KR20180052991A

KR20180052991A - 살모넬라 타이피뮤리움 생균의 표면에 특이적으로 결합하는 dna 앱타머 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20180052991A
Application number: KR1020160150242A
Authority: KR
Inventors: 김양훈; 김서경; 이경아; 조성진
Original assignee: 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2016-11-11
Filing date: 2016-11-11
Publication date: 2018-05-21
Also published as: KR101891406B1

Abstract

본 발명은 살모넬라 타이피뮤리움의 표면에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머, 이를 이용한 살모넬라 타이피뮤리움의 검출 및 살모넬라 타이피뮤리움에 의한 살모넬라증 진단에 관한 것이다. 본 발명의 DNA 앱타머는 살모넬라증의 원인균인 살모넬라 타이피뮤리움 생균의 표면에 특이적으로 결합하는 특성을 가진다. 본 발명의 DNA 앱타머를 이용하여 생물학적 시료 내에서 살모넬라 타이피뮤리움 생균의 존재 여부를 확인할 수 있으며, 이를 통해 살모넬라증을 진단에 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 DNA 앱타머 기능성 소재는 살모넬라증의 진단에 사용되고 있는 기존의 PCR 방법과 같은 분자생물학적 진단 방법을 대체할 수 있으며, 신속하고 경제적인 방법으로 진단할 수 있는 효과가 있다.

Description

살모넬라 타이피뮤리움 생균의 표면에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 이의 용도{DNA Aptamer Specifically Binding to Surface of Living Cell of Salmonella typhimurium and Uses Thereof}

본 발명은 살모넬라 타이피뮤리움의 표면에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머, 이를 이용한 살모넬라 타이피뮤리움의 검출방법 및 살모넬라 타이피뮤리움에 의한 살모넬라증 진단에 관한 것이다.

식중독이란 병원성 미생물이나 독성 화학물질, 또는 오염된 식품을 섭취한 후 단시간 내에 갑작스럽게 발생되는 질환을 말하며, 구토, 오심, 복통, 설사 등을 동반하며 특히 위장에 이상을 일으킨다. 특히 세균성 식중독은 환경과 밀접한 관계가 있으며 환경 위생상태가 불량한 조건 하에서는 전염병 못지않게 문제가 되고 있다. 세균성 식중독은 세균 자체에 의해 증상을 일으키는 감염형과 식품에 들어온 세균이 분비하는 독소에 기인한 독소형으로 분류된다. 감염형 식중독을 일으키는 원인세균으로는 살모넬라속균, 장염비브리오, 장구균 등이 있다. 살모넬라 식중독은 살모넬라 타이피뮤리움 (Salmonella typhimurium), 살모넬라 엔테리티디스 (Salmonella enteritidis), 살모넬라 콜레라수이스 (Salmonella cholerasuis) 등과 같은 균에 의하여 발병한다. 살모넬라증은 살모넬라균 속의 세균에 의하여 발생하는 질병으로 장티푸스와 같은 증세를 나타내는 패혈증형과 식중독인 급성 위장염형으로 대별된다. 살모넬라 식중독은 대개 6~48시간 (평균 12~14시간)의 잠복기를 거친 후에 경련성 복통, 설사, 구토 등의 위장염 증상을 나타내지만 다른 식중독과 달리 발열 증상을 보이는 것이 특징이다.

살모넬라 타이피뮤리움은 전 세계에 널리 분포하고 있는 균종으로, 사람을 비롯하여 소, 말, 양, 개, 가금, 설치류 및 조류 등 다양한 숙주에 감염되어 장염, 패혈증, 유산 및 폐렴을 일으키며, 사람에서 식품을 매개로 한 살모넬라감염증의 가장 중요한 원인체로서 공중보건학적으로 매우 중요시되고 있다.

또한 살모넬라균은 다양한 가축 및 동물 등에 오염될 수 있으며 오염된 동물이나 사람과의 직접적 접촉 또는 이들의 분변에 의해 오염된 환경에서 전염될 수 있다. 살모넬라균에 의한 가축 감염 시 식욕부진, 발열, 악취가 있는 황색 설사변 또는 점혈변이 특징이며 그밖에도 유연, 유루, 기침, 관절의 종창, 신경증상을 보인다. 살모넬라 감염증의 임상증상이 다른 원인에 의한 질병과 유사하기 때문에 감별진단이 필요하며 이 과정에서 시간이 오래 걸린다는 단점이 있다.

살모넬라 타이피뮤리움을 진단하기 위해서는 먼저 살모넬라 속 균의 분리 및 동정이 선행되어야 한다. 또한 리포폴리사카라이드 (lipopolysaccharide, O 항원)와 플라젤라 항원 (flagella antigen, H 항원)을 이용하여 2,500여 혈청형 구분을 위한 검사가 이루어져야 한다. 전통적인 배양 방법은 증식배양, 선택배양 및 생화학검사에 3~5일의 분석시간과 복잡한 절차가 요구되며, 이 때문에 식중독 사고 발생 이후 식중독 원인균을 분리 및 동정할 목적으로 사용될 뿐 조기에 세균을 검출하여 식중독을 차단하는 것은 매우 어렵다. 또한, 혈청형을 동정하기 위해서는 항원에 대한 인자 혈청을 이용한 응집 반응법이 이용되고 있고, 다른 방법으로 whole cell, LPS 및 OPMP 항원을 이용한 ELISA 기법은 유용하고 시간을 절약할 수 있으나 다른 균종과의 교차반응으로 인한 위양성 반응이 흔하기 때문에 특이성에서 문제가 되고 있다.

최근 살모넬라 타이피뮤리움의 신속한 진단을 위해서 PCR, plasmid profile, southern blot hybridization 기법을 기초로 한 분자유전학적 분석 및 제한효소 처리에 의한 DNA의 절단 양상 등을 분석하여 역학관계를 규명하고 있지만, 검출 효율을 높이기 위해서 샘플 내 DNA 추출 과정 및 단백질 추출 과정 등의 샘플 전처리 과정이 필요하고 결과를 분석하기 위한 고가의 분석 장비가 필요하기 때문에 현장검사로의 응용이 어렵다는 단점을 가지고 있다.

따라서 식생활 패턴의 변화에 기인한 외식의 증가와 가공 농산물의 대규모 유통으로 인한 식중독 사고의 방지와 오염된 농산물의 회수에 따른 막대한 비옹의 낭비를 막기 위해서는 기존 분석방법의 단점을 보완할 수 있으며 대규모의 시료를 정확하고 빠르게 처리할 수 있는 고효율 검출 시스템 개발 필요성이 절실히 요구되는 실정이나 아직까지 그에 대한 연구가 미미하다.

대한민국 특허등록 제10-1247972호

이에 본 발명자들은 상기와 같은 살모넬라 타이피뮤리움 검출 기법의 문제점들을 해결하고 보안하기 위하여 본 발명자들은 온도와 pH 등 환경에 안정적인 앱타머 소재를 사용하여 살모넬라 타이피뮤리움을 빠르고 간편하게 검출할 수 있는 진단용 물질을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 살모넬라 타이피뮤리움 (Salmonella typhimurium) 생균의 표면에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기의 DNA 앱타머를 선별하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 DNA 앱타머를 포함하는, 살모넬라 타이피뮤리움 검출용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 DNA 앱타머를 포함하는, 살모넬라 타이피뮤리움 검출용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 DNA 앱타머를 시료와 반응시키는 단계를 포함하는, 살모넬라 타이피뮤리움 검출 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 DNA 앱타머를 포함하는, 살모넬라 타이피뮤리움에 의한 살모넬라증 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 DNA 앱타머를 포함하는, 살모넬라 타이피뮤리움에 의한 살모넬라증 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 DNA 앱타머를 시료와 반응시키는 단계를 포함하는, 살모넬라 타이피뮤리움에 의한 살모넬라증을 진단하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 살모넬라 타이피뮤리움 (Salmonella typhimurium) 생균의 표면에 특이적으로 결합하는, 서열번호 1 내지 서열번호 24로 이루어진 군에서 선택되는 염기서열로 이루어진 DNA 앱타머를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 DNA 앱타머는 표지물질을 더 포함하여 구성될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 표지물질은 형광물질, 바이오틴, 스트렙트아비딘, 아민기, 바이오틴 및 는 티올기로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 표지물질이 상기 DNA 앱타머의 5'말단 또는 3'말단에 표지될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 DNA 앱타머는 상기 DNA 앱타머를 구성하는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 리보스 2' 위치의 하이드록시기가 수소원자, 불소원자, -OR, -COOR 및 아미노기로 이루어진 군 중 어느 하나로 치환될 수 있다.

또한, 본 발명은 PCR을 통해 랜덤 dsDNA (double strand DNA) 라이브러리를 증폭하는 단계; 상기 랜덤 dsDNA 라이브러리로부터 비대칭(asymmetric) PCR을 통해 ssDNA (single strand DNA) 앱타머를 증폭하는 단계; 및 상기 증폭된 ssDNA 앱타머를 살모넬라 타이피뮤리움 생균과 반응시켜 Cell-SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) 기법을 통해 살모넬라 타이피뮤리움 생균 표면에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 선별하는 단계를 포함하는, 상기 DNA 앱타머를 선별하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 DNA 앱타머를 포함하는, 살모넬라 타이피뮤리움 검출용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 DNA 앱타머를 포함하는, 살모넬라 타이피뮤리움 검출용 키트를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 키트는 DNA 앱타머가 기판 상에 고정화된 마이크로어레이 형태일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 DNA 앱타머를 시료와 반응시키는 단계를 포함하는, 살모넬라 타이피뮤리움 검출 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 DNA 앱타머를 포함하는, 살모넬라 타이피뮤리움에 의한 살모넬라증 진단용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 DNA 앱타머를 포함하는, 살모넬라 타이피뮤리움에 의한 살모넬라증 진단용 키트를 제공한다.

나아가 본 발명은 상기 DNA 앱타머를 시료와 반응시키는 단계를 포함하는, 살모넬라 타이피뮤리움에 의한 살모넬라증을 진단하는 방법 또는 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.

본 발명의 DNA 앱타머는 살모넬라증의 원인균인 살모넬라 타이피뮤리움 생균의 표면에 특이적으로 결합하는 특성을 가진다. 본 발명의 DNA 앱타머를 이용하여 생물학적 시료 내에서 살모넬라 타이피뮤리움 생균의 존재 여부를 확인할 수 있으며, 이를 통해 살모넬라증을 진단에 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 DNA 앱타머 기능성 소재는 살모넬라증의 진단에 사용되고 있는 기존의 PCR 방법과 같은 분자생물학적 진단 방법을 대체할 수 있으며, 신속하고 경제적인 방법으로 진단할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 랜덤 DNA 앱타머를 PCR 기법을 이용하여 증폭한 결과와 PCR 기법을 통하여 제작한 dsDNA를 비대칭 PCR 및 스트렙트아비딘 (streptavidin)을 이용하여 회수한 ssDNA을 10% 아크릴아마이드 겔 전기영동을 통하여 비교하여 확인한 결과이다.
레인 M: 100 bp DNA 마커
레인 1: DNA 앱타머로부터 PCR 기법을 통하여 증폭된 dsDNA 결과
레인 2: PCR 기법으로 확보한 dsDNA를 비대칭 PCR 기법과 스트렙트아비딘을 이용하여 제작한 ssDNA 결과
도 2는 살모넬라 타이피뮤리움 생균의 표면에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 제작을 위한 Whole-cell SELEX 과정을 나타낸 것이다.
도 3은 살모넬라 타이피뮤리움 생균의 표면에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 제작을 위하여 실시한 각 SELEX 라운드에서 회수된 살모넬라 타이피뮤리움 생균 표면 결합 DNA 앱타머의 농도를 나노드랍을 이용하여 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 네가티브 선별 (negative selection) 이후에 실시한 8 라운드, 9 라운드, 10 라운드에서 용리된 살모넬라 타이피뮤리움 생균 표면 결합 DNA 앱타머를 이용하여 실시간 PCR을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 살모넬라 타이피뮤리움 생균 표면 결합 DNA 앱타머 제작을 위한 SELEX 과정 후 선별된 라운드에서 확보한 살모넬라 타이피뮤리움 생균 표면 결합 DNA 앱타머 후보군들의 용리액을 나노드랍을 이용하여 정량적으로 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 살모넬라 타이피뮤리움 생균 표면 결합 DNA 앱타머 STA_13과 STA_40의 2차 구조를 나타낸 도면이다.
도 7은 스트렙트아비딘이 코팅된 센서 칩 SA 표면에 살모넬라 타이피뮤리움 생균 표면 결합 DNA 앱타머를 고정시킨 후 살모넬라 타이피뮤리움 생균을 결합시키는 과정을 나타낸 도면이다.
도 8은 살모넬라 타이피뮤리움 생균의 표면에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 이용한 진단 키트의 모식도를 나타낸 도면이다. [a]는 살모넬라 타이피뮤리움 표면 결합 DNA 앱타머를 내장한 살모넬라증 진단 키트의 모식도이며, [b]는 살모넬라 타이피뮤리움을 포함하고 있을 것으로 의심되는 시료를 살모넬라 타이피뮤리움 생균 표면 결합 DNA 앱타머를 내장하고 있는 살모넬라증 진단 키트와 반응하였을 때, 샘플 내 살모넬라 타이피뮤리움과 살모넬라 타이피뮤리움 생균 표면 결합 DNA 앱타머의 결합에 의해 살모넬라증을 진단하는 시스템을 나타낸 모식도이다.

본 발명자들은 기존의 살모넬라 타이피뮤리움 균의 검출 방법보다 더욱 정확하고 신속하며 간단한 검출 방법을 개발하기 위하여, 살모넬라 타이피뮤리움 생균의 표면에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 개발하였다. 본원에서 제공하는 DNA 앱타머는 타 균주에는 결합하지 않고 살모넬라 타이피뮤리움 생균 표면에 특이적으로 결합하므로, 종래 살모넬라 타이피뮤리움로 인한 살모넬라증 또는 식중독 진단 기술로 사용 가능하다.

따라서, 본 발명은 살모넬라 타이피뮤리움 (Salmonella typhimurium) 생균의 표면에 특이적으로 결합하는, 서열번호 1 내지 서열번호 24로 이루어진 군에서 선택되는 염기서열로 이루어진 DNA 앱타머에 관한 것이다.

본 발명에서, 상기 DNA 앱타머 (Aptamer) 란 표적으로 한 물질에 높은 친화력과 특이성을 가지는 단일가닥의 DNA 또는 RNA를 말한다. 본 발명의 목적상, DNA 앱타머는 살모넬라 타이피뮤리움 (Salmonella typhimurium) 생균의 표면에 특이적으로 결합하는 앱타머일 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 DNA 앱타머는 서열번호 1 내지 서열번호 24의 염기서열 중 적어도 하나의 염기서열을 가질 수 있다. 또한, 상기 서열과 상보적인 서열도 본 발명의 범위 내에 포함될 수 있다. 또한, 상기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함될 수 있다. 변이체는 염기 서열은 변화되지만, 서열번호 1 내지 서열번호 24의 염기 서열과 유사한 기능적 특성을 갖는 염기 서열일 수 있다. 구체적으로, DNA 앱타머 유전자는 서열번호 1 내지 서열번호 24의 염기 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다.

폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 DNA 앱타머는 단일가닥 DNA일 수 있다. 단일가닥 DNA 앱타머는 3차 구조를 형성하여 살모넬라 타이피뮤리움 생균의 표면에 결합할 수 있다.

상기 DNA 앱타머는 전형적으로는 타겟 분자의 결합에 대한 시험관내 선택법에 의해 얻을 수 있다. 타겟 분자에 특이적으로 결합하는 앱타머를 선택하는 방법은 당분야에서 공지되어 있다. 예를 들어, 유기 분자, 뉴클레오타이드, 아미노산, 폴리펩타이드, 세포 표면상의 마커분자, 이온, 금속, 염, 다당류가 각 리간드에 특이적으로 결합할 수 있는 앱타머를 분리하는 적절한 타겟 분자가 될 수 있다. 앱타머의 선별은 SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) 방법으로 공지된 생체 내 또는 시험관내 선택 기술을 이용할 수 있다(Ellington et al., Nature 346, 818-22, 1990; 및 Tuerk et al., Science 249, 505-10, 1990). 본원에서 "SELEX 방법"이란 임의적으로 합성된 DNA의 집합에서 특정 분자에 대해 높은 결합력을 지니는 DNA를 선별하여 증폭시킴으로써 해당 분자의 DNA 결합 서열을 알아내는 방법을 의미한다(Louis et al. 1992. Nature 355, 564-566).

일 예로, 본 발명은 (a) PCR을 통해 랜덤 dsDNA (double strand DNA) 라이브러리를 증폭하는 단계, (b) 상기 랜덤 dsDNA 라이브러리로부터 비대칭(asymmetric) PCR을 통해 ssDNA (single strand DNA) 앱타머를 증폭하는 단계, 및 (c) 상기 증폭된 ssDNA 앱타머를 살모넬라 타이피뮤리움 생균과 반응시켜 Cell-SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) 기법을 통해 살모넬라 타이피뮤리움 생균 표면에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 선별하는 단계를 포함하는, DNA 앱타머의 선별 방법에 관한 것이다.

단계 (a)는 DNA 앱타머 선별 방법의 첫번째 단계로, PCR을 이용하여 랜덤 dsDNA 라이브러리를 증폭하는 것이다.

단계 (b)는 PCR을 이용하여 증폭한 dsDNA 중 ssDNA 만을 증폭하기 위해 비대칭(asymmetric) PCR을 수행하는 것이다. 일 구현예로, 비대칭 PCR은 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 10 : 2 비율, 예를 들면, 동일한 농도 (25 uM)에서 정방향 프라이머를 10 ㎕, 역방향 프라이머 2 ㎕를 이용하여 PCR을 수행함으로써 단일가닥 DNA를 수득할 수 있다. ssDNA 앱타머를 선별하는 방법은, 예를 들면, PCR 수행 시 역방향 프라이머에 바이오틴을 부착시켜 dsDNA를 증폭하고, 증폭 산물의 3'에 스트렙트아비딘을 처리하여 바이오틴-스트렙트아비딘 복합체를 형성하여 복합체를 선택적으로 제거함으로써 바이오틴이 결합되지 않은 반대쪽의 ssDNA 앱타머 만을 수득할 수 있다. 수득한 ssDNA 앱타머는 SELEX 방법에 사용하기 위해 ssDNA를 가열하여 변성시킨 후 상온에서 천천히 식혀 3차원 구조를 형성시킬 수 있다.

단계 (c)는 상기 ssDNA 앱타머를 살모넬라 타이피뮤리움 생균과 서로 접촉하여 반응시킨 후, Cell-SELEX 기법을 통해 살모넬라 타이피뮤리움 생균 표면에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 선별하는 것이다. 살모넬라 타이피뮤리움은 생균 상태를 유지하기 위해 적절히 배양될 수 있다. 살모넬라 타이피뮤리움 생균 표면에 결합하지 않는 ssDNA 앱타머는 세척하여 제거하고 특이적으로 결합하는 ssDNA만을 용출시킬 수 있다. 또한, 이 단계에서 살모넬라 타이피뮤리움 균이 아닌 다른 세균에 결합하는 ssDNA를 제거하는 Negative SELEX 단계를 포함할 수 있다.

살모넬라 타이피뮤리움 생균을 이용한 Cell-SELEX 기법의 일 구현예로, 살모넬라 타이피뮤리움 균을 배양하는 단계, 살모넬라 타이피뮤리움의 표면을 세척하는 단계, 살모넬라 타이피뮤리움와 DNA 앱타머를 결합시키는 단계, 살모넬라 타이피뮤리움와 반응성이 있는 살모넬라 타이피뮤리움 표면 결합 DNA 앱타머 만을 회수하는 단계를 SELEX 의 한 라운드로 하여, 최적 특이성 (specificitiy)와 친화성 (affinity)을 갖는 SELEX 라운드를 선별하는 과정을 포함할 수 있다.

최적 SELEX 라운드의 선별 과정은, 나노드랍을 통한 정량화 및 실시간 PCR를 통한 최적 SELEX 라운드 선별 단계, 선별된 라운드에서 최적의 살모넬라 타이피뮤리움 표면 결합 DNA 앱타머 후보군을 확보하기 위하여 앱타머 풀을 클로닝하여 DNA 앱타머 후보군 각 앱타머 서열을 결정하는 단계를 포함할 수 있다.

또한, 확보된 살모넬라 타이피뮤리움 표면 결합 DNA 앱타머 후보군 중 최적 결합을 보이는 앱타머의 선별을 위하여 SELEX을 재진행 후 회수된 ssDNA 앱타머의 농도를 나노드랍 측정하여 선별하는 단계, 선별된 살모넬라 타이피뮤리움 표면 결합 DNA 앱타머 후보군의 5'에 바이오틴을 표지하는 단계, 표지된 살모넬라 타이피뮤리움 표면 결합 DNA 앱타머 후보군의 살모넬라 타이피뮤리움와의 친화력을 확인하기 위한 스트렙트아비딘 (streptavidin)이 코팅된 센서 칩 SA에 바이오틴이 표지된 앱타머를 처리하여 결합시키는 단계, 스트렙트아비딘-바이오틴 결합을 통해 센서칩에 고정된 앱타머에 살모넬라 타이피뮤리움을 부착시켜 살모넬라 타이피뮤리움에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 선별하는 단계를 포함할 수 있다. 스트렙트아비딘으로 코팅된 센서 칩은 SA 센서 칩 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이러한 방법에 의하여, 본 발명에서는 살모넬라 타이피뮤리움 생균 표면 결합 DNA 앱타머 서열 24개를 확보할 수 있었으며, 이를 각각 서열번호 1 내지 24에 나타내었다. 본 발명의 DNA 앱타머는 살모넬라 타이피뮤리움 생균 표면에 특이적으로 결합하므로, 살모넬라 타이피뮤리움 균에 의하여 유발되는 살모넬라증을 진단하는데 유용하게 사용될 수 있다.

따라서, 또 하나의 양태로, 본 발명은 상기 DNA 앱타머를 포함하는, 살모넬라 타이피뮤리움 검출용 조성물에 관한 것이다.

또 하나의 양태로, 본 발명은 상기 DNA 앱타머를 포함하는, 살모넬라 타이피뮤리움 검출용 키트에 관한 것이다.

또 하나의 양태로, 본 발명은 상기 DNA 앱타머를 시료와 반응시키는 단계를 포함하는, 살모넬라 타이피뮤리움의 검출 방법에 관한 것이다.

또 하나의 양태로, 본 발명은 상기 DNA 앱타머를 포함하는, 살모넬라 타이피뮤리움에 의한 살모넬라증 진단용 조성물에 관한 것이다.

또 하나의 양태로, 본 발명은 상기 DNA 앱타머를 포함하는, 살모넬라 타이피뮤리움에 의한 살모넬라증 진단용 키트에 관한 것이다.

또 하나의 양태로, 본 발명은 살모넬라 타이피뮤리움 생균의 표면에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 시료와 반응시키는 단계를 포함하는, 살모넬라 타이피뮤리움에 의한 살모넬라증을 진단하는 방법에 관한 것이다.

본원에서 '진단' 이란 특정 질병 또는 질환에 대한 한 개체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 개체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 개체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 개체의 상태를 모니터링 하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명의 목적상, 진단은 살모넬라 타이피뮤리움에 의한 살모넬라증의 존재 또는 특징을 확인하는 것일 수 있다.

본 발명의 진단용 조성물은 앱타머의 구조 또는 생리 활성을 안정하게 유지시키는 완충액 또는 반응액을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 안정성을 유지하기 위해, 분말 상태 또는 적절한 완충액에 용해된 상태로 제공될 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면, 키트는 DNA 앱타머가 기판 상에 고정화된 형태일 수 있으며, 예를 들어, 마이크로어레이 형태일 수 있다. DNA 앱타머를 기판 상에 고정화시키는 것은 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다.

마이크로어레이 기판의 특정의 영역에 DNA 핵산 물질이 고밀도로 부착된 어레이(배열)를 의미한다. 마이크로어레이의 기판은, 적합한 견고성 또는 반-견고성을 갖는 지지체를 의미하며, 예컨대, 유리, 막(membrane), 슬라이드, 필터, 칩, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 DNA 앱타머는 상기 기판상에 배열되고 고정화될 수 있다. 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시될 수 있다. 예를 들어, DNA 앱타머는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 유리 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 DNA 앱타머는 링커 (예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기판에 결합될 수 있다. 본 발명의 DNA 앱타머는 예를 들어, 비오티닐화될 수 있고, 이는 스트랩트아비딘이 코팅된 기판상에 성공적으로 결합될 수 있다.

일 구현예로, 본 발명은, DNA 앱타머의 5' 위치에 바이오틴을 결합 시키는 단계, 이를 스트렙트아비딘이 고정된 센서 칩에 결합시키는 단계, 스트렙트아비딘과 바이오틴 결합으로 DNA 앱타머가 고정된 센서 칩 표면에 살모넬라 타이피뮤리움을 부착시키는 단계를 포함하는, 살모넬라 타이피뮤리움 표면 결합 DNA 앱타머가 고정된 센서 칩 제작 방법 및 살모넬라 타이피뮤리움 검출 방법을 제공한다.

살모넬라 타이피뮤리움의 검출은 DNA 앱타머와 살모넬라 타이피뮤리움의 복합체 검출에 의해 달성될 수 있으며, 복합체의 검출을 용이하게 하기 위해 DNA 앱타머가 형광물질, 예를 들어 플루오레세인(fulorescein), Cy3 또는 Cy5, 방사성물질, 또는 화학물질(예, 바이오틴)으로 표지될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 DNA 앱타머는 살모넬라 타이피뮤리움의 표면에 특이적으로 결합하는 성질을 가지므로 살모넬라 타이피뮤리움의 검출을 가능하게 할 수 있으며, 나아가 살모넬라 타이피뮤리움에 의해 유발되는 살모넬라증을 진단하는데 유용하다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

DNA 앱타머 풀의 제작

<1-1> PCR 기법을 활용한 랜덤 DNA 라이브러리 증폭

살모넬라 타이피뮤리움에 특이적으로 결합하는 단일 가닥의 DNA 앱타머를 제작하기 위하여 양 말단에 앱타머 풀을 쉽게 증폭하기 위한 부위로서 5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATT 의 부위와 3'-AGATAGTAAGTGCAATCT를 구성하고, 중심에는 40개의 랜덤 서열을 dA : dG : dC : dT = 1.5 : 1.15 : 1.25 : 1 비율로 포함하고 있는 100 bp의 주형 DNA (5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATT-N40-AGATTGCACTTACTATCT-3'; 서열목록 제 25 서열)와 이를 100 bp로 증폭할 수 있는 세 개의 프라이머를 바이오니아(Bioneer, Korea)에 주문 제작하였다. [정방향 프라이머: 5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATT-3' (서열목록 제 26 서열), 역방향 프라이머: 5'-AGATTGCACTTACTATCT-3' (서열목록 제 27 서열), 비오티닐화된 (biotinylated) 역방향 프라이머: 5'-비오틴-AGATTGCACTTACTATCT-3' (서열목록 제 28 서열)].

합성한 프라이머 및 40개의 연속 무작위 서열을 가지는 임의의 DNA 라이브러리는 PCR 기법을 이용하여 증폭하였다. 100 bp DNA 라이브러리의 증폭을 위한 PCR 반응 조성으로는 증류수 35.7 ㎕, 10X PCR 완충용액 5 ㎕, 각 2.5 mM dNTP 혼합물 4 ㎕, 10 pM 정방향 프라이머 2 ㎕, 10 pM 바이오티닐화된 역방향 프라이머 2 ㎕, 주형 DNA 1 ㎕와 Ex Taq 중합효소 (Takara, Japan) 0.3 ㎕ (1 unit/㎕)로 이루어져 있다. PCR 반응 조건은 우선 95℃에서 4분간 변성시키고, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 그리고 72℃에서 30초간 반응을 20주기 반복한 후, 72℃에서 7분간 추가로 신장시키는 반응을 이용하였다. PCR 반응 후 4 ㎕를 취하여, 2% 아가로스 겔 전기영동을 이용하여 100 bp에서 밴드가 나타나는지 확인하였다. PCR을 통하여 확보된 DNA 라이브러리는 PCR 정제 키트 (Qiagen, USA)를 이용하여 정제한 후 증류수 50 ㎕를 이용하여 회수하였다.

<1-2> 비대칭 PCR (asymmetric PCR ) 기법을 활용한 ssDNA 제작

PCR 기법과 PCR 정제 키트를 이용하여 확보한 PCR 산물로부터 ssDNA만을 증폭하기 위하여 비대칭 PCR을 수행하였다. 비대칭 PCR 반응 조성은 획득한 주형 DNA 5 ~ 10 ㎕, 10X PCR 완충용액 10 ㎕, 10 mM dNTP 혼합물 8 ㎕, 10 pM 정방향 프라이머 10 ㎕, 10 pM 바이오티닐화된 역방향 프라이머 1 ㎕, Ex Taq 중합효소 0.5 ㎕ (1 unit/㎕)와 55.5 ~ 65.5 ㎕의 증류수로 이루어져 있다. 비대칭 PCR 반응 조건은 우선 95℃에서 4분간 변성시키고, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 그리고 72℃에서 30초간 반응을 15 cycle을 반복한 후, 72℃에서 7분간 추가 신장시키는 반응을 이용하였다. PCR 반응 후 PCI 및 에탄올 침전법을 활용하여 증류수 50 ㎕에 DNA를 녹여 회수하였다.

<1-3> ssDNA 의 선별 및 회수

비대칭 PCR 기법을 이용하여 확보된 ssDNA 산물 중 바이오틴 (biotin)이 결합되어 있는 ssDNA와 잔여 프라이머(primer)를 제거하고 순수한 정방향의 ssDNA만을 확보하기 위하여, 상기 실시예 <1-2>에서 획득한 50 ㎕의 반응액에 추가로 증류수 50 ㎕를 첨가한 후, 스트렙트아비딘 아가로스 레진 (streptavidin agarose resin, Thermo scientific, USA) 50 ㎕를 첨가하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다.

반응액에서 순수한 ssDNA 앱타머 풀을 회수하기 위하여 반응액을 4℃, 13,000 rpm의 원심분리기를 이용하여 15분간 원심분리한 후, 상층액만을 회수하여 동일 부피의 PCI (phenol : chloroform : isoamylalcohol = 25 : 24 : 1) 용액을 처리하고 강하게 교반한 다음 4℃에서 13,000 rpm으로 15분간 원심분리하여 상층액만을 회수하였다. 상층액에 1/100 부피의 tRNA (sigma aldrich, USA), 1/10 부피의 3 M 소듐 아세테이트 (sodium acetate, pH 4.5)와 3 부피의 100％ 에탄올을 첨가하여 -70℃에서 3시간 이상 반응시켰다. 반응 후에는 4℃에서 13,000 rpm으로 20분간 원심분리하여 ssDNA만을 회수하였다. 회수한 ssDNA는 65℃에서 건조시킨 후, 50 ㎕의 증류수에 녹였다. 회수한 ssDNA 중 10 ㎕를 취하여 10% 아크릴아마이드 겔을 이용하여 dsDNA와 비교하여 정확한 크기의 밴드가 나타나는지 확인하였다 (도 1 참고).

<1-4> ssDNA 앱타머의 구조 제작

상기 실시예 <1-3>을 통하여 확보한 ssDNA 앱타머 40 ㎕에 증류수 10 ㎕를 첨가하고, 2X BHI broth 50 ㎕를 첨가하여 전체 반응 부피를 100 ㎕로 조정하였다. 반응액을 85℃에서 5분간 끓여 변성시킨 후, 상온에서 서서히 식혀 ssDNA 앱타머의 안정한 3차원 구조를 형성하였다.

< 실시예 2>

Whole-cell SELEX 기법을 이용한 살모넬라 타이피뮤리움과 특이적으로 결합하는 살모넬라 타이피뮤리움 표면 결합 DNA 앱타머의 선별

<2-1> 살모넬라 타이피뮤리움 ( S. typhimurium )의 배양 및 준비

살모넬라 타이피뮤리움 표면 결합 DNA 앱타머의 선별을 위하여 배양을 통해 살모넬라 타이피뮤리움을 확보하였다. 먼저 살모넬라 타이피뮤리움을 BHI broth (BD, USA) 5 ㎖에 접종한 뒤 37℃ 교반배양기에서 16시간 동안 배양하여 살모넬라 타이피뮤리움을 확보하였다. 원심분리 (4℃, 13,000 rpm, 10분)를 통하여 살모넬라 타이피뮤리움을 침전시킨 후 배양 배지를 완전히 제거하고 세척 용액 (1X TBS buffer) 200 ㎕를 첨가하여 재현탁을 통해 살모넬라 타이피뮤리움의 표면을 세척한 뒤 원심분리를 통하여 상층액을 제거하였다. 상기의 과정을 3회 반복함으로써 살모넬라 타이피뮤리움 생균 표면에 잔여물이 없도록 하였다.

<2-2> Whole-cell SELEX 기법을 이용한 살모넬라 타이피뮤리움 표면 결합 DNA 앱타머의 선별

살모넬라 타이피뮤리움 생균의 표면에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 선별하기 위하여 상기 실시예 <1-4>에서 구조를 형성한 ssDNA 앱타머 100 ㎕를 실시예 <2-1>에서 확보한 살모넬라 타이피뮤리움 생균에 넣고 재현탁한 후 4℃의 Thermo mixer (Eppendorf, USA)에서 1시간 동안 반응시켰다.

반응이 끝난 후 원심분리 (4℃, 13,000 rpm, 10분)를 통하여 살모넬라 타이피뮤리움과 결합하지 않은 앱타머 풀이 포함된 상층액을 제거한 후, 세척 용액을 이용하여 3회 세척함으로써 살모넬라 타이피뮤리움 표면에 비특이적으로 결합한 ssDNA 앱타머를 모두 제거하였다. 살모넬라 타이피뮤리움 표면에 특이적으로 결합한 ssDNA 앱타머는 DNA 앱타머 용출 용액 [10 mM Tris (pH 7.5), 1mM EDTA] 100 ㎕를 첨가하여 85℃에서 5분간 반응시켜 균을 사멸시킨 후 원심분리 (4℃, 13,000 rpm, 10분)를 통하여 DNA 앱타머가 포함된 상층액을 회수하였다. 회수한 살모넬라 타이피뮤리움 특이 결합 DNA 앱타머 용출 용액으로부터 순수한 DNA 앱타머 풀을 회수하기 위하여 실시예 <1-3>과 같이 PCI 추출 및 에탄올 침전법을 수행한 후 50 ㎕의 증류수에 회수하였다.

<2-3> 대장균 ( E. coli )와 살모넬라 엔테리티디스 ( S. enteritidis )의 배양 및 준비

살모넬라 타이피뮤리움에 특이적으로 결합하는 살모넬라 타이피뮤리움 생균 특이 결합 DNA 앱타머 풀 중에서 다른 균주에 결합하는 비특이적 앱타머를 제거하기 위하여 네가티브 선별 (negative selection)을 수행하였다.

네가티브 선별을 위한 균주로는 살모넬라 타이피뮤리움과 유전학적으로 유사한 대장균 (Escherichia coli)과 살모넬라 엔테리티디스 (Salmonella enteritidis)를 이용하였다. 네가티브 선별을 위한 대장균은 Luria-Bertini (LB) broth 5 ㎖에 접종하였고, 살모넬라 엔테리티디스는 BHI broth에 접종한 뒤 각각의 균주를 37℃ 교반배양기에서 16시간 동안 배양하여 확보하였다. 원심분리 (4℃, 13,000 rpm, 10분)를 통하여 각각의 균을 침전시킨 후 배양 배지를 완전히 제거하고 세척 용액 (1X TBS buffer) 200 ㎕를 첨가하여 재현탁을 통해 균의 표면을 세척한 뒤 원심분리를 통하여 상층액을 제거하였다. 상기의 과정을 3회 반복함으로써 대장균 및 살모넬라 엔테리티디스 생균 표면에 잔여물이 없도록 하였다.

<2-4> 네가티브 선별 (Negative selec ㎖㎖㎖ tion )을 통한 비특이적 ssDNA 제거

살모넬라 타이피뮤리움 생균의 표면이 아닌 배양 배지 내 타 성분에 결합하는 ssDNA를 제거하고, 살모넬라 타이피뮤리움에만 특이적으로 결합하는 ssDNA 앱타머를 제거하기 위하여 SELEX 5회와 6회 사이에 대장균을 이용한 네가티브 선별을 수행하였고, 7회와 8회 사이에 살모넬라 엔테리티디스를 이용한 네가티브 선별을 진행하였다.

상기 실시예 <1-4>를 통해 확보한 ssDNA 앱타머 100 ㎕를 상기 실시예 <2-3>에서 확보한 대장균 및 살모넬라 엔테리티디스 생균에 넣고 재현탁한 후 4℃의 Thermo mixer (Eppendorf, USA)에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 원심분리 (4℃, 13,000 rpm, 10분)를 통하여 대장균 및 살모넬라 엔테리티디스와 결합하지 않은 앱타머 풀이 포함되어 있는 상층액을 회수하였다. 회수한 상층액으로부터 순수한 DNA 앱타머 풀을 회수하기 위하여 실시예 <1-3>과 같이 PCI 추출 및 에탄올 침전법을 수행한 후 50 ㎕의 증류수에 회수하여 다음 라운드의 주형 DNA로 사용하였다. 이후 SELEX를 총 10회까지 진행하였으며, SELEX의 결합 조건은 횟수가 거듭될수록 반응 조건을 엄격하게 하여 표적물질인 살모넬라 타이피뮤리움과 더욱 특이적으로 결합하는 앱타머를 얻고자 하였다.

< 실시예 3>

살모넬라 타이피뮤리움의 표면에 특이적으로 결합하는 최적 DNA 앱 SELEX 라운드 선정을 위한 친화성 테스트

<3-1> 나노드랍 ( Nano -drop)을 이용한 살모넬라 타이피뮤리움 표면 결합 DNA 앱타머 후보군의 친화성 테스트

SELEX를 10회까지 마친 후 SELEX 진행 여부 및 각 라운드에서 용리된 DNA 앱타머의 친화성을 정량적으로 확인하기 위하여 각 라운드에서 용리된 ssDNA의 농도를 나노드랍을 이용하여 측정하였다.

나노드랍을 활용하여 각 라운드에서 용리된 ssDNA 앱타머 농도를 측정한 결과, 8 라운드의 농도가 612.5 ng/㎕로 가장 높았으며, 9 라운드와 10 라운드의 농도는 각각 571.7 ng/㎕, 509.4 ng/㎕로 8 라운드의 결과보다 농도가 떨어지는 것을 확인할 수 있었다(도 3 참조).

<3-2> 실시간 (Real-time) PCR 을 통한 SELEX 라운드의 선별

SELEX를 10회까지 마친 후 각 라운드에서 용리된 DNA 앱타머의 친화성을 정량적으로 확인하기 위하여 실시간 PCR을 수행하였다.

우선 네가티브 선별 이후인 8 라운드, 9 라운드, 10 라운드에서 용리된 각각의 ssDNA 앱타머들을 PCR 기법을 이용하여 증폭하고, 비대칭 PCR 기법을 이용하여 ssDNA를 확보하였다. 각 8, 9, 10 라운드에서 확보된 ssDNA 앱타머 풀은 동일한 농도로 준비하여 Whole-cell SELEX를 다시 한 번 진행하여 살모넬라 타이피뮤리움에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머만을 회수하였다. 이후, 획득된 각 ssDNA들은 각각 10⁰, 10^-1, 10^-2로 희석하여 실시간 PCR 기법의 주형 DNA로 사용하였다. 실시간 PCR은 iQ SYBR Green Supermix (Bio-rad, USA)를 이용하였으며, 실시간 PCR 반응 조건은 우선, 95℃에서 5분 변성 이후, 95℃에서 20초, 52℃에서 20초, 그리고 72℃에서 20초간 반응하는 과정을 40주기 반복한 후, 72℃에서 5분간 연장시키는 반응 조건으로 반응을 진행하였다. 실시간 PCR 결과는 10^-1로 희석된 샘플을 주형 DNA로 이용한 실험에서 결과를 획득할 수 있었다.

10 라운드의 PCR 효율은 74.6% 이었으며, 8라운드에서의 실시간 PCR 효율은 78.4%로 8 라운드 이후에 효율이 떨어지는 것으로 보아 더 이상 SELEX를 진행할 필요가 없음을 확인할 수 있었다. 또한 8 라운드에서 획득한 ssDNA를 주형 DNA로 이용한 실시간 PCR C(t)값이 78.79이고, 9 라운드, 10 라운드의 C(t)값이 각각 21.44, 20.22으로, 8 라운드의 C(t)값이 가장 낮아 8 라운드의 주형 ssDNA의 농도가 가장 높은 것을 확인할 수 있었다 (표 1 및 도 2 참고).

	8R (1 X 10 ^-1 )	9R (1 X 10 ^-1 )	10R (1 X 10 ^-1 )
C(t)	18.79	21.44	20.22
Efficiency(%)	78.4	70.1	74.6

< 실시예 4>

살모넬라 타이피뮤리움과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 후보군의 클로닝

나노드랍과 실시간 PCR을 통하여 살모넬라 타이피뮤리움과 결합 효율이 가장 높은 것으로 판단되는 8 라운드의 ssDNA 앱타머 용출액으로부터 PCR을 수행하여 dsDNA를 증폭하였다.

획득한 dsDNA는 T-블런트 클로닝 키트 (Biofact, Korea)를 이용하여 클로닝을 수행하였다. 클로닝은 T-벡터 (10 ng/㎕) 1 ㎕와 PCR 산물 (20 ng/㎕) 4 ㎕, 6X T-블런트 버퍼 1 ㎕를 섞어서 25℃에서 5분 동안 반응시키는 조건을 이용하였다. T-블런트 클로닝 반응액 6 ㎕는 200 ㎕의 DH5α와 섞어 42℃에서 30초 동안 열충격 (heat shock)을 가한 후 바로 얼음에서 안정화시켰다.

이후 여기에 900 ㎕의 SOC (2% tryptone, 0.5% yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM MgSO₄, 20 mM glucose) 배지를 첨가한 후, 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 배양 후, 200 ㎕의 배양액을 취하여 암피실린 (ampicillin, 50 ㎍/㎖), 카나마이신 (kanamycin, 50 ㎍/㎖), X-gal (50 ㎍/㎖), IPTG (5 ㎍/㎖)이 포함되어 있는 LB 배양 플레이트 (LB plate)에 스프레딩하고 37℃에서 15시간 동안 배양시켰다.

배양 플레이트에서 흰색 콜로니만을 선별하여 플라스미드 DNA 정제 키트 (Intron biotechnology, Korea)를 이용하여 플라스미드를 추출하였다. 확보한 각 콜로니의 플라스미드를 이용하여 앱타머의 염기서열을 결정하였으며 (Solgent, Korea), 서열 분석을 통하여 비정상적인 서열과 중복되는 서열을 제외하고 24개의 살모넬라 타이피뮤리움 생균 표면 특이 결합 DNA 앱타머를 확보할 수 있었다.

아래 표 2는 Whole-cell SELEX 기법을 활용하여 획득한 살모넬라 타이피뮤리움 특이 결합 DNA 앱타머 기능성 소재 24개에 대한 서열을 나타낸 것이다.

클론 명칭	서열번호	선별된 서열	서열크기 (bp)
STA_1	서열번호 1	TGCTGGTGGCCATTGGCTCGTGTCTCGTTACTGCCGAGTG	40
STA_3	서열번호 2	GGAATGACCTGGATTGACCCGTGAGTGTAGCATTTGTCCG	40
STA_4	서열번호 3	TTGACGATACGCAGGGGCGATACAGACAGTCTGCGTATTC	40
STA_6	서열번호 4	CTGTATCCCTCCTCGCTTCCATACCCAAACCGGACACACC	40
STA_7	서열번호 5	CTGCATGCACCTCACGCATCGAGCACTCACTCCTTCTACG	40
STA_8	서열번호 6	CCTCCCGAGGACACACACACACCATCGCGGTACTCTCCCG	40
STA_9	서열번호 7	GCGCACCTCCGCCCTGTCGGGCGTCGTTTCCCCACGAATC	40
STA_10	서열번호 8	GTTTCCGTATGCGCAGCGCCATACACCTGTCTGATCTCCCC	41
STA_11	서열번호 9	TGTCGCAAGGACTCGATCTGGTGGTACCTGCTTTCCGTTG	40
STA_12	서열번호 10	TGAGCACCAAGGATAGTTAGCGGTCGCCTTCACACTAGGC	40
STA_13	서열번호 11	CTGACAGATTAAAAGTGGTTGGGCAACTTCTGCTTGCGAA	40
STA_14	서열번호 12	GGTGGTGTTGACAATTGAACCTTTGCAGGGGTCTGGTGGG	40
STA_15	서열번호 13	GTGGAGGTGCGCTATAGGTCTCTCCGGGTACTGATCCAAT	40
STA_16	서열번호 14	CCGACCCGTAACGCCAGTGAGGGAACACTCTGGAATAGTT	40
STA_18	서열번호 15	CGAGCAAACTGATAAACTCCGCCATGTCAGGCAAAGCTTT	40
STA_22	서열번호 16	CTTCGTTCCGTTGACATAATTCAATTTTGCGTATTTCTTG	40
STA_23	서열번호 17	ATGGGGCTAGTCTACTTCTGTGTCTACCTAGGATTCCGCT	40
STA_29	서열번호 18	TGTAGGCGTAACCTCCTACTCTGTGCACTGTCTAAAGTGAC	41
STA_30	서열번호 19	CGCGGCGTACGCTATCTTGTAACCTCCCGAACTATAACCAC	41
STA_33	서열번호 20	CAAGCGACTCGACCGTGGTACCTCCCCAATAGCCATTTGA	40
STA_36	서열번호 21	TCTCGCAGCCTCTTCCAATCTTGTTATTTACGCTTTCTGT	40
STA_37	서열번호 22	CACAAAGGAGCAAGAACTCAATTGCGCTCGTACCTTGTGG	40
STA_38	서열번호 23	GTAGCTGGGGTCCGGATCTGCGGTTCAGTGCGCTATTGTG	40
STA_40	서열번호 24	TGACGGCTATCTCATTTGGCACATCATTTAGTAAGCTATC	40

< 실시예 5>

살모넬라 타이피뮤리움 생균 표면 결합 DNA 앱타머 후보군들의 구조 결정

살모넬라 타이피뮤리움 생균과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 후보군들의 구조는 Rensselear polytechnic institute에서 제공하는 DNA mfold 프로그램을 활용하여 이미지화 할 수 있었다(도 4 참고).

< 실시예 6>

나노드랍을 이용한 살모넬라 타이피뮤리움 생균 표면 결합 DNA 후보군의 친화도 테스트

살모넬라 타이피뮤리움 생균의 표면에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 선별하기 위하여 상기 실시예 4를 통해 확보한 앱타머 서열을 가지는 클론을 이용하여 ssDNA 앱타머를 제작하였다. 각각의 서열을 가지는 앱타머는 동일한 농도로 제작하여 Whole-cell SELEX를 재진행하여 회수된 앱타머의 농도를 나노드랍을 이용하여 측정하였다.

나노드랍을 활용하여 각 라운드에서 용리된 ssDNA 앱타머 농도를 측정한 결과, 40 라운드의 농도가 1011.2 ng/㎕로 가장 높았으며, 그 뒤를 이어 13라운드의 농도가 1008.5 ng/㎕, 36라운드의 농도가 1001.5 ng/㎕로 나타난 것을 확인할 수 있었다(표 3 및 도 3 참조).

클론 명칭	회수된 앱타머 (ng/㎕)	클론 명칭	회수된 앱타머 (ng/㎕)
STA_1	933.8	STA_15	980.7
STA_3	900.5	STA_16	945.7
STA_4	869.4	STA_18	980.2
STA_6	955.0	STA_22	992
STA_7	897.4	STA_23	931.5
STA_8	876.4	STA_29	702.5
STA_9	841.2	STA_30	934
STA_10	956.5	STA_33	984.9
STA_11	756.3	STA_36	1001.5
STA_12	785.8	STA_37	529.2
STA_13	1008.5	STA_38	873.1
STA_14	959.8	STA_40	1011.2

< 실시예 7>

SPR 을 이용한 살모넬라 타이피뮤리움 생균 표면 결합 DNA 앱타머의 검출능 테스트

<7-1> 살모넬라 타이피뮤리움 특이 결합 DNA 앱타머의 검출능을 확인하기 위한 앱타머 고정 칩 제작

상기 실시예 6에서 살모넬라 타이피뮤리움과 친화도가 높은 것으로 확인된 살모넬라 타이피뮤리움 생균 표면 결합 앱타머 STA_13 및 STA_40에 대하여 살모넬라 타이피뮤리움 검출능을 확인하기 위하여 본 발명자들은 SPR 검출 시스템 기기인 BIAcore 3000 (BIACORE)을 이용하여 표면 플라즈몬 공명 (Surface Plasmon Resonance, SPR) 실험을 실시하였다.

SPR 실험을 위하여 표면이 스트렙트아비딘으로 코팅된 센서 칩 SA (GE Healthcare)를 이용하였다. 먼저 스트렙트아비딘이 고정된 센서 칩에 앱타머를 고정시키기 위하여 STA_13 및 STA_40 앱타머의 5' 말단에 바이오틴을 표지하여 ssDNA 앱타머를 제작하였다. 센서 칩 SA 표면은 HBS-EP 버퍼 (GE Healthcare)를 유속 10 ㎕/min으로 흘려주어 센서 칩 표면을 활성화시킨 후에 바이오틴이 표지된 앱타머를 10 ㎕/min으로 7분 동안 3회 흘려줌으로써 스트렙트아비딘-바이오틴 결합을 통해 앱타머를 센서칩 SA에 고정시켰다. 센서 칩에 고정되지 않은 앱타머를 제거하기 위하여 HBS-EP 버퍼를 10 ㎕/min으로 흘려준 후 살모넬라 타이피뮤리움 배양액을 10분 동안 흘려주어 살모넬라 타이피뮤리움에 대한 각 앱타머의 검출능을 측정하였다.

앱타머	K _d (nM)
STA_13	4.41 x 10^-12
STA_40	3.57 x 10^-11

< 실시예 8>

SPR 을 활용한 살모넬라 타이피뮤리움 생균 표면 특이 결합 DNA 앱타머의 특이성 평가

<8-1> 살모넬라 속 균주와의 친화성 측정

살모넬라 타이피뮤리움과의 결합력 비교를 위하여 살모넬라 속 균주인 살모넬라 듀블린, 살모넬라 콜레라수이스, 살모넬라 엔테리티디스를 배양하였다.

이들 균의 배양방법은 실시예 2에 제시된 대로 BHI broth에 배양하였다. 그 후에 배양액을 살모넬라 타이피뮤리움 표면 결합 앱타머가 고정된 센서칩 SA에 유속 10 ㎕/min으로 10분간 흘려주었다.

<8-2> 대장균과의 친화성 측정

살모넬라 타이피뮤리움과의 결합력 비교를 위하여 대장균을 배양하였다. 이들 균의 배양방법은 실시예 2에 제시된 대로 LB broth에 배양하였다. 그 후에 배양액을 살모넬라 타이피뮤리움 표면 결합 앱타머가 고정된 센서칩 SA에 유속 10 ㎕/min으로 10분간 흘려주었다.

<8-3> 리스테리아 모노사이토제네스와의 친화성 측정

살모넬라 타이피뮤리움과의 결합력 비교를 위하여 리스테리아 모노사이토제네스를 배양하였다. 이들 균의 배양방법은 실시예 2에 제시된 대로 LB broth에 배양하였다. 그 후에 배양액을 살모넬라 타이피뮤리움 표면 결합 앱타머가 고정된 센서칩 SA에 유속 10 ㎕/min으로 10분간 흘려주었다.

<8-4> 쉬겔라 소네이와의 친화성 측정

살모넬라 타이피뮤리움과의 결합력 비교를 위하여 쉬겔라 소네이를 배양하였다. 이들 균의 배양방법은 실시예 2에 제시된 대로 LB broth에 배양하였다. 그 후에 배양액을 살모넬라 타이피뮤리움 표면 결합 앱타머가 고정된 센서칩 SA에 유속 10 ㎕/min으로 10분간 흘려주었다.

<8-5> 스타필로코쿠스 아우레우스와의 친화성 측정

살모넬라 타이피뮤리움과의 결합력 비교를 위하여 스타필로코쿠스 아우레우스를 배양하였다. 이들 균의 배양방법은 실시예 2에 제시된 대로 LB broth에 배양하였다. 그 후에 배양액을 살모넬라 타이피뮤리움 표면 결합 앱타머가 고정된 센서칩 SA에 유속 10 ㎕/min으로 10분간 흘려주었다.

앱타머	앱타머 STA _13 K _d (M)	앱타머 STA _40 K _d (M)
Salmonella typhimurium	4.41 x 10^-12	3.57 x 10^-11
Salmonella dublin	7.98 x 10^-09	3.14 x 10^-08
Salmonella choleraesuis	3.35 x 10^-08	3.07 x 10^-08
Salmonella enteritidis	1.63 x 10^-8	3.12 x 10^-08
Escherichia coli	3.02 x 10^-08	3.11 x 10^-08
Listeria monocytogenes	3.06 x 10^-08	3.04 x 10^-08
Shigella sonnei	3.20 x 10^-08	1.67 x 10^-08
Staphylococcus aureus	4.86 x 10^-08	3.07 x 10^-08

본 발명의 STA_13 및 STA_40 앱타머를 이용하여 다양한 균에 대한 친화성을 측정한 결과는 상기 표 5와 같다.

상기의 실시예를 통해 제작, 확보한 살모넬라 타이피뮤리움 생균 표면 결합 DNA 앱타머의 산업적 활용을 위하여 살모넬라 타이피뮤리움으로 감염된 환경에서 살모넬라 타이피뮤리움 표면 결합 DNA 앱타머를 이용한 검출 방법 및 살모넬라 타이피뮤리움에 감염된 감염된 동물이나 사람에서의 질병 증상을 진단하기 위한 응용 가능성을 확인하기 위하여 다양한 시료에서의 살모넬라 타이피뮤리움 검출 능력을 확인하였다. 이를 통해 다양한 환경에서 살모넬라 타이피뮤리움의 검출이 가능할 것으로 기대된다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> DNA Aptamer Specifically Binding to Surface of Living Cell of Salmonella typhimurium and Uses Thereof <130> PN1610-367 <160> 28 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 1 tgctggtggc cattggctcg tgtctcgtta ctgccgagtg 40 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 2 ggaatgacct ggattgaccc gtgagtgtag catttgtccg 40 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 3 ttgacgatac gcaggggcga tacagacagt ctgcgtattc 40 <210> 4 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 4 ctgtatccct cctcgcttcc atacccaaac cggacacacc 40 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 5 ctgcatgcac ctcacgcatc gagcactcac tccttctacg 40 <210> 6 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 6 cctcccgagg acacacacac accatcgcgg tactctcccg 40 <210> 7 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 7 gcgcacctcc gccctgtcgg gcgtcgtttc cccacgaatc 40 <210> 8 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 8 gtttccgtat gcgcagcgcc atacacctgt ctgatctccc c 41 <210> 9 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 9 tgtcgcaagg actcgatctg gtggtacctg ctttccgttg 40 <210> 10 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 10 tgagcaccaa ggatagttag cggtcgcctt cacactaggc 40 <210> 11 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 11 ctgacagatt aaaagtggtt gggcaacttc tgcttgcgaa 40 <210> 12 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 12 ggtggtgttg acaattgaac ctttgcaggg gtctggtggg 40 <210> 13 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 13 gtggaggtgc gctataggtc tctccgggta ctgatccaat 40 <210> 14 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 14 ccgacccgta acgccagtga gggaacactc tggaatagtt 40 <210> 15 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 15 cgagcaaact gataaactcc gccatgtcag gcaaagcttt 40 <210> 16 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 16 cttcgttccg ttgacataat tcaattttgc gtatttcttg 40 <210> 17 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 17 atggggctag tctacttctg tgtctaccta ggattccgct 40 <210> 18 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 18 tgtaggcgta acctcctact ctgtgcactg tctaaagtga c 41 <210> 19 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 19 cgcggcgtac gctatcttgt aacctcccga actataacca c 41 <210> 20 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 20 caagcgactc gaccgtggta cctccccaat agccatttga 40 <210> 21 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 21 tctcgcagcc tcttccaatc ttgttattta cgctttctgt 40 <210> 22 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 22 cacaaaggag caagaactca attgcgctcg taccttgtgg 40 <210> 23 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 23 gtagctgggg tccggatctg cggttcagtg cgctattgtg 40 <210> 24 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 24 tgacggctat ctcatttggc acatcattta gtaagctatc 40 <210> 25 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> template DNA <400> 25 ggtaatacga ctcactatag ggagatacca gcttattcaa ttnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnagattgca cttactatct 100 <210> 26 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 26 ggtaatacga ctcactatag ggagatacca gcttattcaa tt 42 <210> 27 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 27 agattgcact tactatct 18 <210> 28 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer_biotin <400> 28 agattgcact tactatct 18

Claims

살모넬라 타이피뮤리움 (Salmonella typhimurium) 생균의 표면에 특이적으로 결합하는, 서열번호 1 내지 서열번호 24로 이루어진 군에서 선택되는 염기서열로 이루어진 DNA 앱타머.
제1항에 있어서,
상기 DNA 앱타머는 표지물질을 더 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 DNA 앱타머.
제2항에 있어서,
상기 표지물질은 형광물질, 바이오틴, 스트렙트아비딘, 아민기, 바이오틴 및 는 티올기로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 표지물질이 상기 DNA 앱타머의 5'말단 또는 3'말단에 표지되는 것을 특징으로 하는 DNA 앱타머.
제1항에 있어서,
상기 DNA 앱타머는 상기 DNA 앱타머를 구성하는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 리보스 2' 위치의 하이드록시기가 수소원자, 불소원자, -OR, -COOR 및 아미노기로 이루어진 군 중 어느 하나로 치환된 것을 특징으로 하는 DNA 앱타머.
PCR을 통해 랜덤 dsDNA (double strand DNA) 라이브러리를 증폭하는 단계;
상기 랜덤 dsDNA 라이브러리로부터 비대칭(asymmetric) PCR을 통해 ssDNA (single strand DNA) 앱타머를 증폭하는 단계; 및
상기 증폭된 ssDNA 앱타머를 살모넬라 타이피뮤리움 생균과 반응시켜 Cell-SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) 기법을 통해 살모넬라 타이피뮤리움 생균 표면에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 선별하는 단계를 포함하는, 제1항의 DNA 앱타머를 선별하는 방법.
제1항의 DNA 앱타머를 포함하는, 살모넬라 타이피뮤리움 검출용 조성물.
제1항의 DNA 앱타머를 포함하는, 살모넬라 타이피뮤리움 검출용 키트.
제7항에 있어서,
상기 키트는 DNA 앱타머가 기판 상에 고정화된 마이크로어레이 형태인, 키트.
제1항의 DNA 앱타머를 시료와 반응시키는 단계를 포함하는, 살모넬라 타이피뮤리움 검출 방법.
제1항의 DNA 앱타머를 포함하는, 살모넬라 타이피뮤리움에 의한 살모넬라증 진단용 조성물.
제1항의 DNA 앱타머를 포함하는, 살모넬라 타이피뮤리움에 의한 살모넬라증 진단용 키트.
제1항의 DNA 앱타머를 시료와 반응시키는 단계를 포함하는, 살모넬라 타이피뮤리움에 의한 살모넬라증을 진단하는 방법.