KR100961532B1

KR100961532B1 - 테트라사이클린 및 그 유도체에 특이적으로 결합하는21종의 단일가닥 핵산 구조체 앱타머와 그 생산방법

Info

Publication number: KR100961532B1
Application number: KR1020080028473A
Authority: KR
Inventors: 구만복; 쟈벳; 이수진
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2008-03-27
Filing date: 2008-03-27
Publication date: 2010-06-07
Also published as: KR20090103100A

Abstract

본 발명은 랜덤 DNA 라이브러리로부터 선택된 테트라사이클린(TET, Tetracycline) 및 그 유도체(analogue)에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머의 분리 생산방법과 생산된 DNA 앱타머에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 세균 등의 병원균에 의한 감염 치료를 위해 인체 및 축산물 등에 널리 사용되고 있는 항생제인 테트라사이클린 및 그 유도체에만 특이적으로 결합하는 핵산 구조체인 DNA 앱타머를 자성 비드와 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동을 이용하여 분리 생산하는 방법과 이렇게 생산된 DNA 앱타머에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 랜덤 DNA pool로부터 항생물질인 테트라사이클린(TET, Tetracycline) 및 그 유도체(analogue)에 대해 특이적으로 높은 친화도를 보이는 DNA 앱타머를 SELEX process의 변형된 방법인 FluMag-SELEX process를 이용하여 선별하고, 선별된 DNA 앱타머들의 염기서열, 특성 및 테트라사이클린 또는 그 유도체에 대한 결합력을 분석하였다. 따라서 본 발명에 따른 DNA 앱타머를 이용하여 상하수원, 식품, 인체 등에 잔류하는 극미량의 항생물질의 검출을 보다 효과적 수행할 수 있다.

테트라사이클린(TET, tetracycline), 테트라사이클린 유도체, 항생물질, SELEX, DNA 앱타머

Description

테트라사이클린 및 그 유도체에 특이적으로 결합하는 21종의 단일가닥 핵산 구조체 앱타머와 그 생산방법{twenty one Single-stranded DNA aptamers having high affinity to tetracycline and it's analogues with high specificity and production method thereof}

본 발명은 세균 등의 병원균에 의한 감염 치료를 위해 인체 및 축산물 등에 널리 사용되고 있는 항생제인 테트라사이클린(TET, Tetracycline) 및 그 유도체(analogue)에 특이적으로 결합하는 단일가닥 핵산 구조체 앱타머 및 그 분리 생산방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 랜덤 DNA 라이브러리로부터 선택된 테트라사이클린, 옥시테트라사이클린 및 독시사이클린에 특이적으로 결합 가능한 DNA 앱타머를 자성 비드와 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동을 이용하여 분리 생산하는 방법 및 생산된 DNA 앱타머에 관한 것이다.

테트라사이클린(TET, Tetracycline) 계열의 항생제인 옥시테트라사이클린(OTC, Oxytetracycline)과 독시사이클린(DOX, Doxycycline)은 모그룹인 테트라사이클린의 화학구조에서 4-, 6-에피머(epimer)만 변형이 된 것으로서 이들은 테트라사이클린 아날로그(Tetracycline analogues)라 불린다. 이것들은 일반적으로 테트 라사이클린 TET 의약품의 생산 시에 발생되고, 이 외에 열, pH, 습도 등의 비정상적인 환경에서 TET로부터 발생할 수 있다고 알려졌다.

테트라사이클린(TET, Tetracycline)과 테트라사이클린 아날로그인 옥시테트라사이클린(OTC, Oxytetracycline) 및 독시사이클린(DOX, doxycycline)은 현재 가장 널리 이용되는 항생제이다. 이들 항생제는 인체 및 동물용 의약품으로 일반적으로 세균에 의한 감염치료 시에 사용되어 상처 또는 감염의 치료율을 높이거나, 축수산물의 감염 예방 차원에서 직접 투여되거나 사료의 형태로 동물에게 주입된다. 특히 OTC(oxytetracycline)는 흡수율이 TET (tetracycline) 보다 더 높다고 알려져 있어 가장 많이 이용되는 항생제이다.

그러나 현재 동물의 사료 찌꺼기나 배설물에 들어있던 잔류 테트라사이클린 또는 그 유사체가 토양이나 물에 흡수되었다가 환경에서의 여러 경로를 통하여 사람에게까지 영향을 줄 수 있어 문제가 된다. 특히 꿀, 우유, 계란 등에 잔류되어 있는 TET(tetracycline)는 이미 몇몇의 연구를 통해 그 문제점이 보고 되었다. OTC(oxytetracycline)도 주로 위장장애를 일으키고 특히 임산부나 소아의 치아와 뼈를 황갈색으로 변성시키는 문제점을 발생시키고, 태아의 골격발육을 지연시켜 기형아 출산 위험성을 높이는 것으로 알려졌다. DOX(doxycycline)의 경우 신장질환은 야기할 수 있으며, 경구 피임약을 복용하는 사람에게는 그 피임효율을 50 % 경감시키기도 한다.

또한 TET 등의 항생제가 잔류되어 있는 축수산물을 장기간 섭취할 경우에 생체 내에 내성이 생겨 면역력을 떨어뜨리는 등 부작용이 생길 수 있다. 다시 말해 동물들에 대한 항생제 오남용으로 인해 일반적인 식중독균이 ‘다제내성균’(슈퍼 박테리아)이 된다면, 일반적으로 사용하는 항생제로는 식중독을 치료할 수 없게 되고, 이를 치유하기 위해 더 독한 항생제를 투여하는 악순환이 반복된다. 따라서 항생제의 오남용을 방지하는 것은 물론이고 식품의 안전성을 확보하기 위해 잔류된 항생제를 검출하는 방법을 개발하는 것은 필요하다 할 것이다.

앱타머는 특정 타깃에 대해 높은 특이성과 친화도를 갖는 단일가닥 DNA 또는 RNA의 구조체를 말한다. 앱타머는 센서 분야에서 이용되는 기존의 감지물질인 항체보다도 훨씬 표적에 대한 친화도가 높고, 열 안정성이 우수하며, in vitro에서 합성이 가능하기 때문에 동물에게 항원을 주입하여 항체를 생산하는 번거로운 공정을 생략할 수 있어 비용 면에서 훨씬 우위에 있고, 타깃 물질에 제약이 없어 단백질, 아미노산 같은 생분자나 환경호르몬이나 항생제 같은 작은 유기화학 물질, 박테리아 등의 다양한 타깃에 대한 앱타머를 합성할 수 있다. 따라서 앱타머는 극미량의 잔류 항생제의 검출방법에 도입하기에 매우 적절한 물질이며, 이를 활용한 나노바이오 기술을 이용하여 다른 특정 물질을 검출하는데도 응용할 수 있다. 이렇게 표적 물질과 특이적으로 결합하는 앱타머의 특성으로 인해 최근 들어 앱타머를 신약개발, 약물전달 시스템, 그리고 바이오센서로 이용하기 위하여 많은 연구가 이루어졌다. 그러나 기존의 앱타머 개발의 목표는 대부분 의료 진단용 바이오센서 개발이나 신약 개발에 사용하기 위해 단백질 관련 질병의 표적물질로 하는 연구가 대부분이었다.

기존의 잔류항생제 검출방법은 잔류 항생제가 녹아있는 성분에 따라 각기 다 른 시험용액을 조제하여 잔류항생제를 추출, 정제하여 액체크로마토그래피로 정량하는 방법이었다. 어떤 물질에서든 특이적으로 테트라사이클린(tetracycline) 또는 그 유도체(analogue)에 결합하여 검출할 수 있는 앱타머와는 달리 기존의 방법은 녹인 물질에 따른 시험법도 소수이고, 시험용액을 각기 조제하는 것도 번거롭다. 또한 추출, 정제 과정 중에 테트라사이클린 또는 그 유도체의 손실이 있을 수도 있으므로 정확한 정량이 어렵다. 이러한 잔류의약품, 항생제 및 환경호르몬 등과 같은 저분자 유해물질 결합 특이적 앱타머들은 상수원 및 하천에 잔류하는 물 시료 뿐 아니라 인체 등 생체 내에서의 잔류 유해물질 검출 및 진단 기술과 같은 의료 기술로의 적용할 수 있는데 비하여 기존의 잔류항생제 검출은 식품이나 물에만 적합한 방법만 제시되어 왔다.

이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 항생물질의 한 종류인 테트라사이클린(tetracycline) 뿐만 아니라 그 유도체(analogue)에도 특이적으로 높은 친화도를 보이는 핵산 구조체인 DNA 앱타머와 그 분리 생산방법을 개발하였다. 또한, 상기 테트라사이클린 및 그 유도체에 특이적으로 결합 가능한 DNA 앱타머를 포함하는 조성물을 생산하여 식품, 상하수원, 인체 등으로부터 잔류 항생물질을 효과적으로 검출할 수 있음을 확인하고, 본　발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 테트라사이클린(tetracycline) 및 그 유도체(analogue)에 특이적으로 높은 친화도를 갖고 결합하는 21 종의 단일가닥 핵산 구조체 앱타머 및 그 생산방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 DNA 앱타머를 이용한 테트라사이클린 또는 그 유도체 검출용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 테트라사이클린(tetracycline) 및 그 유도체(analogue)에 특이적으로 결합 가능한 DNA 앱타머를 제공한다. 본 발명에서는 상기 테트라사이클린(tetracycline) 및 그 유도체(analogue)에 특이적으로 결합 가능한 DNA 앱타머를 SELEX process를 이용하여 선별하였다. 본 발명에 사용된 SELEX process는 임의적으로 합성된 DNA 또는 RNA의 집합에서 특정 분자에 대해 높은 결합력을 지니는 DNA 또는 RNA를 선별하여 증폭시킴으로써 해당분자의 DNA 결합 서열을 알아내는 방법(Louis C. Bock, Linda C. Griffin, John A. Latham, Eric H. Vermaas, John J. Toole., 1992, Selection of single-stranded DNA molecules that bind and inhibit human thrombin., Nature 355, 564-566)을 말한다.

본 발명의 DNA 앱타머에서, 상기 DNA 앱타머는 테트라사이클린과 그 유도체인 옥시테트라사이클린(OTC, Oxytetracycline) 및 독시사이클린(DOX, doxycycline) 모두에 특이적으로 결합할 수 있다. 상기 테트라사이클린 계열의 항생제인 옥시테트라사이클린(OTC, Oxytetracycline)과 독시사이클린(DOX, Doxycycline)은 모그룹인 테트라사이클린의 화학구조에서 4-, 6-에피머(epimer)만 변형이 된 것으로서 이들은 테트라사이클린 유도체(Tetracycline analogues)라 불린다(도 1). 이들은 일반적으로 테트라사이클린 TET 의약품의 생산 시에 발생되고, 이 외에 열, pH, 습도 등의 비정상적인 환경에서 TET으로부터 발생할 수 있다고 알려졌다.

본 발명의 DNA 앱타머에서, 상기 DNA 앱타머는 상기 SELEX process에 의해 선택된 테트라사이클린 및 그 유도체에 특이적으로 결합하는 어떠한 염기서열의 DNA 앱타머일 수 있으나, 바람직하게는 서열번호 1 내지 서열번호 21 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 것이 좋고, 더욱 바람직하게는 서열번호 6, 9, 12, 13, 15, 16, 및 17의 염기서열을 갖는 것이 좋다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 테트라사이클린(tetracycline) 및 그 유도체(analogue)에 특이적으로 결합 가능한 DNA 앱타머의 생산방법을 제공한다:

a) 테트라사이클린(tetracycline) 및 그 유도체로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 항생제와 자성비드(magnetic beads)를 붕산염(borate) 버퍼용액에서 반응시켜 공유결합을 유도하는 단계;

b) 상기 결합된 항생제-자성비드와 양 끝에 PCR용 프라이머 영역을 포함하고 중앙에 30-50개의 임의의 염기를 갖는 DNA pool을 버퍼용액에서 혼합하여 상온에서 결합을 유도하는 단계;

c) 상기 결합된 항생제-자성비드-DNA pool을 자석을 이용하여 분리하는 단계;

d) 상기 분리된 항생제-자성비드-DNA pool로부터 DNA pool을 분리하는 단계;

e) 상기 PCR용 프라이머 영역에 상보적인 프라이머 쌍으로 PCR을 수행하여 상기 분리된 DNA pool을 증폭하는 단계;

f) 상기 a)단계에서 선택되지 않는 상기 군에 속하는 다른 항생제와 자성비드(magnetic beads)를 붕산염(borate) 버퍼용액에서 반응시켜 공유결합을 유도하는 단계; 및

g) 상기 결합된 항생제-자성비드와 상기 e)단계에서 증폭된 DNA pool로 b) 내지 d) 단계를 수행하여 테트라사이클린 및 그 유도체 모두에 특이적으로 결합하는 DNA pool을 선별하는 단계.

본 발명의 상기 f) 및 g) 단계에서는, 상기 a)단계에서 선택되지 않는 다른 항생제-자성비드와 상기 e) 단계에서 증폭된 DNA pool를 가지고 상기 b) 내지 d) 단계를 반복적으로 수행함으로써, 하나의 항생제에만 결합하는 DNA pool을 제거할 수 있고, 순차적으로 선택된 항생제 모두에 결합할 수 있는 DNA pool 만을 선별할 수 있다. 상기 f) 및 g) 단계는 결합을 원하는 항생제의 개수에 따라 2회 이상 반복적으로 수행할 수 있다. 본 발명의 실시예 3 내지 실시예 5에서는 옥시테트라사이클린에 4회, 테트라사이클린에 2회, 및 독시사이클린에 2회에 걸쳐 상기의 선별단계를 수행하여 이들 항생제 모두에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 선별하였다.

본 발명의 방법에서, 상기 a)단계의 공유결합은 테트라사이클린(tetracycline) 또는 그 유도체(analogue)의 아미노기(amino group)와 자성비드의 토실기(tosyl group)의 공유결합인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 방법에서, 상기 a)단계 후, 테트라사이클린 또는 그 유도체와 결합하지 않은 자성비드의 토실기를 에탄올아민(ethanol amine) 용액으로 40-50℃에서 6-18시간 동안 불활성화 시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 방법에서, 상기 d)단계에서 DNA의 분리는 70-90℃에 3-10분간 두어 DNA를 항생제-자성비드로부터 분리하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 방법에서, 상기 e)단계에서 상기 프라이머 쌍 중 하나에 표지인자를 붙여 PCR을 수행할 수 있다. 상기 표지인자는 전기영동을 수행 시에 표지인자가 붙은 단일가닥 DNA를 겔 상에서 정체(retardation)시키고, 형광표지되어 분리가 용이한 어떠한 표지인자도 될 수 있으나, 바람직하게는 Cy3, Cy5, Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 658, 시아닌(Cyanine)-3, 시아닌-5, 플루오레세인(fluorescein), 보디피(bodipy), 텍사스 레드(Texas red), FITC(Fluorescein Isothiocyanate), 로다민(rhodamine), 아미노-알릴 수정된 dNTPs를 갖는 반응성 염료, 바이오틴 등이 좋다. 본 발명의 실시예에서는 플루오레세인(fluorescein)을 붙인 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였는데, 이 경우 전기영동 과정에서 두 가닥의 DNA가 변성(denaturation)되면 플루오레세인이 붙어있는 DNA 가닥은 위에, 붙어있지 않은 DNA 가닥은 아래에 각각 위치하고, 플루오레세인이 자체 발광하기 때문 에 분리가 용이하다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 테트라사이클린(tetracycline) 및 그 유도체(analogue)에 특이적으로 결합 가능한 DNA 앱타머를 포함하는 테트라사이클린(tetracycline) 및 그 유도체(analogue) 검출용 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물에서, 상기 DNA 앱타머는 테트라사이클린 및 그 유도체에 특이적으로 결합하는 어떠한 염기서열의 DNA 앱타머일 수 있으나, 바람직하게는 서열번호 1 내지 서열번호 21 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 것이 좋고, 더욱 바람직하게는 서열번호 6, 9, 12, 13, 15, 16, 및 17의 염기서열을 갖는 것이 좋다.

본 발명의 테트라사이클린 및 그 유도체 검출용 조성물은 잔류 허용기준을 초과하는 항생제 중에서 가장 많이 검출되는 항생제인 테트라사이클린 및 그 유도체를 검출하기 위한 것으로, 잔류 항생제는 매우 적은 양으로 식품이나 환경에 존재하더라도 생물농축현상 등과 같은 여러 환경적인 경로에 의해서 최종 소비자인 사람에게 영향을 미칠 수 있기 때문에, 축수산물에서 광범위하게 사용되고 있는 잔류 항생물질을 검출 및 제거하는 기술이 필요하다. 따라서 테트라사이클린 및 그 유도체의 검출을 위해 본 발명의 DNA 앱타머를 이용하여 어떠한 형태로도 사용할 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 DNA 앱타머를 자성비드에 고정화된 테트라사이클린 또는 그 유도체에 결합시키게 되면 결합된 DNA 앱타머-항생제-자성비드를 자석을 이용하여 분리할 수 있게 되고, 이 복합체로부터 다시 테트라사이클린 또는 그 유도체를 분리함으로써 테트라사이클린 또는 그 유도체만을 선택적으로 검출할 수 있게 된다. 또한 본 발명의 DNA 앱타머-자성비드를 본 발명의 실시예에 기술된 방법 이외에도 본 발명의 DNA 앱타머와 연결자로 연결된 센서를 이용하여 시료 중의 테트라사이클린 또는 그 유도체를 검출할 수 있다.

본 발명의 조성물을 이용하는 테트라사이클린 및/또는 그 유도체의 제거방법의 한 예를 들면, 상기 DNA 앱타머가 고정화된 자성비드를 컬럼(column)에 채운 후 테트라사이클린 및/또는 그 유도체를 포함하는 시료를 통과시켜 테트라사이클린 및/또는 그 유도체만을 선택적으로 제거할 수 있다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.

1) 자성 비드에 어느 하나의 항생제의 고정

테트라사이클린, 그 유도체인 옥시테트라사이클린 및 독시사이클린 중에서 어느 하나를 선택하여 자성비드에 고정시킬 수 있다. 어느 것을 먼저 선택하는지는 본 발명의 기술적 사상을 달성하는데 있어서 중요한 것은 아니다. 본 발명의 실시예 3에서는 옥시테트라사이클린으로 먼저 자성비드와 공유결합을 시켰는데, 이는 테트라사이클린 계열 항생제 중에서 OTC가 가장 많이 발견되기 때문이다. TET 또는 그 유사체의 아미노기(amino group)는 자성비드의 토실기(tosyl group)와 공유결합을 형성한다. 이를 위해 TET 또는 그 유사체와 자성비드(0.2 × 10⁹)를 각각 버퍼용액에 넣고 반응시킨다. TET 또는 그 유사체가 결합된 자성비드는 자석을 이용해서 분리가 가능하며 같은 버퍼용액으로 비드를 세척하여 결합하지 않은 항생제를 제거 한다.

2) TET 및 그 유사체 결합 특이적 DNA 앱타머 개발

표적 물질 특이적인 앱타머를 개발하기 위한 방법으로는 일반적으로 SELEX(Systematic Evolution of Ligand by Exponential Enrichment) 방법이 널리 사용되고 있다. 본 발명에서는 일반적인 SELEX를 변형한 FluMag-SELEX process를 이용하여 TET 및 그 유사체에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 개발하였다. 본 발명에서 사용한 FluMag-SELEX process는 DNA 증폭단계에서 형광 표지된 프라이머(fluorescence labelled primer)를 사용하고, 이어지는 PAGE를 이용한 PCR product sepatarion (dsDNA->ssDNA)과정에서 형광을 띠는 밴드를 취할 수 있는 이점을 이용하기 위한 변형된 기술이며, 타겟과 결합하는/결합하지 않는 DNA를 구별할 수 방법으로 자석(magnet)을 이용한 SELEX 방법이다. 기존의 다른 SELEX의 경우, 방사선 표지(radioactive label), capillary electrophoresis, membrane filter 등을 이용했었는데, 경비가 많이 들고 핸들링 하기가 어려운 단점이 있었다. PCR product를 분리하기 위해서는 chromatography, affinity column 등이 이용되었지만 가격이 비싸고, 효율이 떨어지는 문제가 있다(R. Stoltenburg, C. Reinemann, B. Strehlitz (2005) Anal Bioanal Chem 383: 83?91).

이를 위하여 먼저 76mer로 된 중앙의 40개의 임의의 염기를 갖는 DNA pool을 합성하였으며, 이 DNA pool을 TET 또는 그 유사체 중 선택된 어느 하나의 항생제가 고정되어 있는 자성 비드와 함께 버퍼용액에 넣고 혼합하여 결합 반응을 시킨 후 자석을 이용해 선택된 항생제와 결합하지 않은 DNA를 제거하였다. 고온 처리를 하여 선택된 항생제와 결합한 DNA를 자성비드에서부터 분리시킨 다음 에탄올 침전법으로 용리된 DNA를 확보하였다.

선택된 항생제에 특이적으로 결합하는 DNA의 양을 늘리기 위해 PCR을 수행하고 PCR 반응물을 정제한 후 고농도의 요소(urea)가 들어있는 폴리아크릴아마이드 젤로 전기영동을 하여 분리된 두 개의 단일 가닥 DNA를 얻었다. 적합한 DNA 밴드를 젤 추출(gel extraction)한 후 다시 에탄올 침전법으로 분리된 DNA를 확보한다. 이 때 확보된 DNA pool은 다시 처음 선택된 항생제가 고정되어 있는 자성비드 용액과 혼합하여 선택된 항생제와 반응시킨다. 이러한 일련의 과정을 4회 반복하여 50%이상이 선택된 항생제에 결합하는 DNA pool을 얻었다. 5번째 선별부터는 선택된 항생제 이외에 선택되지 않은 항생제-자성비드를 사용하여 순차적으로 모든 항생제에 결합 가능한 DNA를 선별하였다. 이렇게 선별된 DNA pool을 TOPO cloning kit를 이용하여 클로닝(cloning)하고 얻어진 콜로니에서부터 DNA를 추출하여 염기분석을 시행할 결과, 서로 다른 21개의 TET 또는 그 유도체에 특이적으로 결합하는 핵산 구조체를 확보하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. 자성비드에 테트라사이클린 또는 그 유사체의 결합

1-1. 자성비드와 테트라사이클린(TET)의 결합

테트라사이클린(TET, Sigma Co.)의 아미노기(amino group)와 자성비드(M-280 Tosylactivated magnetic beads, Dynal Biotech ASA, Norway)의 토실기(tosyl group)는 공유결합을 형성하게 되는데, 이것을 위해 10 mM의 TET와 0.2× 10⁹ 개의 자성비드를 버퍼용액(0.1 M borate buffer, pH 10.5)에 넣고 45 ℃에서 24시간 반응시켰다. TET가 결합된 자성비드(테트라사이클린-자성비드)는 자석을 이용해서 분리가 가능하며 같은 버퍼용액으로 비드를 세척하여 결합하지 않은 TET를 제거하였다. TET가 결합된 자성비드는 세척 후 0.5M의 에탄올아민 용액(ethanol amine, pH 8.0)과 45℃에서 12시간 반응시켜 TET와 결합하지 않은 토실기를 불활성시켰다. 활성을 가지고 있는 토실기가 남아있으면 분자간의 여러 가지 상호작용, 예컨대, 반데르발스 결합, hydrophobic interaction 등으로 인해 nonspecific binding이 일어날 수 있기 때문에 활성이 거의 없다고 알려진 에탄올아민 용액으로 활성기를 차단(blocking)시켰다. 수차례 세척 후 버퍼용액(0.1 M borate, pH 9.5)에 자성 비드를 혼합하여 4℃에서 보관하였다.

1-2. 자성비드와 테트라사이클린 유사체의 결합

테트라사이클린을 옥시테트라사이클린(OCT, Sigma Co.) 또는 독시사이클 린(Sigma Co.)으로 치환한 것을 제외하고 실시예 1-1과 같은 방법으로 자성비드와 옥시테트라사이클린 또는 독시사이클린을 결합시켰다.

실시예 2. 임의의 염기서열을 가지는 DNA pool 합성

76mer DNA pool로서 양 끝에 PCR을 위한 프라이머 영역(primer region)이 있고 중앙에 40개의 임의의 염기를 가진 DNA pool을 아래와 같은 방법으로 합성하였다. 본 발명에 사용된 DNA pool은 Genotech Inc. Korea에 화학적으로 합성을 의뢰하였다.

CGTACGGAATTCGCTAGC-N40-GGATCCGAGCTCCACGTG

실시예 3. 옥시테트라사이클린과 결합하는 DNA 앱타머의 선별

실시예 2에서 합성된 랜덤 DNA pool을 9.35 μmole의 실시예 1-2에서 제조한 OTC가 고정되어 있는 자성 비드와 함께 버퍼용액(20mM Tris-Cl buffer, pH 7.6 contained 100mM NaCl, 2mM MgCl₂, 5mM KCL, 1mM CaCl₂ 및 0.02% Tween 20)에 넣고 혼합하여 30분간 상온에서 반응시킨 후 OTC와 결합하지 않은 DNA를 제거하기 위해 위의 혼합액이 들어있는 튜브를 자석에 고정시켜서 OTC와 결합하지 않은 DNA를 제거하고, 결합력이 약한 DNA를 제거하기 위해 버퍼용액으로 5회 세척하였다. OTC와 결합한 DNA를 용리하기 위해서는 튜브를 80℃에서 5분간 두어 DNA를 자성비드에서 부터 분리시킨 다음 에탄올 침전법으로 용리된 DNA를 확보하였다. 이렇게 얻어진 OTC에 결합하는 DNA의 양을 측정하였다. 도 3에서는 eluted ssDNA의 양이 1 내지 4의 선별단계(selection round)에서 얻어진 OTC에 결합하는 DNA의 양을 보여준다.

실시예 4. 옥시테트라사이클린과 결합 가능한 DNA 앱타머 pool의 생산

TET 유사체인 OTC에 특이적으로 결합하는 특이적인 DNA의 양을 늘리기 위해 이미 알고 있는 프라이머 영역을 이용하여 PCR을 수행(94 ℃ 5 min, (94 ℃ 1 min, 47 ℃ 1min, 72 ℃ 1 min)X 30 cycles, 72 ℃ 10 min)하였다. PCR 생산물은 두 가닥의 DNA이므로 이를 단일가닥으로 분리하기 위한 과정을 위하여, 아래와 같이 하나의 프라이머에는 플루오레세인(fluorescein)을 고정하였다.

forward (APTFf) 5’-fluorescein-CGTACGGAATTCGCTAGC

reverse (APTR) 5’-CACGTGGAGCTCGGATCC-3’

PCR 반응물을 정제키트(purification kit)를 이용하여 정제한 후 이중가닥의 DNA를 단일가닥으로 만들기 위해 폴리아크릴아마이드젤 전기영동을 실시하였다. 10%의 폴리아크릴아마이드 젤에는 6M의 요소(urea), 20%의 포름아마이드(formamaid)가 포함되어 있어 전기영동 후에는 두 개의 밴드가 생성된다. 이는 전기영동 과정에서 두 가닥의 DNA가 변성(denaturation)되어 플루오레세인이 붙어있는 DNA 가닥은 위에, 붙어있지 않은 DNA 가닥은 아래에 각각 위치하기 때문이다. 플루오레세인이 붙어 있는 DNA 밴드를 잘라내어 젤 추출(gel extraction)을 실시한 후 다시 에탄올 침전법으로 분리된 DNA를 확보하였다. 이 때 확보된 DNA pool은 다시 처음의 OTC가 고정되어 있는 자성비드 용액과 혼합하여 OTC와 반응시켰다. 이러한 과정의 모식도를 도 2에 나타내었고, 일련의 과정(FluMag-SELEX process)을 한 번의 선별(selection)이라 하면 총 4번의 선별과정을 거쳐 최종적으로 50% 이상이 OTC에 결합하는 DNA pool을 얻었다. 2번째 선별 후에 에탄올아민으로 count selection을 실시함으로써 비특이적으로 결합하는 DNA를 차단하고 OTC에만 높은 친화도를 가지고 특이적으로 결합하는 DNA pool을 확보할 수 있었다.

실시예 5. 테트라사이클린 및 독시사이클린과도 결합하는 DNA 앱타머의 선별

5번째 선별부터 옥시테트라사이클린을 테트라사이클린으로 치환한 것을 제외하고 실시예 3과 같은 방법으로 수행하였다. 실시예 3에서 얻은 옥시테트라사이클린에 결합하는 DNA pool을 9.35 μmole의 TET가 고정된 자성비드에 결합시킴으로써 OTC에만 강하게 결합하고 TET에는 결합하지 않는 DNA를 제거하고, OTC에 결합함과 동시에 TET에도 강하게 결합하는 DNA pool을 얻었다. 도 3에서는 4번째 이후의 선별단계(selection round)에서 얻어진 eluted ssDNA pool이 TET과 결합하는 것을 정량적으로 나타내었다.

6번째 selection 다음에는 독시사이클린(Doxycycline)이 고정된 자성비드를 이용하여 DOX에만 강하게 결합하는 DNA pool을 제거하고, OTC, TET, 및 DC 모두에 강하게 결합하는 DNA pool을 선별할 수 있었다(도 3). 총 8번의 selection 과정을 통해 TET analogue인 OTC와 TET(D)에 80 % 이상이 강하게 결합하는 DNA pool을 확보하였다. 도 2에서는 이러한 TET Analogues 특이적 결합 앱타머를 개발되는 과정을 모식도로 나타내었다. 각각의 selection에서 자성비드에서부터 용리된 ssDNA의 퍼센트는 도 4에 나타내었다.

최종적으로 얻어진 DNA pool을 TOPO cloning kit(Invitrogen Life technologies사)를 이용하여 cloning 하고 얻어진 콜로니에서부터 DNA를 추출하여 염기분석을 시행할 결과 서로 다른 21 종의 TET analogues에 결합 특이적인 서열번호 1 내지 서열번호 21의 핵산 구조체(DNA 앱타머)를 확보하였다.

실시예 6. 21종의 DNA 앱타머의 염기서열 분석과 TET 및 TET 유사체의 친화도 측정

서로 다른 21 종의 TET 및 TET 유사체에 높은 친화도를 가지고 특이적으로 결합하는 DNA의 염기서열을 분석한 결과를 하기 표 1에 제시하였다. 또한 이 21 종의 앱타머의 2차 구조를 m-fold 프로그램을 이용하여 예측한 결과를 도 5에 나타내었다.

[표 1]. TET 및 TET 유사체에 높은 친화도를 가지고 특이적으로 결합하는 서로 다른 2종의 DNA 앱타머의 염기서열

상기 서열번호 1 내지 서열번호 21의 21종 DNA 앱타머 중에서 TET에 대한 친화도가 가장 높은 7종의 앱타머를 다음과 같이 선택하였다.

실시예 7. 7종의 DNA 앱타머의 TET 와의 결합력 분석

25 μM의 TET와 0 내지 1 μM의 각각의 TET 결합 앱타머를 버퍼용액(20 mM Tris-Cl buffer pH 7.6 contained 100mM NaCl, 2mM MgCl₂, 5mM KCL, 1mM CaCl₂ 및 0.02% Tween 20)에 넣고 상온에서 30분간 반응시킨 후 반응물을 Microcon filter(YM 10)(Millipore Co., USA)에 넣고 12,000 g에서 8분간 원심분리 하였다. 앱타머와 결합하여 filter 위에 남은 TET와 filter를 통과한 앱타머와 결합하지 않은 TET의 농도를 376 nm에서의 흡광도를 측정하여 TET와의 결합력이 가장 높은 서열번호 No.6(T7), No.9(T15), No.12(T19), No.13(T20), No.15(T22), No.16(T23), 및 No.17(T24)의 앱타머를 선정하였다.

각각의 앱타머 양에 결합한 TET의 농도는 비선형 회귀법과 단일 부위 포화형 리간드 결합법으로 Sigmaplot 8.0을 이용하여 plotting되었고, 여기에 y=Bmax* X/Kd + X 식이 이용되었다(y는 포화도, Bmax는 최대 결합 위치, Kd는 해리상수, X는 결합하지 않은 앱타머).

그 결과를 하기 표 2에 나타내었고, No.23의 Kd값이 23.8 nM, No.24의 Kd값이 57.5 nM로서 TET와 매우 강력하게 결합하는 것이 확인되었고, 각 앱타머의 TET 및 TET Analogue에 대한 결합곡선을 도 6에 제시하였다.

[표 2]. 7 종의 앱타머의 해리상수 값

실시예 8. 7종의 DNA 앱타머의 TET 및 TET Analogue 결합 특이성 확인

TET 및 TET Analogue 앱타머가 TET 및 TET Analogue에만 특이적으로 결합하는 것을 보여주기 위한 대조군으로 DCF(Diclofenac)이 사용되었다. 또한 이미 실시예 4에서 2번째의 selection 다음에 에탄올아민으로 count selection을 실시하였으므로 비특이적인 결합이 거의 없음을 확신할 수 있었다. 그럼에도 TET 및 TET Analogue에 강하게 결합하는 앱타머가 다른 화학물질에는 결합하지 않고 오직 TET 및 TET Analogue에만 특이적으로 결합한다는 것을 보여주는 실험을 실시하였다.

먼저 각각의 TET, OTC, DOX와 DCF를 자성 비드에 고정하였다. 동시에 각각의 케미컬이 고정된 자성비드와 6 종의 TET Analogues 앱타머(T7, T15, T19, T22, T23, T24)를 각각 혼합하여 버퍼용액(20 mM Tris-Cl buffer pH 7.6 contained 100 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2 and 0.02% Tween 20)에 넣고 상온에서 30 분간 반응시킨 후 자석을 이용하여 자성비드를 분리시키고 결합하지 않은 앱타 머가 포함된 버퍼용액을 따로 취한 후 spectrophotometer로 DNA를 측정하여 각각의 케미컬과 앱타머의 결합을 계산하였다. 그 결과, TET와 그 아날로그인 OTC, DOX에 대한 6 종의 앱타머의 결합력은 뚜렷한 반면에 DCF에는 6 종의 앱타머에서 모두 전혀 반응하지 않는 것으로 확인이 되었다. 이를 통해 6 종의 앱타머[서열번호 No.6(T7), No.9(T15), No.12(T19), No.15(T22), No.16(T23), 및 No.17(T24)]가 모두 TET Analogues에 특이적으로 결합하는 것을 증명하였다(도 7).

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 테트라사이클린 및 그 유사체인 옥시테트라사이클린과 독시사이클린 모두에 특이적으로 결합 가능한 DNA 앱타머를 이용하여 물 또는 식품 등에 존재하는 극미량의 잔류 항생물질을 보다 민감하게 검출할 수 있다.

또한 본 발명의 DNA 앱타머를 포함하는 항생물질 제거방법 및 장치에 이용하여 극소량의 항생물질이 포함되어 있는 시료에서 타겟물질만을 선택적으로 제거할 수 있다. 따라서 식품 또는 환경에 존재하는 극소량의 항생물질로 인한 항생제 내성 박테리아의 발생 및 생물농축현상 등으로부터 인간을 보호하는 데 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 테트라사이클린 및 그 유도체의 화학구조를 나타낸다.

도 2는 테트라사이클린 및 그 유도체에만 특이적으로 결합하는 핵산 구조체를 개발하는 방법을 모식화한 것이다.

도 3은 각각의 선별(selection)에서 테트라사이클린 또는 그 유사체가 고정된 자성비드에서부터 용리된 ssDNA의 퍼센트를 나타낸다.

도 4는 각각의 선별(selection)에서 OTC(oxytetracycline), TET(tetracycline)이 고정된 자성비드에서부터 용리된 ssDNA의 퍼센트를 나타낸다.

도 5는 테트라사이클린 또는 그 유사체에 결합 특이적인 21 종의 핵산 구조체 앱타머의 염기서열을 m-fold program을 이용하여 예측한 2차 구조 모식도이다.

도 6는 테트라사이클린 또는 그 유사체와 본 발명의 7 종의 앱타머의 결합곡선을 나타낸다.

도 7은 본 발명의 앱타머가 OTC(oxytetracycline), TET(tetracycline), 및 DOX(Doxycycline)에 특이적으로 결합하고, 비슷한 구조를 갖는 다른 화학물질에 대해서는 친화도가 없음을 보여주는 그래프이다.

<110> Korea University Industry and Academy Cooperation Foundation <120> twenty one Single-stranded DNA aptamers having high affinity to tetracycline and it's analogues with high specificity and production method thereof <160> 21 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 1 cgtacggaat tcgctagcac agcgggcgta gttggggggg ccggtacctg ggcggtgtgg 60 atccgagctc cacgtg 76 <210> 2 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 2 cgtacggaat tcgctagccc atacggcacg acggatcaca taacgccctt gtgtgggtgg 60 atccgagctc cacgtg 76 <210> 3 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 3 cgtacggaat tcgctagcgg gacgtgcgtg atgtgtgtgt ggtccggtgt gtgctgtggg 60 atccgagctc cacgtg 76 <210> 4 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 4 cgtacggaat tcgctagccc gcgggtgacg gacgtagggg agcatctagt tgggtggtgg 60 atccgagctc cacgtg 76 <210> 5 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 5 cgtacggaat tcgctagcgg gcggggtgcg tacgtagctg atgctcaggc tggggtgtgg 60 atccgagctc cacgtg 76 <210> 6 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 6 cgtacggaat tcgctagcgg gcagcggtgg tgtggcggga tctggggttg tgcggtgtgg 60 atccgagctc cacgtg 76 <210> 7 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 7 cgtacggaat tcgctagccc acggcgtgtc cggtcatgtg ggatgagtgt tgtggtgggg 60 atccgagctc cacgtg 76 <210> 8 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 8 cgtacggaat tcgctagccg ggcgggcgag ggggtggtag ttgtgctcac ggtggggtgg 60 atccgagctc cacgtg 76 <210> 9 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 9 cgtacggaat tcgctagcgg aggaacgggt tccagtgtgg ggtctatcgg ggcgtgcggg 60 atccgagctc cacgtg 76 <210> 10 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 10 cgtacggaat tcgctagcgg cgcggtgtat gacaaagcga ggtcgtggcg tgcggtgtgg 60 atccgagctc cacgtg 76 <210> 11 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 11 cgtacggaat tcgctagcgg gcggggatgt gatcggtcct ggggttgggt cgtgtggtgg 60 atccgagctc cacgtg 76 <210> 12 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 12 cgtacggaat tcgctagccg ggagggcggg gtgtggtatg tattgagcgt ggtccgtggg 60 atccgagctc cacgtg 76 <210> 13 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 13 cgtacggaat tcgctagccc cccggcaggc cacggcttgg gttggtccca ctgcgcgtgg 60 atccgagctc cacgtg 76 <210> 14 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 14 cgtacggaat tcgctagcgg gcggcacacc ggtggtcgca ctatcaggtg ttggtgcggg 60 atccgagctc cacgtg 76 <210> 15 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 15 cgtacggaat tcgctagcgg gcggacgcta ggtggtgatg ctgtgctaca cgtgttgtgg 60 atccgagctc cacgtg 76 <210> 16 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 16 cgtacggaat tcgctagcgg gggcacacat gtaggtgctg tccaggtgtg gttgtggtgg 60 atccgagctc cacgtg 76 <210> 17 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 17 cgtacggaat tcgctagcgg gcgggggtgc tgggggaatg gagtgctgcg tgctgcgggg 60 atccgagctc cacgtg 76 <210> 18 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 18 cgtacggaat tcgctagccc atcgggacnt gtcngtngtg gggccaaggt accggggggg 60 atccgagctc cacgtg 76 <210> 19 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 19 cgtacggaat tcgctagcgg gccctgggga ggtagcgggg gtcatgtggc gatgtgcggg 60 atccgagctc cacgtg 76 <210> 20 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 20 cgtacggaat tcgctagcgg ggggggcacc atnntagggg accnatgcgt gtgntggtgg 60 atccgagctc cacgtg 76 <210> 21 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 21 cgtacggaat tcgctagccg gggttgtgac cgggtgtggc acgaggtgat gcgtgtgtgg 60 atccgagctc cacgtg 76

Claims

테트라사이클린(tetracycline), 옥시테트라사이클린(Oxytetracycline) 및 독시사이클린(doxycycline) 모두에 특이적으로 결합 가능하고, 서열번호 1 내지 서열번호 21 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 DNA 앱타머.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
테트라사이클린, 옥시테트라사이클린 및 독시사이클린 모두에 특이적으로 결합 가능하고 서열번호 1 내지 서열번호 21 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 DNA 앱타머를 포함하는 테트라사이클린, 옥시테트라사이클린 및 독시사이클린 검출용 조성물.
삭제