 고정되어 있지 않은 복수 종류의 항원 (표적 물질) 에, 준비해 둔 항체 (결합 물질) 를 첨가한다.

이어서, 항원 항체 반응에 의해, 항체를 각각 특정한 항원에 결합시켜, 항원 항체 복합체를 형성시킨다. 당해 복합체를 형성하지 않았던 항원 혹은 항체는, 검출 목적에 따라, 세정에 의해 제거하거나, 혹은 세정하지 않은 대로 해둔다.

이어서, 수퍼옥사이드나 그 밖의 프리라디칼을 생성하는 시약을 첨가한다. 그 후, 각 항원에 대응한 길이가 상이한 올리고뉴클레오티드 사슬 함유 단편을 얻을 수 있다. 얻어진 단편의 길이를, 아가로스 겔을 이용한 전기 영동법이나 마이크로칩 등에 의해 식별 검출한다.

또, 이 제 3 실시 형태를 이용하면, 도 3A 의 모식도 (하) 에 나타내는 바와 같이, 복합체의 형성 반응을 확인할 수도 있다. 당해 형성 반응으로서는, 예를 들어, 세포막 수용체의 2량체화, 및 세포내 단백 결합 등을 들 수 있다. 이로써, 암 등의 진단이나 발증기전의 해명에 현재 또는 장래 필요라고 생각되는 기술을 제공할 수 있다.

또한, 제 3 실시 형태에서는, 검출 환경은 액상 및 고상의 구별을 불문한다.

(4) 제 4 실시 형태는, 도 3B 의 모식도에 나타내는 바와 같이, 우선, 지지 체 (웰 플레이트 등) 에 고정된 및/또는 고정되어 있지 않은 복수 종류의 항원 (표적 물질) 에, 결합 물질로서의 항체 (표지 처리 항체) 를 첨가한다. 당해 항체는, 올리고펩티드 사슬 부분과 올리고뉴클레오티드 사슬 부분을 연결한 하이브리드사슬이 복합화된 항체이다. 올리고펩티드 사슬 부분은, 특정한 단백질 분해 효소에 의해 절단되는 부위를 갖도록 설계하고, 올리고뉴클레오티드 사슬 부분은, 상기 항체가 인식하는 항원의 종류에 따라 상이한 길이가 되도록 설계한다. 이어서, 항원 항체 반응에 의해, 표지 처리 항체를 각각 특정한 항원에 결합시켜, 항원 항체 복합체를 형성시킨다. 당해 복합체를 형성하지 않았던 항원 혹은 표지 항체는, 검출 목적에 따라, 세정에 의해 제거하거나, 혹은 세정하지 않은 대로 해둔다.

이어서, 형성한 항원 항체 복합체를 특이적으로 인식하는 항체 또는 보체(C1 등) 로서 상기 특정한 단백질 분해 효소가 복합화된 것을 첨가한다. 당해 항체 또는 보체가, 항원 항체 복합체에 결합하면, 상기 단백질 분해 효소가, 가까이 존재하는 항원 항체 복합체 중의 올리고펩티드 사슬 부분을 절단한다. 그 결과, 각 항원의 종류에 대응한 길이가 상이한 올리고뉴클레오티드 사슬 함유 단편을 얻을 수 있다. 얻어진 단편의 길이를, 아가로스 겔을 이용한 전기 영동법이나 마이크로칩등에 의해 식별 검출한다.

이 제 4 실시 형태를 이용하면, 공지된 샌드위치법과는 상이하고, 목적으로 하는 항원에 대한 1종류의 에피토프를 인식하는 항체로 항원을 검출할 수 있다.

또한, 제 4 실시 형태에서는, 검출 환경은 액상 및 고상의 구별을 불문한다.

2. 표적 물질-결합 물질 복합체의 형성 공정

본 발명의 검출 방법은, 지지체에 고정된 복수 종류의 표적 물질, 및/또는 지지체에 고정되어 있지 않은 복수 종류의 표적 물질과, 당해 표적 물질의 종류에 대응하여 식별할 수 있도록 표지 처리된 결합 물질을 접촉시켜, 당해 표적 물질과 당해 결합 물질과의 복합체를 형성시키는 공정을 포함한 방법이다. 또한, 상기「결합 물질」이란, 특정한 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하고, 항원 (표적 물질) 에 대한 항체 등을 예시할 수 있다.

(1) 지지체

본 발명에 있어서 이용할 수 있는 지지체로서는, 항원 등의 표적 물질을 고정할 수 있고, 당해 표적 물질에, 항체 등의 결합 물질 (용액) 을 접촉시킬 수 있는 것이면 되고, 한정은 되지 않는다. 이러한 지지체로서는, 통상, 불용성의 재질 및 형상 등의 것이 이용된다. 예를 들어, 항원 항체 반응에 의한 어세이계에 이용할 수 있는 지지체가 바람직하고, 구체적으로는, 멀티플라스틱 웰 플레이트, 플라스틱 비즈, 라텍스 비즈, 자성 비즈, 플라스틱 튜브, 나일론 막, 니트로셀룰로오스 막 등을 들 수 있다.

(2) 표적 물질

본 발명의 방법에 있어서 검출 대상으로 하는 표적 물질은, 피험 시료 (자세하게는 동일한 피험 시료) 에 포함되는 복수 종류의 표적 물질이다. 당해 표적 물질의 개개의 종류는 한정되지 않는다. 이러한 표적 물질로서는, 예를 들어, 각종 단백질 (항체 단백질도 포함한다), 펩티드 (올리고펩티드, 폴리펩티드 등), 다당류, 당지질, 각종 핵산 (DNA 나 RNA), 및 그 밖의 저분자의 화학 합성물이나 생체 성분 등을 들 수 있고, 그 중에서도, 항원이 될 수 있는 것 (즉, 항체 단백질이 존재할 수 있는 것 또는 제작 가능한 것) 이 바람직하다. 또한, 다른 실시 형태로서, 단일 종류의 표적 물질을 검출 대상으로 하고, 표지 처리된 결합 물질을 복수 종류 이용하여, 표적 물질이 어느 결합 물질에 대해서 특이적인지를 특정하는 (즉 표적 물질의 종류를 특정하는) 어세이계로 할 수도 있다.

상기 피험 시료로서는, 예를 들어, 생체 성분 (조직이나 혈액), 식육이나 야채 등의 식품류, 토양이나 하천수, 연소 폐기물 등을 들 수 있는데, 한정은 되지 않는다.

상기 피험 시료에 포함되는 표적 물질의 종류수는, 복수 (적어도 2종류) 이면 잘 한정되지 않지만, 본 발명의 방법에 의하면, 예를 들어, 10종류 이상이어도 특정한 표적 물질을 명확하게 식별 검출할 수 있고, 또 50종류 이상이어도 되며, 또한 100종류 이상이어도 된다.

상기 피험 시료 중의 표적 물질의 농도는, 한정은 되지 않지만, 본 발명 방법에 의하면, 예를 들어, 피험 시료 1μL당 표적 물질이 ng 오더 이하의 농도여도 되고, 특정한 표적 물질을 명확하게 식별 검출할 수 있고, 또 pg 오더 이하여도 되며, 나아가서는 fg 오더 이하여도 된다. 특히, 식별 처리된 결합 물질로서, 하기(i)~(iv) 의 결합 물질 (후에 상세히 서술한다) 등을 이용하는 경우에는, 보다 낮은 표적 물질 농도여도 높은 감도로 식별 검출할 수 있고, 그 중에서도 (ii) 또는 (iii) 의 결합 물질을 이용하는 경우가 바람직하다.

(i) PCR 에서 증폭 가능한 영역을 갖는 올리고뉴클레오티드 사슬과의 복합체를 형성하고 있는 결합 물질

(ii) 형광 색소를 결합시킨 올리고뉴클레오티드 사슬 또는 올리고펩티드 사슬과의 복합체를 형성하고 있는 결합 물질

(iii) 방사성 동위체 원소를 함유시키거나 또는 방사성 물질을 결합시킨 올리고뉴클레오티드 사슬 또는 올리고펩티드 사슬과의 복합체를 형성하고 있는 결합 물질

(iv) 표지 처리 덴드리머를 결합시킨 올리고뉴클레오티드 사슬 또는 올리고펩티드 사슬과의 복합체를 형성하고 있는 결합 물질

본 발명의 방법에 있어서는, 표적 물질을 지지체에 고정시킨 후에 표지 처리된 결합 물질 (용액) 과 접촉시켜, 이로써 표적 물질과 결합 물질과의 특이적 결합 반응을 실시하도록 해도 되고, 표적 물질을 지지체 등에 고정시키지 않고 당해 반응을 실시하도록 해도 되며, 또는 이들을 조합하여 실시하도록 해도 되고, 한정은 되지 않는다.

표적 물질을 지지체에 고정시키는 방법으로서는, 예를 들어, 지지체 표면에 직접 표적 물질을 고정시키는 방법, 표적 물질에 특이적으로 결합하는 항체를 미리 지지체 표면에 결합시켜 고정시키고, 그 후, 당해 고정된 항체에 표적 물질을 결합 시킴으로써, 간접적으로 고정시키는 방법 등을 들 수 있는데, 한정은 되지 않는다. 후자의 간접적인 고정 방법의 경우, 표적 물질이 될 수 있는 다종 다양한 물질 중 검출 대상이 될 수 있는 물질을 미리 선발할 수 있으므로, 검출 감도나 검출 정밀 도를 높일 수 있다. 또한, 후자의 고정 방법에 있어서, 후에 이용하는 표지 처리된 결합 물질도 항체인 경우에는, 지지체에 직접 고정시키는 항체로서는, 통상, 후에 이용하는 항체와는 표적 물질 (항원) 에 대해서 인식하는 에피토프가 상이하다는 것을 이용한다.

표적 물질을 지지체에 고정시키는 경우에는, 표지 처리된 결합 물질 (용액) 과 접촉시키기 전에, 통상적인 방법에 따라, 블로킹을 실시하는 것이 바람직하다. 상기 직접 고정의 경우에는 당해 고정 후에, 상기 간접 고정의 경우에는 지지체로의 항체 고정 후 또한 표적 물질 결합 전에, 블로킹을 실시하는 것이 바람직하다.

(3) 결합 물질

본 발명의 방법에서는, 결합 물질로서, 표적 물질의 종류에 대응하여 식별할 수 있도록 표지 처리된 결합 물질을 복수 종류 이용한다. 표지 처리는, 특정한 표적 물질에 대응하는 특이적인 결합 물질마다 1종류의 표지 처리가 실시되도록 하고, 후의 검출 단계에 있어서 표지의 수 및 그 종류의 특정을 실시함으로써, 검출된 표적 물질의 수 및 그 종류의 특정을 실시하도록 한다. 그러나 이것에는 한정은 되지 않고, 예를 들어, 복수종의 결합 물질에 동일한 표지 처리를 실시하고, 복수종의 표적 물질을 포괄적으로 검출할 수도 있다.

본 발명의 방법에서 이용할 수 있는 결합 물질로서는, 예를 들어, 특정한 항원 물질에 대해서 특이적으로 결합할 수 있는 항체 (항체 단백질) 외에, 특정한 표적 유전자 또는 핵산 분자에 대해서 하이브리다이즈할 수 있는 1개 사슬 핵산 (DNA, RNA (mRNA 등), 합성 핵산), 특정한 표적 단백질 등에 대해서 특이적으로 결 합할 수 있는 각종 단백질 (항체를 제외한다), 특정한 당지질에 대해서 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 (렉틴 등), 및 특정한 항체에 대해서 특이적으로 결합할 수 있는 항원 물질 등을 들 수 있고, 그 중에서도, 항체가 바람직하다.

결합 물질이 항체인 경우에는, 일반적으로는, 특정한 단일 종류의 항원 (표적 물질) 마다 특이성을 갖는 모노클로날 항체를 이용하도록 하는 것이 바람직하지만, 한정은 되지 않는다. 예를 들어, 특정한 복수종의 항원에 공통된 특이성을 갖는 모노클로날 항체 등도 이용할 수 있다. 이러한 항체를 이용하는 어세이계에 의하면, 복수종의 항원을 단일의 항체에 의해 포괄적으로 검출할 수 있다.

또한 본 발명의 방법에 있어서, 「지지체에 고정된 표적 물질과 표지 처리된 결합 물질을 접촉시킨다」란, 일반적으로는, 당해 표적 물질과 당해 표지 처리되어 결합 물질을 직접 접촉시켜 결합시키는 것을 의미한다. 그러나, 본 발명에서는 이것에 한정은 되지 않고, 보다 광의적으로, 지지체에 고정된 표적 물질에, 우선 당해 표적 물질에 특이성을 갖는 1차적인 결합 물질 (1차 항체 등) 을 결합시키고, 이어서, 이 1차 결합 물질에 대해서 특이성을 갖는 결합 물질로서, 상기의 표지 처리된 결합 물질을 접촉시킴으로써, 결과적으로 상기 표적 물질과 당해 표지 처리된 결합 물질을 간접적으로 결합시키는 것도 포함한다. 이 간접적인 결합에 있어서는, 상기 1차 결합 물질에는, 추가로 2차 결합 물질, 3차 결합 물질, …n차 결합 물질을 결합시켜도 되고, 그 경우, 표지 처리된 결합 물질로서는 n차 결합 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 것을 이용하면 된다. 또한, 상기 n 은, 1~11 이며, 바람직하게는 1 또는 2 이다.

본 발명의 방법에 이용하는 결합 물질은, 표지 물질로서의 각종 핵산사슬 및 펩티드 사슬 등과 복합체를 형성하고 있는 것이 바람직하다. 결합 물질이 항체인 경우에는, 당해 복합체는 「복합 항체」라고 칭한다. 상기 핵산사슬 및 펩티드 사슬 등으로서는, 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 사슬 (DNA사슬, RNA사슬), 올리고펩티드 사슬, 및 올리고펩티드핵산사슬 등을 바람직하게 들 수 있고, 이들은 천연물이어도 합성물이어도 된다. 그 중에서도, 올리고뉴클레오티드 사슬과의 복합체를 형성하고 있는 결합 물질 (올리고뉴클레오티드 복합체) 은, 염기 배열이나 올리고뉴클레오티드 사슬 길이에 의한 식별화, 형광 색소의 결합이나 방사성 동위체 원소의 함유 등에 의한 식별화, 혹은 PCR 증폭 단편 길이에 의한 식별화 등, 보다 한층 유용성·실용성이 높은 식별화가 가능해지는 등의 효과가 얻어지므로 보다 바람직하고, 합성된 올리고뉴클레오티드 사슬과의 복합체를 형성하고 있는 결합 물질이 더욱 바람직하다.

상기 각종 핵산사슬나 펩티드 사슬 등의 길이는, 특별히 한정은 되지 않는다.

예를 들어, 올리고뉴클레오티드 사슬 (DNA사슬, RNA사슬) 의 경우에는, 예를 들어, 100~5,000mer 인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 100~1,000mer, 더욱 바람직하게는 100~500mer 이다. 올리고뉴클레오티드 사슬의 길이가 상기 범위를 만족하는 경우, 결합 물질과의 복합화가 용이해져, 복합화 후의 상태를 안정화시킴과 함께, 검출 감도의 향상이나 검출 시간의 단축이 도모할 수 있는 등의 효과가 얻어진다.

올리고펩티드 사슬의 경우에는, 예를 들어, 10~1,000아미노산 잔기인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 10~500아미노산 잔기, 더욱 바람직하게는 10~100아미노산 잔기이다. 올리고펩티드 사슬의 길이가 상기 범위를 만족하는 경우, 결합 물질과의 복합화가 용이해져, 복합화 후의 상태를 안정화시킴과 함께, 올리고펩티드 사슬로의 표지 처리가 용이해지는 등의 효과가 얻어진다.

올리고펩티드 핵산사슬의 경우에는, 예를 들어, 10~100아미노산 잔기의 올리고펩티드 사슬에 100~5,000mer 의 핵산사슬 (DNA사슬, RNA사슬) 가 연결된 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 핵산사슬 부분이 100~1,000mer 인 것, 더욱 바람직하게는 핵산사슬 부분이 100~500mer 인 것이다. 올리고펩티드핵산사슬의 길이가 상기 범위를 만족하는 경우, 결합 물질과의 복합화가 용이해져, 복합화 후의 상태를 안정화시킴과 함께, 검출 감도의 향상이나 검출 시간의 단축을 도모할 수 있는 등의 효과가 얻어진다.

상기 올리고뉴클레오티드 복합체는, 예를 들어, 표지 부분으로서의 올리고뉴클레오티드 사슬 (DNA사슬, RNA사슬) 의 일단을, 결합 물질에 공유 결합시키는 것 등에 의해 얻을 수 있다. 동일하게, 상기 올리고펩티드 복합체 및 올리고펩티드 핵산 복합체는, 예를 들어, 표지 부분으로서의 올리고펩티드 사슬 또는 올리고펩티드 핵산사슬의 일단을, 결합 물질에 공유 결합시키는 것 등에 의해 얻을 수 있다. 이들 복합체의 조제에 있어서는, 올리고뉴클레오티드 사슬, 올리고펩티드 사슬 및 올리고펩티드 핵산사슬은, 예를 들어, 1개 또는 2개 이상의 티올기나 아미노기 (치환기) 또는 비오틴 (혹은 아비딘) 등이 화학적 또는 효소적 처리 (바람직 하게는 화학적 처리) 에 의해 도입되어 있어도 된다. 이로써, 결합 물질과의 복합화가 용이해져, 복합화 후의 상태가 한층 안정화하고, 얻어지는 복합체의 수율을 향상시킴과 함께, 나아가서는 검출 감도나 검출 효과를 높이는 등의 효과를 얻을 수 있다.

상기 올리고뉴클레오티드 복합체의 조제 방법으로서는, 예를 들어, (i) 5'말단에 아미노기나 티올기를 부가한 올리고뉴클레오티드 사슬을 2가의 가교제를 이용하여 결합 물질에 고정시키는 방법 (E.Hendrickson et al., Nucl.Acids Res., Vol 23(3), p522-529 (1995)), 및 (ii) 미리 결합 물질 및 올리고뉴클레오티드 사슬을 모두 비오틴화하고, 당해 결합 물질과 올리고뉴클레오티드 사슬을 혼합시킴과 함께 아비딘을 첨가함으로써, 아비딘을 통하여 올리고뉴클레오티드 사슬을 결합 물질에 고정시키는 방법 등을 들 수 있다.

상기 올리고펩티드 복합체 및 올리고펩티드 핵산 복합체의 조제 방법으로서는, 예를 들어, (i) 아미노기나 티올기를 갖는 올리고펩티드 사슬 또는 올리고펩티드 핵산사슬 (이하, 올리고펩티드 사슬 등), (ii) 아미노기나 티올기를 부가한 올리고펩티드 사슬 등을, 2가의 가교제를 이용하여 결합 물질에 고정시키는 방법, 및 (iii) 미리 결합 물질 및 올리고펩티드 사슬 등을 모두 비오틴화시키고, 당해 결합 물질과 올리고펩티드 사슬 등을 혼합함과 함께 아비딘을 첨가함으로써, 아비딘을 통하여 올리고펩티드 사슬 등을 결합 물질에 고정시키는 방법 등을 들 수 있다.

또 본 발명에 있어서는, 표지 부분이 되는 올리고뉴클레오티드 사슬, 올리고펩티드 사슬 또는 올리고펩티드 핵산을, 적어도 어댑터 부분을 통하여 결합 물질과 복합화시킴으로써, 상기 서술한 각종 복합체를 얻을 수도 있다 (도 7(1) 참조). 어댑터 부분을 개재한 고정에 의해, 당해 복합체의 구조 안정성을 한층 높일 수 있어, 얻어지는 복합체의 수율을 보다 향상시킴과 함께, 나아가서는 검출 감도나 검출 효과를 높이는 등의 효과가 얻어진다. 상기 어댑터 부분으로서는, 예를 들어, 프로테인 G, 프로테인 A, 프로테인 L, 및 프로테인 A 와 프로테인 G 와의 융합 단백질 등의 각종 단백질을 들 수 있고, 이들은, 특히 결합 물질이 항체 분자인 경우에, 당해 항체와 용이하게 또한 안정적으로 결합할 수 있으므로 바람직하다.

어댑터 부분을 포함한 복합체의 조제 방법으로서는, 한정은 되지 않지만, (i) 우선, 어댑터 부분에 표지 부분이 되는 올리고뉴클레오티드 사슬 등을 결합시키고, (ii) 이어서, 어댑터 부분을 결합 물질에 고정시키는 방법이 바람직하다.

구체적으로는, 상기 (i) 에 있어서는, 어댑터 부분을 아비딘 수식하고, 표지 부분이 되는 올리고뉴클레오티드 사슬 등을 비오틴화하여, 양자를 혼합함으로써, 올리고펩티드 사슬 등을 어댑터 부분에 결합시킨다. 혹은, 미리 어댑터 부분 및 올리고펩티드 사슬 등을 모두 비오틴화시키고, 당해 어댑터 부분과 올리고펩티드 사슬 등을 혼합함과 함께 아비딘을 첨가함으로써, 아비딘을 통하여 올리고펩티드 사슬 등을 어댑터 부분에 결합시킬 수도 있다. 또한, 전자의 수법의 경우, 어댑터 부분의 아비딘 수식은, 우선 링커 화합물을 어댑터 부분과 결합 반응시킨 후, 당해 화합물에 아비딘을 결합시켜도 된다. 여기에서 사용되는 어댑터 부분이 프로테인 A, G 또는 L 등의 경우에는, 링커 화합물로서, 예를 들어 「Sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate(Sulfo-SMCC) 」등을 바람직하게 이용할 수 있다.

이어서, 상기 (ii) 에 있어서는, 어댑터 부분과 결합 물질이 결합 반응성을 갖는 경우에는, 상기 (i) 에서 얻어진 어댑터 부분/표지 부분 결합체와 결합 물질을 혼합함으로써, 올리고뉴클레오티드 복합체 등의 각종 복합체를 얻을 수 있다. 또, 어댑터 부분과 결합 물질이, 원래 결합 반응성을 갖지 않는 경우에는, 예를 들어, 양자를 비오틴화하고 아비딘 존재하에서 혼합하는 등, 상기 (i) 에 있어서 채용할 수 있는 수법과 동일한 수법을 이용하여 각종 복합체를 얻을 수 있다.

이하의 (3-1) 및 (3-2) 에, 올리고뉴클레오티드 복합체 등 및 올리고펩티드 복합체에 있어서의 표지 처리에 대해 구체적으로 예시한다. 또한, 이들 예시는 모두, 표적 물질 및 결합 물질의 일례로서 항원 및 항체를 이용하여 설명한 것인데, 표적 물질 및 결합 물질이 항원 및 항체 이외의 경우에 대해서도 동일한 설명을 적용할 수 있다.

(3-1) 올리고뉴클레오티드 복합 항체에 있어서의 표지 처리

올리고뉴클레오티드 복합 항체의 경우, 표지 처리는, 올리고뉴클레오티드 사슬 그 자체로 이루어져 있어도 되고 (예를 들어, 하기 (A1)~(A3), (A6), (A7), (A9) 의 처리 등), 올리고뉴클레오티드 사슬을 통하여 이루어져 있어도 되며 (예를 들어, 하기(A4), (A5), (A8) 의 처리 등), 한정은 되지 않는다.

올리고뉴클레오티드 사슬에 대해서 이루어지는 상기 표지 처리로서는, 구체적으로는, 하기 (A1)~(A9) 에서 선택되는 적어도 1개의 처리를 바람직하게 들 수 있다. 그 중에서도, (A1), (A2) 및 (A9) 의 처리가, 표지 처리가 용이하고, 검 출 감도가 높다는 등의 점에서 보다 바람직하다.

(A1) 제한 효소에 의한 절단 부위를 형성하는 처리 (도 1 참조)

(A2) PCR 로 증폭 가능한 영역을 형성하는 처리 (도 2 참조)

(A3) 방사성 동위체 원소를 함유시키는 처리

(A4) 형광 색소를 결합시키는 처리

(A5) 효소를 결합시키는 처리

(A6) 광조사에 의한 절단 부위를 형성하는 처리

(A7) 활성 산소에 의한 절단 부위를 형성하는 처리 (도 3A 참조)

(A8) 표지 처리 덴드리머를 결합시키는 처리

(A9) 염기의 종류에 있어서 적어도 1염기의 차이를 형성하는 처리

또한, 올리고펩티드 핵산 복합 항체의 경우에도, 그 핵산 (올리고뉴클레오티드) 부분에 대해서, 상기 올리고뉴클레오티드 복합 항체의 경우와 동일한 표지 처리를 실시할 수 있다. 각 표지 처리의 실제에 대해서도, 후술하는 구체적 설명을, 적절하고 동일하게 적용할 수 있다.

상기 (A1) 의 처리의 경우에는, 예를 들어, 도 1 에 나타내는 바와 같이 다른 항체의 표지와는 그 절단 후에 얻어지는 올리고뉴클레오티드 단편의 길이가 상이하도록 하거나, 다른 항체의 표지로부터는 그 절단 후에 올리고뉴클레오티드 단편을 얻을 수 없게 하거나, 혹은, 이들을 조합시켜 실시함으로써, 식별 검출할 수 있다.

절단 후의 단편의 길이가 상이하도록 하는 것은, 구체적으로는, 항체에 결합 시키는 올리고뉴클레오티드 사슬의 길이는 항체간에 실질적으로 동일한데, 제한 효소에 의한 절단 부위의 위치가 서로 상이하도록 합성하거나, 또는, 항체에 결합시키는 올리고뉴클레오티드 사슬의 길이 자체를 항체간에 서로 상이하도록 합성하는 것 등에 의해 실시할 수 있다. 절단 후의 단편의 길이의 상이차는, 한정은 되지 않지만, 양호한 감도로 식별 검출할 수 있는 점에서, 10mer 이상인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 50mer 이상, 더욱 바람직하게는 100mer 이상이다.

상기 (A2) 의 처리의 경우에는, 예를 들어, 도 2 에 나타내는 바와 같이, 다른 항체의 표지와는 그 PCR 산물로서 얻어지는 단편의 길이가 상이하도록 하거나, 다른 항체의 표지로부터는 그 PCR 산물을 얻을 수 없도록 하거나, 혹은, 이들을 조합하여 실시함으로써, 식별 검출할 수 있다.

PCR 산물로서 얻을 수 있는 단편의 길이가 상이하도록 하는 것은, 구체적으로는, 동일한 프라이머를 이용한 경우여도, 프라이머의 결합 위치가 상이하고, PCR 로 증폭 가능한 영역의 폭 (길이) 이 각 항체간에 상이하도록 합성함으로써 실시할 수 있다. PCR 산물의 단편의 길이의 상이차는, 한정되지 않지만, 양호한 감도로 식별 검출할 수 있는 점에서, 5mer 이상인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 10mer 이상, 더욱 바람직하게는 50mer 이상이다.

상기 (A3) 의 처리의 경우에는, 예를 들어, 다른 항체의 표지와는 방사선종이 상이하도록 하거나, 다른 항체의 표지에 있어서는 방사선을 방사하지 않도록 하거나, 혹은, 이들을 조합하여 실시함으로써, 식별 검출할 수 있다.

방사성 동위체 원소를 함유시키는 처리 방법으로서는, 예를 들어, 올리고뉴 클레오티드 사슬을 합성할 때에 방사성 동위체 원소를 함유하는 핵산을 사용하거나, 방사성 동위체 원소를 함유한 수식기 (³²PO₄, ³⁵SO₄) 나 H¹²⁵I 등에서 올리고뉴클레오티드 사슬을 직접 표지하는 방법 등을 들 수 있다.

구체적으로는, 방사성 동위체 원소로서는, ³²P, ³H, ¹⁴C, ³⁵S, ⁵⁹F, ¹²⁵I 등을 이용할 수 있고, 그 중에서도, 식별 검출의 감도를 높이는 점에서는, β선을 방출하는 방사성 동위체 원소 (예를 들어 ³H 나 ¹⁴C 등) 와 γ선을 방출하는 방사성 동위체 원소 (예를 들어 ¹²⁵I 등) 와의 조합으로 이용하는 것이 바람직하다.

상기 (A4) 의 처리의 경우에는, 예를 들어, 다른 항체의 표지와는 그 형광 색소의 극대 흡수 파장이 상이하도록 하거나, 다른 항체의 표지에 있어서는 그 형광 색소를 결합시키지 않도록 하거나, 혹은, 이들을 조합시켜 실시함으로써, 식별 검출할 수 있다.

형광 색소를 결합시키는 처리 방법으로서는, 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 사슬의 관능기를 형광 색소로 직접 표지하는 방법 등을 들 수 있다.

구체적으로는, 형광 색소로서는, 플루오레세인이소티오시아네이트 (FITC), 테트라메틸로다민이소티오시아네이트 (RITC), 루시페라아제, GFP (형광 강도가 상이한 EGFP 등도 포함한다) 및 그 유도체 (형광 파장이나 여기 파장이 상이한 YFP 나 BFP 등) 등을 이용할 수 있고, 그 중에서도, 식별 검출의 감도를 높이는 점에서는, FITC 와 RITC 의 조합이나, GFP 와 그 유도체의 조합으로 이용하는 것이 바람 직하다.

상기 (A5) 의 처리의 경우에는, 예를 들어, 발색용 기질과 결합함으로써 형광 색소를 생성시키는 효소를 이용하여, 다른 항체의 표지와는 그 효소의 종류를 바꾸어, 형광 색소의 극대 흡수 파장이 상이하도록 하거나, 다른 항체의 표지에는 그 효소를 결합시키지 않도록 하거나, 혹은, 이들을 조합시켜 실시함으로써, 식별 검출할 수 있다.

효소를 결합시키는 처리 방법으로서는, 예를 들어, 살리실히드록사민화시킨 효소를, 단백질 가교제를 통하여, 올리고뉴클레오티드 사슬에 결합시키는 방법 등을 들 수 있다.

구체적으로는, 상기 효소로서는, 알칼리포스파타아제, 각종 퍼옥시다아제 (호스래디쉬 (서양 와사비) 퍼옥시다아제), 베타갈락토시다아제, 크산틴옥시다아제 등을 이용할 수 있고, 그 중에서도, 식별 검출의 감도를 높이는 점에서는, 발색법에 있어서 증감제인 DAB 와 TMB 를 조합시켜 이용하는 것이 바람직하다.

상기 (A6) 의 처리의 경우에는, 예를 들어, 다른 항체의 표지와는 절단 가능한 광의 파장이 상이하도록 하거나, 다른 항체의 표지와 절단 가능한 광의 파장이 동일해도 절단 후의 단편의 길이가 상이하도록 하는 등 상이한 식별 처리를 실시하도록 하거나, 다른 항체의 표지에서는 광조사에 의해 절단하지 않도록 하거나, 혹은, 이들을 조합시켜 실시함으로써, 식별 검출할 수 있다.

구체적으로는, 올리고뉴클레오티드 사슬에, 소정의 파장광의 조사로 개열 (절단) 가능한 크로스 링커 (2가의 가교제 등) 를 부가한 후, 이 링커를 통하여, 올리고뉴클레오티드 사슬과 항체를 결합시키도록 한다. 광조사로 개열 가능한 크로스 링커로서는, 예를 들어, 옥심에스테르 유도체나 카르바모일옥시이미노 유도체 등을 이용할 수 있다. 다른 항체의 표지와는 절단 가능한 광의 파장이 상이하도록 하는 경우에는, 다른 항체에 있어서의 크로스 링커와는 개열 가능한 파장이 상이한 크로스 링커를 이용하도록 하는 것 등으로 실시할 수 있다. 이 경우, 크로스 링커로서는, 옥심에스테르 유도체와 카르바모일옥시이미노 유도체와의 조합으로 이용하는 것이, 양호한 검출 감도를 얻을 수 있는 등의 점에서 바람직하다. 또, 다른 항체의 표지와 절단 후의 단편의 길이가 상이하도록 하는 경우에는, 크로스 링커를 통하여 결합시키는 올리고뉴클레오티드 사슬의 길이가 상이하도록 하는 것 등으로 실시할 수 있다. 절단 후의 단편의 길이의 상이차는, 한정은 되지 않지만, 양호한 감도로 식별 검출할 수 있는 점에서, 10mer 이상인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 50mer 이상, 더욱 바람직하게는 100mer 이상이다. 그 밖에, 다른 항체의 표지와 절단 후의 단편에 상이한 표지 처리를 실시하는 경우로서는, 크로스 링커를 통하여 결합시키는 올리고뉴클레오티드 사슬에, 상기 (A3)~(A5) 및 하기 (A8) 의 처리를 실시하는 것 등으로 실시할 수 있다.

상기 (A7) 의 처리의 경우에는, 예를 들어, 다른 항체의 표지와는 절단 후의 단편의 길이가 상이하도록 하는 등 상이한 표지 처리를 실시하도록 하거나, 다른 항체의 표지에서는 활성 산소에 의해 절단하지 않도록 하거나, 혹은, 이들을 조합시켜 실시함으로써, 식별 검출할 수 있다.

구체적으로는, 올리고뉴클레오티드 사슬에, 활성 산소와의 접촉에 의해 개열 (절단) 가능한 크로스 링커 (2가의 가교제 등) 를 부가한 후, 이 링커를 통하여, 올리고뉴클레오티드 사슬과 항체를 결합시키도록 한다. 활성 산소와의 접촉에 의해 개열 가능한 크로스 링커로서는, 예를 들어, N-hydroxysucciniimide-4-azidobenzoate 등의 아지드계의 크로스 링커나, S-니트로소아민 유도체 혹은 N-니트로소아민 유도체 등을 이용할 수 있다.

다른 항체의 표지와 절단 후의 단편의 길이가 상이하도록 하는 경우에는, 크로스 링커를 통하여 결합시키는 올리고뉴클레오티드 사슬의 길이가 상이하도록 하는 것 등으로 실시할 수 있다. 절단 후의 단편 길이의 상이차는, 한정은 되지 않지만, 양호한 감도로 식별 검출할 수 있는 점에서, 10mer 이상인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 50mer 이상, 더욱 바람직하게는 100mer 이상이다. 그 밖에, 다른 항체의 표지와 절단 후의 단편에 상이한 표지 처리를 실시하는 경우로서는, 크로스 링커를 통하여 결합시키는 올리고뉴클레오티드 사슬에, 상기 (A3)~(A5) 및 하기 (A8) 의 처리를 실시하는 것 등으로 실시할 수 있다.

상기 (A8) 의 처리의 경우에는, 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 덴드리머 (DNA 덴드리머, RNA 덴드리머) 등의 각종 덴드리머에, 상기 서술한 것과 같이 방사성 동위체 원소를 함유시키는, 방사성 물질을 결합시키는, 형광 색소를 결합시키는, 또는 효소를 결합시키는 등의 표지 처리를, 1종 또는 2종 이상 실시한 덴드리머를 이용한다. 그리고, 다른 항체의 표지와는 그 종류나 정도 등이 상이하도록 하거나, 다른 항체의 표지에는 이러한 표지 처리 덴드리머를 결합시키지 않도록 하거나, 혹은, 이들을 조합시켜 실시함으로써, 식별 검출할 수 있다.

덴드리머란, 그것을 구성하는 물질 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드나 DNA 등) 로 이루어지는 수목상 다분지 고분자이며, 중심 (코어) 으로부터 규칙적인 분지 골격 구조가 3차원적으로 넓어지고 있는 것을 말한다. 덴드리머는, 그 분지 부분끼리의 사이가 정해진 화학 결합의 반복 구조로 되어 있다. 일반적으로, 그 반복수는 「세대」에 표현되고, 세대가 큰 만큼 크고 또한 구상에 가까운 구조가 된다.

본 발명에 있어서는, 상기 표지 처리 덴드리머와 동일하게, 표지 처리 덴드론도 이용할 수 있다. 덴드론이란, 덴드리머와 동일하게 수목상 다분지 고분자인데, 중심 (포컬 포인트) 으로부터 한 방향으로만 넓어지고 있는 (늘어나고 있는) 것을 말한다.

덴드리머의 합성 방법으로서는, 한정은 되지 않지만, 코어로부터 외측을 향해 합성을 진행시키는 다이버전트법, 말단 관능기에서 내측을 향해 합성을 진행시키는 컨버전트법, 및, 이들을 조합시킨 방법 등을 들 수 있고, 덴드론에서도 동일한 방법을 들 수 있다. 덴드리머나 덴드론의 합성 경로는 매우 질서적이므로, 상기 서술한 것과 같은 표지 처리 물질 등을, 그들 (덴드리머나 덴드론) 의 내외부를 불문하고, 3차원적으로 원하는 위치에 도입할 수 있다.

표지 처리 덴드리머를 결합시키는 처리 방법으로서는, 예를 들어, 항체에 결합하고 있는 올리고뉴클레오티드 사슬에 상보적으로 결합할 수 있는 배열 영역 (암) 을, 덴드리머의 말단 (최외층) 에 형성하고, 소정의 조건하에서 하이브리다이제이션하여 결합시키는 방법이나, 항체에 결합하고 있는 올리고뉴클레오티드 사슬 의 미결합 말단에 아미노기나 티올기를 부가하고, 2가의 가교제를 이용하여 덴드리머의 말단과 결합시키는 방법 등을 들 수 있다. 또, 표지 처리 덴드론을 결합시키는 처리 방법에 대해서도 동일하다.

상기 (A9) 의 처리의 경우에는, 우선, 각각의 복합 항체에 고정되어 있는 올리고뉴클레오티드 사슬이 각각 동등한 길이 (상기 (A1) 나 (A2) 의 처리에서는 차이를 인식할 수 없는 정도의 길이) 여도, 염기의 종류가 상이한 개소를 1개소 이상 형성한다. 그리고, 이 종류가 상이한 염기를 포함한 PCR 증폭 단편을, DNA 시퀀스 (예를 들어, Applied Biosystems사 제조, 제품명 ： ABI-3100) 에 의한 해석이나, ABI PRISM 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems사 제조) 등을 이용한 Real Time PCR 에 의한 해석 등의 1염기의 차이를 인식할 수 있는 해석 수단을 이용하여, 식별 검출할 수 있다. 또한, 각 올리고뉴클레오티드 사슬에는, PCR 에 의한 증폭 전에 주형이 되는 소정의 단편을 유리하기 위해, 제한 효소 사이트 (바람직하게는 동일한 제한 효소에 의한 절단 부위) 를 형성할 수도 있다. 당해 처리의 경우, 표지의 베어리에이션은, 「〔염기의 종류 (A, T, G, C 등)〕×〔염기의 길이 (염기수)〕」로 산출되는 조합까지 가능하고, 이 처리는 동시 다항목 검출에 특히 바람직한 처리라고 할 수 있다. 상기 베어리에이션은, 공지된 각종 변이 도입법을 이용하거나, 핵산 합성의 단계에서 염기 배열의 설정에 차이를 형성함으로써 용이하게 설계할 수 있다.

(3-2) 올리고펩티드 복합 항체에 있어서의 표지 처리

올리고펩티드 복합 항체의 경우, 표지 처리는, 올리고펩티드 사슬 그 자체로 이루어져 있어도 되고 (예를 들어, 하기 (B1), (B2), (B5), (B6) 의 처리 등), 올리고펩티드 사슬을 통하여 이루어지고 있어도 되며 (예를 들어, 하기 (B3), (B4), (B7) 의 처리 등), 한정은 되지 않는다.

올리고펩티드 사슬에 대해서 이루어지는 상기 표지 처리로서는, 구체적으로는, 하기 (B1)~(B7) 에서 선택되는 적어도 1개의 처리를 바람직하게 들 수 있다. 그 중에서도, (B1) 의 처리가, 표지 처리가 용이하고, 검출 감도가 높은 등의 점에서 보다 바람직하다.

(B1) 단백질 분해 효소에 의한 절단 부위를 형성하는 처리

(B2) 방사성 동위체 원소를 함유시키는 처리

(B3) 형광 색소를 결합시키는 처리

(B4) 효소를 결합시키는 처리

(B5) 광조사에 의한 절단 부위를 형성하는 처리

(B6) 활성 산소에 의한 절단 부위를 형성하는 처리 (도 3A 참조)

(B7) 표지 처리 덴드리머를 결합시키는 처리

또한, 올리고펩티드 핵산 복합 항체의 경우에도, 그 올리고펩티드 부분에 대해서, 상기 올리고펩티드 복합 항체의 경우와 동일한 표지 처리를 실시할 수 있다. 각 표지 처리의 실제에 대해서도, 후술하는 구체적 설명을, 적절히 동일하게 적용할 수 있다.

상기 (B1) 의 처리의 경우에는, 예를 들어, 다른 항체의 표지와는 그 절단 후에 얻을 수 있는 올리고펩티드 단편의 길이가 상이하도록 하거나, 다른 항체의 표지로부터는 그 절단 후에 올리고펩티드 단편을 얻을 수 없도록 하거나, 혹은, 이들을 조합시켜 실시함으로써, 식별 검출할 수 있다.

구체적으로는, 절단 후의 단편의 길이가 상이하도록 하려면, 항체에 결합시키는 올리고펩티드 사슬의 길이는 항체간에 실질적으로 동일하지만, 제한 효소에 의한 절단 부위의 위치가 서로 상이하도록 합성하거나, 또는, 항체에 결합시키는 올리고뉴클레오티드 사슬의 길이 자체를 항체간에 서로 상이하도록 합성함으로써 실시할 수 있다. 절단 후의 단편의 길이의 상이차는, 한정은 되지 않지만, 양호한 감도로 식별 검출할 수 있는 점에서, 5아미노산 잔기 이상인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 10아미노산 잔기 이상, 더욱 바람직하게는 20아미노산 잔기 이상이다.

상기 (B2) 의 처리의 경우에는, 예를 들어, 상기 (A3) 의 경우와 동일하게 하여 식별 검출할 수 있다.

방사성 동위체 원소를 함유시키는 처리 방법으로서는, 예를 들어, 올리고펩티드 사슬을 합성할 때에 방사성 동위체 원소를 함유하는 핵산을 사용하거나, 방사성 동위체 원소를 함유하는 수식기 (³²PO₄, ³⁵SO₄) 나 H¹²⁵I 등으로 올리고펩티드 사슬을 직접 표지하는 방법 등을 들 수 있다.

방사성 동위체 원소의 구체적 예시, 및 그 바람직한 조합에 대해서도, 상기(A3) 의 경우와 동일한 것이 바람직하다.

상기 (B3) 의 처리의 경우에는, 예를 들어, 상기 (A4) 의 경우와 동일하게 하여 식별 검출할 수 있다.

형광 색소를 결합시키는 처리 방법으로서는, 예를 들어, 올리고펩티드 사슬의 관능기를 형광 색소로 직접 표지하는 방법 등을 들 수 있다.

형광 색소의 구체적 예시, 및 그 바람직한 조합에 대해서도, 상기 (A4) 의 경우와 동일한 것이 바람직하다.

상기 (B4) 의 처리의 경우에는, 예를 들어, 상기 (A5) 의 경우와 동일하게 하여 식별 검출할 수 있다.

효소를 결합시키는 처리 방법으로서는, 예를 들어, 살리실히드록사민화시킨 효소를, 단백질 가교제를 통하여, 올리고펩티드 사슬에 결합시키는 방법 등을 들 수 있다.

상기 효소의 구체적 예시, 및 증감제의 바람직한 조합에 대해서도, 상기 (A5) 의 경우와 동일한 것이 바람직하다.

상기 (B5) 의 처리의 경우에는, 예를 들어, 상기 (A6) 의 경우와 동일하게 하여 식별 검출할 수 있다.

구체적으로는, 올리고펩티드 사슬에, 소정의 파장광의 조사로 개열 (절단) 가능한 크로스 링커 (2가의 가교제 등) 를 부가한 후, 이 링커를 통하여, 올리고펩티드 사슬과 항체를 결합시키도록 한다. 광조사에서 개열 가능한 크로스 링커로서는, 예를 들어, 상기 (A6) 의 경우와 동일한 것을 이용할 수 있다. 다른 항체의 표지와는 절단 가능한 광의 파장이 상이하도록 하는 경우에는, 크로스 링커의 조합도 포함하여, 상기 (A6) 의 경우와 동일하게 실시할 수 있다. 또, 다른 항체의 표지와 절단 후의 단편의 길이가 상이하도록 하는 경우에도, 상기 (A6) 의 경우와 동일하게 실시할 수 있다. 절단 후의 단편의 길이의 상이차는, 한정은 되지 않고, 적절하게 설정할 수 있다. 그 밖에, 다른 항체의 표지와 절단 후의 단편에 상이한 표지 처리를 실시하는 경우로서는, 크로스 링커를 통하여 결합시키는 올리고펩티드 사슬에, 상기 (B2)~(B4) 및 하기 (B7) 의 처리를 실시하는 것 등으로 실시할 수 있다.

상기 (B6) 의 처리의 경우에는, 예를 들어, 상기 (A7) 의 경우와 동일하게 하여 식별 검출할 수 있다.

구체적으로는, 올리고펩티드 사슬에, 활성 산소와의 접촉에 의해 개열 (절단) 가능한 크로스 링커 (2가의 가교제 등) 를 부가한 후, 이 링커를 통하여, 올리고펩티드 사슬과 항체를 결합시키도록 한다. 활성 산소와의 접촉에 의해 개열 가능한 크로스 링커로서는, 예를 들어, 상기 (A7) 의 경우와 동일한 것을 이용할 수 있다. 다른 항체의 표지와 절단 후의 단편의 길이가 상이하도록 하는 경우에는, 상기 (A7) 의 경우와 동일하게 실시할 수 있다. 절단 후의 단편의 길이의 상이차는, 한정은 되지 않고, 적절하게 설정할 수 있다. 그 밖에, 다른 항체의 표지와 절단 후의 단편에 상이한 표지 처리를 실시하는 경우로서는, 크로스 링커를 통하여 결합시키는 올리고펩티드 사슬에, 상기 (B2)~(B4) 및 하기 (B7) 의 처리를 실시하는 것 등으로 실시할 수 있다.

상기 (B7) 의 처리의 경우에는, 예를 들어, 상기 (A8) 의 경우와 동일하게 하여 식별 검출할 수 있다. 또, 표지 처리 덴드리머와 동일하게, 표지 처리 덴 드론도 이용할 수 있는 점도 동일하다.

표지 처리 덴드리머를 결합시키는 처리 방법으로서는, 예를 들어, 항체에 결합하고 있는 올리고펩티드 사슬에 상보적으로 결합할 수 있는 배열 영역 (암) 을, 덴드리머의 말단 (최외층) 에 형성하고, 소정의 조건하에서 하이브리다이제이션 하여 결합시키는 방법, 및, 항체에 결합하고 있는 올리고펩티드 사슬의 미결합 말단에 아미노기나 티올기를 부가하고, 2가의 가교제를 이용하여 덴드리머의 말단과 결합시키는 방법 등을 들 수 있다. 또, 표지 처리 덴드론을 결합시키는 처리 방법에 대해서도 동일하다.

(4) 항원 항체 반응

상기 서술한 것과 같이, 지지체에 고정 (코팅) 된 표적 물질에, 표지 처리된 결합 물질 (용액) 을 접촉시킬 때에는, 일반적으로는, 미리 공지된 블로킹액으로 블로킹 처리를 실시하고, PBS 등의 공지된 세정액으로 잘 세정한다. 그 후, 표지 처리된 결합 물질을 복수종 포함한 용액을 적당량 첨가하고, 실온에서 30~60분간 교반하면서, 표적 물질과 결합 물질과의 결합 반응을 실시하여 양물질의 복합체를 형성시켜, 다시 잘 세정하는 것이 바람직하다.

또, 지지체 등에 고정되어 있지 않는 표적 물질에, 표지 처리된 결합 물질 (용액) 을 접촉시킬 때에는, 일반적으로는, 표적 물질을 포함한 피험 시료에 대해서 적당한 전처리를 실시하고, 표적 물질 이외의 불순물을 제거 혹은 줄이는 것이 바람직하다.

3. 표지 검출 공정

본 발명의 검출 방법은, 표적 물질-결합 물질 복합체를 형성한 결합 물질 중의 표지를 검출하는 공정을 포함한 방법이다. 검출 방법으로서는, 구체적으로는, 상기 서술한 결합 물질의 표지 처리의 종류 (상기 (A1)~(A9), (B1)~(B7) 등의 표지 처리) 에 의해 상이하므로, 그 종류별로 이하에 설명한다.

(1) 제한 효소에 의한 절단 부위를 형성하는 처리 ((A1) 의 처리) 의 경우

올리고뉴클레오티드 복합체 (DNA 복합체 또는 RNA 복합체) 를 이용한 경우, 통상적인 방법에 따라, 소정의 제한 효소 용액을 첨가하고, 올리고뉴클레오티드 사슬을 절단한다. 얻어진 단편의 길이는, 아가로스 겔 등을 이용한 전기 영동법에 의해 식별하여 검출할 수 있다. 또, 도 7(3)~(5) 에 나타내는 바와 같이, 상기 제한 처리 후의 유리 단편을, 형광 표지한 소정의 프라이머를 이용하여 PCR 에 의해 증폭하고, 얻어진 증폭 단편에 대해, DNA 시퀀스 (예를 들어, Applied Biosystems사 제조, 제품명 ： ABI-3100) 를 이용한 GeneScan 소프트웨어에 의한 해석에 의해 피크 위치 및 그 높이를 동정함으로써, 제한 효소 처리 후의 유리 단편의 길이를 식별하여 검출할 수도 있다.

상기 검출에 있어서, 항원의 양이 적었던 경우 등, 제한 효소 처리 후의 단편 농도가 낮을 때에는, 필요에 따라, 당해 처리 후의 반응액을 스핀 칼럼 등으로 원심 침강시켜 농축하는 것이 바람직하다.

또한, 올리고펩티드 핵산 복합체를 이용한 경우에도, 그 핵산사슬 (올리고뉴클레오티드 사슬) 부분에 대해서, 상기 동일한 검출 방법을 채용할 수 있다.

(2) PCR 로 증폭 가능한 영역을 형성하는 처리 ((A2) 의 처리) 의 경우

올리고뉴클레오티드 복합체 (DNA 복합체 또는 RNA 복합체) 를 이용한 경우, 통상적인 방법에 따라, 설계한 소정의 프라이머 등을 첨가하고, PCR 에 의해 (약 5~30사이클) 특정한 단편을 증폭한 PCR 산물을 얻는다. 얻어진 증폭 단편의 길이는, 아가로스 겔 등을 이용한 전기 영동법에 의해 식별하여 검출할 수 있다. 또, 상기 소정의 프라이머로서 형광 표지한 프라이머를 이용하여, 얻어진 증폭 단편에 대해, DNA 시퀀스 (예를 들어, Applied Biosystems사 제조, 제품명 ： ABI-3100) 를 이용한 GeneScan 소프트웨어에 의한 해석에 의해 피크 위치 및 그 높이를 동정함으로써, 증폭 단편의 길이를 식별하여 검출할 수도 있다.

(3) 단백질 분해 효소에 의한 절단 부위를 형성하는 처리 ((B1) 의 처리) 의 경우

올리고뉴펩티드 복합체를 이용한 경우, 통상적인 방법에 따라, 소정의 단백질 분해 효소 용액을 첨가하고, 올리고펩티드 사슬을 절단한 후, SDS-PAGE 등의 전기 영동법에 의해 단편의 길이를 식별하여 검출한다. 표적 물질의 양이 적었던 경우 등, 효소 처리 후의 단편 농도가 낮을 때에는, 필요에 따라, 당해 처리 후의 반응액을 스핀 칼럼 등으로 원심 침강시켜 농축시키는 것이 바람직하다.

또한, 올리고펩티드 핵산 복합체를 이용한 경우에도, 그 올리고펩티드 사슬 부분에 대해서, 상기 동일한 검출 방법을 채용할 수 있다.

(4) 형광 색소를 결합시키는 처리 ((A3) 및 (B2) 의 처리) 의 경우

공지된 형광 광도계나 형광 현미경 등에 의해, 소정의 형광 파장을 식별하여 검출한다.

또한, 본 발명에 있어서는, 반도체 레이저 및 고감도 포토다이오드 등을 구비한 측정 모듈 디바이스 (예를 들어, 히타치 제작소사 제조, 제품명 ： 코스모아이 ； Applied Biosystems사 제조, 제품명 ： ABI-3100) 를 이용할 수도 있다. 당해 디바이스는, 미량의 DNA 혹은 RNA, 또는 펩티드 등을 단시간에 분리·동정하고, 정량할 수 있는 것을 특징으로 한다는 것이다. 당해 디바이스를 이용함으로써, 종래 실현되어 있지 않았던, 고속 (단시간) 또한 고감도이고, 게다가 동시 다항목의 검출 조건의 식별 검출을 할 수 있다. 구체적으로는, 측정 시간을 120분 이내 (바람직하게는 60분 이내, 보다 바람직하게는 30분 이내) 로 하고, 검출 감도를 100~100,000fg/mL (바람직하게는 100~10,000fg/mL, 보다 바람직하게는 100~1,000fg/mL) 로 하며, 검출 가능 표지수 (1칩당) 를 5종류 이상 (바람직하게는 10종류 이상, 보다 바람직하게는 50종류 이상) 으로 할 수 있다.

(5) 효소를 결합시키는 처리 ((A4) 및 (B3) 의 처리) 의 경우

공지된 ELISA법의 통상적인 방법에 따라, 발색용 기질을 첨가하여 형광 색소를 생성시킨 후, 형광 색소의 결합 처리를 한 경우와 동일한 방법에 의해, 식별 검출할 수 있다.

(6) 방사성 동위체 원소를 함유시키는 처리 ((A5) 및 (B4) 의 처리) 의 경우

공지된 방사선량 측정 장치나 공지된 웨스턴 블롯법의 통상적인 방법에 따라, 소정의 방사선종을 식별 검출할 수 있다.

(7) 광조사에 의한 절단 부위를 형성하는 처리 ((A6) 및 (B5) 의 처리) 의 경우

소정의 파장광의 조사를 실시하고, 올리고뉴클레오티드 사슬나 올리고펩티드 사슬 등을 절단 (자세하게는, 결합 물질로부터 분리) 한다. 그 후, 얻어진 단편의 길이를, 예를 들어, 아가로스 겔 등을 이용한 전기 영동법이나 SDS-PAGE 등의 전기 영동법에 의해 식별하여 검출한다. 표적 물질의 양이 적은 경우 등, 광조사 처리 후의 단편 농도가 낮을 때에는, 필요에 따라, 당해 처리 후의 반응액을 스핀 칼럼 등으로 원심 침강시켜 농축하는 것이 바람직하다. 또, 상기 절단 후의 단편은, 상기 (4)~(6) 의 경우와 동일하게 하여 식별 검출할 수도 있다.

(8) 활성 산소에 의한 절단 부위를 형성하는 처리 ((A7) 및 (B6) 의 처리) 의 경우

우선, HRP (서양 와사비 퍼옥시다아제) 및 Fe 착물 등의, 프리라디칼을 생성 유리시키는 시약을 첨가함으로써, 활성 산소를 발생시킨다. 이 활성 산소가, 올리고뉴클레오티드 사슬나 올리고펩티드 사슬 등을 절단한다 (자세하게는, 결합 물질로부터 분리). 그 후, 얻어진 단편의 길이를, 예를 들어, 아가로스 겔 등을 이용한 전기 영동법이나 SDS-PAGE 등의 전기 영동법에 의해 식별하여 검출한다. 표적 물질의 양이 적은 경우 등, 절단 처리 후의 단편 농도가 낮을 때에는, 필요에 따라, 당해 처리 후의 반응액을 스핀 칼럼 등으로 원심 침강시켜 농축하는 것이 바람직하다. 또, 당해 절단 후, 상기 (4)~(6) 의 경우와 동일하게 하여 식별 검출할 수 있다.

(9) 표지 처리 덴드리머를 결합시키는 처리 ((A8) 및 (B7) 의 처리) 의 경우

검출 방법은, 덴드리머에 실시된 표지 처리의 종류에 의해 상이하거나, 구체적으로는, 상기 서술한 각 표지 처리의 경우의 방법과 동일한 방법에 의해 식별 검출할 수 있다. 표지 처리 덴드론을 이용한 경우에 대해서도 동일하다.

(10) 적어도 1염기의 상이를 형성하는 처리 ((A9) 의 처리) 의 경우

올리고뉴클레오티드 복합체 (DNA 복합체나 RNA 복합체) 를 이용한 경우, 우선, 통상적인 방법에 따라, 소정의 제한 효소 용액을 첨가하고 올리고뉴클레오티드 사슬을 절단한다. 또는, 제한 효소 처리에 의해 얻어진 유리 단편을 주형으로 하고, 소정의 프라이머를 이용한 PCR (약 5~30사이클) 에 의해 특정한 단편을 증폭한 PCR 산물을 얻는다. 혹은, 상기 제한 효소 처리는 실시하지 않고, 올리고뉴클레오티드 복합체 중의 올리고뉴클레오티드 사슬을 직접 주형으로 하여, 소정의 프라이머를 이용한 PCR 에 의해 상기와 동일하게 PCR 산물을 얻는다. 그 후, 상기 서술한 DNA 시퀀스에 의한 해석이나 Real Time PCR 에 의한 해석 등의 1염기의 차를 인식할 수 있는 해석 수단에 의해, PCR 후의 증폭 단편의 염기 배열의 상이에 기초하여 식별 검출할 수 있다.

(11) 또한, 상기 (1)~(10) 의 경우의 표지 검출 공정에서는, 적절하게, 공지된 처리 수단을 조합시켜 실시할 수 있다. 당해 처리 수단으로서는, 예를 들어, 웨스턴 블롯법의 통상적인 방법에 따라, 스캐너를 이용하여 동정·정량하는 수 단, 및, 목적으로 하는 항원을 포함한 세포나 화합물 등을 플로우사이트메트리 또는 셀소터 혹은 적당한 지지체를 이용하여 검출하고 분리·회수하는 수단 등을 들 수 있다.

4. 그 밖의 공정

본 발명의 방법은, 상기 서술한 각종 공정 이외에, 추가로 다른 공정을 포함하고 있어도 되고, 한정은 되지 않는다. 이들 다른 공정은, 공지된 수단·방법을 이용하여 실시할 수 있다.

5. 식별 검출용 키트

본 발명의 표적 물질의 식별 검출용 키트는, 구성 성분으로서 표적 물질의 종류에 대응하여 식별할 수 있도록 표지 처리된 복수 종류의 결합 물질을 포함한 키트이다. 당해 결합 물질의 상세한 것에 대해서는, 상기 본 발명의 검출 방법에 있어서의 설명 (구체적으로는 상기 「2.(3)」에 기재된 설명) 이 동일하게 적용할 수 있다.

본 발명의 키트는, 상기 본 발명의 검출 방법을 실시하므로 유효하게 이용할 수 있어 매우 유용성이 높은 것이다.

본 발명의 키트는, 상기 구성 성분 이외에 다른 구성 성분을 포함하고 있어도 된다. 다른 구성 성분으로서는, 예를 들어, 제한 효소, DNA 폴리머라아제, PCR 프라이머, dNTP, 각종 버퍼, 멸균수, 에펜돌프 튜브, 페놀클로로포름, 클로로포름, 에탄올, 핵산 공침제, 각종 겔 (분말), 프리라디칼 생성 유리 시약 (HRP 및 Fe 착물 등), 블로킹제로서 Bovine Serum Albumin (BSA), Skim milk, Goat 혈청 등 의 혈청 성분, 및 각종 detergent, DNA 인터카레이터 등의 형광 시약, 광반응 물질, 각종 플레이트, 아지화 나트륨 등의 방부제, 그리고 실험 조작 매뉴얼 (설명서) 등의 외에, 필요에 따라, 각종 전기 영동 장치나 PCR 등 실험 기기 등도 들 수 있다.

이하에, 실시예를 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다.

〔실시예 1〕

＜PCR 에 의한 식별 검출＞

1. 복합 항체의 조제 및 검정

(1) 올리고뉴클레오티드 사슬의 조제

101mer 의 올리고뉴클레오티드의 조제는, 5' 프라이머로서, 3' 말단에 비오틴이 결합된 서열번호 1 의 프라이머 (5-MUSTagRIBio) 를 사용하여, 3' 프라이머로서, 5' 말단에 FAM 이 결합된 서열번호 2 의 프라이머 (3-MUSTag101FAM) 를 사용하고, PCR 에 의해 실시하였다.

203mer 의 올리고뉴클레오티드의 조제는, 5' 프라이머로서, 3' 말단에 비오틴이 결합된 서열번호 1 의 프라이머 (5-MUSTagRIBio) 를 사용하고, 3' 프라이머로서, 5' 말단에 FAM 이 결합된 서열번호 3 의 프라이머 (3-MUSTag203FAM) 를 사용하여, PCR 에 의해 실시하였다.

5-MUSTagRIBio：

Biotin-CGGAATTCGCGGACGAGGAGAAGCTGCCGCCCGGCTGG(서열번호 1)

3-MUSTag101FAM：

FAM-GCTGGCGTTAGTGATGTGGTTGAA (서열번호 2)

3-MUSTag203FAM：

FAM-CTGGCTGTGCTTCACCAG (서열번호 3)

상기 각 PCR 은, Pin1 을 인서트한 pcDNA3.1 (In vitro사 제조) 을 주형 DNA 로 하고, 폴리머라아제로서 Taq polymerase 를 사용하여, 하기의 반응액 조성 및 반응 조건으로 실시하였다.

《반응액 조성》

주형 DNA (100μg/μL)： 1μL

Taq polymerase： 2.5unit

5' 프라이머 (20μM)： 2μL

3' 프라이머 (20μM)： 2μL

dNTP (2.5mM each)： 8μL

10×Buffer： 10μL

멸균수： 적당량 (약 77μL)

합계： 100μL

《반응 조건》

「95℃ 에서 1분간의 열변성·해리→55℃ 에서 1분간의 어닐링→72℃ 에서 30초간의 합성·신장」을 1사이클로 하는 사이클 조건에서, 합계 30 사이클.

상기 각 PCR 후의 증폭 산물은, PCR 후에 원심하여 얻어진 상청을, MinElute PCR Purification spin column (키아겐사 제조) 또는 Miniprep 칼럼 (Invitrogen사 제조) 에서 필터 정제함으로써, 단일한 올리고뉴클레오티드로 정제하였다.

(2) 비오틴화 항체의 조제

통상적인 방법에 의해, 하기의 2종의 모노클로날 항체를 제작하였다.

12CA5 (항 HA 모노클로날 항체)

9E10 (항 Myc 모노클로날 항체)

이어서, 12CA5 와 9E10 을, 각각, 항체와 Sulfo-NHS-LC-Biotin (Pierce사 제조) 과의 몰비가 1：20 이 되도록 혼합하고, 실온에서 30분간 반응시켰다. 각 반응액을 5mL 의 탈염 칼럼에 통과시켜, 목적으로 하는 항체 획분을 회수하고, 2종의 비오틴화 항체를 얻었다.

(3) 올리고뉴클레오티드 복합 항체의 조제

비오틴화 12CA5 에는 101mer 의 올리고뉴클레오티드를, 비오틴화 9E10 에는 203mer 의 올리고뉴클레오티드를, 각각, 1：1 의 몰비로 혼합하였다. 이어서, 각각에 있어서, NeutrAvidin (PIERCE Biotechnology사 제조) 를, 비오틴화 항체에 대해 1：1 의 몰비로 첨가하고, 실온에서 15분간 반응시켰다. 이들 반응액을, 각각, 5mL 의 탈염 칼럼에 통과시켜, 목적의 획분을 회수하고, 2종의 올리고뉴클레오티드 복합 항체를 얻었다.

(4) 항원 특이성 및 식별 검출능의 검정

얻어진 2종의 복합 항체에 대해, 항원 특이성 (항원 항체 반응성) 및 표지마 다의 식별 검출능을 갖는 것의 확인을, 이하와 같이 하여 실시하였다.

우선, 항원으로서 HA 및 Myc 의 합성 펩티드를 준비하고, ELISA법의 통상적인 방법에 따라, 이들 합성 펩티드를 각각 코팅한 96공 플라스틱 웰 플레이트를 준비하였다. 이어서, 5% 밀크 in PBST 용액으로 하룻밤 블로킹을 실시하고, PBS 로 잘 세정한 후, 각 플레이트의 웰에, 먼저 조제한 2종의 올리고뉴클레오티드 복합 항체를 포함한 용액을 적당량 첨가하여, 실온에서 1시간 셰이킹하면서 반응시켰다.

반응 후, 각 플레이트를 PBS 로 3회 세정마다 세정하고, 이어서, EcoRI 완충 용액으로 조제한 EcoRI 효소 용액을 웰에 첨가하여, 37℃ 에서 2시간 반응시켜, 올리고뉴클레오티드 복합 항체에 있어서의 올리고뉴클레오티드 사슬을 절단하였다.

그 후, 필요에 따라 스핀 칼럼으로 농축하여 회수한 후, 1% 아가로스 겔 전기 영동을 실시하였다. 전기 영동 후에 검출된 밴드를 도 4 에 나타내었다.

그 결과, HA 코팅 플레이트로부터 회수된 올리고뉴클레오티드 단편은 약 100mer 이며, Myc 코팅 플레이트로부터 회수된 올리고뉴클레오티드 단편은 약 200mer 인 것이 확인되었다.

따라서, 12CA5 와 101mer 의 올리고뉴클레오티드와의 복합 항체가, HA 와만 특이적으로 반응하고, 9E10 과 203mer 의 올리고뉴클레오티드와의 복합 항체가, Myc 와만 특이적으로 반응한 것을, 제한 효소 처리 후의 올리고뉴클레오티드 단편의 길이의 상이에 의해 식별 검출할 수 있는 것이 확인되었다.

2. 복합 항체를 이용한 식별 검출

조제한 2종의 복합 항체를 이용하고, 「항원 항체 반응」및 「표지마다의 식별 검출」을 이하와 같이 실시하였다.

항원-항체 반응 샌드위치법의 통상적인 방법에 따라, 지지체로서의 입경 1μm 의 자성 비즈 (BioLabs사 제조) 에, 9E10 (항 Myc 모노클로날 항체) 또는 12CA5 (항 HA 모노클로날 항체) 를 결합한 항체 결합 비즈를 준비하였다. 항원으로서는 독자적으로 제작한 HA-GST-Myc 의 합성 펩티드 (항원 용액) 를 이용하였다. 우선, 3개의 마이크로 튜브 내에서, 9E10 결합 비즈와 12CA5 결합 비즈를, 양비 (입자수비) 로, 각각 3：1, 1：1, 1：3 이 되도록 혼합하고, 이들에 항원 용액을 첨가하여, 실온에서 30분간 인큐베이션하였다. 이들을 PBST 로 3회 잘 세정하고, 각각에, 2종의 올리고뉴클레오티드 복합 항체를 포함한 용액을 적당량 첨가하여, 실온에서 30분간 셰이킹하면서 반응시켰다. 그 후, 추가로 PBST 로 3회 잘 세정하고, 원심하여 얻어진 잔사에, 서열번호 1 의 프라이머 (5-MUSTagRIBio) 및 2의 프라이머 (3-MUSTag101FAM) 그리고 서열번호 1 의 프라이머 (5-MUSTagRIBio) 및 3 의 프라이머 (3-MUSTag203FAM) 를 첨가하여 (즉, 서열번호 1, 2 및 3 의 프라이머를 첨가하여), 하기의 반응액 조성 및 반응 조건으로 PCR 을 실시하였다.

《반응액 조성》

주형 DNA (원심 후의 잔사)： 각 튜브의 잔사량

Taq polymerase： 2.5unit

5'프라이머

5-MUSTagRIBio (20μM)： 4μL

3'프라이머

3-MUSTag101FAM(20μM)： 2μL

3-MUSTag203FAM(20μM)： 2μL

dNTP(2.5 mM each)： 8μL

10×Buffer： 10μL

멸균수： 적당량 (약 70μL)

합계： 100μL

《반응 조건》

「94℃ 에서 30초의 열변성·해리→60℃ 에서 30초의 어닐링→72℃ 에서 30초간의 합성·신장」을 1사이클로 하는 사이클 조건으로, 합계 5 사이클.

PCR 후에 원심하여 얻어진 상청에 대해, 1% 아가로스 겔 전기 영동을 실시하였다. 전기 영동 후에 검출된 밴드를 도 5 에 나타냈다.

그 결과, 모든 양비의 샘플에 있어서도, 약 100bp 및 약 200bp 의 단편의 밴드가 인정되었으므로, 동일 반응조 내에 있어서 올리고뉴클레오티드 표지마다 식별 검출할 수 있는 것을 확인할 수 있었다. 또, 항체 결합 비즈의 양비에 대응한 양의 단편량이 인정되고, 양비 의존성 (정량성) 이 있는 식별 검출을 할 수 있는 것도 확인할 수 있었다.

〔실시예 2〕

＜미량 유체 분석 장치를 사용한 식별 검출＞

1. 복합 항체의 조제

(1) 올리고뉴클레오티드 사슬의 조제

300mer 의 올리고뉴클레오티드의 조제는, 5' 프라이머로서, 3' 말단에 비오틴이 결합된 서열번호 4 의 프라이머 (5-pcDNA3Bio840) 를 사용하여, 3' 프라이머로서, 5' 말단에 FAM 이 결합된 서열번호 5 의 프라이머 (3-MUSTag1140FAM) 를 사용하고, PCR 에 의해 실시되었다.

500mer 의 올리고뉴클레오티드의 조제는, 5' 프라이머로서, 3' 말단에 비오틴이 결합된 서열번호 4 의 프라이머 (5-pcDNA3Bio840) 를 사용하고, 3' 프라이머로서, 5' 말단에 FAM 이 결합된 서열번호 6 의 프라이머 (3-MUSTag1340FAM) 를 사용하여, PCR 에 의해 실시하였다.

5-pcDNA3Bio840：

Biotin-CTTACTGGCTTATCGAAA (서열번호 4)

3-MUSTag1140FAM：

FAM-CATTTTATTAGGAAAGGA (서열번호 5)

3-MUSTag1340FAM：

FAM-CGCGCTTAATGCGCCGCT (서열번호 6)

상기 각 PCR 은, pcDNA3.1 (In vitro사 제조) 을 주형 DNA 로 하고, 폴리머라아제로서 Taq polymerase 를 사용하여, 하기의 반응액 조성 및 반응 조건으로 실시하였다.

《반응액 조성》

주형 DNA (100μg/μL)： 1μL

Taq polymerase： 2.5 unit

5' 프라이머 (20μM)： 2μL

3' 프라이머 (20μM)： 2μL

dNTP (2.5mM each)： 8μL

10×Buffer： 10μL

멸균수： 적당량 (약 77μL)

합계： 100μL

《반응 조건》

「95℃ 에서 1분간의 열변성·해리→55℃ 에서 1분간의 어닐링→72℃ 에서 30초간의 합성·신장」을 1사이클로 하는 사이클 조건으로, 합계 30 사이클.

상기 각 PCR 후의 증폭 산물은, PCR 후에 원심하여 얻어진 상청을, MinElute PCR Purification spin column (키아겐사) 으로 필터 정제함으로써, 단일한 올리고뉴클레오티드로 정제하였다.

(2) 비오틴화 항체의 조제

실시예 1 의 「1. 의 (2)」와 동일하게 하여, 비오틴화 12CA5 및 비오틴화 9E10 을 조제하였다.

(3) 올리고뉴클레오티드 복합 항체의 조제

비오틴화 12CA5 에는 300mer 의 올리고뉴클레오티드를, 비오틴화 9E10 에는 500mer 의 올리고뉴클레오티드를, 각각, 1：1 의 몰비로 혼합하였다. 이어서, 각각에 있어서, NeutrAvidin (PIERCE Biotechnology사 제조) 를, 비오틴화 항체에 대해 1：1 의 몰비로 첨가하고, 실온에서 15분간 반응시켰다. 이들 반응액을, 각각, 5mL 의 탈염 칼럼에 통과하고, 목적의 획분을 회수하여, 2종의 올리고뉴클레오티드 복합 항체를 얻었다. 각 올리고뉴클레오티드 복합 항체는 겔 여과 칼럼 (PC12：Pharmacia사 제조) 를 이용하여 분획하고, 280nm 및 210nm 의 동시 검출계로 올리고뉴클레오티드 복합 항체만을 얻었다.

2. 복합 항체를 이용한 식별 검출

조제한 2종의 복합 항체를 이용하여, 「항원 항체 반응」및 「표지마다의 식별 검출」을 이하와 같이 실시하였다.

항원-항체 반응 샌드위치법의 통상적인 방법에 따라, 지지체로서 입경 1μm의 자성 비즈 (BioLabs사 제조) 를 이용하고 12CA5 혹은 9E10 을 결합한 항체 결합 비즈를 준비하였다. 항원으로서 HA-GST-Myc 의 합성 펩티드를 이용하였다. 우선, 12CA5 혹은 9E10 이 각각 결합하고 있는 항체 결합 비즈와 각각 1, 0.1, 0.01pmol/μL 의 HA-GST-Myc 의 합성 펩티드를 마이크로 튜브 내에서 혼합하고, 실온에서 30분간 인큐베이션하였다. 이것을 PBST 로 3회 잘 세정하고, 2종 (EcoRI 처리에 의해 각각 300mer 및 500mer 의 올리고뉴클레오티드가 유리한다) 의 올리고뉴클레오티드 복합 항체를 포함한 용액을 적당량 첨가하고, 실온에서 30분간 셰이킹하면서 반응시켰다. 그 후, 적당량의 EcoRI 용액을 각각의 마이크로 튜브에 첨가하고, 37℃ 에서 15분간 반응시켜, 올리고뉴클레오티드 복합 항체에 있어서의 올리고뉴클레오티드 사슬을 절단하고, 원심하여 얻어진 상청을, 코스모아이 SV1210 (히타치 제작소사 제조) 으로 분석하였다.

그 결과, EcoRI 처리에 의해 얻어지는, 300mer 및 500mer 의 올리고뉴클레오티드 단편의 존재를 나타내는 피크가, 각각, 항원 농도 의존적으로 인정되었다 (도 6 참조).

또, 시판되는 핵산 분석 장치를 이용한 경우에도, 300mer 및 500mer 의 올리고뉴클레오티드 단편의 존재를, 각각, 항원 농도 의존적 (정량적) 으로 검출할 수 있는 것이 인정되었다.

〔실시예 3〕

＜PCR 에 의한 식별 검출＞

1. 어댑터를 이용한 복합 항체의 조제

이하의 순서에 의해, 항체 분자에, 어댑터 부분이 되는 「프로테인 G」를 통하여, 올리고뉴클레오티드 사슬을 결합시킨 복합 항체를 조제하였다.

(1) 올리고뉴클레오티드 사슬의 조제

100mer 의 올리고뉴클레오티드의 조제는, 5' 프라이머로서, 5' 말단에 비오틴이 결합된 서열번호 7 의 프라이머 (5-pcDNA3Bio840) 를 사용하고, 3' 프라이머로서, 서열번호 8 의 프라이머 (3-pGEX+MUST100) 를 사용하여, PCR 에 의해 실시하였다.

200mer 의 올리고뉴클레오티드의 조제는, 5' 프라이머로서, 5' 말단에 비오틴이 결합된 서열번호 7 의 프라이머 (5-pcDNA3Bio840) 를 사용하고, 3' 프라이머로서, 서열번호 9 의 프라이머 (3-pGEX+MUST200) 를 사용하여, PCR 에 의해 실시하였다.

300mer 의 올리고뉴클레오티드의 조제는, 5' 프라이머로서, 5' 말단에 비오틴이 결합된 서열번호 7 의 프라이머 (5-pcDNA3Bio840) 를 사용하고, 3' 프라이머로서, 서열번호 10 의 프라이머 (3-pGEX+MUST300) 를 사용하여, PCR 에 의해 실시하였다.

400mer 의 올리고뉴클레오티드의 조제는, 5' 프라이머로서, 5' 말단에 비오틴이 결합된 서열번호 7 의 프라이머 (5-pcDNA3Bio840) 를 사용하고, 3' 프라이머로서, 서열번호 11 의 프라이머 (pGEX+MUST400) 를 사용하여, PCR 에 의해 실시되었다.

500mer 의 올리고뉴클레오티드의 조제는, 5' 프라이머로서, 5' 말단에 비오틴이 결합된 서열번호 7 의 프라이머 (5-pcDNA3Bio840) 를 사용하고, 3' 프라이머로서, 서열번호 12 의 프라이머 (3-pGEX+MUST500) 를 사용하여, PCR 에 의해 실시하였다.

5-pcDNA3Bio840：

Biotin-CTTACTGGCTTATCGAAA (서열번호 7)

3-pGEX+MUST100：

GGCAAGCCACGTTTGGTG CAGTCGAGGC TGATCAGCGA (서열번호 8)

3-pGEX+MUST200：

GGCAAGCCACGTTTGGTG TCCTCATTTT ATTAGGAAAG (서열번호 9)

3-pGEX+MUST300：

GGCAAGCCACGTTTGGTG AGCATGCCTG CTATTGTCTT (서열번호 10)

3-pGEX+MUST400：

GGCAAGCCACGTTTGGTG CCCGCCGCGC TTAATGCGCC (서열번호 11)

3-pGEX+MUST500：

GGCAAGCCACGTTTGGTG AAAGCCGGCG AACGTGGCGA(서열번호 12)

상기 각 PCR 은, pGEX (Pharmacia사 제조) 를 주형 DNA 로 하고, 폴리머라아제로서 Taq polymerase 를 사용하여, 하기의 반응액 조성 및 반응 조건으로 실시하였다.

《반응액 조성》

주형 DNA (100μg/μL)： 1μL

Taq polymerase： 2.5unit

5' 프라이머 (20μM)： 2μL

3' 프라이머 (20μM)： 2μL

dNTP (2.5mM each)： 8μL

10×Buffer： 10μL

멸균수： 적당량 (약 77μL)

합계： 100μL

《반응 조건》

상기 각 PCR 후의 증폭 산물은, PCR 후에 원심하여 얻어진 상청을, MinElute PCR Purification spin column (키아겐사 제조) 에서 필터 정제함으로써, 단일한 올리고뉴클레오티드로 정제하였다.

(2) 프로테인 G/아비딘 결합체의 조제

(i) Maleimide 활성화 프로테인 G 의 조제

5mg 의 프로테인 G 를, 500μL 의 50mM sodium phosphate (pH 7.4) 에 용해하였다. 이어서, 50μL DMSO 에 화학 수식제 (chemical linker) 로서의 Sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate (이하「Sulfo-SMCC」(PIERCE 50mg, # 22322, Molecular Weight:436.37, Spacer Arm Length:11.6Å；하기 구조식 (I) 참조)) 를 1mg 용해하고, 이것을 상기 프로테인 G의 용액에 첨가하였다.

상기 첨가 후의 용액을, 실온에서 60분간 천천히 교반하고, 프로테인 G 와 Sulfo-SMCC 를 반응시켜 결합시켰다. 또한, 당해 결합은, Sulfo-SMCC 의 Sulfo-NHS 에스테르기와 프로테인 G 와의 결합이다.

반응 후에 남은 여분인 Sulfo-SMCC 를 제거하기 위해, 결합 버퍼로 평형화한 탈염 칼럼을 이용하고, 반응액을 500μL 씩의 분획으로 나누었다. 각각의 분획에 있어서의 용출 단백질 (Maleimide 활성화 프로테인 G) 의 농도를 측정하고, 피크의 획분을 채취하였다.

5kDa pore size filter tube 를 이용하고, 원심에 의해 Maleimide 활성화 프로테인 G 를 농축시켜, 용액의 최종 용량을 500μL 로 조정하였다.

(ii) 아비딘과의 결합

버퍼 (100mM Na Phosphate (pH 7.6), 5mM EDTA) 에, EZ-Link Maleimide Activated NeutroAvidin (PIERCE 5mg, #31007, 60 kDa) 을 용해시켰다. 이 용액에, Maleimide 활성화 프로테인 G 용액을 첨가하였다. 당해 첨가는, 프로테인 G 와 아비딘과의 몰비 (프로테인 G：아비딘) 이 1：3 정도가 되도록, 이하의 양비에 조정하여 실시하였다.

프로테인 G (22kDa):아비딘 (60kDa) = 1mg:1mg

혼합 후의 용액을, 4℃ 에서 4시간 이상 (~하룻밤) 천천히 교반하면서 반응시켰다.

반응 후의 용액을, 겔 여과 칼럼 (FPLC gel filtration (PC12 column)) 에 걸쳐, 프로테인 G/아비딘 결합체 중, 프로테인 G 의 1분자에 대해서 아비딘이 2 또는 3분자 결합하고 있는 결합체에 상당하는 분자량의 획분을 채취하였다.

(3) 복합 항체의 조제

(i) 프로테인 G/아비딘 결합체와 올리고뉴클레오티드 사슬과의 결합

버퍼 (50mM Tris (pH 8.0), 1mM EDTA, 0.1M NaCl, 0.5% gelatin, 0.1% Tween20) 중에, 상기 (1) 에서 정제하여 얻어진 각 올리고뉴클레오티드 사슬 (비오틴화 올리고) 와, 상기 (2) 에서 얻어진 프로테인 G/아비딘 결합체를, 각각 몰비 (비오틴화 올리고：프로테인 G/아비딘 결합체) 가 1:2 정도가 되도록 혼합하였다. 혼합 용액을, 실온에서 30분간 이상 교반하면서 반응 (비오틴-아비딘 결합 반응) 시켜, 올리고뉴클레오티드/프로테인 G 결합체를 얻었다.

(ii) 항체의 조제

통상적인 방법에 의해, 하기 5종의 모노클로날 항체를 제작하였다.

항 Int6 항체 (항 Mouse IgG 모노클로날 항체)

항 HIF1α 항체 (항 Rabbit IgG 모노클로날 항체)

12CA5 (항 HA 모노클로날 항체)

9E10 (항 Myc 모노클로날 항체)

항 β-galactosidase 항체 (항 β-galactosidase 모노클로날 항체)

(iii) 항체와 어댑터 부분과의 결합

버퍼 (50mM Tris (pH 8.0), 1mM EDTA, 0.1M NaCl, 0.5% gelatin, 0.1% Tween20) 중에, 올리고뉴클레오티드/프로테인 G 결합체와, 각종 모노클로날 항체를, 각각 1：1 의 몰비가 되도록 혼합하고, 교반하면서 실온에서 1시간 혹은 4℃ 에서 12시간 반응시켰다. 구체적으로는, 항 Int6 항체 (항 Mouse IgG 모노클로날 항체) 는 100mer 의 올리고뉴클레오티드가 결합한 상기 결합체와 혼합하고, 항 HIF1α 항체 (항 Rabbit IgG 모노클로날 항체) 는 200mer 의 올리고뉴클레오티드가 결합한 상기 결합체와 혼합하고, 12CA5 는 300mer 의 올리고뉴클레오티드가 결합한 상기 결합체와 혼합하며, 9E10 는 400mer 의 올리고뉴클레오티드가 결합한 상기 결합체와 혼합하여, 항 β-galactosidase 항체 (항 β-galactosidase 모노클로날 항체) 는 500mer 의 올리고뉴클레오티드가 결합한 상기 결합체와 혼합하여, 반응시켰다. 각 반응액을, 각각, 5mL 의 탈염 칼럼에 통과시키고, 목적의 획분을 회수하여, 5종의 올리고뉴클레오티드 복합 항체를 얻었다.

2. 복합 항체를 이용한 식별 검출

조제한 5종의 복합 항체를 이용하고, 「항원 항체 반응」및 「표지마다의 식별 검출」을 이하와 같이 하여 실시하였다.

ELISA법의 통상적인 방법에 따라, ELISA 플레이트의 웰에, 5종의 항원 (Mouse IgG, Rabbit IgG, HA, Myc 및 β-galactosidase (각 50ng)) 를 고착시켰다. 블로킹은, 5% Skim milk 100mM Na Phosphate 150mMNaCl (pH 7.4) 를 웰에 첨가하고, 실온에서 30분간 정치하여 실시하였다. 당해 웰에, 5종의 올리고뉴클레오티드 복합 항체를 포함한 용액을 20μL 첨가하고, 실온에서 30분간 셰이킹하면서 반응시켰다. 반응 후, 0.1% NP40, 100mM Na Phosphate 150mMNaCl (pH 7.4) 로 5회 잘 세정하고, 이어서, 100mM Na Phosphate 150mMNaCl (pH 7.4) 로 1회 세정한 후, 적당량의 EcoRI 용액 (10unit/20μL) 을 웰에 첨가하여, 37℃ 에서 30분간 반응시켜, 항원과 결합한 복합 항체의 올리고뉴클레오티드 사슬을 유리시켰다. 이 유리 올리고뉴클레오티드를 포함한 상청을 회수하였다.

그 후, 이 상청에 (즉, 유리 올리고뉴클레오티드를 주형으로 하고), 서열번호 13 의 프라이머 (5-Forw-3), 및 FAM 색소로 형광 표지한 서열번호 14 의 프라이 머(3-pGEX-FAM) 를 첨가하고, 하기의 반응액 조성 및 반응 조건으로 PCR 을 실시하였다.

5-Forw-3：　 TGCATCTAGAGGGCCCTATTCTATA (서열번호 13)

3-pGEX-FAM： FAM-GGCAAGCCACGTTTGGTG (서열번호 14)

《반응액 조성》

EcoRI 처리 후의 상청： 5μL

Taq polymerase： 2.5 unit

5' 프라이머

5-Forw-3(20mM)： 2μL

3' 프라이머

3-pGEX-FAM(20mM)： 2μL

dNTP (2.5mM)： 8μL

10×Buffer： 10μL

멸균수： 적당량 (약 73μL)

합계： 100μL

《반응 조건》

「95℃ 에서 5분간의 열변성·해리→55℃ 에서 30초간의 어닐링→72℃ 에서 30초간의 합성·신장」을 1사이클로 하는 사이클 조건에서, 합계 15 사이클. 그 후, 10μl 의 포름아미드에 반응액을 1μl 용해하고, 95℃ 에서 5분간의 열변성.

PCR 후의 반응액을 원심하고, 얻어진 상청에 대해, DNA 시퀀스 ABI-3100 (Applied Biosystems사 제조) 을 이용하여 GeneScan 소프트웨어에 의한 해석을 실시하고, 각 피크 위치 및 그 높이의 동정을 실시하였다.

그 결과, 각 항원 (Mouse IgG, Rabbit IgG, HA, Myc 및 β-galactosidase) 에 특이적으로 결합할 수 있는 복합 항체가 갖는 올리고뉴클레오티드 단편, 즉 올리고 길이가 100mer, 200mer, 300mer, 400mer 및 500mer 의 올리고뉴클레오티드 단편의 존재를 나타내는 피크가 확인되었다 (도 8 참조).

〔참고예 1〕

＜본 발명의 검출법과 종래의 ELISA법과의 검출 감도의 비교＞

1. ELISA법으로 이용하는 1차 항체의 조제

통상적인 방법에 따라, 마우스 항 HA 항체 및 마우스 항 Myc 항체를 조제하였다.

2. 본 발명의 검출법으로 이용하는 올리고뉴클레오티드 복합 항체의 조제

실시예 3 의 「1.」과 동일한 방법에 의해, 「200mer 의 올리고뉴클레오티드 사슬을 갖는 12CA5 복합 항체」(이하, 복합 항체 A) 를 조제하였다.

구체적으로는, 실시예 3 에서 사용한 5종의 올리고뉴클레오티드 복합 항체 중「100mer 의 올리고뉴클레오티드 사슬을 갖는 복합 항체」의 조제 방법에 있어서, 100mer 의 올리고뉴클레오티드 사슬을 갖는 올리고뉴클레오티드/프로테인 G 결합체와 항 Int6 항체 (항마우스 IgG 모노클로날 항체) 를 반응시키는 대신에, 200mer 의 올리고뉴클레오티드 사슬을 갖는 올리고뉴클레오티드/프로테인 G 결합체와 항 Int6 항체를 반응시킨 것 이외에는, 실시예 3 의 「1.」과 동일하게 하여, 상기 복합 항체 A 를 조제하였다.

3. 항원의 고정

항원으로서는 HA-GST-Myc 의 합성 펩티드를 이용하였다. ELISA법의 통상적인 방법에 따라, ELISA 플레이트의 각 웰에, 당해 항원을 하기 표에 나타내는 양으로 고착시켰다. 블로킹은, 5% Skim milk, 100mM Na Phosphate, 150mMNaCl (pH 7.4) 을 웰에 첨가하고, 실온에서 30분간 정치하여 실시하였다.

각 웰에 있어서의 항원량

	A	B	C	D	E	F	G	H
02열 04열	1.3pg	256fg	51fg	10.2fg	2.0fg	410ag	82ag	1.6ag
01열 03열	500ng	100ng	20ng	4ng	800pg	160pg	32pg	6.4pg

4. ELISA 에 의한 검출

상기 3. 의 블로킹 후, 0.1%NP40, Phosphate Buffer Saline (pH 7.4) 에서 3회 잘 세정하였다.

1차 항체로서, 상기 1. 에서 조제한 마우스 항 HA 항체를 플레이트의 01열 및 02열의 각 웰에, 마우스 항 Myc 항체를 플레이트의 03열 및 04열의 각 웰에, 각각 첨가하였다.

0.1%NP40, Phosphate Buffer Saline (pH 7.4) 으로 3회 잘 세정하고, HRP 표지 염소항 마우스 IgG 를 첨가하였다.

0.1%NP40, Phosphate Buffer Saline (pH 7.4) 으로 3회 잘 세정하고, 기질을 첨가하여 정치하였다. 그 후, 1%SDS 로 발색을 정지하였다.

발색 후의 플레이트 (도 9(a)) 의 각 웰에 대해, ELISA-Reader (415nm) 를 이용하여 측정한 결과를 도 9(b) 에 나타낸다. 이 결과로부터, ELISA법에서의 최대 감도는 항원량 4ng (D 의 01열의 웰) 인 것이 확인되었다.

5. 본 발명의 검출법에 따른 검출

상기 3. 의 블로킹 후, 0.1% NP40, 100mM Na Phosphate 150mMNaCl (pH 7.4) 로 3회 잘 세정하였다.

0.1%NP40, Phosphate Buffer Saline (pH 7.4) 으로 3회 잘 세정한 후, 상기 2. 에서 조제한 복합 항체 A 를 포함한 용액을, 플레이트의 01열 및 02열의 각 웰에 20μL 씩 첨가하고, 실온에서 30분간 셰이킹하면서 반응시켰다.

반응 후, 0.1%NP40, 100mM Na Phosphate 150mMNaCl (pH 7.4) 로 3회 잘 세정하고, 이어서, 100mM Na Phosphate 150mMNaCl (pH 7.4) 로 1회 세정한 후, 적당량의 EcoRI 용액 (10unit/20μL) 을 웰에 첨가하여, 37℃ 에서 30분간 반응시켜, 항원과 결합한 복합 항체 A 의 올리고뉴클레오티드 사슬을 유리시켰다. 이 유리 올리고뉴클레오티드를 포함한 상청을 회수하였다.

그 후, 이 상청에 (즉, 유리 올리고뉴클레오티드를 주형으로 하고), 서열번호 13 의 프라이머 (5-Forw-3), 및 FAM 색소로 형광 표지한 서열번호 14 의 프라이머 (3-pGEX-FAM) 를 첨가하고, 실시예 3 의 「2.」와 동일한 반응액 조성 및 반응 조건 (단 사이클수는 20) 으로 PCR 을 실시했다.

5-Forw-3：　 TGCATCTAGAGGGCCCTATTCTATA (서열번호 13)

3-pGEX-FAM： FAM-GGCAAGCCACGTTTGGTG (서열번호 14)

PCR 후의 반응액을 원심하고, 얻어진 상청에 대해, DNA 시퀀스 ABI-3100 (Applied Biosystems사 제조) 을 이용하여 GeneScan 소프트웨어에 의한 해석을 실시하고, 피크의 검출 (피크 위치 및 그 높이의 동정) 을 실시하였다.

그 결과, 도 10 및 도 11 에 나타내는 바와 같이, 본 발명의 검출법이면, 적어도 256fg (B 의 02열의 웰) 의 항원량까지 유효하게 검출할 수 있는 것을 알았다. 즉, 본 발명의 검출법 (PCR：20 사이클) 은, 최대 감도 4ng 인 ELISA법에 비해, 검출 감도가 약 15,000배 높은 것이 확인되었다.

〔참고예 2〕

＜본 발명의 검출법에 있어서의 정량성＞

1. 올리고뉴클레오티드 복합 항체의 조제

실시예 3 의 「1.」과 동일한 방법에 의해, 「100mer 의 올리고뉴클레오티드 사슬을 갖는 9E10 복합 항체」(이하, 복합 항체 B) 를 조제하였다.

구체적으로는, 실시예 3 에서 사용한 5종의 올리고뉴클레오티드 복합 항체 중「400mer 의 올리고뉴클레오티드 사슬을 갖는 복합 항체」의 조제 방법에 있어서, 400mer 의 올리고뉴클레오티드 사슬을 갖는 올리고뉴클레오티드/프로테인 G 결합체와 9E10 (항 Myc 모노클로날 항체) 을 반응시키는 대신에, 100mer 의 올리고뉴클레오티드 사슬을 갖는 올리고뉴클레오티드/프로테인 G 결합체와 9E10 을 반응시킨 것 이외에는, 실시예 3 의 「1.」과 동일하게 하여, 상기 복합 항체 B 를 조제 하였다.

2. 항원의 고정

ELISA법의 통상적인 방법에 따라, ELISA 플레이트의 각 웰에, 항원으로서의 Myc 펩티드를 각각 상이한 양으로 고착시켰다. 구체적으로는, 각 웰에, 50ng, 12.5ng, 3.1ng, 780pg, 190pg, 48.8pg, 12.2pg 및 3pg 의 Myc 를 각각 고착시켰다. 또한 각 웰에는, Myc 이외의 항원 (하기 표를 참조) 도 아울러 고착시켰다.

항원	항원량/well
HA 펩티드	1~5ng
Myc-GST-HA	1~5ng
Int6 펩티드	1~5ng
HIF 펩티드	1~5ng
β-galactosidase 효소 단백	1~5ng

블로킹은, 5% Skim milk, 100mM Na Phosphate, 150mMNaCl (pH 7.4) 을 각 웰에 첨가하고, 실온에서 30분간 정치하여 실시하였다.

3. 본 발명의 검출법에 따른 검출

블로킹 후, 0.1%NP40, 100mM Na Phosphate 150mMNaCl (pH 7.4) 로 3회 잘 세정하였다.

상기 1. 에서 조제한 복합 항체 B 를 포함한 용액을, 각 웰에 20μL 씩 첨가하고, 실온에서 30분간 셰이킹하면서 반응시켰다.

반응 후, 0.1%NP40, 100mM Na Phosphate 150mMNaCl (pH 7.4) 로 3회 잘 세정하고, 이어서, 100mM Na Phosphate 150mMNaCl (pH 7.4) 로 1회 세정한 후, 적당량의 EcoRI 용액 (10unit/20μL) 을 각 웰에 첨가하고, 37℃ 에서 30분간 반응시켜, 항원과 결합한 복합 항체 B 의 올리고뉴클레오티드 사슬을 유리시켰다. 이 유 리 올리고뉴클레오티드를 포함한 상청을 회수하였다.

그 후, 이 상청에 (즉, 유리 올리고뉴클레오티드를 주형으로 하고), 서열번호 13 의 프라이머 (5-Forw-3), 및 FAM 색소로 형광 표지한 서열번호 14 의 프라이머 (3-pGEX-FAM) 를 첨가하고, 실시예 3 의 「2.」와 동일한 반응액 조성 및 반응 조건 (단 사이클수는 20) 으로 PCR 을 실시하였다.

5-Forw-3：　 TGCATCTAGAGGGCCCTATTCTATA (서열번호 13)

3-pGEX-FAM： FAM-GGCAAGCCACGTTTGGTG (서열번호 14)

PCR 후의 반응액을 원심하고, 얻어진 상청에 대해, DNA 시퀀스 ABI-3100 (Applied Biosystems사 제조) 을 이용하여 GeneScan 소프트웨어에 의한 해석을 실시하고, 피크의 검출 (피크 위치 및 그 높이의 동정) 을 실시하였다. 그 결과를 도 12 에 나타낸다.

얻어진 검출 결과에 대해, 횡축을 사용한 단백양 (항원량：Myc 의 양), 세로축을 시그널치로 하고, 각 값을 플롯하였다 (도 13). 또한, 시그널치가 검출 한계를 초과한 것에 대해서는 플롯하고 있지 않다. 그 결과, 각 값은 의미가 있도록 상관하고 있고, 본 발명의 검출법에 의하면, 항원의 종류수에 관련되지 않아, 특정한 항원에 대해 정량적으로 검출할 수 있는 것이 확인되었다.

본 발명에 의하면, 피험 시료에 포함되는 복수 종류의 표적 물질을 한 번에 식별하여 검출할 수 있는, 표적 물질의 검출 방법을 제공할 수 있다. 본 발명 방법은, 특히, 암의 진단 (조기 발견에 의한 치유율의 향상) 이나 항암제의 약효 평가, 뇌졸중이나 심근경색의 진단 (조기 진단에 의한 후유증의 저감), 및 감염증에 있어서의 병원체의 특정 등이라는 인간 임상 검사의 분야나, 가축이나 애완동물의 감염증, 그 밖의 질환의 진단, 또 잔류 농약이나 세균에 의한 식품 오염 물질의 특정, 및 다이옥신이나 PCB 등의 환경 오염 물질의 특정 등이라는 식품이나 환경의 분야에 있어서, 검사 또는 진단 효율이나 평가 효율 등을 비약적으로 높일 수 있어 매우 유용하다.

서열표 프리 텍스트

서열번호 1：프라이머

서열번호 2：프라이머

서열번호 3：프라이머

서열번호 4：프라이머

서열번호 5：프라이머

서열번호 6：프라이머

서열번호 7：프라이머

서열번호 8：프라이머

서열번호 9：프라이머

서열번호 10：프라이머

서열번호 11：프라이머

서열번호 12：프라이머

서열번호 13：프라이머

서열번호 14：프라이머

<110> The Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science <120> A Method of Detection for antigen <130> PCT05-0083 <150> JP 2004-318395 <151> 2004-11-01 <160> 14 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 cggaattcgc ggacgaggag aagctgccgc ccggctgg 38 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gctggcgtta gtgatgtggt tgaa 24 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ctggctgtgc ttcaccag 18 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 cttactggct tatcgaaa 18 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 cattttatta ggaaagga 18 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 cgcgcttaat gcgccgct 18 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 cttactggct tatcgaaa 18 <210> 8 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ggcaagccac gtttggtgca gtcgaggctg atcagcga 38 <210> 9 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 ggcaagccac gtttggtgtc ctcattttat taggaaag 38 <210> 10 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 ggcaagccac gtttggtgag catgcctgct attgtctt 38 <210> 11 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 ggcaagccac gtttggtgcc cgccgcgctt aatgcgcc 38 <210> 12 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 ggcaagccac gtttggtgaa agccggcgaa cgtggcga 38 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 tgcatctaga gggccctatt ctata 25 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 ggcaagccac gtttggtg 18

Claims

피험 시료에 포함되는 복수 종류의 표적 물질을 식별하여 검출하는 방법으로서, 지지체에 고정된 표적 물질 및/또는 고정되어 있지 않은 표적 물질과, 당해 표적 물질의 종류에 대응하여 식별할 수 있도록 표지 처리된 결합 물질을 접촉시켜 당해 표적 물질과 당해 결합 물질과의 복합체를 형성시키는 공정, 및 상기 복합체를 형성한 결합 물질 중의 표지를 검출하는 공정을 포함한 상기 방법.
제 1 항에 있어서,

상기 결합 물질 중의 표지 부분이 적어도 어댑터 부분을 통하여 당해 결합 물질에 고정된 것인 방법.
제 2 항에 있어서,

상기 어댑터 부분이 프로테인 G, 프로테인 A, 프로테인 L, 및 프로테인 A 와 프로테인 G 와의 융합 단백질로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종인 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 결합 물질은 올리고뉴클레오티드 사슬과의 복합체를 형성하는 것인 방법.
제 4 항에 있어서,

상기 표지 처리가 상기 올리고뉴클레오티드 사슬에, 제한 효소에 의한 절단 부위를 형성하는 처리, PCR 에서 증폭 가능한 영역을 형성하는 처리, 방사성 동위체 원소를 함유시키는 처리, 형광 색소를 결합시키는 처리, 효소를 결합시키는 처리, 광조사에 의한 절단 부위를 형성하는 처리, 활성 산소에 의한 절단 부위를 형성하는 처리, 표지 처리 덴드리머를 결합시키는 처리, 및 염기의 종류에 있어서 적어도 1염기의 차이를 형성하는 처리로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개인 방법.
제 5 항에 있어서,

상기 표지를 검출하는 공정이 상기 PCR 에 의해 증폭된 산물을 전기 영동에 의해 검출하는 공정인 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 결합 물질은 올리고펩티드 사슬과의 복합체를 형성하는 것인 방법.
제 7 항에 있어서,

상기 표지 처리가 상기 올리고펩티드 사슬에, 단백질 분해 효소에 의한 절단 부위를 형성하는 처리, 방사성 동위체 원소를 함유시키는 처리, 형광 색소를 결합시키는 처리, 효소를 결합시키는 처리, 광조사에 의한 절단 부위를 형성하는 처리, 활성 산소에 의한 절단 부위를 형성하는 처리, 및 표지 처리 덴드리머를 결합시키는 처리로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1개인 방법.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 표적 물질이 항원이며, 상기 결합 물질이 항체인 방법.
표적 물질의 종류에 대응하여 식별할 수 있도록 표지 처리된 복수 종류의 결합 물질을 포함한, 표적 물질의 식별 검출용 키트.