CN106591315B - 金黄色葡萄球菌肠毒素c2的核酸适配体c202及其筛选方法和应用 - Google Patents

金黄色葡萄球菌肠毒素c2的核酸适配体c202及其筛选方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN106591315B
CN106591315B CN201611168443.7A CN201611168443A CN106591315B CN 106591315 B CN106591315 B CN 106591315B CN 201611168443 A CN201611168443 A CN 201611168443A CN 106591315 B CN106591315 B CN 106591315B
Authority
CN
China
Prior art keywords
staphylococcus aureus
aptamer
aureus enterotoxin
enterotoxin
magnetic bead
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201611168443.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106591315A (zh
Inventor
王开宇
兰小鹏
廖剑
洪笑迁
闫慧慧
杨湘越
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Command of PLA
Original Assignee
Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Command of PLA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Command of PLA filed Critical Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Command of PLA
Priority to CN201611168443.7A priority Critical patent/CN106591315B/zh
Publication of CN106591315A publication Critical patent/CN106591315A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106591315B publication Critical patent/CN106591315B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1048—SELEX
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G01N33/56938—Staphylococcus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/531—Stem-loop; Hairpin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/10—Applications; Uses in screening processes
    • C12N2320/13—Applications; Uses in screening processes in a process of directed evolution, e.g. SELEX, acquiring a new function
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明涉及一种金黄色葡萄球菌肠毒素C2的核酸适配体C202及其筛选方法和应用，核酸适配体C202的序列为：AGGGCCGAGCTCACTTGTCACGGGCACCCTAACTGGGAGGAGGCAGGATAACACCGCCGGCACAATTGTGC；它的筛选方法为，基于核酸适配体的体外SELEX筛选技术，利用羧基磁珠作为固相介质，以金黄色葡萄球菌肠毒素C2为靶标，通过金黄色葡萄球菌肠毒素C2磁珠从ssDNA文库中筛选得到与金黄色葡萄球菌肠毒素C2特异性结合的核酸适配体，本发明的核酸适配体C202能高亲和力、高特异性地与金黄色葡萄球菌肠毒素C2结合。

Description

金黄色葡萄球菌肠毒素C2的核酸适配体C202及其筛选方法和 应用
技术领域
本发明涉及一种金黄色葡萄球菌肠毒素C2的核酸适配体C202及其筛选方法和应用。
背景技术
金黄色葡萄球菌肠毒素是由金黄色葡萄球菌分泌的具有超抗原活性的外毒素。金黄色葡萄球菌肠毒素可不经抗原提呈细胞加工，直接与MHCⅡ类分子非限制性的结合，形成的复合物与T淋巴细胞抗原受体的β链V区结合，大量激活T淋巴细胞，使其活化、增殖，并释放大量的炎性细胞因子引起强烈的免疫应答，最终导致炎症失控和多器官的损害，引起毒素休克等疾病。此外，由于金黄色葡萄球菌肠毒素较能抗消化，耐热以及只需很小剂量就可引发T细胞应答，金黄色葡萄球菌肠毒素也被作为肿瘤治疗的超抗原药物。
金黄色葡萄球菌肠毒素有多个血清型，分别是A型、B型、C1型、C2型、C3型、D型、E型、G型、H型、I型、M型、N型、O型和毒性休克综合症1型毒素、毒性休克综合症2型毒素等，其中金黄色葡萄球菌肠毒素C2不仅与金黄色葡萄球菌相关感染有关，同时也是金黄色葡萄球菌肠毒素中应用最多的超抗原药物。
检测金黄色葡萄球菌肠毒素C2主要采用免疫学方法，包括沉淀反应、凝集反应、ELISA、固相RIA、生物传感器等，这些方法使用抗体作为金黄色葡萄球菌肠毒素C2检测的识别元件，而抗体的制备存在周期长，步骤繁琐，成本高等不足之处。近年来，以检测金黄色葡萄球菌肠毒素C2基因为目标的分子生物学方法发展较快，但PCR等分子生物学方法仍存在假阳性、假阴性等技术难题。因此，研制具有更高灵敏度、经济、简便的金黄色葡萄球菌肠毒素C2检测新技术，对于食品卫生监督、临床金黄色葡萄球菌感染的诊疗等都有重要意义。
治疗金黄色葡萄球菌肠毒素C2引起的毒素休克，临床常采用抗炎、补液等对症支持疗法。最新研究发现，抑制金黄色葡萄球菌肠毒素C2的超抗原活性，在初始阶段阻断炎症级联反应的发生，是治疗金黄色葡萄球菌肠毒素C2相关疾病的有效策略。基于此策略，研制各种多肽药物、抗体药物、疫苗等，已成为的金黄色葡萄球菌肠毒素C2生物技术新药研究的热点。
金黄色葡萄球菌肠毒素C2超抗原药物的获得，常采用基因克隆的方法，将金黄色葡萄球菌肠毒素C2基因片段克隆至原核表达载体中，在大肠杆菌中表达并纯化。但这种方法中纯化步骤常采用离子交换方法或带标签的亲和纯化方法，前者吸附选择特异性差，后者试剂成本较高。
适配体又被称为“合成抗体”、“化学抗体”，其化学本质是一条单链寡核酸分子(ssDNA或RNA)折叠成特定三维结构与靶物质高亲和力和高特异性结合。适配体的获得通过指数富集配体的系统进化技术(Systematic evolution of ligands byexponentialenrichment,SELEX)的体外筛选过程。核酸适配体具有高亲和力、高特异性、可体外合成、可通过修饰改变其功能及药代动力学特性、无免疫原性、经济等特点。基于上述优势开发的核酸适配体药物可特异性阻断靶标功能；将核酸适配体作为识别元件，还可开发简便、精准的检测新技术以及高效、经济的亲和纯化系统。因此，筛选出高特异性、高亲和力结合金黄色葡萄球菌肠毒素C2的核酸适配体具有重要的科研、临床和市场价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有高特异性和高亲和力的金黄色葡萄球菌肠毒素C2的核酸适配体C202及其筛选方法和应用。
本发明的目的通过如下技术方案实现：一种金黄色葡萄球菌肠毒素C2的核酸适配体C202，它的序列如下：
AGGGCCGAGCTCACTTGTCACGGGCACCCTAACTGGGAGG 40
AGGCAGGATAACACCGCCGGCACAATTGTGC 71
所述的金黄色葡萄球菌肠毒素C2的核酸适配体C202的筛选方法，基于核酸适配体的体外SELEX筛选技术，利用羧基磁珠作为固相介质，以金黄色葡萄球菌肠毒素C2为靶标，通过金黄色葡萄球菌肠毒素C2磁珠从ssDNA文库中筛选得到与金黄色葡萄球菌肠毒素C2特异性结合的核酸适配体。
所述的金黄色葡萄球菌肠毒素C2的核酸适配体C202的应用，在分离、纯化金黄色葡萄球菌肠毒素C2中的应用。
所述的金黄色葡萄球菌肠毒素C2的核酸适配体C202的应用，在分析检测金黄色葡萄球菌肠毒素C2中的非疾病诊断和治疗方法应用。
所述的金黄色葡萄球菌肠毒素C2的核酸适配体C202的应用，在金黄色葡萄球菌肠毒素C2为效应分子的靶向治疗中的应用。
所述的金黄色葡萄球菌肠毒素C2的核酸适配体C202的应用，在治疗金黄色葡萄球菌感染中以及在治疗金黄色葡萄球菌肠毒素C2引起相关综合症中的应用。
较之现有技术而言，本发明的优点在于：
1.该核酸适配体C202无毒性，分子量小，渗透性好，易于合成与标记。
2.该核酸适配体C202的合成成本较抗体制备的成本低，且周期短，重现性好。
3.该核酸适配体C202能高亲和力、高特异性地与金黄色葡萄球菌肠毒素C2结合，解离常数为265.2±39.2pM，且它对其他同源蛋白不具有识别功能。
4.该核酸适配体C202在金黄色葡萄球菌肠毒素C2的分离、纯化，金黄色葡萄球菌肠毒素C2相关的食品安全检测，金黄色葡萄球菌肠毒素C2相关疾病的诊断和治疗，金黄色葡萄球菌感染的诊断和治疗，金黄色葡萄球菌肠毒素C2介导的靶向治疗等领域方面具有广阔的应用前景和重要的科学、社会、经济价值。
附图说明
图1为核酸适配体C202二级结构的生物学信息学模拟图。
图2为荧光结合率实验分析核酸适配体C202的特异性图。在图2中，横坐标为分析的蛋白，纵坐标为荧光结合率。
图3为荧光结合率实验分析核酸适配体C202结合金黄色葡萄球菌肠毒素C2的解离常数绘制曲线。解离常数(Kd)为265.2±39.2pM。在图3中，横坐标为DNA浓度(pM)，纵坐标为荧光结合率。
图4为核酸适配体C202亲和纯化金黄色葡萄球菌肠毒素C2的SDS-PAGE凝胶电泳图。在图4中，“M”为分子量标准；“A”为大肠杆菌超声后的上清液；“B”为亲和介质上洗脱的溶液。
具体实施方式
下面结合说明书附图和实施例对本发明内容进行详细说明：
一种金黄色葡萄球菌肠毒素C2的核酸适配体C202，它的序列如下：
AGGGCCGAGCTCACTTGTCACGGGCACCCTAACTGGGAGG 40
AGGCAGGATAACACCGCCGGCACAATTGTGC 71
所述的金黄色葡萄球菌肠毒素C2的核酸适配体C202，在25℃，100mM Na+，1mM Mg2+的条件下，其空间结构如下：
所述的金黄色葡萄球菌肠毒素C2的核酸适配体C202，对所述核酸适配体C202的5’端或3’端进行FITC、氨基、生物素、地高辛化学修饰。
所述的金黄色葡萄球菌肠毒素C2的核酸适配体C202，对所述核酸适配体C202做截短或延长或部分碱基替换的结构改造所得到的产物进行FITC、氨基、生物素、地高辛化学修饰。
所述的金黄色葡萄球菌肠毒素C2的核酸适配体C202的筛选方法，基于核酸适配体的体外SELEX筛选技术，利用羧基磁珠作为固相介质，以金黄色葡萄球菌肠毒素C2为靶标，通过金黄色葡萄球菌肠毒素C2磁珠从ssDNA文库中筛选得到与金黄色葡萄球菌肠毒素C2特异性结合的核酸适配体。
所述的金黄色葡萄球菌肠毒素C2的核酸适配体C202的筛选方法，它包括以下步骤：
(1)筛选文库的准备：准备以下序列所示的随机ssDNA文库：
5’-AGGGCCGAGCTCACTTGT-N35-CCGCCGGCACAATTGTGC-3’；
(2)将金黄色葡萄球菌肠毒素C2与羧基磁珠偶联制备金黄色葡萄球菌肠毒素C2磁珠；
(3)将ssDNA文库进行热激活处理；
(4)将经步骤(3)后的ssDNA文库与步骤(2)所得的金黄色葡萄球菌肠毒素C2磁珠进行孵育；
(5)磁性分离经步骤(4)后的金黄色葡萄球菌肠毒素C2磁珠，洗去金黄色葡萄球菌肠毒素C2磁珠表面未结合、弱结合及非特异性结合的ssDNA；加热金黄色葡萄球菌肠毒素C2磁珠，收集与金黄色葡萄球菌肠毒素C2磁珠特异性结合的ssDNA，即ssDNA富集文库；
(6)PCR扩增：将步骤(5)所得的ssDNA富集文库进行PCR扩增，其中PCR扩增所用的引物为：
引物P1：5’-FAM-AGGGCCGAGCTCACTTGT-3’
引物P2：5’-Biotin-GCACAATTGTGCCGGCGG-3’；
(7)PCR产物的纯化：利用小片段纯化试剂盒对PCR产物进行纯化；将纯化后的dsDNA与链霉亲和素磁珠进行孵育，结合dsDNA的链霉亲和素磁珠经洗涤、dsDNA解链后，用磁力架分离，收集上清；上清经乙醇沉淀后获得用于下一轮筛选的次级ssDNA文库；
(8)循环筛选：将步骤(7)所得的FAM标记的次级ssDNA文库，作为下一轮筛选的次级文库，并重复步骤(3)～(7)的筛选过程。
实施例一：核酸适配体C202的筛选
所述的金黄色葡萄球菌肠毒素C2的核酸适配体C202的筛选方法，它包括以下步骤：
(1)筛选文库的准备：设计两端固定区域为18个核苷酸、中间随机区域为35个核苷酸的随机ssDNA文库(5’-AGGGCCGAGCTCACTTGT-N35-CCGCCGGCACAATTGTGC-3’)，并委托生工生物工程股份有限公司合成。
(2)金黄色葡萄球菌肠毒素C2与羧基磁珠偶联：所述金黄色葡萄球菌肠毒素C2蛋白购自美国Toxin Technology公司，所述羧基磁珠及其偶联试剂购自美国BangsLaboratories公司，操作参照制造商提供的说明书；通过BCA法蛋白浓度测定耦联前后金黄色葡萄球菌肠毒素C2溶液中蛋白浓度的变化，经计算磁珠的耦联效率为85％；将金黄色葡萄球菌肠毒素C2磁珠分散于PBS缓冲液中，4℃保存。
(3)取2nmol随机ssDNA文库溶于500μL选择缓冲液(50mM Tris-HCl，100mM NaCl，1mM MgCl2，5mM KCl，pH 7.4)，然后经热激活处理。其中，热激活处理的方法为：95℃变性5min后，立即置于冰水浴中冰浴10min，随后置于室温10min。
(4)将经步骤(3)后的ssDNA文库与步骤(2)所得的金黄色葡萄球菌肠毒素C2磁珠(金黄色葡萄球菌肠毒素C2载量为100ng)以及酵母tRNA(摩尔量为ssDNA文库的5倍)混合并于室温孵育1h。
(5)磁性分离经步骤(4)后的金黄色葡萄球菌肠毒素C2磁珠，用含0.2％BSA的选择缓冲液洗去金黄色葡萄球菌肠毒素C2磁珠表面未结合、弱结合及非特异性结合的ssDNA；然后将金黄色葡萄球菌肠毒素C2磁珠用200μL ddH2O重悬，100℃热水浴5min后，置于磁力架1-2min，收集上清，获得与金黄色葡萄球菌肠毒素C2磁珠特异性结合的ssDNA，即ssDNA富集文库。
(6)PCR扩增：将步骤(5)所得的ssDNA富集文库加入到1mL PCRmix中；漩涡振荡混匀后，按每管50μL分装进行PCR扩增，扩增条件为：94℃预变性5min后；94℃变性30S，58℃退火30S，72℃延伸30S，15-25个循环。
其中1mL PCRmix中含有：10×PCR缓冲液100μL；pfu酶3μL；dNTP 20μL；引物P1：5’-FAM-AGGGCCGAGCTCACTTGT-3’和引物P2：5’-Biotin-GCACAATTGTGCCGGCGG-3’各3μL；所述引物P1和引物P2均委托生工生物工程股份有限公司合成。
(7)PCR产物的纯化：两端分别标有生物素和荧光基团FAM的PCR产物，使用小片段纯化试剂盒纯化(所述的小片段纯化试剂盒购自生工生物工程股份有限公司)，将纯化后的dsDNA与链霉亲和素磁珠(购自Invitrogen-Dynal公司)在37℃孵育20min，用洗涤缓冲液(5mM Tris-HCl，pH 7.5，1M NaCl，500μMEDTA)洗涤结合dsDNA的链霉亲和素磁珠三次后，用50μL NaOH溶液(0.1M)在37℃孵育30min使dsDNA解链；用磁力架分离，收集上清，上清经乙醇沉淀获得FAM标记的次级ssDNA文库，并溶解于选择缓冲液中，作为下一轮筛选的次级文库。
(8)筛选过程共进行9轮。从第二轮开始，次级文库的用量均为50pmol。
实施例二：核酸适配体C202序列的分析：
(1)经过9轮筛选后，收集富集的ssDNA文库，并委托上海派森诺生物科技股份有限公司利用高通量测序技术对文库序列进行分析，分析过程为：PCR扩增富集文库，并加上测序接头和Index部分；通过凝胶电泳选择纯化文库；利用Agilent 2100Bioanalyzer通过Agilent High Sensitivity DNA Kit对文库质控；利用Quant-iT PicogGreen dsDNAAssay Kit对文库进行定量；利用IlluminateNextSeq 500平台，以单链文库为模板进行桥式PCR扩增、测序引物退火、边合成边测序；并对测序结果进行比对和富集分析。
(2)利用UNAFold网络平台分析在25℃，100mM Na+，1mM Mg2+的条件下，核酸适配体C202序列的二级结构。分析出核酸适配体C202序列的二级结构示意图如图1所示。
实施例三：核酸适配体C202的特异性分析：
(1)体外化学合成FAM标记的核酸适配体C202，并将其溶于选择缓冲液。
(2)参照实施例一中步骤(2)，将BSA、金黄色葡萄球菌肠毒素A、金黄色葡萄球菌肠毒素B以及金黄色葡萄球菌肠毒素C1分别与羧基磁珠耦联制备BSA磁珠、金黄色葡萄球菌肠毒素A磁珠、金黄色葡萄球菌肠毒素B磁珠、金黄色葡萄球菌肠毒素C1磁珠以及金黄色葡萄球菌肠毒素C2磁珠。其中，所述BSA购自Sigma公司，所述金黄色葡萄球菌肠毒素A、金黄色葡萄球菌肠毒素B以及金黄色葡萄球菌肠毒素C1均购自美国Toxin Technology公司。
(3)取200μL步骤(1)所得的核酸适配体C202溶液分别与步骤(2)制得的BSA磁珠、金黄色葡萄球菌肠毒素A磁珠、金黄色葡萄球菌肠毒素B磁珠、金黄色葡萄球菌肠毒素C1磁珠以及金黄色葡萄球菌肠毒素C2磁珠混合，在暗盒中室温孵育1h，设空白磁珠为对照。
(4)用0.1％PBST洗涤经步骤(3)的上述磁珠3遍，与上述磁珠结合的核酸适配体，用200μL选择缓冲液100℃煮沸5min洗脱。
(5)利用荧光定量仪分别测定初始溶液和洗脱液的荧光强度，计算荧光结合率＝(初始荧光强度-洗脱荧光强度)/初始荧光强度×100％，用计算值初步代表核酸适配体C202与靶分子的结合率。
如图2所示，核酸适配体C202与金黄色葡萄球菌肠毒素C2的结合率均显著高于其与BSA、金黄色葡萄球菌肠毒素A、金黄色葡萄球菌肠毒素B、金黄色葡萄球菌肠毒素C1的结合率，表明核酸适配体C202与金黄色葡萄球菌肠毒素C2的结合具有较好的特异性。
实施例四：核酸适配体C202的亲和力分析
(1)取不同浓度的FAM标记核酸适配体C202溶液分别与金黄色葡萄球菌肠毒素C2磁珠混合，在暗盒中室温孵育1h。
(2)参照实施例三中的步骤(4)和步骤(5)，实验获得并计算不同浓度核酸适配体C202溶液与金黄色葡萄球菌肠毒素C2磁珠的荧光结合率。
(3)利用荧光结合率的计算值，绘制核酸适配体C202结合金黄色葡萄球菌肠毒素C2的饱和结合曲线，通过非线性回归分析计算核酸适配体C202结合金黄色葡萄球菌肠毒素C2的解离常数。
如图3所示，我们获得了核酸适配体C202的饱和结合曲线，经计算核酸适配体C202的解离常数为265.2±39.2pM，表明核酸适配体C202与金黄色葡萄球菌肠毒素C2结合的结合能力强，解离常数在皮摩尔级别。
实施例五：基于C202的亲和层析方法纯化重组金黄色葡萄球菌肠毒素C2蛋白
(1)C202亲和柱的制备：将生物素化的核酸适配体C202溶解在缓冲液A中(20mMNaH2PO4，150mM NaCl，pH7.4)，终浓度为20nM；然后注射到链霉亲和素琼脂糖凝胶的预装柱上，用蠕动泵以2.5mL/min的流速循环；用缓冲液(10mM CaCl2、4mM MgCl2、2M NaCl)洗涤基质表面非特异性的C202。
(2)用大肠杆菌系统重组表达金黄色葡萄球菌肠毒素C2蛋白，超声破菌后，12000rpm高速离心15min，收集含有金黄色葡萄球菌肠毒素C2蛋白的上清液。
(3)利用G25分子筛层析将重组金黄色葡萄球菌肠毒素C2蛋白溶液置换为选择缓冲液，制备上样金黄色葡萄球菌肠毒素C2溶液。
(4)将金黄色葡萄球菌肠毒素C2溶液通过蠕动泵加入到C202亲和柱，流速按照接触时间(I/O)10min来计算。
(5)用20倍柱体积的平衡液(0.050M Tris-HCl，0.010M CaCl2，pH 7.4)平衡；用洗脱液(0.020M Tris-HCl，0.010M EDTA，pH 7.4)洗脱，通过测量在波长280nM处的吸光值，监测金黄色葡萄球菌肠毒素C2蛋白的洗脱情况。
(6)SDS-PAGE凝胶上电泳分析蛋白的纯化情况。
如图4为蛋白纯化产物的SDS-PAGE电泳凝胶的图像，从左到右的泳道代表了下列起始产物的迁移结果：“B”为亲和介质上洗脱的溶液即步骤(5)中利用洗脱液从C202亲和柱上洗脱的溶液；“M”为分子量标准；“A”为大肠杆菌超声后的上清液即步骤(2)所得的含有金黄色葡萄球菌肠毒素C2蛋白的上清液。图像扫描分析显示，经核酸适配体C202亲和纯化后，金黄色葡萄球菌肠毒素C2纯度达99％以上。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国人民解放军南京军区福州总医院
<120> 金黄色葡萄球菌肠毒素C2的核酸适配体C202及其筛选方法和应用
<160> 3
<210> 1
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agggccgagc tcacttgtca cgggcaccct aactgggagg 40
aggcaggata acaccgccgg cacaattgtg c 71
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
agggccgagc tcacttgt 18
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gcacaattgt gccggcgg 18

Claims (3)

1.一种金黄色葡萄球菌肠毒素C2的核酸适配体C202，其特征在于：它的序列如SEQ IDNO.1所示；且它在25℃，100mM Na+，1mM Mg2+的条件下，其空间结构如下：
2.根据权利要求1所述的金黄色葡萄球菌肠毒素C2的核酸适配体C202，其特征在于：对所述核酸适配体C202的5’端或3’端进行FITC、氨基、生物素、地高辛化学修饰。
3.根据权利要求1或2所述的金黄色葡萄球菌肠毒素C2的核酸适配体C202在分离、纯化金黄色葡萄球菌肠毒素C2中的应用。
CN201611168443.7A 2016-12-16 2016-12-16 金黄色葡萄球菌肠毒素c2的核酸适配体c202及其筛选方法和应用 Active CN106591315B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611168443.7A CN106591315B (zh) 2016-12-16 2016-12-16 金黄色葡萄球菌肠毒素c2的核酸适配体c202及其筛选方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611168443.7A CN106591315B (zh) 2016-12-16 2016-12-16 金黄色葡萄球菌肠毒素c2的核酸适配体c202及其筛选方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106591315A CN106591315A (zh) 2017-04-26
CN106591315B true CN106591315B (zh) 2019-01-18

Family

ID=58600756

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201611168443.7A Active CN106591315B (zh) 2016-12-16 2016-12-16 金黄色葡萄球菌肠毒素c2的核酸适配体c202及其筛选方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106591315B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110904112B (zh) * 2019-12-12 2024-04-02 福州市长乐区宝爱冬医学技术有限公司 一种白喉毒素的核酸适配体dt03及其应用
CN110885829B (zh) * 2019-12-12 2024-03-08 沈阳和合医学检验所有限公司 一种白喉毒素的核酸适配体dt05及其应用
CN110938631B (zh) * 2019-12-12 2024-03-29 福州市长乐区宝爱冬医学技术有限公司 一种白喉毒素的核酸适配体dt02及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102633867A (zh) * 2011-02-15 2012-08-15 中国科学院沈阳应用生态研究所 抗原性改变的肠毒素c2突变体及编码基因与制备和应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7259256B2 (en) * 2002-10-02 2007-08-21 National Chunghsing University Primers useful in polymerase chain reaction for the identification of subtypes C1, C2 and C3 of staphylococcal enterotoxin type C

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102633867A (zh) * 2011-02-15 2012-08-15 中国科学院沈阳应用生态研究所 抗原性改变的肠毒素c2突变体及编码基因与制备和应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Transcytosis, Antitumor Activity and Toxicity of Staphylococcal Enterotoxin C2 as an Oral Administration Protein Drug;Zhao WB等;《TOXINS》;20160630;第8卷(第6期);第1-12页
用SELEX技术筛选葡萄球菌肠毒素B特异性适配体;江丽等;《临床检验杂志》;20090630;第27卷(第6期);第420-421页

Also Published As

Publication number Publication date
CN106591315A (zh) 2017-04-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2424269T3 (es) Inmuno-PCR sándwich por desplazamiento
JP3143477B2 (ja) 生物学的サンプル中における生物学的分子の検出のためのバクテリオファージの使用に基づく方法
CN106591315B (zh) 金黄色葡萄球菌肠毒素c2的核酸适配体c202及其筛选方法和应用
Mirzakhani et al. Development of a DNA aptamer for screening Neisseria meningitidis serogroup B by cell SELEX
CN106701768B (zh) 金黄色葡萄球菌肠毒素c2的核酸适配体c201及其筛选方法和应用
KR100961532B1 (ko) 테트라사이클린 및 그 유도체에 특이적으로 결합하는21종의 단일가닥 핵산 구조체 앱타머와 그 생산방법
CN114350670A (zh) 特异性识别可溶性st2蛋白的核酸适配体及其应用
CN106636105B (zh) 金黄色葡萄球菌肠毒素c2的核酸适配体c203及其筛选方法和应用
KR20180052991A (ko) 살모넬라 타이피뮤리움 생균의 표면에 특이적으로 결합하는 dna 앱타머 및 이의 용도
CN106854649B (zh) 金黄色葡萄球菌肠毒素c2的核酸适配体c204及其筛选方法和应用
CN106801059B (zh) 金黄色葡萄球菌肠毒素c2的核酸适配体c205及其筛选方法和应用
CN105349544A (zh) 一种金黄色葡萄球菌肠毒素a的核酸适配体s3及其应用
CN111793629B (zh) 铜绿假单胞菌外毒素a的核酸适配体eta01及其应用
CN110819632B (zh) 用于结合曲妥珠抗体的核酸适体
CN110885829B (zh) 一种白喉毒素的核酸适配体dt05及其应用
CN110904112B (zh) 一种白喉毒素的核酸适配体dt03及其应用
CN100519759C (zh) 一种制备用于快速检测伤寒的凝集试剂的方法
CN110923239B (zh) 一种白喉毒素的核酸适配体dt04及其应用
CN110938631B (zh) 一种白喉毒素的核酸适配体dt02及其应用
CN110885828B (zh) 一种白喉毒素的核酸适配体dt01及其应用
CN115678902A (zh) 一种幽门螺杆菌VacA的核酸适配体VACA01及其应用
CN114807150B (zh) 靶向和拮抗hmgb1分子的核酸适体
KR101541221B1 (ko) 리스테리아의 병원성 조절인자 PrfA 단백질과 특이적으로 결합하는 ＤＮＡ 앱타머 및 이의 용도
CN116814637A (zh) 一种结合csf-1r蛋白的核酸适配体及其应用
CN111909934A (zh) 铜绿假单胞菌胞外酶Y的核酸适配体ExoY01及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant