KR20160050727A - 리포칼린 2 단백질에 특이적으로 결합하는 dna 앱타머 및 이의 용도 - Google Patents

리포칼린 2 단백질에 특이적으로 결합하는 dna 앱타머 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 LCN2 단백질과 특이적으로 결합할 수 있는 DNA 앱타머와 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 DNA 앱타머는 간암 바이오마커인 LCN2 단백질과 특이적으로 결합하는 특성을 가지므로 본 발명의 DNA 앱타머는 LCN2 단백질의 검출 용도로 사용될 수 있다. 뿐만 아니라, 본 발명의 DNA 앱타머는 현재 간암 진단에 활용되고 있는 AFP나 PIVKA-II의 면역학적 검출방법을 대체할 수 있는 특이성과 안정성을 갖고 있어서 기존 진단 검출 기법과 더불어 간암 조기 진단을 할 수 있는 앱타머 기반의 진단 시스템으로 신속하고 경제적인 간암 진단을 할 수 있을 것으로 전망된다

Description

리포칼린 2 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 이의 용도{DNA Aptamer Specifically Binding to LCN2 (Lipocalin 2) protein and Its Use}
본 발명은 리포칼린 2 (Lipocalin 2, LCN2) 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 이의 용도에 관한 것이다.
간암은 가장 흔한 암 중의 하나로서 전 세계적으로 암 발생 빈도가 4위이지만, 사망률은 3위를 기록하는 질병이다. 간암은 발생률에 비해 사망률이 높은 질병이며 발견 시 생존율은 50% 이지만, 재발률 또한 40-80% 정도로 매우 높아 조기 진단 및 예후 관리가 매우 절실한 질환으로 알려져 있다.
이와 같이 발생률에 비하여 사망률이 높은 이유는 간암은 발병 초기에 간암의 발병을 나타내는 특이 증상이 없기 때문이며, 간암 환자의 80% 정도는 간경변에서 시작하여 합병증으로 사망하는 경우가 많기 때문에 간암의 조기진단은 환자의 생존율을 크게 높일 수 있어 예후관리를 위한 진단물질의 개발이 주목받고 있다.
간암의 주요 원인으로는 B형 및 C형 간염 바이러스에 의한 감염, 곰팡이 독소인 아플라톡신 환경인자, 알코올 섭취, 흡연 등이 알려져 있으며, 이중 특히 간염 바이러스에 의한 감염은 간암을 유발하는 직접적 원인인 것으로 보고되어 있다.
현재 간암 진단을 위하여 널리 활용되고 있는 종양표지자는 AFP (Alpha-fetoprotein)과 PIVKA(Protein Induced by Vitamin K Absence)-Ⅱ가 대표적이다. 종양 표지자인 AFP와 PIVKA-Ⅱ의 간세포암 (HCC) 종에 대한 진단 민감도는 각각 39-64%, 48-62%, 특이도는 각각 76-91%, 81-98%로 PIVKA-Ⅱ가 AFP보다 다소 높은 특이도를 보여주고 있으나 간경화 (Liver cirrhosis)를 동반한 간세포암일 경우 진단되지 않는 단점이 있다. 또한 AFP의 경우, 급성 또는 만성 간염과 전격성 간염, 간경변증과 같은 질환에서도 비특이적으로 증가할 수 있으며, 배아세포종이나 5-10%의 위장관암에서도 양성적 반응이 나올 수 있으며, 간암이 발병 되었음에도 불구하고 AFP 혈중 농도가 상승하지 않는 경우가 많다. 그러므로 현재의 간암 마커인 AFP나 PIVKA-II보다 간암을 특이적이고 효과적으로 진단 할 수 있는 마커를 발굴하고 이를 이용하여 간암을 조기 진단 할 수 있는 검사 시약의 개발이 필요하다.
리포칼린은 면역반응을 조절하고 세포의 항상성을 조절하는 기능이 있다고 보고되었다 (Flower, D. R., Biochem. J., 1996). 특히, 리포칼린 패밀리 (lipocalin family)에 포함된 리포칼린 2 (이하 LCN2)는 호중구 젤라틴분해효소관련 리포칼린 (Neutrophil Gelatinase-Associated Lipocalin ; NGAL)이라고도 불리며 약 25 kDa의 당단백질로 이루어져 있다. LCN2는 세포증식이 활발한 세포에서 발현이 증가된다는 보고가 있어, 최근 다양한 인간 암들로부터 발현되는 것이 분석되고 종양으로 발전할 수 있는 것으로 관심을 받고 있다 (Reilly PT, Oncogene 2012; Bratt T. Biochim Biophys Acta, 2000). LCN2는 특히, 유방암, 폐암, 대장암, 췌장암에서 발견한 보고가 있으며 (Nielsen BS et al. Gut, 1996; Furutani M et al, Cancer Lett, 1998), 정상 난소에서는 발현되지 않으나(Cowland JB eta al. Genomics, 1997), 난소암에서는 과량 발현한다는 보고가 있다(Bartsch S, EBS Lett, 1995). 이들은 주로 암세포주를 이용하여 실험하였으며 RNA 수준에서 발현차를 보고 면역조직화학 등에 의해 단백질 발현을 조사하였다.
이에 본 발명에서는 간암을 조기 진단할 수 있는 새로운 마커로써 LCN2 단백질을 활용하는 방법뿐만 아니라, 표적 물질 탐지 인자인 앱타머를 활용하여 LCN2를 검출하는 진단기법을 개발하고자 하였다.
기존 항체를 기반으로 하는 표적물질 검출 기법의 문제점으로는 동물 실험을 동반하기 때문에 자유로운 생산, 정제, 변형에 어려움이 있고, 단백질로 주변 pH, 온도 등에 대한 안정성 확보에도 어려움이 있으며, 항체 생산에는 많은 시간과 비용이 요구될 뿐만 아니라 배치간 변이(batch to bacth variation)가 존재하여 순수한 표적 항체만을 생산 확보하는 것이 매우 어렵다는 단점을 가지고 있다. 이와 같은 기존 항체를 기반으로 하는 표적물질 검출 기법의 문제점들을 해결, 보안하기 위하여 본 발명에서는 앱타머를 활용하고자 한다.
본 발명에서 활용하고자 하는 앱타머(aptamer)는 짧은 길이의 올리고머로 안정된 삼차구조를 형성하여 표적 물질과 항체 사이에 나타나는 친화도와 유사한 친화도를 나타내며, 표적물질과 특이적인 결합력을 가지는 특징이 있다. 또한 앱타머는 DNA나 RNA로 구성되어 있어 단백질로 이루어진 항체보다 안정적이며, 다양한 표적 물질(단백질, 생균, 펩타이드, 금속, 화학물질 등)과 특이적으로 결합이 가능하다는 특징을 가지고 있다. 뿐만 아니라, 화학적 합성 기법을 이용해 제작이 가능하기 때문에 단시간, 저비용으로 대량 생산이 가능하며, 한번 제작, 생산 후 동일한 능력을 가지는 앱타머를 지속적으로 생산 가능한 탁월한 장점을 갖고 있다. 이와 더불어 주변의 pH와 온도에 매우 안정성이 높아 최근 표적 물질의 탐지 및 질환 진단 센서 개발 등 환경, 의료 등 다양한 분야에서의 활용 가능성이 높이 평가되고 있다.
대한민국 등록특허 제681,763호
이에 본 발명자들은 간암을 조기에 진단 가능한 DNA 앱타머(aptamer)를 개발하기 위해 연구 노력하던 중, 사람의 LCN 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 합성 및 선별하는데 성공하였으며, 이를 이용한 간암 조기 진단용 키트를 제작함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 간암을 조기 진단하기 위한 리포칼린 2(Lipocalin 2; LCN2) 단백질과 특이적으로 결합하는 LCN2 단백질 특이적 DNA 앱타머를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 리포칼린 2 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 리포칼린 2의 검출 또는 간암 진단용 조성물, 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 리포칼린 2 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머가 기판에 집적되어 리포칼린 2를 포함하는 시료에 특이적으로 반응하는 것을 특징으로 하는 리포칼린 2 검출 또는 간암 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, (a) 생체로부터 분리된 생물학적 시료와 LCN2 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 생물학적 시료와 상기 DNA 앱타머 간의 LCN2 단백질 특이적 결합 반응을 통해 LCN2의 존부를 확인하는 단계;를 포함하는 간암의 진단에 필요한 정보를 제공하는 것이다.
상기 목적을 위하여, 본 발명의 목적은 간암을 조기 진단하기 위한 리포칼린 2(Lipocalin 2; LCN2) 단백질과 특이적으로 결합하는 LCN2 단백질 특이적 DNA 앱타머를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 DNA 앱타머는 서열번호 1 내지 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 군 중 선택된 하나의 염기서열과 90% 이상의 동일성을 갖는 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleiotide)일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 DNA 앱타머는 서열번호 1 내지 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 군 중 어느 하나에 개시된 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleiotide)일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 DNA 앱타머는 표지물질을 더 포함하여 구성될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 DNA 앱타머는 형광물질, 아민기, 바이오틴 및 티올기로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 표지물질이 상기 DNA 앱타머의 5' 말단 또는 3' 말단에 표지되는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 DNA 앱타머는 상기 DNA 앱타머를 구성하는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 리보스 2' 위치의 하이드록시기가 수소원자, 불소원자, -OR, -COOR 및 아미노기로 이루어진 군 중 어느 하나로 치환된 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 리포칼린 2(Lipocalin 2; LCN2) 단백질은 서열번호 15의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleiotide)일 수 있다.
또한, 본 발명은 리포칼린 2(Lipocalin 2; LCN2) 단백질에 특이적으로 결합하는 서열번호 1 내지 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 군 중 선택된 어느 하나의 염기서열을 갖는 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 사람 LCN2 단백질 검출 또는 간암 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 리포칼린 2(Lipocalin 2; LCN2) 단백질에 특이적으로 결합하는 서열번호 1 내지 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 군 중 선택된 어느 하나의 염기서열을 갖는 DNA 앱타머가 기판에 집적되어 리포칼린 2를 포함하는 시료에 특이적으로 반응하는 것을 특징으로 하는 리포칼린 2 검출 또는 간암 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 기판(well)은 종이, 플라스틱, 유리, 금속 및 실리콘으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 (a) 생체로부터 분리된 생물학적 시료와 LCN2 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 생물학적 시료와 상기 DNA 앱타머 간의 LCN2 단백질 특이적 결합 반응을 통해 LCN2의 존부를 확인하는 단계;를 포함하는 간암의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명은 LCN2 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머와 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 DNA 앱타머는 간암의 새로운 바이오마커인 LCN2 단백질과 특이적으로 결합하는 특성을 갖는다. 따라서, 본 발명의 LCN2 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머는 간암 환자 샘플에서 LCN2 단백질을 검출함으로써, 간암의 조기 진단 및 예후 판단 용도로 사용될 수 있다. 뿐만 아니라, 본 발명의 LCN2 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머는 각종 암 진단에 사용되는 기존 항체를 대체할 수 있으며, 나아가 각종 암뿐만 아니라 다양한 난치성 질환을 보다 신속하고 경제적으로 진단할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 랜덤 DNA 앱타머를 PCR 기법을 이용하여 증폭한 결과와 PCR 기법을 통하여 제작한 dsDNA를 열-냉각기법 및 스트랩타비딘 (streptavidin)을 이용하여 회수한 ssDNA을 10% 아크릴아마이드 겔 전기영동을 통하여 비교하여 확인한 결과이다.
레인 M: 100 bp DNA 마커
레인 1: DNA 앱타머로부터 PCR 기법을 통하여 증폭된 dsDNA 결과
레인 2: PCR 기법으로 확보한 dsDNA를 열-냉각기법과 스트랩타비딘을 이용하여 제작한 ssDNA 결과
도 2는 LCN2 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 제작을 위하여 실시한 각 SELEX 라운드에서 회수된 히스티딘 융합 LCN2 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 또는 LCN2 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 후보군들의 ssDNA 농도를 Nanodrop spectrophotometer를 이용하여 정량적으로 나타낸 결과이다.
도 3은 LCN2 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 제작을 위한 SELEX 과정에서 선별된 10개의 LCN2 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 후보군 LCN2-1 내지 LCN2-10의 2차 구조를 나타낸 도면이다.
도 4은 LCN2-1내지 LCN2-10의 LCN2에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 후보군 9종을 각각 LCN2 단백질과 결합, 1차 항체인 LCN2 다중클론성 항체(Anti-Lipocalin 2 antibody(Mouse polyclonal))와 2차 항체인 퍼옥시다아제 (peroxidase)가 결합되어 있는 마우스의 lgG (Anti-mouse IgG(conjugated HRP))을 처리하여 LCN2 단백질과 DNA 앱타머 후보군간의 결합부위 확인을 위한 도트 블로팅 (Dot blotting) 실험 결과(A)이고 (B)는 LCN2 앱타머 2번의 스팟과 앱타머 5번의 스팟 결과양상을 결합구조로서 도식화한 도이다.
도 5는 NOS group (N-oxysuccinimide esters group)을 가지고 있는 well 표면에 LCN2에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 고정, DNA 앱타머에 의하여 LCN2 단백질이 포획되고 이에 LCN2에 특이적으로 결합하는 또다른 DNA 앱타머를 결합시켜 LCN2를 검출하는 방법의 각 단계들을 도면으로 나타낸 도이다.
도 6은 LCN2 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머의 특이성을 확인하기 위한 실험으로서 도 5의 단계를 기반으로 수행한다. 네가티브 컨트롤 (Negative control)로 각각 NOS group (C-A), Cy5 형광물질로 표지된 DNA 앱타머 (C-B), Cy5 표지 DNA 앱타머와 아민기(NH2)표지 DNA 앱타머 (C-C), 단백질과 아민기 표지 DNA 앱타머 (C-D)만을 측정하고 네가티브 컨트롤 단백질로서 BSA, GST, prfA와도 결합력을 측정한 실험 결과이다.
도 7은 도 5의 단계를 기반으로 수행한 LCN2 단백질의 농도 증가에 따른 Cy5 표지 DNA 앱타머의 형광값을 측정한 실험 결과이다.
도 8은 LCN2 단백질과 특이적으로 결합하는 앱타머를 이용한 간암 표적인자인 LCN2 검출 키트의 모식도를 나타낸 도면이다. 간암으로 의심되는 환자의 시료를 LCN2 단백질과 특이적으로 결합하는 앱타머가 고정되어 있는 진단 키트에 처리하였을 때, 샘플 내 LCN2 단백질과 LCN2 단백질 결합 앱타머의 결합에 의해 LCN2를 진단하는 시스템을 모식도로 나타낸 도이다.
도 9는 상기 도 8의 단계를 기반으로하는 LCN2 단백질 검출 키트를 사용하여 간암으로 의심되는 환자의 시료에 있는 LCN2 단백질을 검출하고 실제 LCN2 농도와 비교한 실험 결과이다.
도 10은 항체기반의 LCN2 검출 키트인 LCN2 ELISA kit의 모식도와 앱타머를 기반으로하는 LCN2 검출 키트의 모식도를 검출 단계를 표현하여 비교한 도이다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 명세서의 LCN2 단백질은 호중구 젤라틴분해효소관련 리포칼린 (neutrophil gelatinase-associated lipocalin(NGAL))이라고도 불리며 약 25 kDa의 당단백질로 이루어져 있다. LCN2는 세포증식이 활발한 세포에서 발현이 증가된다는 보고가 있으며, 실제 유방암, 폐암, 대장암, 췌장암에서 발견한 보고가 있어 종양으로 발전할 수 있는 세포에서 발현이 증가되는 것으로 관심을 받고 있다 (Nielsen BS et al. Gut, 1996; Furutani M et al, Cancer Lett, 1998). 또한 정상 난소에서는 발현되지 않으나 난소암에서는 과량 발현한다는 보고가 있으며 (Bartsch S, EBS Lett, 1995) 특히 최근 간암과 관련된 보고는 비 종양 간 조직에 비해 인간의 간세포암 (HCC) 조직에서 LCN2의 수준이 크게 증가한다고 보고되었다 (Eun-Kyoung Lee et. al., Int J Oncol. 2011). 따라서 LCN2가 간암 조기진단의 새로운 바이오마커로써 사용될 수 있음을 확인 하였으며 이에 본 발명에서는 LCN2 단백질을 활용하여 간암을 진단하고자 한다.
본 발명은 새로운 간암 마커 단백질인 LCN2 (lipocalin 2)와 특이적으로 결합하는 DNA 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다.
본 명세서에서 용어 DNA 앱타머는 특정 분자에 고친화성 및 특이성으로 결합할 수 있는 DNA 핵산 분자를 의미한다. 본 명세서에서 DNA 앱타머는 DNA 올리고뉴클레오타이드와 혼용하여 사용한다.
본 명세서에서 용어 올리고뉴클레오타이드는 일반적으로 길이가 약 200개 미만을 갖는 뉴클레오타이드 중합체를 지칭하며, 이에는 DNA 및 RNA가 포함될 수 있으며, 바람직하게는 DNA 핵산 분자이다. 뉴클레오타이드는 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드 또는 염기 및/또는 이들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해 또는 합성 반응에 의해 중합체 내로 도입될 수 있는 모든 기질일 수 있다. 뉴클레오타이드 구조에 대한 변형이 존재하는 경우, 이러한 변형은 올리고뉴클레오타이드 중합체의 합성 전에 또는 후에 추가될 수 있다. 뉴클레오타이드 서열은 비-뉴클레오타이드 성분에 의해 중단될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 합성 후에, 예를 들어 표지와의 결합에 의해 추가로 변형시킬 수 있다.
본 발명의 DNA 앱타머는 전형적으로는 표적 분자의 결합에 대한 시험관내 선택법에 의해 얻을 수 있다. 표적 분자에 특이적으로 결합하는 앱타머를 선택하는 방법은 당 분야에서 공지되어 있다. 예를 들어, 유기 분자, 뉴클레오타이드, 아미노산, 폴리펩타이드, 세포 표면상의 마커분자, 이온, 금속, 염, 다당류가 각 리간드에 특이적으로 결합할 수 있는 앱타머를 분리하는 적절한 표적 분자가 될 수 있다. 앱타머의 선별은 SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) 방법으로 공지된 생체 내 또는 시험관 내 선택 기술을 이용할 수 있다 (Ellington et al., Nature 346, 818-22, 1990; 및 Tuerk et al., Science 249, 505-10, 1990). 본 명세서에서 SELEX 방법이란 임의적으로 합성된 DNA 집합에서 특정 분자에 대해 높은 결합력을 지니는 DNA를 선별하여 증폭시킴으로써 해당 분자의 DNA 결합서열을 알아내는 방법을 의미한다(Louis et al., 1992. Nature 355,564-566). 앱타머의 선별 및 제조에 대한 구체적인 방법은 미국특허 5,582,981, WO 00/20040, 미국특허 5,270,163, Lorsch and Szostak, Biochemistry, 33:973 (1994), Mannironi et al.,Biochemistry 36:9726 (1997), Blind, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:3606-3610 (1999), Huizenga and Szostak, Biochemistry, 34:656-665 (1995), WO 99/54506, WO 99/27133, WO 97/42317 및 미국특허 5,756,291에 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로써 삽입된다.
본 발명은 LCN2 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 기반으로 하는 간암의 진단 및 LCN2 단백질의 검출을 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명의 LCN2 단백질 검출은 LCN2 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머와 LCN2 단백질의 복합체를 검출하는 방법에 기초한다. 복합체의 검출을 용이하게 하기 위해 본 발명의 LCN2 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 형광물질, 예를 들어 플루오레세인 (fulorescein) Cy3 또는 Cy5, 방사성물질 또는 화학물질, 예를 들어 비오틴 (biotin)으로 표지되거나 1차 아민 (primary amine)으로 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
본 발명의 LCN2 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머는 예를 들어, 비오티닐화 (biotinylated)화될 수 있고, 이는 스트랩트아비딘 (streptavidin)이 코팅된 well상에 성공적으로 고정 시킬 수 있다. well상에 고정화된 본 발명의 LCN2 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머는 LCN2 단백질이 결합될 수 있으며, 이와 같이 well 고정 DNA 앱타머에 결합된 LCN2 단백질은 다시 LCN2 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 이용하여 포획 유무를 시각화 할 수 있다.
본 발명에서 LCN2 단백질 검출용 조성물은 키트의 형태로 제공될 수 있다. 본 발명에서 키트는 서열번호 제 1 서열 내지 제 10 서열 중 어느 하나에 개시된 염기서열 또는 이 서열과 90% 이상의 동일성을 갖는 염기서열을 갖는 DNA 올리고뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함한다. 본 발명에서의 키트는 시료 중의 LCN2 단백질 검출 키트를 사용하기 위한 설명서 또는 라벨을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 시료내 사람 LCN2 단백질의 검출 및 분석은 간암 가능성을 제시할 수 있으며 추후 간암 모니터링을 위한 검출에 유용한 정보를 제공할 수 있다. 구체적으로, LCN2는 염증유도인자와 결합하여 염증을 유도하여 다양한 종양과 간암 등으로부터 발현량이 증가된다는 보고가 있다. 이에 LCN2 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 이용하여 환자의 시료로부터 LCN2 단백질의 유무 및 정량 확인함으로써, 간암 진단 또는 예후 LCN2 검출에 활용할 수 있다.
또한, 본 발명은 간암의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위해 환자의 생물학적 시료로부터 본 발명의 LCN2 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머와 LCN2 단백질과의 결합반응을 통해 LCN2 단백질을 검출하는 방법을 제공한다. 상기 용어 생물학적 시료는 혈액, 타액, 누액, 요액, 활액, 점액, 세포, 조직, 및 기타 다른 조직 및 체액을 포함할 수 있으며, 세포 배양 상등액, 파열된 진핵세포 및 세균 발현계 등도 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
<실시예 1>
LCN2 유전자 선정 및 His 융합 재조합 LCN2 단백질 준비
<1-1> LCN2 유전자의 선정
LCN2 단백질은 면역반응을 조절하고 세포의 항상성을 조절하는 기능을 갖는 것으로 보고되어 있으며 세포 증식이 활발한 염증이나 암세포에서 발현 수치가 증가한다고 알려져 있다. 특히 LCN2가 종양의 형성과 연관되어 있다고 보고되어있어 현재 간암 발병 시 발현량이 증가하여 널리 사용되고 있는 AFP 간암 표지자로서 간암 진단의 성공률을 높일 것으로 기대되는 물질이다.
우선, 사람에서 발현되는 LCN2 단백질에 대한 앱타머를 제작하기 위하여 Sino Biological Inc.(China) 사의 His 융합된 재조합 사람 LCN2 단백질 (Recombinant Human Lipocalin-2/NGAL/LCN2(His-tagged LCN2 protein))을 구매하여 LCN2에 특이적인 앱타머 제작에 사용하였다.
<실시예 2>
DNA 앱타머의 제작
<2-1> Primer 및 DNA 앱타머 풀의 합성
LCN2 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 제작하기 위해 40개의 랜덤 서열을 dA : dG : dC : dT = 1.5 : 1.15 : 1.25 : 1 비율로 포함하고 있는 76 bp의 주형 DNA (5'-ATACCAGCTTATTCAATT-N40-AGATAGTAAGTGCAATCT-3'; 서열번호 제 11 서열)와 이를 76 bp로 증폭할 수 있는 세 개의 프라이머를 바이오니어로부터 주문하여 제작하였다 [정방향 프라이머: 5'-ATACCAGCTTATTCAATT-3' (서열번호 제 12 서열), 역방향 프라이머: 5'-AGATTGCACTTACTATCT-3' (서열번호 제 13 서열), 비오티닐화된 (biotinylated) 역방향 프라이머: 5'-비오틴-AGATTGCACTTACTATCT-3' (비오틴과 결합하는 염기서열을 서열번호 14로 표기함)].
<2-2> PCR 기법을 활용한 랜덤 DNA 라이브러리 증폭
임의의 DNA 라이브러리는 PCR 기법을 이용하여 증폭하였으며, 76 bp DNA 라이브러리의 증폭을 위한 PCR 반응 조성은 주형 DNA 1 ㎕, 10X PCR 완충용액 5 ㎕, 각 2.5 mM dNTP 혼합물 4 ㎕, 25 μM 정방향 프라이머 2 ㎕, 25 μM 비오티닐화된 역방향 프라이머 2 ㎕, Ex Taq 중합효소 (Takara, Japan) 0.3 ㎕ (1 unit/㎕)와 35.7 ㎕의 증류수로 이루어져 있다. PCR 반응 조건은 우선 95℃에서 5분간 변성시키고, 95℃에서 30초, 52℃에서 30초, 그리고 72℃에서 30초간 반응을 20주기 반복한 후, 72℃에서 5분간 추가로 신장시키는 반응을 이용하였다. PCR 반응 후 4 ㎕를 취하여, 2% 아가로스 겔 전기영동을 통하여 76bp에서 밴드가 나타나는지 증폭 산물을 확인하였다. PCR을 통하여 확보된 DNA 라이브러리는 PCR 정제 키트 (Qiagen, USA)를 이용하여 정제한 후 증류수 50 ㎕를 이용하여 회수하였다.
<2-3> 가열-냉각 (heating-cooling) 기법을 활용한 ssDNA 제작
PCR 기법과 PCR 정제 키트를 이용하여 회수한 DNA 라이브러리 50 ㎕에 증류수 50 ㎕를 첨가하여 부피를 100 ㎕로 조정한 후, 가열-냉각 (heating-cooling) 기법을 이용하여 dsDNA를 ssDNA로 변성 (Denaturation)하였다. 실험 방법을 구체적으로 표현하자면 PCR 기법과 PCR 정제 키트를 이용하여 획득한 dsDNA를 85℃에서 5분 동안 반응하여 dsDNA를 ssDNA로 변성시킨 후, 반응 종료 후 즉시 반응액을 4℃로 냉각 시켜 ssDNA를 제작하였다.
<2-4> ssDNA의 선별 및 회수
가열-냉각 기법을 이용하여 확보된 ssDNA 산물 중 비오틴 (Biotin)이 결합되어 있는 ssDNA와 primer를 제거하고 정방향의 ssDNA만을 순수하게 확보하기 위하여, 상기 실시 예에서 획득한 100 ㎕의 반응액에 스트렙트아비딘 아가로즈 레진(streptavidin agarose resin, Thermo scientific, USA) 50 ㎕를 첨가하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응액은 4℃, 13,000 rpm의 원심분리기를 이용하여 15분간 원심분리한 후, 상층액만을 회수하여 동일 부피의 PCI (phenol : chloroform : isoamylalcohol = 25 : 24 : 1) 용액을 처리한 후 4℃에서 13,000 rpm으로 15분간 원심 분리하여 상층액만을 회수하였다. 상층액에 1/100 부피의 tRNA (sigma aldrich, USA), 1/10 부피의 3 M 소듐 아세테이트 (sodium acetate, pH 4.5)와 3 부피의 100% 에탄올을 첨가하여 -70℃에서 1시간 이상 반응시켰다. 반응 후에는 4℃에서 13,000 rpm으로 20분간 원심분리하여 ssDNA만을 회수하였다. 회수한 ssDNA는 65℃에서 건조시킨 후, 50 ㎕의 증류수에 녹였다. 회수한 ssDNA 중 10 ㎕를 취하여 10% 아크릴아마이드 겔을 이용하여 dsDNA와 비교하여 정확한 크기의 밴드가 나타나는지 확인하였다 (도 1 참고).
<실시예 3>
SELEX 기법을 이용한 재조합 LCN2 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 선별
<3-1> SELEX에 이용되는 각 용액의 조성
SELEX에 이용한 각 용액은 Ni-NTA Agarose (Qiagen, USA)를 이용하였으며, 조성은 다음과 같았다. 즉, 1 X 앱타머 선별 용액 (pH 7.9): 500mM NaCl, 20mM Tris-HCl, 5mM imidazole, 2 X 앱타머 선별 용액 (pH 7.9): 300mM NaCl, 40mM Tris-HCl, 10mM imidazple, 2mM MgCl2, 세척 용액 (pH 7.9): 500mM NaCl, 60mM imidazole, 20mM Tris-HCl, DNA 앱타머 용출 용액 (pH 7.9): 300mM NaCl, 20mM Tris-HCl, 250mM imidazole.
<3-2> SELEX에 이용될 DNA 앱타머 구조 제작
상기 실시예 2-4를 통하여 제작 확보한 ssDNA 40 ㎕에 증류수 10 ㎕를 첨가하고, 2X DNA 앱타머 선별 용액 50 ㎕를 첨가하여 전체 반응 부피를 100 ㎕로 조정한 후 85℃에서 5분간 끓여 변성 시킨 후, 상온에서 서서히 식혀 ssDNA 앱타머의 안정한 3차원 구조를 형성하였다.
<3-3> Ni-NTA agarose 정제 키트를 이용한 LCN2 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머의 선별
상기 실시예 1에서 구매한 히스티딘 융합 LCN2 단백질 3 ㎕ (60.87 pmol)를 1 X 앱타머 선별용액으로 전체 반응 부피를 100 ㎕로 조정한 후, 상기 실시예 3-2에서 획득한 ssDNA 앱타머 풀 (608.7 pmol)과 1:10 비율로 혼합하여 4℃에서 1시간동안 반응시켰다. Ni-NTA agarose 정제 키트를 활성화하기 위하여 Ni-NTA agarose 200 ㎕에 1 X 앱타머 선별용액 200 ㎕을 넣고 4℃에서 30분 동안 교반하며 반응시켜 활성화시킨 후, 4℃에서 13,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 상층액을 제거했다. 상기 과정을 2회 반복한 후 히스티딘 융합 LCN2 단백질과 ssDNA 앱타머 풀을 반응시킨 반응액을 활성화된 Ni-NTA agarose와 4℃에서 1시간 동안 교반하며 반응시켰다. 이후, 4℃에서 13,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 상층액을 제거한 후, 세척용액 1 ㎖을 넣어 세척하는 과정을 5회 반복하여 히스티딘 융합 LCN2 단백질과 결합하지 못한 ssDNA 앱타머를 제거하였다. Ni-NTA agarose로부터 히스티딘 융합 LCN2 단백질과 이에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 용출하기 위하여 DNA 앱타머 용출 용액 200 ㎕를 넣어 4℃에서 1시간동안 교반하며 반응시켰으며, 이후, 4℃에서 13,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 상층의 용출 용액을 얻었다. 상기 과정을 2회 반복하여 상층의 용출 용액을 획득하였다. 히스티딘 융합 LCN2 단백질과 이에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머간의 결합물에서 히스티딘 융합 LCN2 단백질을 제거하기 위하여, 용출 용액에 동일 부피의 PCI 용액을 처리한 후 4℃에서 13,000 rpm으로 15분간 원심 분리하여 상층액만을 회수하였다. 이후, 히스티딘 융합 LCN2 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 만을 회수하기 위하여 PCI 법을 통하여 회수된 상층액에 1/100 부피의 tRNA, 1/10 부피의 3M 소듐 아세테이트 (pH 4.5)와 3배부피의 100% 에탄올을 첨가하여 -70℃에서 1시간 이상 반응시켰고, 반응액을 4℃에서 13,000 rpm으로 20분간 원심 분리하였다. 이를 통하여 LCN2 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머만을 회수할 수 있었으며, 회수된 DNA 앱타머는 65℃에서 건조시킨 후, 50 ㎕의 증류수에 녹였다.
<3-4> 비특이적 DNA 앱타머 제거를 위한 네가티브 선별 (Negative selection)
LCN2 단백질이 아닌 히스티딘 잔기와 아가로스 (agarose)에 결합하여 선별된 비특이적인 DNA 앱타머를 제거하기 위하여 SELEX 6회와 7회 사이에 LCN2 단백질 없이 히스티딘 아미노산만 고정되어 있는 Ni-NTA agarose에 DNA 앱타머 용액을 결합하는 네가티브 선별 (negative selection)을 진행하였다. 1 X 앱타머 선별 용액을 이용하여 활성화된 Ni-NTA agarose에 히스티딘을 고정 시킨 후, 상온에서 냉각시켜 구조를 형성한 ssDNA 앱타머 풀을 반응시켰으며, Ni-NTA agarose와 히스티딘에 결합하지 않은 상층의 ssDNA 앱타머 용액을 7회 SELEX에 이용하였다. 이후 3-3과 같은 방법으로 SELEX를 총 10회까지 진행하였으며, SELEX의 결합 조건은 횟수가 거듭될수록 반응 조건을 엄격하게 하여 표적물질인 LCN2 단백질과 더욱 특이적으로 결합하는 앱타머를 얻고자 하였다.
<실시예 4>
히스티딘 융합 LCN2 단백질과 특이적으로 결합하는 최적 DNA 앱타머 선별을 위한 SELEX 라운드 선별
<4-1> 나노 드롭 (Nano Drop)을 이용한 각 라운드의 친화성 확인
SELEX를 10회 까지 마친 후 SELEX 계속 진행 여부 및 각 라운드에서 용리된 ssDNA 앱타머의 친화성을 정량적으로 확인하기 위하여 각 라운드에서 용리된 ssDNA의 농도를 나노 드롭 (Nano drop (Micro spectrophotometer))을 이용하여 측정하였다. 나노 드롭을 활용하여 각 라운드에서 용리된 ssDNA 앱타머 농도를 측정한 결과, 네가티브 선별 이후에 8 라운드의 농도가 246.6 ng/㎕로 가장 높았으며, 9 라운드와 10 라운드의 농도는 각각 180.1 ng/㎕와 147.4 ng/㎕로 8 라운드의 결과 보다 농도가 떨어지는 것을 확인할 수 있었으며, 이를 통하여 네가티브 선별 이후, 히스티딘 융합 LCN2 단백질과 가장 특이적으로 결합하는 최적 앱타머 풀은 8 라운드 풀임을 확인할 수 있었다 (도 2 참고).
<4-2> 실시간(Real time) PCR 기법을 이용한 최적 라운드 확인
SELEX를 10회까지 마친 후 SELEX 진행 여부 및 각 라운드에서 용리된 DNA 앱타머의 친화성을 정량적으로 확인하기 위하여 실시간 PCR을 수행하였다.
우선 초기 DNA 라이브러리와 네가티브 선별 이후인 7 라운드, 8 라운드, 9 라운드에서 용리된 각각의 ssDNA 앱타머들을 PCR 기법을 이용하여 증폭하고, 가열- 냉각 기법을 이용하여 ssDNA를 확보하였다. 각 7, 8, 9 라운드에서 확보된 ssDNA 앱타머 풀은 동일한 농도로 준비하여 동일한 농도의 히스티딘 융합 LCN2 단백질과 4℃에서 12시간 이상 반응시켰다. 반응액은 활성화된 Ni-NTA agarose와 1시간 동안 반응시킨 후 4℃에서 13,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 상층액을 제거했다. 이후, 세척 용액으로 5회 세척하여 히스티딘 융합 LCN2 단백질과 결합하지 못한 ssDNA를 제거한 후 앱타머 용출 용액과 반응시켜 히스티딘 융합 LCN2 단백질과 결합한 DNA 앱타머를 회수하였다. 회수한 히스티딘 융합 LCN2 단백질과 결합한 DNA 앱타머에 동일 부피의 PCI를 처리하여 히스티딘 융합 LCN2 단백질을 제거한 후, 회수 용액의 1/100 부피의 tRNA, 1/10 부피의 3 M 소듐 아세테이트 (pH 4.5)와 3배 부피의 100% 에탄올을 첨가하여 -70℃에서 1시간 이상 반응시켰다. 회수된 DNA는 85℃에서 건조시킨 후, 50 ㎕의 증류수에 녹였다. 이를 통하여 획득된 각 ssDNA들은 각각 100와 10-1 로 희석하여 실시간 PCR 기법의 주형 DNA로 사용하였다. 실시간 PCR은 iQ SYBR Green Supermix (Bio-rad, USA)를 이용하였으며, 실시간 PCR 반응 조건은 우선, 95℃에서 5분 변성 이후, 95℃에서 20초, 52℃에서 20초, 그리고 72℃에서 20초간 반응하는 과정을 40주기 반복한 후, 72℃에서 5분간 연장시키는 반응 조건으로 반응을 진행하였다. 실시간 PCR 결과는 10-1로 희석된 샘플을 주형 DNA로 이용한 실험에서 결과를 획득할 수 있었다. 실시간 PCR 효율은 각 7, 8, 9 라운드별로 55.30%, 68.79%, 36.79%였으며, 7 라운드와 9 라운드에서 획득한 ssDNA를 주형 DNA로 이용한 실시간 PCR Ct값은 18.24, 19.08로 8 라운드 Ct값인 17.49의 결과 보다 값이 높게 나왔다. 8 라운드의 ssDNA 앱타머들이 7 라운드와 9라운드와 비교하여 높은 앱타머 농도의 풀임을 확인할 수 있었으며 더 이상 SELEX를 진행이 필요 없음을 확인하였다 (표 1 참고). 이는 나노 드롭을 이용하여 확인한 각 라운드에서 회수된 앱타머 농도 측정 결과와도 일치하는 것을 확인할 수 있었다. 나노 드롭 결과 및 실시간 PCR 결과를 통하여 8 라운드의 앱타머 풀이 히스티딘 융합 LCN2 단백질과 결합 효율이 가장 높은 것을 확인할 수 있었다.
7R (1 X 10 -1 ) 8R (1 X 10 -1 ) 9R (1 X 10 -1 )
Efficiency(%) 55.30 68.79 36.79
C(t) 18.24 17.49 19.08
<실시예 5>
LCN2 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 후보군 확보
나노 드롭과 실시간 PCR을 통하여 히스티딘 융합 LCN2 단백질과 친화력이 가장 높은 것으로 판단된 8 라운드의 ssDNA 앱타머 풀에 대해 정방향 프라이머: 5'-ATACCAGCTTATTCAATT-3' (서열번호 제 12 서열)와 역방향 프라이머: 5'-AGATTGCACTTACTATCT-3' (서열번호 제 13 서열)를 이용한 PCR 수행으로 dsDNA를 획득하였다. 이렇게 획득한 dsDNA는 T-블런트 클로닝 키트 (SolGent, Korea)를 이용하여 클로닝을 수행하였다. 클로닝은 T-벡터 (10 ng/㎕) 1 ㎕와 PCR 산물 (20 ng/㎕) 4 ㎕, 6 X T-블런트 버퍼 1 ㎕를 섞어서 25℃에서 5분 동안 반응시키는 조건을 이용하였다. T-블런트 클로닝 반응액 6 ㎕는 100 ㎕의 DH5α와 섞은 후 42℃에서 30초 동안 열충격 (heat shock)을 가한 후, 2분 동안 얼음에서 반응시켰다. 여기에 900 ㎕의 SOC (2% tryptone, 0.5% yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, 20 mM glucose) 배지를 첨가한 후, 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 이후, 200 ㎕의 배양액을 취하여 암피실린 (ampicillin, 50 ㎍/ml), 카나마이신 (kanamycin, 50 ㎍/ml), X-gal (50 ㎍/ml), IPTG (5 ㎍/ml)가 포함되어 있는 LB 배양 플레이트 (LB plate)에 스프레딩하고, 37℃에서 15시간 동안 배양시킨 후, 42개의 흰색 콜로니만을 선별하여 각 콜로니의 염기서열을 결정하였으며 (Solgent, Korea), 서열 분석을 통하여 중복되지 않고 LCN2 단백질과 친화력이 높은 LCN2 단백질 결합 DNA 앱타머 10개를 확보할 수 있었다. 아래 표 2는 Ni-NTA agarose를 활용한 LCN2 단백질 결합 DNA 앱타머 선별 SELEX 기법을 이용하여 획득한 LCN2 단백질 결합 DNA 앱타머 후보군 10개에 대한 서열을 구체적으로 나타낸 것이다.
클론
명칭 		서열번호 선별된 서열 서열크기
(bp)
LCN2-1 서열번호 1 GCCACGACTTGGGGAATCCTAAGGGCTGTGAACGCCGTGG 40
LCN2-2 서열번호 2 CCACAGTAGGTGAGGTTCACTGAGTTATCCATTGTTGGCA 40
LCN2-3 서열번호 3 CGCGGAGTAACTCTCGGTGGTTAACCTGCCCACAGTGGG 39
LCN2-4 서열번호 4 CCCAAGGGCGAGCTGGCGGCTTGTTGCATAAATTCGTGG 39
LCN2-5 서열번호 5 CGGAGGGCGGAAGCAAAGCGTAACAGAAAGCCAACACGCG 40
LCN2-6 서열번호 6 CCCAGCAATCCATTACTTCGTTAGTTCTAATTACCAACC 39
LCN2-7 서열번호 7 GCACGGTACGCTCTTGAGTGATCCACAATTTCTAACCGCG 40
LCN2-8 서열번호 8 CCGCGTCACCTCACTGCTCCCACTGCGTTGCGTCTCTA 38
LCN2-9 서열번호 9 CGACAATAGATCAGAACGCTCGAGTTCGCGAGGTGGGGG 39
LCN2-10 서열번호 10 GCATGCAGGAAATCATGGAGACCAAATGGGTATAGGTCG 39
<실시예 6>
LCN2 단백질 결합 DNA 앱타머 후보군들의 구조 결정
LCN2 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 후보군들의 구조는 Rensselear polytechnic institute에서 제공하는 DNA mfold 프로그램을 활용하여 이미지화 할 수 있었다 (도 3 참고).
<실시예 7>
SPR(Surface Plasmon Resonance)을 이용한 LCN2 단백질과 LCN2 결합 앱타머 후보군 간의 친화도 테스트
<7-1> LCN2 단백질과 이에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 후보군들 간의 각 친화도를 정량하기 위한 LCN2 단백질 코팅 센서 칩 제작 실험
LCN2 단백질과 상기 실시예 5에서 획득한 앱타머 후보군들간의 친화도를 정량하기 위하여, 본 발명자들은 SPR 검출 시스템 기기인 BIAcore 3000 (BIACORE)을 이용하여 표면 플라즈몬 공명 (Surface Plasmon Resonance, SPR) 실험을 실시하였다. LCN2 단백질과 앱타머 후보군과의 친화도를 정량하기 위하여 표면이 카르복실기로 코팅된 센서 칩 CM5 (GE Healthcare, UK)을 이용하였다. 우선 센서 칩 CM5에 0.1 M Nhydroxysuccinimide (NHS)와 0.4 M N-ethyl-N'-(dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) 혼합액을 5 ㎕/min의 속도로 10분 동안 흘려 센서칩 표면의 카르복실기를 반응성이 더 좋은 N-히드록시석신이미드 에스테르 (N-Hydroxy- succinimide ester; NHS-에스테르)로 활성화시켰다. NHS-에스테르로 활성화된 센서칩 CM5의 표면에 LCN2 단백질을 고정하기 위하여 10 mM 소듐 아세테이트 (pH 4.5) 완충액에 60 ㎍/㎖의 농도로 녹아 있는 LCN2 단백질 용액을 5 ㎕/min의 속도로 10분 동안 처리하여 칩 표면을 LCN2 단백질로 코팅하였다. 이후 His 융합 사람 LCN2 단백질이 고정된 센서 칩에 1 M 에탄올아민 하이드로클로라이드 (pH 8.5)를 5 ㎕/min의 속도로 10분 동안 흘려줌으로써 센서 칩 표면에 남아 있는 카르복실 반응기를 불활성시켰다. 이를 통하여 다른 시약 및 DNA 앱타머가 칩 표면에 직접 결합하는 것을 방지하였으며, 각 실험 후 센서칩은 1 M NaCl, 50 mM NaOH로 재생시켰다. 속도 변수는 BIA 평가프로그램(BIACORE)으로 수득, 정량하였다.
<7-2> LCN2 단백질 결합 DNA 앱타머 후보군의 친화력 측정
LCN2 단백질과 가장 높은 친화력을 가지는 앱타머를 선별하기 위하여 확보된 LCN2 단백질 결합 DNA 앱타머 후보군을 HBS-EP 버퍼 (GE Healthcare, UK)에 각 300 nM, 500 nM, 700 nM, 1,000nM의 농도로 녹여 준비하였다. 기 제작 준비된 LCN2 결합 DNA 앱타머는 아무것도 결합시키지 않은 센서 칩 (채널 1)과 LCN2 단백질이 고정된 센서 칩 (채널 2)에 다양한 농도 (각 300 nM, 500 nM, 700 nM, 1,000nM)의 LCN2 결합 DNA 앱타머 후보군을 주입함으로써 LCN2 단백질과 이에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 후보군간의 친화도를 정량화하였다. 각 LCN2 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 후보군의 해리상수 (K D , dissociation) 수득 결과 히스티딘 융합 LCN2 단백질 결합 DNA 앱타머 후보군 중 LCN2_1 앱타머의 해리상수 (K D )가 6.47 X 10-16 M으로 표적하는 LCN2 단백질에 대해 가장 높은 친화도 값을 가지고 있음을 확인 할 수 있었다 (표 3 참고).
클론 명칭 K D (M) 클론 명칭 K D (M)
LCN2-1 6.47 x 10-16 LCN2-6 8.16 x 10-14
LCN2-2 2.24 x 10-15 LCN2-7 8.01 x 10-13
LCN2-3 6.97 x 10-15 LCN2-8 1.10 x 10-12
LCN2-4 7.19 x 10-15 LCN2-9 3.42 x 10-12
LCN2-5 6.09 x 10-14 LCN2-10 7.02 x 10-12
<실시예 8>
도트 블로팅 검정 (Dot blot assay)을 통한 LCN2 결합 DNA 앱타머 후보군들 간의 LCN2 결합 부위 비교
상기 실시예 5에서 획득한 앱타머 후보군들간의 LCN2와 결합부위를 확인하기 위하여 도트 블로팅 검정을 진행하였다. LCN2 결합 앱타머와 LCN2 단백질의 구체적인 결합 부위는 알 수 없으나 LCN2 다중클론성 항체 (Anti-Lipocalin 2 antibody(Mouse polyclonal))의 결합부위와 동일한 결합부위를 갖는 앱타머 또는 동일하지 않은 결합부위를 갖는 앱타머로 구분하였다. 선별된 10개의 LCN2 결합 앱타머 중 9개만 선별하여 진행하였다. 선별된 9개의 앱타머와 LCN2 단백질을 4℃에서 15시간 반응시켰다. 반응액은 메탄올로 활성화시킨 PVDF 멤브레인 (membrane)에 스포팅한 후 PBS 버퍼 (pH 7.2)로 상온에서 15분 동안 세척한 후, PBS-Tween 20과 탈지유를 포함한 A buffer로 블로킹하였다. 이 후, 스포팅한 멤브레인은 A buffer로 반응시켰으며 1차항체로서 LCN2 다중클론성 항체 (Anti-Lipocalin 2 (Mouse polyclonal))가 사용되었고, 2차 항체로는 퍼옥시다아제 (peroxidase)가 결합되어 있는 마우스의 lgG 항체를 사용하였다. 모든 반응은 상온에서 1시간 동안 수행하였고, 멤브레인은 0.5% Tween 20을 포함하고 있는 PBS 버퍼로 상온에서 15분 동안 3회 세척하였다. 반응이 끝난 멤브레인의 시그널은 ECL detection system을 이용하여 화학발광을 탐지하여 확인하였다. 1차 항체와 LCN2가 결합하는 부위와 동일한 부위에 결합하는 LCN2 앱타머의 경우 1차 항체의 결합을 방해하여 스팟이 형성되지 않으나 1차 항체의 결합부위와 다른 부위에 결합하는 LCN2 앱타머의 경우 1차 항체가 결합할 수 있는 부위가 보존되어 있어 1차 항체가 결합하여 스팟을 형성하는 것을 확인하였다 (도 4(A) 참고). 특히, LCN2 앱타머 2번의 스팟은 1차 항체의 LCN2 결합을 방해하여 스팟이 형성되지 않았고 앱타머 5번의 스팟은 1차 항체의 LCN2와의 결합을 방해하지 않아 ECL detection system에 의하여 발광이 측정되었다 (도 4(B) 참고).
<실시예 9>
LCN2 결합 DNA 앱타머를 이용한 LCN2 검출력 확인
<9-1> LCN2 단백질과 이에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머의 특이성 실험
상기 실시예 8에서 선별한 LCN2 결합 앱타머 LCN2-2와 LCN2-5를 사용하여 LCN2 단백질에 대한 LCN2 결합 DNA 앱타머의 특이성을 실험하였다. NOS group (N-oxysuccinimide esters group)으로 코팅된 각 well에 아민기(NH2)로 표지된 LCN2-5 앱타머를 1μM 농도로 계산하여 1X 앱타머 선별용액으로 전체 반응 부피를 100 ㎕로 조정하여 넣어주고 상온에서 30분 동안 교반하며 고정시킨 후 용액을 제거하였다. DNA 앱타머가 고정된 well를 1X PBS 버퍼 100㎕로 3회 헹궈준 후, LCN2 단백질과 네가티브 컨트롤 (Negative control)로 BSA, GST, prfA 단백질을 각각 100nM로 계산한 후 최종 용액 100 ㎕가 되도록 1X PBS 버퍼로 채워 각 well에 넣어 4℃에서 1시간 동안 교반하며 반응시켰다. 이후 각 well 마다 들어있는 단백질 반응 용액들을 제거하고 1X PBS 버퍼 100 ㎕로 3회 헹궈주어 LCN2 단백질을 제외한 비특이적인 물질들을 세척하여 제거하였다. 상기 실시예 8에서 선별된 앱타머 LCN2-2에 Cy5 형광물질을 표지하여 1μM로 계산하고 1X 앱타머 선별용액으로 최종 용액 100 ㎕가 되도록 채운 후 well에 넣었다. well을 호일로 싸서 빛을 차단한 후 상온에서 20분 동안 교반하며 반응시켰다. 각 well 마다 Cy5 형광물질 표지 DNA 앱타머 용액을 제거한 후 1x PBS 버퍼 100 ㎕로 세척하고 Exitation 646 nm와 Emission 662 nm에서 각 well마다의 형광값을 ELISA Reader로 측정하였다. 시료내에 LCN2 단백질이 존재하는 경우 도 5 처럼 형광 발광이 이루어지는 원리로 개발하였다.
네가티브 컨트롤로서 NOS group (C-A), Cy5 형광물질로 표지된 DNA 앱타머 (C-B), Cy5 표지 DNA 앱타머와 아민기 표지 DNA 앱타머 (C-C), LCN2 단백질과 아민기 표지 DNA 앱타머 (C-D)만 처리한 시료도 측정였다. ELISA Reader를 이용한 형광 측정결과, LCN2 단백질을 넣지 않은 샘플들인 C-A, C-B, C-C와 다른 단백질을 처리한 BSA, GST, prfA 시료에서는 형광값이 거의 나타나지 않았으나 LCN2가 존재한 시료에서는 높은 형광값이 측정되었다. 또한 LCN2 단백질과 형광물질을 함께 처리하였으나 DNA 앱타머가 well에 고정되지 않은 C-D 시료의 경우도 형광값이 거의 나타나지 않음을 확인할 수 있었다 (도 6 참고).
<9-2> LCN2 단백질의 농도에 따른 이에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머의 경향성 측정
상기 실시예 8에서 선별한 LCN2 결합 앱타머 LCN2-2와 LCN2-5를 사용하여 LCN2 단백질 농도에 따른 LCN2 결합 DNA 앱타머의 결합양상을 확인하기위한 실험을 하였다. 도 5의 원리로 실험하였고 상기 실시예 9-1과 유사한 방법으로 시행하였다. 실험 방법을 서술하자면 상기 아민기로 표지한 LCN2-5 DNA 앱타머를 1μM 농도로 계산하여 1X 앱타머 선별용액으로 전체 반응 부피를 100 ㎕로 조정한 후 NOS group으로 코팅된 well에 처리하여 상온에서 30분 동안 DNA 앱타머를 well에 고정시켰다. DNA 앱타머가 고정된 well를 1X PBS 버퍼로 헹궈준 후, 1X PBS 버퍼로 희석한 LCN2 단백질 5 ng/㎖, 10 ng/㎖, 25 ng/㎖, 50 ng/㎖, 100 ng/㎖, 250 ng/㎖, 500 ng/㎖의 7개 농도를 각 well에 넣고 4℃에서 1시간 교반하며 반응시켰다. 이후 1X PBS 버퍼로 결합하지 못한 물질들을 제거하고 상기 실시예 8에서 선별된 앱타머 LCN2-2에 Cy5 형광물질을 표지하여 1μM로 계산하고 1X 앱타머 선별용액으로 최종 용액 100 ㎕가 되도록 채운 후 well에 넣었다. well을 호일로 싸서 빛을 차단한 상태로 상온에서 20분 동안 반응시켰다. 각 well 마다 Cy5 형광물질 표지 DNA 앱타머 용액을 제거한 후 1x PBS 버퍼 100 ㎕로 세척하고 Exitation 646 nm와 Emission 662 nm에서 각 well마다의 형광값을 ELISA Reader로 측정하였다.
실험결과, LCN2 검출 키트의 검출 한계는 10 ng/㎖ 으로 나타났으며, 10 ng/㎖ 이상 존재 시 LCN2 단백질의 증가에 따라 Cy5 형광물질이 표지된 DNA 앱타머의 형광값도 함께 높아지는 것을 ELISA Reader로 측정 할 수 있었다 (도 7참고). 본 실험을 통해 앱타머 기반 LCN2 검출 키트는 인체내 LCN2를 400 ng/ml 까지 대량 존재하는 간암환자에서도 정상인과 구분할 수 있는 검출 범위를 제공 할 수 있을 것으로 기대된다.
<9-3> LCN2 특이결합 DNA 앱타머를 활용한 인체 시료내 LCN2 진단 평가
상기의 실시예를 통해 제작, 확보한 LCN2 결합 DNA 앱타머의 산업적 활용을 위하여 간암이 예상되거나 간암환자의 예후를 진단하기 위한 인체 내 시료에서 LCN2를 특이적으로 결합하는 앱타머를 이용한 LCN2 검출 방법 및 기존 간암을 진단하는 AFP 진단 키트등와 더불어 간암의 확진률을 높여줄 수 있는 앱타머 기반의 LCN2 간이 진단 키트를 개발하였다. LCN2 검출 키트는 실시예 6에서 선별한 앱타머 LCN2-5를 아민기로 표지하여 NOS group을 가지고 있는 well에 상온에서 30분동안 교반하여 고정화시킨다. 앱타머 LCN2-5가 고정된 well에 간암 환자의 인체 시료를 넣어 4℃에서 1시간동안 반응시킨다. 이후 LCN2 단백질을 제외한 비특이적인 물질들을 세척하여 제거한 후, 상기 실시예 6에서 선별된 LCN2-2 앱타머에 Cy5 형광물질을 표지하여 시료를 처리했던 well에 넣어 반응시켰다. 인체 시료 내에 LCN2 단백질이 존재하는 경우 그림 8처럼 형광 발광이 이루어지는 원리로 개발하였다. 상기의 실험결과는 LCN2에 특이적인 DNA 앱타머를 사용하여 인체 시료 내 LCN2를 검출한 형광값은 실제 환자들의 시료에 존재하는 LCN2 농도값과 유사한 양상으로 결과값이 도출되는 것을 확인할 수 있었다 (도 9참고).
상기의 실험을 통하여 제작한 앱타머 기반 LCN2 검출 키트는 복합물질인 인체 내 시료에서도 LCN2를 특이적으로 검출할 수 있음을 확인하였다(도 10참고).
이제까지 본 발명에 대하여 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation <120> DNA Aptamer Specifically Binding to LCN2 (Lipocalin 2) protein and Its Use <130> PN1409-281 <160> 14 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LCN2-1 <400> 1 gccacgactt ggggaatcct aagggctgtg aacgccgtgg 40 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LCN2-2 <400> 2 ccacagtagg tgaggttcac tgagttatcc attgttggca 40 <210> 3 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LCN2-3 <400> 3 cgcggagtaa ctctcggtgg ttaacctgcc cacagtggg 39 <210> 4 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LCN2-4 <400> 4 cccaagggcg agctggcggc ttgttgcata aattcgtgg 39 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LCN2-5 <400> 5 cggagggcgg aagcaaagcg taacagaaag ccaacacgcg 40 <210> 6 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LCN2-6 <400> 6 cccagcaatc cattacttcg ttagttctaa ttaccaacc 39 <210> 7 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LCN2-7 <400> 7 gcacggtacg ctcttgagtg atccacaatt tctaaccgcg 40 <210> 8 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LCN2-8 <400> 8 ccgcgtcacc tcactgctcc cactgcgttg cgtctcta 38 <210> 9 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LCN2-9 <400> 9 cgacaataga tcagaacgct cgagttcgcg aggtggggg 39 <210> 10 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LCN2-10 <400> 10 gcatgcagga aatcatggag accaaatggg tataggtcg 39 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 11 ataccagctt attcaatt 18 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 12 agattgcact tactatct 18 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer_biotin <400> 13 agattgcact tactatct 18 <210> 14 <211> 198 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCN2 <400> 14 Met Pro Leu Gly Leu Leu Trp Leu Gly Leu Ala Leu Leu Gly Ala Leu 1 5 10 15 His Ala Gln Ala Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro 20 25 30 Leu Ser Lys Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln 35 40 45 Gly Lys Trp Tyr Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Ala Ile Leu Arg Glu 50 55 60 Asp Lys Asp Pro Gln Lys Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu 65 70 75 80 Asp Lys Ser Tyr Asn Val Thr Ser Val Leu Phe Arg Lys Lys Lys Cys 85 90 95 Asp Tyr Trp Ile Arg Thr Phe Val Pro Gly Cys Gln Pro Gly Glu Phe 100 105 110 Thr Leu Gly Asn Ile Lys Ser Tyr Pro Gly Leu Thr Ser Tyr Leu Val 115 120 125 Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys 130 135 140 Lys Val Ser Gln Asn Arg Glu Tyr Phe Lys Ile Thr Leu Tyr Gly Arg 145 150 155 160 Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser 165 170 175 Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile 180 185 190 Asp Gln Cys Ile Asp Gly 195

Claims (12)

  1. 리포칼린 2(Lipocalin 2; LCN2) 단백질과 특이적으로 결합하는 LCN2 단백질 특이적 DNA 앱타머.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 DNA 앱타머는 리포칼린 2(Lipocalin 2; LCN2) 단백질과 특이적으로 결합하는 서열번호 1 내지 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 군 중 선택된 어느 하나의 염기서열과 90% 이상의 동일성을 갖는 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleiotide)인 것을 특징으로 하는 DNA 앱타머.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 DNA 앱타머는 서열번호 1 내지 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)인 것을 특징으로 하는 DNA 앱타머.
  4. 제 1항 내지 제 3항의 어느 한 항에 있어서,
    상기 DNA 앱타머는 표지물질을 더 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 DNA 앱타머.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 DNA 앱타머는 형광물질, 아민기, 바이오틴 및 티올기로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 표지물질이 상기 DNA 앱타머의 5' 말단 또는 3' 말단에 표지되는 것을 특징으로 하는 DNA 앱타머.
  6. 제 1항 내지 제 3항의 어느 한 항에 있어서,
    상기 DNA 앱타머는 상기 DNA 앱타머를 구성하는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 리보스 2' 위치의 하이드록시기가 수소원자, 불소원자, -OR, -COOR 및 아미노기로 이루어진 군 중 어느 하나로 치환된 것을 특징으로 하는 DNA 앱타머.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 리포칼린 2(Lipocalin 2; LCN2) 단백질은 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 DNA 앱타머.
  8. 리포칼린 2(Lipocalin 2; LCN2) 단백질에 특이적으로 결합하는 서열번호 1 내지 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 군 중 선택된 어느 하나의 염기서열을 갖는 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는, 리포칼린 2의 검출 또는 간암 진단용 조성물.
  9. 리포칼린 2(Lipocalin 2; LCN2) 단백질에 특이적으로 결합하는 서열번호 1 내지 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 군 중 선택된 어느 하나의 염기서열을 갖는 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 리포칼린 2 검출 또는 간암 진단용 키트.
  10. 리포칼린 2(Lipocalin 2; LCN2) 단백질에 특이적으로 결합하는 서열번호 1 내지 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 군 중 선택된 어느 하나의 염기서열을 갖는 DNA 앱타머가 기판에 집적되어 리포칼린 2를 포함하는 시료에 특이적으로 반응하는 것을 특징으로 하는 리포칼린 2 검출 또는 간암 진단용 키트.
  11. 제 9항에 있어서,
    상기 기판은 종이, 플라스틱, 유리, 금속 및 실리콘으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 리포칼린 2 검출 또는 간암 진단용 키트.
  12. (a) 생체로부터 분리된 생물학적 시료와 LCN2 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 생물학적 시료와 상기 DNA 앱타머 간의 LCN2 단백질 특이적 결합 반응을 통해 LCN2의 존부를 확인하는 단계;를 포함하는 간암의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
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CN107561284A (zh) * 2016-03-25 2018-01-09 蒋志超 易于操作的甲胎蛋白试剂盒
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