JP3143477B2 - 生物学的サンプル中における生物学的分子の検出のためのバクテリオファージの使用に基づく方法 - Google Patents
生物学的サンプル中における生物学的分子の検出のためのバクテリオファージの使用に基づく方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、生物学的ソースにおける興味ある分子の存
在の検出方法に関する。これは、科学的研究の多くの領
域に共通の要求に応えるものである。実際、生物学的サ
ンプル中における、たとえば臨床的病原に関与する分子
の存在を同定する能力は、とくに医学の分野における研
究の重要な対象と常に考えられてきた。
在の検出方法に関する。これは、科学的研究の多くの領
域に共通の要求に応えるものである。実際、生物学的サ
ンプル中における、たとえば臨床的病原に関与する分子
の存在を同定する能力は、とくに医学の分野における研
究の重要な対象と常に考えられてきた。
バイオ医学の分野は、疑いもなく、この方法が適用さ
れる主要な（それのみではないが）分野である。実際、
この目的の方法に関連する本発明は、とくに診断レベル
での検出における感度がますます高レベルに到達するこ
とを目標に提案されてきた。
れる主要な（それのみではないが）分野である。実際、
この目的の方法に関連する本発明は、とくに診断レベル
での検出における感度がますます高レベルに到達するこ
とを目標に提案されてきた。
細胞または組織抽出物中における特定の分子の存在を
検出するために最も頻繁に用いられるバイオ化学的ツー
ルはそれらの著しい感度と高い結合特異性のために抗体
である。
検出するために最も頻繁に用いられるバイオ化学的ツー
ルはそれらの著しい感度と高い結合特異性のために抗体
である。
興味ある分子との相互作用がこれらの方法で起こった
場合、それは抗体自体に連結されたマーカー、たとえば
蛍光物質、酵素活性を有するタンパク質、または放射性
マーカーを用いて強調される。
場合、それは抗体自体に連結されたマーカー、たとえば
蛍光物質、酵素活性を有するタンパク質、または放射性
マーカーを用いて強調される。
これらのマーカーの検出能力は、いずれの場合も、い
わゆるシグナル増幅方法の使用によりかなり増強される
ことが見出されている。これらは、たとえば特異的認識
のために用いられる抗体（一次抗体）ではなく、第一の
抗体に結合できる第二の抗体（二次抗体）にマーカーを
連結することによって、より強力な検出シグナルを得る
ことを可能にする。マーカー分子たとえばフルオレスセ
インもしくはローダミンのような蛍光物質、アルカリホ
スファターゼもしくは西洋ワサビペールオキシダーゼの
ような酵素活性をもつプロテアーゼに共有結合で結合す
る二次抗体を用いて多くの方法が開発されている。電子
顕微鏡を用いる検出の場合にはフェリンまたはコロイド
状金スフェアも使用される。
わゆるシグナル増幅方法の使用によりかなり増強される
ことが見出されている。これらは、たとえば特異的認識
のために用いられる抗体（一次抗体）ではなく、第一の
抗体に結合できる第二の抗体（二次抗体）にマーカーを
連結することによって、より強力な検出シグナルを得る
ことを可能にする。マーカー分子たとえばフルオレスセ
インもしくはローダミンのような蛍光物質、アルカリホ
スファターゼもしくは西洋ワサビペールオキシダーゼの
ような酵素活性をもつプロテアーゼに共有結合で結合す
る二次抗体を用いて多くの方法が開発されている。電子
顕微鏡を用いる検出の場合にはフェリンまたはコロイド
状金スフェアも使用される。
別の増幅システムでは、分子の高い結合親和性、たと
えば、ビオチン（小さな水溶性ビタミン）およびストレ
プトアビジン（細菌性タンパク質）、またはレシチン
（特異的な糖残基を認識し結合できるタンパク質）と糖
タンパク質、糖脂質またはプロテオグリカンのような分
子の間の高い結合親和性が使用される。
えば、ビオチン（小さな水溶性ビタミン）およびストレ
プトアビジン（細菌性タンパク質）、またはレシチン
（特異的な糖残基を認識し結合できるタンパク質）と糖
タンパク質、糖脂質またはプロテオグリカンのような分
子の間の高い結合親和性が使用される。
マーカーのネットワークの創成が検出シグナルをかな
り増幅することを可能にすることを含めて、このテーマ
に対しては、著しく広範囲の一連の変動が可能である。
これらのすべての方法は、いずれの場合も、標的分子の
特異的同定が可能な分子として抗体の使用に関連し、し
たがって、それらはまた、標的分子の濃度により感度レ
ベルが限定されることである。
り増幅することを可能にすることを含めて、このテーマ
に対しては、著しく広範囲の一連の変動が可能である。
これらのすべての方法は、いずれの場合も、標的分子の
特異的同定が可能な分子として抗体の使用に関連し、し
たがって、それらはまた、標的分子の濃度により感度レ
ベルが限定されることである。
後者の限定は，さらに最近ここで検出酵素の代わりに
この目的のためのPCR（ポリメラーゼチェーン反応）技
術の適用に基づいて立案された方法により克服された。
これらの方法は、実際、この場合も、タンパク質ではな
く、既知の配列をもつポヌクレオチドに生理学的にカッ
プリングする特異的なリガンドに対するモノクローナル
抗体の使用に基づいている。
この目的のためのPCR（ポリメラーゼチェーン反応）技
術の適用に基づいて立案された方法により克服された。
これらの方法は、実際、この場合も、タンパク質ではな
く、既知の配列をもつポヌクレオチドに生理学的にカッ
プリングする特異的なリガンドに対するモノクローナル
抗体の使用に基づいている。
これは、既知のDNA配列の増幅によって以後の検出を
実施することを可能にし、これは、ポリメラーゼチェー
ン反応（PCR）の使用が効果的に達成される（V.Ruzicka
ら,1993;T.Sanoら,1992;H.Zhouら,1993）。
実施することを可能にし、これは、ポリメラーゼチェー
ン反応（PCR）の使用が効果的に達成される（V.Ruzicka
ら,1993;T.Sanoら,1992;H.Zhouら,1993）。
免疫PCRとして知られるこの方法は実際、標的分子に
唯一の抗体が結合していても検出することを可能にす
る。感度におけるかなりの改良にもかかわらず、これら
の方法には、とくにポリヌクレオチドと抗体の直接的な
会合ならびに関心分子への抗体の結合時におけるポリヌ
クレオチドによる避け難い干渉により生じる高いバック
グランドのような一連の問題を提供する。
唯一の抗体が結合していても検出することを可能にす
る。感度におけるかなりの改良にもかかわらず、これら
の方法には、とくにポリヌクレオチドと抗体の直接的な
会合ならびに関心分子への抗体の結合時におけるポリヌ
クレオチドによる避け難い干渉により生じる高いバック
グランドのような一連の問題を提供する。
さらに、増幅反応の特異性および収率が反応試薬を混
合するときの温度に依存するとし、PCR反応がプライマ
ーのハイブリダイゼーションに至適と考えられる温度以
下の温度で起ことすると、非特異的なハイブリダイゼー
ション産物を得ることができる。
合するときの温度に依存するとし、PCR反応がプライマ
ーのハイブリダイゼーションに至適と考えられる温度以
下の温度で起ことすると、非特異的なハイブリダイゼー
ション産物を得ることができる。
現在ではこの問題は、システムが「熱開始」プライマ
ーの特異的ハイブリダイゼーションが可能になる温度に
到達したのちにのみ、必須の試薬の増幅反応への添加を
行うことによって解決している。この操作は試薬を機械
的に分離することにより（D.E.Birchら,1996）、または
DNAポリメラーゼの酵素活性をブロックする抗体を用い
ることにより（J.Chengら,1996）達成される。
ーの特異的ハイブリダイゼーションが可能になる温度に
到達したのちにのみ、必須の試薬の増幅反応への添加を
行うことによって解決している。この操作は試薬を機械
的に分離することにより（D.E.Birchら,1996）、または
DNAポリメラーゼの酵素活性をブロックする抗体を用い
ることにより（J.Chengら,1996）達成される。
最近、増幅反応に続いてインシトゥハイブリダイゼー
ション反応を行うインシトゥPCRとして知られる細胞上
で実施されるPCR法が開発されている（G.J.Nuovo,199
4）。この方法によれば、DNA鋳型およびプライマーは、
非特異的ハイブリダイゼーション反応を回避する利点か
ら、細胞分解の瞬間まで、生物学的に分離したままに置
かれる（EP524908;Hoffmann La Roche Inc.）。
ション反応を行うインシトゥPCRとして知られる細胞上
で実施されるPCR法が開発されている（G.J.Nuovo,199
4）。この方法によれば、DNA鋳型およびプライマーは、
非特異的ハイブリダイゼーション反応を回避する利点か
ら、細胞分解の瞬間まで、生物学的に分離したままに置
かれる（EP524908;Hoffmann La Roche Inc.）。
さらに、最近の方法の多くの代表的な問題を克服する
と考えられ、したがって応答シグナルの増幅を改良す
る、新たな診断方法にすべて関連する一連の特許があ
る。これらは、それらの主題として様々な方法を有し、
たとえば特定のタンパク質の発見と関連するPCRの使用
（WO 9421676）；リガンドたとえばウイルスHIV−１の
エピトープに結合した遺伝子操作ハイブリッド酵素の使
用（WO 942636）；抗原に結合するタンパク質と複合さ
せた核酸から発生させたウイルスエピトープの使用（WO
9406934）；制御配列に連結したウイルスエピトープお
よびそのエピトープに向けられたモノクローナル抗体の
発現のために、たとえばHCVから得られたウイルスcDNA
の部分の使用がある。後者の場合、興味あるcDNA領域は
抗体応答とDNAとのハイブリダイゼーション後に生じる
応答の間の交差制御の実施を可能にする（EP388232）。
と考えられ、したがって応答シグナルの増幅を改良す
る、新たな診断方法にすべて関連する一連の特許があ
る。これらは、それらの主題として様々な方法を有し、
たとえば特定のタンパク質の発見と関連するPCRの使用
（WO 9421676）；リガンドたとえばウイルスHIV−１の
エピトープに結合した遺伝子操作ハイブリッド酵素の使
用（WO 942636）；抗原に結合するタンパク質と複合さ
せた核酸から発生させたウイルスエピトープの使用（WO
9406934）；制御配列に連結したウイルスエピトープお
よびそのエピトープに向けられたモノクローナル抗体の
発現のために、たとえばHCVから得られたウイルスcDNA
の部分の使用がある。後者の場合、興味あるcDNA領域は
抗体応答とDNAとのハイブリダイゼーション後に生じる
応答の間の交差制御の実施を可能にする（EP388232）。
一方、他の特許はその主題を、DNAアーゼ−Ｉによる
ウイルスゲノムたとえばHIV−１の消化により得られる
抗原決定基のライブラリーの構築に有し、適当なベクタ
ーを用いて得られたこれらのフラグメントの発現に続い
て、上記発現産物を抗体の使用によりついで選択するも
のである（EP373070）。
ウイルスゲノムたとえばHIV−１の消化により得られる
抗原決定基のライブラリーの構築に有し、適当なベクタ
ーを用いて得られたこれらのフラグメントの発現に続い
て、上記発現産物を抗体の使用によりついで選択するも
のである（EP373070）。
この関連で、本発明の価値はその主題として、広範に
異なる状況および広範に異なる目的に使用できるきわめ
て多目的の方法からなり、現在の技術水準で存在する様
々な問題の克服を可能にする点にある。
異なる状況および広範に異なる目的に使用できるきわめ
て多目的の方法からなり、現在の技術水準で存在する様
々な問題の克服を可能にする点にある。
本発明の方法は、実際、特異的な抗体の産生ではな
く、検査すべきサンプル中の関心分野と相互作用できる
任意の分子をカプシド上に表す組換え線状ファージの使
用を前提とするものである。
く、検査すべきサンプル中の関心分野と相互作用できる
任意の分子をカプシド上に表す組換え線状ファージの使
用を前提とするものである。
適当な分子を表すファージが利用可能である場合は、
問題の分子が様々な起源（ヒト生体または動物生体から
採取したサンプルのみならず、他の種類のたとえば水、
飲料または食品）の生物学的サンプル中に微量に存在し
ても、任意の種類の関心分子（アミノ酸のみではなく）
の存在を検出することを可能にする。本発明の主題を形
成する操作の組合せはまた、結果の明瞭性を危くするDN
Aと試薬の間の非特異的会合ならびにその結果としての
バックグランドの危険を消失させるように統合される。
問題の分子が様々な起源（ヒト生体または動物生体から
採取したサンプルのみならず、他の種類のたとえば水、
飲料または食品）の生物学的サンプル中に微量に存在し
ても、任意の種類の関心分子（アミノ酸のみではなく）
の存在を検出することを可能にする。本発明の主題を形
成する操作の組合せはまた、結果の明瞭性を危くするDN
Aと試薬の間の非特異的会合ならびにその結果としての
バックグランドの危険を消失させるように統合される。
これらの利点は、PCRによる検出に使用されたDNAが試
薬に直接暴露されるのではなく、採用された組換えファ
ージの内部に包含されているという事実の結果である。
薬に直接暴露されるのではなく、採用された組換えファ
ージの内部に包含されているという事実の結果である。
タンパク性カプシド封入への存在は実際に、以後の検
出に用いられるDNAをリガンド分子（一方はカプシドに
暴露される）と受容体分子（サンプル中の関心分子）の
間の結合反応時の干渉から防止する。
出に用いられるDNAをリガンド分子（一方はカプシドに
暴露される）と受容体分子（サンプル中の関心分子）の
間の結合反応時の干渉から防止する。
これに続いて、リガンド分子と受容体分子の間の相互
作用ののち、適当な洗浄操作を行って、特異的な相互作
用により受容体に結合しなかったファージを除去する。
最後に、ファージDNAのヌクレオチド配列を、非特異的
な反乱を回避する方法に必要な試薬を添加することによ
り増幅させる。実際、増幅させるDNAは初期の段階には
ファージカプシドのタンパク質により保護されたまま
で、タンパク質はポリメリゼチェーン反応が開始された
瞬間にはじめて変性される。
作用ののち、適当な洗浄操作を行って、特異的な相互作
用により受容体に結合しなかったファージを除去する。
最後に、ファージDNAのヌクレオチド配列を、非特異的
な反乱を回避する方法に必要な試薬を添加することによ
り増幅させる。実際、増幅させるDNAは初期の段階には
ファージカプシドのタンパク質により保護されたまま
で、タンパク質はポリメリゼチェーン反応が開始された
瞬間にはじめて変性される。
その他の利点は、受容体ファージの構築に用いられた
基本的組換えファージミドが一本鎖DNAを含有する粒子
として大腸菌により本質的に分泌されるという事実に由
来する。実際一本鎖DNA鋳型上PCRの使用が二本鎖DNA上
で実施した場合よりも良好な結果を与えることは、現在
の技術水準から既知である。
基本的組換えファージミドが一本鎖DNAを含有する粒子
として大腸菌により本質的に分泌されるという事実に由
来する。実際一本鎖DNA鋳型上PCRの使用が二本鎖DNA上
で実施した場合よりも良好な結果を与えることは、現在
の技術水準から既知である。
本発明は、さらに添付の図面を参照すればより明瞭な
ものになろう。
ものになろう。
図１は抗−HCV抗体に結合できるペプチドをカプシド
の表面に現すファージP787のDNAの増幅の結果を示す。
エチジウムプロミド含有アガロースゲル上UV蛍光により
可視化する。ＭはプラスミドDNApUC19の制限酵素Hinf I
による加水分解によって得られた分子量の標準である。
の表面に現すファージP787のDNAの増幅の結果を示す。
エチジウムプロミド含有アガロースゲル上UV蛍光により
可視化する。ＭはプラスミドDNApUC19の制限酵素Hinf I
による加水分解によって得られた分子量の標準である。
図２は、抗−HCV抗体を含有する患者からのC17および
C22血清とインキュベーションしたのちの、ファージ混
合物のDNAの増幅の結果を示す。可視化はエチジウムブ
ロミド含有アガロースゲル上UV蛍光による。PC89は非組
換えファージであり、それとファージライブラリーを構
築して、ここで陰性対照として使用した。
C22血清とインキュベーションしたのちの、ファージ混
合物のDNAの増幅の結果を示す。可視化はエチジウムブ
ロミド含有アガロースゲル上UV蛍光による。PC89は非組
換えファージであり、それとファージライブラリーを構
築して、ここで陰性対照として使用した。
図３は、図２において使用したのと同一のファージ混
合物のDNAを、２名の志願者からの抗−HCV抗体を含まな
い、したがって、陰性対照と考えられる血清N57およびN
60とインキュベーション後に増幅した結果である。可視
化は、エチジウムブロミド含有アガロースゲル上UV蛍光
による。PC89は実施例１に上述したように陰性対照ファ
ージである。ＭはプラスミドDNApUC19の制限酵素Hinf I
による加水分解によって得られた分子量の標準である。
合物のDNAを、２名の志願者からの抗−HCV抗体を含まな
い、したがって、陰性対照と考えられる血清N57およびN
60とインキュベーション後に増幅した結果である。可視
化は、エチジウムブロミド含有アガロースゲル上UV蛍光
による。PC89は実施例１に上述したように陰性対照ファ
ージである。ＭはプラスミドDNApUC19の制限酵素Hinf I
による加水分解によって得られた分子量の標準である。
本発明の主題は、ある種の関心分野、この関係では受
容体分子としても指示される分子の存在を、少なくとも
ある種の分子、ここではリガンド分子として指示され、
ファージカプシド上に暴露された分子により特異的に認
識されるそれらの能力に基づいた定量および測定方法で
ある。
容体分子としても指示される分子の存在を、少なくとも
ある種の分子、ここではリガンド分子として指示され、
ファージカプシド上に暴露された分子により特異的に認
識されるそれらの能力に基づいた定量および測定方法で
ある。
この記載中、リガンド分子および受容体分子の概念は
いかに厳密に相互に依存し、特異的な作業概念に厳密に
結合するかが強調される必要がある。この結果としてカ
プシドの表面に暴露される分子は、サンプル中における
存在が考えられ、その存在または濃度が測定される分子
に特異的に結合し、したがって「受容体」と定義される
分子に特異的に結合するその能力に基づきもっぱら「リ
ガンド」と定義され、およびその逆である。
いかに厳密に相互に依存し、特異的な作業概念に厳密に
結合するかが強調される必要がある。この結果としてカ
プシドの表面に暴露される分子は、サンプル中における
存在が考えられ、その存在または濃度が測定される分子
に特異的に結合し、したがって「受容体」と定義される
分子に特異的に結合するその能力に基づきもっぱら「リ
ガンド」と定義され、およびその逆である。
本発明においては、たとえば生物学的液体、細胞もし
くは組織の表面のようなソースから得られる任意の分子
は、上に定義したような特異的「リガンド」との相互作
用によってその存在が同定できれば、「受容体」と考え
られる。たとえば確認された抗原（ウイルス抗原、腫瘍
抗原もしくは正常組織に存在する抗原）を明瞭に認識で
きる抗体、またはその正確な分子的性質はまだ分かって
いない抗原が、単独ではこの範疇ではないが、「リガン
ド」の範疇に属する。この場合、これらの抗原は「受容
体」と考えられる。これらの定義は、たとえば、検討さ
れる生物学的液体中または細胞および組織の表面上にお
けるこれらの抗原の存在および／または濃度が診断的価
値を有する指標である場合に関係する。しかしながら、
本発明の方法によれば、存在または濃度の測定が必要な
関心受容体分子が抗体を形成する場合には、抗原自体を
リガンドとして使用することが可能である。
くは組織の表面のようなソースから得られる任意の分子
は、上に定義したような特異的「リガンド」との相互作
用によってその存在が同定できれば、「受容体」と考え
られる。たとえば確認された抗原（ウイルス抗原、腫瘍
抗原もしくは正常組織に存在する抗原）を明瞭に認識で
きる抗体、またはその正確な分子的性質はまだ分かって
いない抗原が、単独ではこの範疇ではないが、「リガン
ド」の範疇に属する。この場合、これらの抗原は「受容
体」と考えられる。これらの定義は、たとえば、検討さ
れる生物学的液体中または細胞および組織の表面上にお
けるこれらの抗原の存在および／または濃度が診断的価
値を有する指標である場合に関係する。しかしながら、
本発明の方法によれば、存在または濃度の測定が必要な
関心受容体分子が抗体を形成する場合には、抗原自体を
リガンドとして使用することが可能である。
同様に、関心があれば、この場合それらと特異的に結
合できる分子、すなわち「リガンド」として作用するこ
とにより検出されることになる生物学的液体中に存在す
る可溶性受容体とともに、単一細胞または組織中の細胞
の膜上に存在する特異的受容体も「受容体」と考えるこ
とが可能である。関心分子がもはや、膜受容体を形成し
ない（この場合は「リガンド」として作用する）が、そ
れらの特異的リガンド（この場合は「受容体」と考えら
れる）と考えられる。
合できる分子、すなわち「リガンド」として作用するこ
とにより検出されることになる生物学的液体中に存在す
る可溶性受容体とともに、単一細胞または組織中の細胞
の膜上に存在する特異的受容体も「受容体」と考えるこ
とが可能である。関心分子がもはや、膜受容体を形成し
ない（この場合は「リガンド」として作用する）が、そ
れらの特異的リガンド（この場合は「受容体」と考えら
れる）と考えられる。
したがって、検討下にあるサンプル中における存在が
診断的および／または予知的価値（特異的病態の出現と
のその関連が確認されたのち）を有することまたはいず
れの目的であれ興味がもたれることが考えられる任意の
分子は「受容体」の範疇に包含できることを理解すべき
である。
診断的および／または予知的価値（特異的病態の出現と
のその関連が確認されたのち）を有することまたはいず
れの目的であれ興味がもたれることが考えられる任意の
分子は「受容体」の範疇に包含できることを理解すべき
である。
この方法には、とくに医学および獣医学のみでなく、
他の分野たとえば食品および環境の分野にも、多くの適
用が明らかである。
他の分野たとえば食品および環境の分野にも、多くの適
用が明らかである。
この方法は、「リガンド」およびサンプル中に存在す
る受容体分子の間の相互作用を検出するため、組換えま
たは非組換えいずれかの線状バクテリオファージの使用
が可能なことは、本発明者らにより、サンプル中に存在
する受容体分子が著しく低濃度であっても、ファージゲ
ノム中に存在し、物理的または遺伝子的に「リガンド」
に関連する特異的ヌクレオチド配列の増幅により、次の
ように検証された。
る受容体分子の間の相互作用を検出するため、組換えま
たは非組換えいずれかの線状バクテリオファージの使用
が可能なことは、本発明者らにより、サンプル中に存在
する受容体分子が著しく低濃度であっても、ファージゲ
ノム中に存在し、物理的または遺伝子的に「リガンド」
に関連する特異的ヌクレオチド配列の増幅により、次の
ように検証された。
簡略に述べれば、本発明の方法は、常に適用が可能
で、以下を同定することができる。すなわち、 Ａ）生物学的液体中または細胞もしくは組織の表面上に
おけるその存在が、ある病態に相関するか、または、た
とえば診断的目的からかなりの興味がもたれる場合の受
容体分子または「受容体」群を形成する均一なクラス、
および Ｂ）その構造がそれらをバクテリオファージのカプシド
上に暴露することを可能にし、受容体分子に特異的に結
合する能力を保持する、たとえばポリペプチド型の「リ
ガンド」または「リガンド」群のクラスである。
で、以下を同定することができる。すなわち、 Ａ）生物学的液体中または細胞もしくは組織の表面上に
おけるその存在が、ある病態に相関するか、または、た
とえば診断的目的からかなりの興味がもたれる場合の受
容体分子または「受容体」群を形成する均一なクラス、
および Ｂ）その構造がそれらをバクテリオファージのカプシド
上に暴露することを可能にし、受容体分子に特異的に結
合する能力を保持する、たとえばポリペプチド型の「リ
ガンド」または「リガンド」群のクラスである。
本発明の主題は、したがって、本質的に以下の操作に
基づく方法である。すなわち、 ａ）ファージの表面上に暴露された分子と相互作用する
能力を破壊することなく、関心分子を固定化し、 ｂ）上述のように固定化された分子を、内部にその配列
が少なくとも部分的に既知の一本鎖DNA分子を有し、生
物学的サンプル中に存在する少なくとも１個の関心分子
に特異的に結合できる少なくとも１個の分子がカプシド
の表面上に暴露された少なくとも１個の組換え線状バク
テリオファージと、特異的結合を生じさせ、 ｃ）この方法で得られた分子−バクテリオファージ複合
体を、反応混合物から分離し、 ｄ）分子とバクテリオファージの間の非特異的相互作用
によって発生した複合体を除去するために洗浄し、 ｅ）以下のｇ）に記載の操作を実施するための試薬を添
加し、 ｆ）このように選択されたバクテリオファージタンパク
質カプシドを形成するタンパク質を溶解させ、 ｇ）上述のようにして得られたDNAをポリメラーゼチェ
ーン反応（PCR）によって増幅し、 ｈ）上述のように増幅されたDNAをたとえば慣用の方法
により検出する。
基づく方法である。すなわち、 ａ）ファージの表面上に暴露された分子と相互作用する
能力を破壊することなく、関心分子を固定化し、 ｂ）上述のように固定化された分子を、内部にその配列
が少なくとも部分的に既知の一本鎖DNA分子を有し、生
物学的サンプル中に存在する少なくとも１個の関心分子
に特異的に結合できる少なくとも１個の分子がカプシド
の表面上に暴露された少なくとも１個の組換え線状バク
テリオファージと、特異的結合を生じさせ、 ｃ）この方法で得られた分子−バクテリオファージ複合
体を、反応混合物から分離し、 ｄ）分子とバクテリオファージの間の非特異的相互作用
によって発生した複合体を除去するために洗浄し、 ｅ）以下のｇ）に記載の操作を実施するための試薬を添
加し、 ｆ）このように選択されたバクテリオファージタンパク
質カプシドを形成するタンパク質を溶解させ、 ｇ）上述のようにして得られたDNAをポリメラーゼチェ
ーン反応（PCR）によって増幅し、 ｈ）上述のように増幅されたDNAをたとえば慣用の方法
により検出する。
増幅されたDNAを検出する方法は、たとえば、エチジ
ウムブロミドの存在下におけるアガロースゲル上電気泳
動、キャピラリー電気泳動、放射能で特異的に標識した
または発光プローブへのハイブリダイゼーションによる
ことができる。
ウムブロミドの存在下におけるアガロースゲル上電気泳
動、キャピラリー電気泳動、放射能で特異的に標識した
または発光プローブへのハイブリダイゼーションによる
ことができる。
とくにｇ）に指示した操作、すなわち、ファージDNA
の増幅は、少なくとも１種はファージDNAの既知配列と
相補性である１対のオリゴヌクレオチドを用い、PCRに
よって行われる。さらに、ファージカプシドタンパク質
の溶解のプロトコールは、そのDNAの変性が起こり、通
常93〜96℃の範囲内に落ちる温度を使用し、プライマー
とDNA鋳型の接触は同じ温度で行うと、すなわちPCRに
「熱開始」を行うと、結果として非特異的反応産物の事
実上の消失が達成されることを見出した。
の増幅は、少なくとも１種はファージDNAの既知配列と
相補性である１対のオリゴヌクレオチドを用い、PCRに
よって行われる。さらに、ファージカプシドタンパク質
の溶解のプロトコールは、そのDNAの変性が起こり、通
常93〜96℃の範囲内に落ちる温度を使用し、プライマー
とDNA鋳型の接触は同じ温度で行うと、すなわちPCRに
「熱開始」を行うと、結果として非特異的反応産物の事
実上の消失が達成されることを見出した。
この方法の重要な適用は関心分野が抗体の場合であ
る。
る。
さらに特異的な適用では、関心分子の固定化が固相に
行われ、この場合それは続いて受動吸着および／または
分子自体に特異的な抗体を用いることにより達成され
る。
行われ、この場合それは続いて受動吸着および／または
分子自体に特異的な抗体を用いることにより達成され
る。
いずれにしても、固定化はまた、細菌またはStaffilo
coccus Aureus、グループC Streptococciのプロテイン
Ｇ、および動物免疫グロブリンに結合できる任意の他の
細菌性タンパク質からなる群より選択される細菌性タン
パク質少なくとも１種を使用することにより達成でき
る。
coccus Aureus、グループC Streptococciのプロテイン
Ｇ、および動物免疫グロブリンに結合できる任意の他の
細菌性タンパク質からなる群より選択される細菌性タン
パク質少なくとも１種を使用することにより達成でき
る。
とくに興味があるこの方法のさらに他の適用は、使用
されるバクテリオファージがカプシドの表面上にウイル
ス抗原、自己抗原（生物学的液体のソースである動物に
存在できる抗原）、アレルゲン、細胞膜受容体、上記分
子の部分、または検討下の生物学的液体中のその存在を
模倣できるオリゴペプチド、ならびにそれらに由来する
特異的な細胞膜受容体もしくはペプチド、または試験さ
れる液体中に受容体が存在するアミノ酸型のリガンドを
表す場合である。
されるバクテリオファージがカプシドの表面上にウイル
ス抗原、自己抗原（生物学的液体のソースである動物に
存在できる抗原）、アレルゲン、細胞膜受容体、上記分
子の部分、または検討下の生物学的液体中のその存在を
模倣できるオリゴペプチド、ならびにそれらに由来する
特異的な細胞膜受容体もしくはペプチド、または試験さ
れる液体中に受容体が存在するアミノ酸型のリガンドを
表す場合である。
この方法の基本的な態様中には、まず第一に、検出の
ために用いられる手段は常に一般に組換え型のM13、f1
またはfdの線状バクテリオファージであり、それはカプ
シドの表面上に、好ましくはアミノ酸型の、試験すべき
「受容体」と特異的に相互作用できる「リガンド」とし
て働く分子１種または２種以上を暴露することを可能に
する。これは、独創性の第一の要素を形成し、もはやリ
ガンド分子を直接使用する必要はなく、適当に選択され
た天然の「リガンド」、それらの部分または模倣体を含
有するファージが使用される。
ために用いられる手段は常に一般に組換え型のM13、f1
またはfdの線状バクテリオファージであり、それはカプ
シドの表面上に、好ましくはアミノ酸型の、試験すべき
「受容体」と特異的に相互作用できる「リガンド」とし
て働く分子１種または２種以上を暴露することを可能に
する。これは、独創性の第一の要素を形成し、もはやリ
ガンド分子を直接使用する必要はなく、適当に選択され
た天然の「リガンド」、それらの部分または模倣体を含
有するファージが使用される。
本発明はそれ自体、過去に記載された他の検出方法、
たとえば抗体をプローブとして使用される既知の配列を
有するポリヌクレオチド分子と人工的に結合させる免疫
PCRとは、本発明ではファージの内部に含有された遺伝
情報を関心分子の存在の決定に使用するという事実によ
って正に識別される。
たとえば抗体をプローブとして使用される既知の配列を
有するポリヌクレオチド分子と人工的に結合させる免疫
PCRとは、本発明ではファージの内部に含有された遺伝
情報を関心分子の存在の決定に使用するという事実によ
って正に識別される。
さらに、異なるファージを同時に使用する能力は、関
心分子または多数の関心分子さえ同時に検出することを
可能にする。
心分子または多数の関心分子さえ同時に検出することを
可能にする。
しかしながら、主要な特徴はとくに、ファージの表面
上に暴露された「リガンド」とPCRによる検出に用いら
れるファージDNAとの会合である。これは、「リガン
ド」をコードする遺伝情報のみでなく、また、さらに一
般的にファージゲノム中の任意のヌクレオチド配列を構
成することが可能である。
上に暴露された「リガンド」とPCRによる検出に用いら
れるファージDNAとの会合である。これは、「リガン
ド」をコードする遺伝情報のみでなく、また、さらに一
般的にファージゲノム中の任意のヌクレオチド配列を構
成することが可能である。
この結果として、本発明の方法はまた、検出に使用さ
れる「リガンド」と会合するヌクレオチド配列を、特異
性を増大させ増幅反応時間を短縮するように選択するこ
とを可能にした。事実上、PCR反応を達成するには、オ
リゴヌクレオチドプライマーの配列、各インキュベーシ
ョンが行われる時間および温度ならびに各反応における
サイクル数が、きわめて迅速なそして高度に特異的な増
幅を得るようにこの時点で予め選択できる。
れる「リガンド」と会合するヌクレオチド配列を、特異
性を増大させ増幅反応時間を短縮するように選択するこ
とを可能にした。事実上、PCR反応を達成するには、オ
リゴヌクレオチドプライマーの配列、各インキュベーシ
ョンが行われる時間および温度ならびに各反応における
サイクル数が、きわめて迅速なそして高度に特異的な増
幅を得るようにこの時点で予め選択できる。
事実上、その性質により、ファージの内部に存在し検
出に使用される遺伝情報は、反応管中に１個のDNA分子
の存在でも強調することを可能にする現時点のPCR法を
用いるととくに増幅させる傾向がある。ポリメラーゼチ
ェーン反応を用いて得られる感度は現在使用されている
他の検出方法を用いては容易に達成することはできな
い。
出に使用される遺伝情報は、反応管中に１個のDNA分子
の存在でも強調することを可能にする現時点のPCR法を
用いるととくに増幅させる傾向がある。ポリメラーゼチ
ェーン反応を用いて得られる感度は現在使用されている
他の検出方法を用いては容易に達成することはできな
い。
これから得られる他の利点は、増幅に使用されるオリ
ゴヌクレオチドプローブが、ファージ中に存在する特定
のDNAを、それ含まない他のファージからのDNAの存在下
にも特異的な増幅を与えるように設計することができ
る。たとえば、特異的な挿入体を含有するファージのDN
Aのみ（たとえば、カプシド上に暴露された場合「リガ
ンド」として作用する分子をコードするDNA）を、この
挿入体を含まないファージのDNAの存在下でも、増幅す
るようにプローブを設計することが可能である。これの
最も直接的な結果は、検討下にある受容体分子（単数ま
たは複数）を異なるファージの混合物と反応させて、他
のファージの存在下でも、各単一の種類のファージとの
結合を同定することが可能である。
ゴヌクレオチドプローブが、ファージ中に存在する特定
のDNAを、それ含まない他のファージからのDNAの存在下
にも特異的な増幅を与えるように設計することができ
る。たとえば、特異的な挿入体を含有するファージのDN
Aのみ（たとえば、カプシド上に暴露された場合「リガ
ンド」として作用する分子をコードするDNA）を、この
挿入体を含まないファージのDNAの存在下でも、増幅す
るようにプローブを設計することが可能である。これの
最も直接的な結果は、検討下にある受容体分子（単数ま
たは複数）を異なるファージの混合物と反応させて、他
のファージの存在下でも、各単一の種類のファージとの
結合を同定することが可能である。
さらにDNAがタンパク性のカプシドの内部に含まれる
という事実は、PCR法に典型的な検出特異性の限界の一
つの克服を可能にする。この限界は、２個のプライマー
の配列により、DNA鋳型を増幅プローブと比較的低温で
接触させる必要である。温度を最初の増幅サイクルを開
始させるために上昇させるとDNAの一部はプローブに複
合体化したままで、これはDNA鋳型上でプローブ自体の
非特異的延長を生じる。様々な方法がこの問題を除去す
るために提案されている（4,5）。本発明の方法は、上
述のように、天然にカプシドの内部に封入されたDNAを
使用し、したがってそれはカプシドの溶解のときまで特
異的プローブとの接触から保護されるという事実を使用
することで問題を見事に解決することができる。この点
に関して、きわめて高い特異性が、単にその方法を、DN
Aと特異的プローブの間の接触を高温でのみ可能にする
熱溶解プロトコールを用いて遂行することにより得るこ
とができる。
という事実は、PCR法に典型的な検出特異性の限界の一
つの克服を可能にする。この限界は、２個のプライマー
の配列により、DNA鋳型を増幅プローブと比較的低温で
接触させる必要である。温度を最初の増幅サイクルを開
始させるために上昇させるとDNAの一部はプローブに複
合体化したままで、これはDNA鋳型上でプローブ自体の
非特異的延長を生じる。様々な方法がこの問題を除去す
るために提案されている（4,5）。本発明の方法は、上
述のように、天然にカプシドの内部に封入されたDNAを
使用し、したがってそれはカプシドの溶解のときまで特
異的プローブとの接触から保護されるという事実を使用
することで問題を見事に解決することができる。この点
に関して、きわめて高い特異性が、単にその方法を、DN
Aと特異的プローブの間の接触を高温でのみ可能にする
熱溶解プロトコールを用いて遂行することにより得るこ
とができる。
この実施態様によりむしろ単純にまたきわめて実用的
に達成される様式において、PCRの「熱開始（Hot Star
t）」という技術用語で知られた方法を達成することが
できる。
に達成される様式において、PCRの「熱開始（Hot Star
t）」という技術用語で知られた方法を達成することが
できる。
以上、本発明を一般的に記述してきた。以下の実施例
を参照し、特異的実施態様のさらに詳細な説明を、本発
明の対象、特徴、利点および操作のより明瞭な理解のた
めに掲げる。これらの実施例は単に例示のためのもので
あり、請求の範囲に定義された本発明の範囲をいかなる
意味でも限定するものではない。
を参照し、特異的実施態様のさらに詳細な説明を、本発
明の対象、特徴、利点および操作のより明瞭な理解のた
めに掲げる。これらの実施例は単に例示のためのもので
あり、請求の範囲に定義された本発明の範囲をいかなる
意味でも限定するものではない。
実施例１ ヒト肝炎ウイルス（HCV）の抗原に対する特異的な抗体
の患者血清中における検出方法 本発明に従い、以下の方法を使用した。
の患者血清中における検出方法 本発明に従い、以下の方法を使用した。
Fc部分に特異的なヒトのヤギ−抗−IgG免疫グロブリ
ンを、最近PCR法に用いられている96ウエルのポリカル
ボネートプレート［Coster製,Thermowell−II（登録商
法）6509型］のウエルに吸着させた。インキュベーショ
ン後、プレートを食塩リン酸緩衝液で洗浄し、残った吸
着部位を粉末スキムミルクを再懸濁した緩衝液中でイン
キュベートしてブロックした（文献に記載されたよう
に）。以下を次の方法で調製してプレート上のウエルに
分配した。１）各種レベルに希釈した試験すべきヒト血
清の量；この実施例では、HVCに感染し、抗−HCV抗体を
含有する患者からのヒト血清C17およびC22型を使用し
た。N57およびN60は見掛け上健康な抗−HCV抗体は見出
せない個体から得られた血清型である。これらの血清の
量を非特異的担体として作用する非組換え型のファージ
と混合する。PCR反応で増幅できるが、カプシド上には
特異的リガンドを示さない組換えファージ2A、本実施例
ではヒト抗−HCV抗体を結合できるペプチド、また2BHCV
−特異的ファージP787を添加した。
ンを、最近PCR法に用いられている96ウエルのポリカル
ボネートプレート［Coster製,Thermowell−II（登録商
法）6509型］のウエルに吸着させた。インキュベーショ
ン後、プレートを食塩リン酸緩衝液で洗浄し、残った吸
着部位を粉末スキムミルクを再懸濁した緩衝液中でイン
キュベートしてブロックした（文献に記載されたよう
に）。以下を次の方法で調製してプレート上のウエルに
分配した。１）各種レベルに希釈した試験すべきヒト血
清の量；この実施例では、HVCに感染し、抗−HCV抗体を
含有する患者からのヒト血清C17およびC22型を使用し
た。N57およびN60は見掛け上健康な抗−HCV抗体は見出
せない個体から得られた血清型である。これらの血清の
量を非特異的担体として作用する非組換え型のファージ
と混合する。PCR反応で増幅できるが、カプシド上には
特異的リガンドを示さない組換えファージ2A、本実施例
ではヒト抗−HCV抗体を結合できるペプチド、また2BHCV
−特異的ファージP787を添加した。
37℃で90分間インキュベートしたのちプレートを空に
してリン酸緩衝液で洗浄し、特異的に結合しなかったす
べての組換えファージを除去した。各ウエルについで、
PCRに適当な緩衝液中、増幅に特異的なDNAプローブ、ポ
リメラーゼTaq、ジオキシヌクレオチド三リン酸塩を含
む混合物を加えた。
してリン酸緩衝液で洗浄し、特異的に結合しなかったす
べての組換えファージを除去した。各ウエルについで、
PCRに適当な緩衝液中、増幅に特異的なDNAプローブ、ポ
リメラーゼTaq、ジオキシヌクレオチド三リン酸塩を含
む混合物を加えた。
プレートをPCRのために熱インキュベーターに移し、
５分間95℃に加熱して開始する反応サイクルでプロセス
を継続した。この経過は、ファージタンパク質の溶解が
起こり、ついで増幅すべきDNAが特異的プローブと接触
するのはこの温度でのみであることから、とくに重要で
ある。PCR反応はこの高温で開始し（熱開始）、94℃で1
0秒間および72℃で10秒間の25サイクルを続ける。反応
は72℃で２分間インキュベートして終結する。
５分間95℃に加熱して開始する反応サイクルでプロセス
を継続した。この経過は、ファージタンパク質の溶解が
起こり、ついで増幅すべきDNAが特異的プローブと接触
するのはこの温度でのみであることから、とくに重要で
ある。PCR反応はこの高温で開始し（熱開始）、94℃で1
0秒間および72℃で10秒間の25サイクルを続ける。反応
は72℃で２分間インキュベートして終結する。
この方法で増幅されたファージP787のDNAはエチジウ
ムブロミドを含むアガロースゲル上電気泳動により特異
的実施例１に示すように強調する。
ムブロミドを含むアガロースゲル上電気泳動により特異
的実施例１に示すように強調する。
実施例２ 患者血清中における抗−HCV抗体の存在を診断するファ
ージの組成物の使用 それぞれヒトＣ型肝炎ウイルスの異なるタンパク性領
域を模倣する特異的に選択された多数のファージの組成
物を、血清中の抗−HCV抗体存在を診断するために使用
した。それらがもつ配列によってファージは識別できる
が、より単純に挿入体の長さにより、ファージDNA挿入
体のディメンションに従いアガロースゲル上で異なる長
さのDNAフラグメントの増幅を観察することが可能であ
る。
ージの組成物の使用 それぞれヒトＣ型肝炎ウイルスの異なるタンパク性領
域を模倣する特異的に選択された多数のファージの組成
物を、血清中の抗−HCV抗体存在を診断するために使用
した。それらがもつ配列によってファージは識別できる
が、より単純に挿入体の長さにより、ファージDNA挿入
体のディメンションに従いアガロースゲル上で異なる長
さのDNAフラグメントの増幅を観察することが可能であ
る。
本実施例では、ファージの混合物を使用して、いかに
実施例１に記載のようにアガロースゲル上の応答を得る
ことが可能であるかを示す。
実施例１に記載のようにアガロースゲル上の応答を得る
ことが可能であるかを示す。
血清中で異なる抗原の抗体を同定できること、および
増幅応答が特異的であることは驚くべきである。図２お
よび図３に示す結果は、しかしながら、実施例１に上述
した電気泳動により分析することができる応答から構成
される。
増幅応答が特異的であることは驚くべきである。図２お
よび図３に示す結果は、しかしながら、実施例１に上述
した電気泳動により分析することができる応答から構成
される。
実施例３ ヒト抗−IL−６抗体のインビトロでの検出方法 IL−６に対する受容体がプレート上に固定化され、IL
−６を発現するファージが細胞外培養培地中のその存在
を検出するために使用される方法を記載する。
−６を発現するファージが細胞外培養培地中のその存在
を検出するために使用される方法を記載する。
hIL−６をコードするヒトcDNAを、M13から文献記載の
ようにして得られたファージミドの遺伝子IIIのアミノ
末端に融合させた。組換えhIL−6/M13−p IIIファージ
はヒトインターロイキン６受容体の存在の検出に使用で
きる。本技術分野では、文献記載のようにhIL−6/Rおよ
び抗−hIL−６抗体の両者をインビトロで結合できるhIL
−６を発現するファージをいかに選択するかは既に記載
されている。本発明者らは、本発明に記載の方法を使用
すれば、認識がさらに効果的に可能であることを証明し
た。
ようにして得られたファージミドの遺伝子IIIのアミノ
末端に融合させた。組換えhIL−6/M13−p IIIファージ
はヒトインターロイキン６受容体の存在の検出に使用で
きる。本技術分野では、文献記載のようにhIL−6/Rおよ
び抗−hIL−６抗体の両者をインビトロで結合できるhIL
−６を発現するファージをいかに選択するかは既に記載
されている。本発明者らは、本発明に記載の方法を使用
すれば、認識がさらに効果的に可能であることを証明し
た。
固体支持体、たとえば、プラスチックビーズに、１μ
ｇのモノクローナル抗−hIL−６抗体を10mM NaHCO3、pH
9.2中４℃で一夜インキュベートして固定した。1mlのTB
S/6％BSA中、４℃で４時間インキュベートしてブロック
したのちビーズをhIL−６と４℃で一夜インキュベート
した。ビーズを2mlのTBSTによる洗浄に２回付し、つい
で1mlのTBST/0.1％BSA中で１時間インキュベートした。
ついでファージを500μｌの100mMグリシン塩酸塩、pH2.
2で溶出し、溶出液を3MのTris−HCl,pH8.9で中和した。
抗体に結合したファージは本発明に記載したようにPCR
により検出できる。
ｇのモノクローナル抗−hIL−６抗体を10mM NaHCO3、pH
9.2中４℃で一夜インキュベートして固定した。1mlのTB
S/6％BSA中、４℃で４時間インキュベートしてブロック
したのちビーズをhIL−６と４℃で一夜インキュベート
した。ビーズを2mlのTBSTによる洗浄に２回付し、つい
で1mlのTBST/0.1％BSA中で１時間インキュベートした。
ついでファージを500μｌの100mMグリシン塩酸塩、pH2.
2で溶出し、溶出液を3MのTris−HCl,pH8.9で中和した。
抗体に結合したファージは本発明に記載したようにPCR
により検出できる。
実施例４ ヒトIL−６受容体の可溶化型の検出方法 遺伝子操作した卵胞癌細胞に発現させたヒトIL−６受
容体を、本発明に記載の方法に従い検出し、可能であれ
ば、IL−６またはIL−６のスーパーアンタゴニストを発
現できるファージを用いて定量する方法を記載する。
容体を、本発明に記載の方法に従い検出し、可能であれ
ば、IL−６またはIL−６のスーパーアンタゴニストを発
現できるファージを用いて定量する方法を記載する。
CHO細胞系（CsRh14）はインターロイキン６受容体（r
ef）の可溶化型を分泌できる。100μｌのトシル活性化
したDynabeads M450（unipath）を用いて濃縮型を調製
し、磁性粒子コンセントレーターを用いて50mMホウ酸ナ
トリウム、pH9.5で洗浄し、ついで15μｇのモノクロー
ナル抗−hIL−6Rα抗体を含有する同一緩衝液400μｌ中
25℃で24時間インキュベートした。TBS/0.1％BSA中４℃
で12時間飽和継代後、ビーズを、CsRh14系から得られた
血清を含まない、shIL−6Rα250ngを含有する条件培地4
00μｌと25℃で４時間インキュベートした。shIL−6Rα
が結合したビーズを数回洗浄したのちに、hIL−６を発
現できるファージとともに（1:4の比）、４℃で16時間
インキュベートした。反応容量をTBS/0.1％BSAの適当量
を加えることにより、1mlとした。ビーズを1mlのTBSTで
３回洗浄したのち、ファージを400mlの100mMのクエン酸
塩緩衝液、pH3.2で溶出した。3M Tris CHl、pH8.9で中
和したのち、結合したファージを本発明の本質に従いPC
Rで検出した。
ef）の可溶化型を分泌できる。100μｌのトシル活性化
したDynabeads M450（unipath）を用いて濃縮型を調製
し、磁性粒子コンセントレーターを用いて50mMホウ酸ナ
トリウム、pH9.5で洗浄し、ついで15μｇのモノクロー
ナル抗−hIL−6Rα抗体を含有する同一緩衝液400μｌ中
25℃で24時間インキュベートした。TBS/0.1％BSA中４℃
で12時間飽和継代後、ビーズを、CsRh14系から得られた
血清を含まない、shIL−6Rα250ngを含有する条件培地4
00μｌと25℃で４時間インキュベートした。shIL−6Rα
が結合したビーズを数回洗浄したのちに、hIL−６を発
現できるファージとともに（1:4の比）、４℃で16時間
インキュベートした。反応容量をTBS/0.1％BSAの適当量
を加えることにより、1mlとした。ビーズを1mlのTBSTで
３回洗浄したのち、ファージを400mlの100mMのクエン酸
塩緩衝液、pH3.2で溶出した。3M Tris CHl、pH8.9で中
和したのち、結合したファージを本発明の本質に従いPC
Rで検出した。
参考文献 1.V.Ruzicka,W.Marz,A.Russ and W.Gross:1993 Science
260,698−699. 2.T.Sano,C.L.Smith,C.R.Cantor:1992 Science 258,120
−122. 3.H.Zhou,R.J.Fischer and T.S.Papas:1993 Nucl.Ac.Re
s.21,6038−3039. 4.D.E.Birch,L.Kolmodin,J.Wong,G.A.Zangenberg and
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−122. 3.H.Zhou,R.J.Fischer and T.S.Papas:1993 Nucl.Ac.Re
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d applications.Rower Press 1994.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特表 平８−506493（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/68 C12Q 1/70 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (14)
- 【請求項１】生物学的サンプル中の興味ある分子の存在
を検出するための方法であって、 ａ）前記生物学的サンプルを処理して、ファージの表面
に暴露された分子と相互作用する能力を破壊することな
く興味ある分子を固定化し、 ｂ）上述のように固定化された興味ある分子を、その配
列が少なくとも部分的に既知の一本鎖DNA分子を内部に
有し、生物学的サンプル中に存在する少なくとも１個の
興味ある分子に特異的に結合できる少なくとも１個の分
子をカプシド表面上に露出する少なくとも１個の組換え
線状バクテリオファージと、特異的に結合させ、 ｃ）この方法で得られた分子−バクテリオファージ複合
体を、反応混合物から分離し、 ｄ）分子とバクテリオファージ間の非特異的相互作用に
よって発生した複合体を除去すために前記分子−バクテ
リオファージ複合体を洗浄し、 ｅ）以下のｇ）に記載の操作を実施するための試薬を上
述のようにして得られた分子−バクテリオファージ複合
体に添加し、 ｆ）このように選択されたバクテリオファージタンパク
質カプシドを形成するタンパク質を溶解させ、 ｇ）上述のようにして得られたDNAをポリメラーゼチェ
ーン反応（PCR）によって増幅し、 ｈ）上述のように増幅されたDNAを検出する操作からな
る上記方法。 - 【請求項２】ｆ）で示された操作はDNAの変性が起こる
温度で実施し、それによって、ｇ）で示された操作工程
のPCRのための「熱開始」を達成することからなる、生
物学的サンプル中の興味ある分子を検出するための請求
項１記載の方法。 - 【請求項３】興味ある分子は抗体である、生物学的サン
プル中の興味ある分子を検出するための請求項１または
２記載の方法。 - 【請求項４】興味ある分子は固相に固定化される、生物
学的サンプル中の興味ある分子を検出するための請求項
１〜３のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項５】興味ある分子の固相上への固定化は受動吸
着によって行われる、生物学的サンプル中の興味ある分
子を検出するための請求項４記載の方法。 - 【請求項６】興味ある分子の固相上への固定化はその分
子自体に特異的な抗体の使用により行われる、生物学的
サンプル中の興味ある分子を検出するための請求項４記
載の方法。 - 【請求項７】分子の固相上への固定化は、細菌またはス
タフィロコッカス・アウレウス（Staffilococcus Aureu
s）のプロテインＡ、グループＣストレプトコッカス（S
treptococci）のプロテインＧ、および動物免疫グロブ
リンに結合できる任意の他の細菌性タンパク質からなる
群より選択される少なくとも１個の細菌性タンパク質の
使用により行われる、生物学的サンプル中の興味ある分
子を検出するための請求項３記載の方法。 - 【請求項８】バクテリオファージはカプシド表面上にウ
イルス抗原、その部分または検討下にある生物学的液体
中のそれらの存在の硬化を模倣できるオリゴペプチドを
示す、生物学的サンプル中の興味ある分子を検出するた
めの請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項９】バクテリオファージはカプシド表面上に自
己抗原、その部分または検討下にある生物学的液体中の
それらの存在の効果を模倣できるオリゴペプチドを示
す、生物学的サンプル中の興味ある分子を検出するため
の請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１０】バクテリオファージはカプシド表面上に
アレルゲン、その部分または検討下にある生物学的液体
中のそれらの存在の効果を模倣できるオリゴペプチドを
示す、生物学的サンプル中の興味ある分子を検出するた
めの請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１１】バクテリオファージはカプシド表面上に
細胞膜受容体、それの受容体の部分またはそれらの生物
活性を模倣できるオリゴペプチドを示す、生物学的サン
プル中の興味ある分子を検出するための請求項１〜７の
いずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１２】バクテリオファージはカプシド表面上に
特異的細胞膜受容体、またはそれらから誘導されるペプ
チドを示す、生物学的サンプル中の興味ある分子を検出
するための請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１３】バクテリオファージはカプシド表面上
に、試験される液体中にその受容体が存在すると思われ
るペプチドリガンドを示す、生物学的サンプル中の興味
ある分子を検出するための請求項１〜７のいずれか一項
に記載の方法。 - 【請求項１４】バクテリオファージはカプシド表面上に 細胞膜受容体、それらの受容体の部分またはそれらの生
物活性を模倣できるオリゴペプチド； 特異的細胞膜受容体、またはそれらから誘導されるペプ
チド；および／または 試験される液体中にその受容体が存在すると思われるペ
プチドリガンド をともに示す、生物学的サンプル中の興味ある分子を検
出するための請求項１〜７のいずれか一項に記載の方
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