JP2016533752A - オリゴヌクレオチドプローブおよびその使用 - Google Patents

オリゴヌクレオチドプローブおよびその使用 Download PDF

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Abstract

標的バイオマーカーに結合し、表現型の特徴決定を可能にするオリゴヌクレオチドのための方法および組成物が提供される。標的バイオマーカーは、微小胞抗原、例えば様々な疾患に由来する微小胞を含み得る。特徴決定は、疾患または障害の検出、診断、予後判定、セラノーシスまたは他の特徴決定を含み得る。

Description

相互参照
本出願は、2013年8月28日に出願された米国特許仮出願第61/871,107号；2013年9月6日に出願された同第61/874,621号；2013年11月6日に出願された同第61/900,975号；2013年12月5日に出願された同第61/912,471号；2014年1月6日に出願された同第61/924,192号；2014年3月6日に出願された同第61/949,216号；2014年4月3日に出願された同第61/974,949号；2014年5月7日に出願された同第61/990,085号；2014年5月16日に出願された同第61/994,704号；および2014年7月14日に出願された同第62/024,436号の恩典を主張し、これらの全ての出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
EFS-WEB経由で提出された配列表
MPEP §1730 II.B.2(a)において認可されかつ明記される米国特許商標庁EFS-WEBサーバを介した配列表の以下の電子的提出物の全内容は、参照によりその全体があらゆる目的のために本明細書に組み入れられる。この配列表は、電子的に提出された、以下に特定されるテキストファイルに包含されている。
ファイル名：37901820601SeqList.txt
作成日：2014年8月27日
サイズ（バイト）：101,923,503バイト
発明の背景
本発明は、微小胞表面抗原に結合することが可能なアプタマーの分野に概して関連し、これらのアプタマーは、微小胞が関係する癌および/または他の疾患もしくは障害の治療薬および診断薬として有用である。本発明はさらに、微小胞に結合することが可能なアプタマーの投与のための材料および方法にも関連する。微小胞は、癌、例えば乳癌であることを示す細胞に由来し得る。
アプタマーは、分子に対する特異的な結合親和性を有する多量体核酸分子であり、これは古典的なワトソン-クリック型塩基対形成以外の相互作用を介してもよい。アプタマー、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドなどの用語は、本明細書において互換可能に使用され得る。
アプタマーは、ファージディスプレイによって作製されたペプチドまたはモノクローナル抗体（「mAb」）と同様に、選択された標的に特異的に結合することおよび標的が有する活性を調節することが可能であり、例えばアプタマーは、結合を通してそれらの標的が機能する能力をブロックし得る。インビトロ選択プロセスによってランダム配列オリゴヌクレオチドのプールから作製される場合、アプタマーは、成長因子、転写因子、酵素、免疫グロブリン、および受容体を含む100種を超えるタンパク質に対して作製されている。典型的なアプタマーは、サイズが10〜15 kDa（30〜45ヌクレオチド）であり、サブナノモルの親和性によってその標的に結合し、かつ密接に関連する標的を識別する（例えば、アプタマーは典型的に、同じ遺伝子ファミリー由来の他のタンパク質には結合しない）。一連の構造試験は、アプタマーが、抗体-抗原複合体において親和性および特異性を駆動する同じタイプの結合相互作用（例えば、水素結合、静電気的相補性、疎水性接触、立体排除）を使用できることを示している。
アプタマーは、高い特異性および親和性、生物学的有効性、ならびに優れた薬物動態学的特性を含む、治療薬および診断薬として使用するための複数の望ましい特徴を有する。加えて、これらは抗体および他のタンパク質生物製剤と比較して、例えば以下の特有の競合的優位性を有している。
スピードおよび管理
アプタマーは、全面的にインビトロプロセスによって作製され、このことは、治療用リードを含む最初のリードの迅速な作製を可能にする。インビトロ選択は、アプタマーの特異性および親和性が厳しく管理されることを可能にし、かつ毒性および非免疫原性の標的の両方に対するリードを含むリードの作製を可能にする。
毒性および免疫原性
あるクラスのアプタマーは、毒性も免疫原性もほとんど無いかまたは全くないことが実証されている。高レベルのアプタマーによるラットまたはウッドチャックの長期にわたる投薬（毎日10 mg/kgを90日間）において、臨床的、細胞の、または生化学的測定のどれによっても毒性は観察されない。一方、多くのモノクローナル抗体の有効性は、抗体自身に対する免疫応答によって激しく制限され得る。最も可能性が高い理由としてアプタマーがMHCを介してT細胞に対して提示されず、かつ免疫応答は一般に核酸断片を認識しないようにされていることから、アプタマーに対する抗体を顕在化させることは極めて困難である。
投与
このことから、最近承認された抗体治療薬は、静脈内注入（典型的に2〜4時間にわたる）によって投与され、アプタマーは、皮下注射によって投与することができる（皮下投与によるアプタマーの生物学的利用率は、サルにおける研究では80%を超える（Tucker et al., J. Chromatography B. 732: 203-212, 1999（非特許文献1）））。この違いは、比較的低い溶解性およびこれによる大部分の治療用mAbに必要な多大な量に主に起因する。良好な溶解性（>150 mg/mL）かつ比較的低い分子量（アプタマー：10〜50 kDa；抗体：150 kDa）では、アプタマーの一週間の用量は、注射により0.5 mL未満の量で送達され得る。加えて、小さいサイズのアプタマーは、これらが、抗体または抗体断片は侵入することができない立体構造的に狭窄の領域中に侵入することを可能にする。このことは、アプタマーをベースにした治療薬または予防法のさらに別の利点を示している。
スケーラビリティおよびコスト
アプタマーは、化学的に合成され、かつ診断的または治療的用途のための生産需要を満たすために必要に応じて容易にスケール変更される。生産のスケール変更における問題は、現在一部の生物製剤の有用性を制限しており、かつ大規模なタンパク質生産プラントの資本コストは莫大であるが、単一の大規模オリゴヌクレオチド合成装置は、100 kg/年を上回って生産することができ、かつ必要とする初期投資は比較的控えめである。キログラムスケールでのアプタマー合成用の製品の現在のコストは$100/gと推定され、これは高度に最適化された抗体用のコストに匹敵する。
安定性
アプタマーは、化学的に頑強である。これらは元来、熱および変性剤などの因子に対する暴露に続いて活性を回復するように適合されており、かつ長期の間（>1年）、室温で凍結乾燥粉末として保管することができる。
参照による組み込み
本明細書で言及したすべての刊行物、特許、および特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により本明細書に組み入れられているよう具体的かつ個々に示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み入れられる。
Tucker et al., J. Chromatography B. 732: 203-212, 1999
本発明の組成物および方法は、微小胞表面抗原または微小胞表面抗原の機能的断片などの関心対象のバイオマーカーに結合するアプタマーを提供する。様々な態様において、本発明のアプタマーは、診断、予後判定、またはセラノーシス用の（theranostic）プロセスにおいて、診断用の読み出し情報を提供することが確認されている微小胞表面抗原の存在またはレベルについて、生物学的試料をスクリーニングするために使用される。診断は、癌、たとえば乳癌に関し得る。他の態様において、本発明のアプタマーは、治療用途のための薬学的組成物において化学的に修飾または構成される。
ある局面において、本発明は、SEQ ID NO: 10558に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同であるオリゴヌクレオチドを提供する。関連する局面において、本発明は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000、500000、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017または少なくとも1018個の異なるオリゴヌクレオチド配列を含み、各オリゴヌクレオチド配列またはその部分がSEQ ID NO: 10558に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である、複数のオリゴヌクレオチドを提供する。
もう一つの局面において、本発明は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000または500000個の異なるオリゴヌクレオチド配列を含み、各オリゴヌクレオチド配列またはその部分がSEQ ID NO: 10559〜510558から選択される配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である、複数のオリゴヌクレオチドを提供する。関連する局面において、本発明は、SEQ ID NO: 10559〜510558にリストされたオリゴヌクレオチドの少なくとも50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％または少なくとも99％を含む、オリゴヌクレオチドプローブライブラリーを提供する。
さらに別の局面において、本発明は、SEQ ID NO: 510559〜510578から選択される配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である核酸配列またはその部分を含む、オリゴヌクレオチドを提供する。関連する局面において、本発明は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個の異なるオリゴヌクレオチド配列を含み、各オリゴヌクレオチド配列またはその部分がSEQ ID NO: 510559〜510578に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である、複数のオリゴヌクレオチドを提供する。
さらに別の局面において、本発明は、SEQ ID NO: 510579〜510598から選択される配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である核酸配列またはその部分を含む、オリゴヌクレオチドを提供する。関連する局面において、本発明は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個の異なるオリゴヌクレオチド配列を含み、各オリゴヌクレオチド配列またはその部分がSEQ ID NO: 510579〜510598に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である、複数のオリゴヌクレオチドを提供する。
ある局面において、本発明は、SEQ ID NO: 510599〜510763から選択される配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である核酸配列またはその部分を含む、オリゴヌクレオチドを提供する。関連する局面において、本発明は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、125、130、140、150、160または165個の異なるオリゴヌクレオチド配列を含み、各オリゴヌクレオチド配列またはその部分がSEQ ID NO: 510599〜510763に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である、複数のオリゴヌクレオチドを提供する。さらに別の関連する局面において、本発明は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、125、130、140、150、160または165個の異なるオリゴヌクレオチド配列を含み、各オリゴヌクレオチド配列またはその部分が表16に列挙した配列番号に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である、複数のオリゴヌクレオチドを提供する。
本明細書に提供される核酸配列はまた、機能的局面（たとえば様々な標的への結合または表現型を特徴決定する能力）が維持される限り、所望により修飾されることができる。そのような修飾は本明細書の中で「機能的修飾」と呼ばれ得る。機能的修飾は、オリゴヌクレオチドの機能的局面を増強し得る、またはそれに対してほとんどまたは全く影響を及ぼし得ない。たとえば、オリゴヌクレオチドは、DNAまたはRNAを含み得る、様々な非天然ヌクレオチドを組み込み得る、他の化学的修飾を組み込み得る、または様々な欠失もしくは挿入を含み得る。そのような修飾は、合成、安定性、送達、標識などを容易にし得る、または実際にはほとんどまたは全く影響を及ぼし得ない。いくつかの場合、オリゴヌクレオチド中のいくつかのヌクレオチドが置換されていても、そのオリゴヌクレオチドの機能的局面は維持され得る。同様に、5'および3'隣接領域が置換されていてもよい。さらに他の場合において、オリゴヌクレオチドの一部分だけがその機能性を指示するように決定されて、他の部分は欠失または置換されることができるようにしてもよい。ヌクレオチドおよびポリヌクレオチドを合成し、修飾するための数多くの技術が、様々な化学的修飾を含め、本明細書に開示されている、または当技術分野において公知である。
ある局面において、本発明はまた、上記発明によって提供されるものであることができるオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドを試料と接触させる工程および試料中の標的へのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドの結合の存在またはレベルを検出する工程を含む方法を提供する。試料は、生物学的試料、有機試料、無機試料、組織、細胞培養物、体液、血液、血清、細胞、微小胞、タンパク質複合体、脂質複合体、糖質またはそれらの任意の組み合わせ、部分もしくは変種を含み得る。標的は、細胞、オルガネラ、タンパク質複合体、リポタンパク質、糖質、微小胞、膜断片、小分子、重金属、毒素または薬物を含み得る。
関連する局面において、本発明は、（a）微小胞を含む生物学的試料をオリゴヌクレオチドプローブライブラリーと接触させる工程であって、任意で、オリゴヌクレオチドプローブライブラリーが、上記発明によって提供されるオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドを含む、工程；（b）微小胞の少なくとも一部分に結合したオリゴヌクレオチドを同定する工程；および（c）同定されたオリゴヌクレオチドのプロファイルに基づいて試料を特徴決定する工程を含む、方法を提供する。
もう一つの局面において、本発明は、（a）溶解状態の混合物を形成するために、試料を、少なくとも106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017または少なくとも1018個の異なるオリゴヌクレオチド配列のオリゴヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドプローブライブラリーと接触させる工程であって、オリゴヌクレオチドが、試料中の複数の実体に結合して複合体を形成することができ、任意で、オリゴヌクレオチドプローブライブラリーが、上記発明によって提供されるオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドを含む、工程；（b）工程（a）で形成された複合体を混合物から分割する工程；および（c）試料に関するオリゴヌクレオチドプロファイルを同定するために、工程（b）で分割された複合体中に存在するオリゴヌクレオチドを検出する工程を含む、方法を提供する。ある態様において、検出する工程は、複合体中のすべてもしくはいくつかのオリゴヌクレオチドの配列決定、複合体中のすべてもしくはいくつかのオリゴヌクレオチドの増幅、および/または複合体中のすべてもしくはいくつかのオリゴヌクレオチドの、アレイへのハイブリダイゼーションを実施する工程を含む。アレイは、任意の有用なアレイ、たとえば平面または粒子ベースのアレイであることができる。
さらに別の局面において、本発明は、（a）第一のオリゴヌクレオチドライブラリーを生物学的試験試料および生物学的対照試料と接触させる工程であって、生物学的試料中に存在する生物学的実体と、第一のオリゴヌクレオチドライブラリー中に存在する複数のオリゴヌクレオチドとの間に複合体が形成される、工程；（b）生物学的試験試料および生物学的対照試料それぞれに関してオリゴヌクレオチドのサブセットを生成するために、工程（a）で形成された複合体を分割して、複合体中のオリゴヌクレオチドを単離する工程；（c）（b）におけるオリゴヌクレオチドのサブセットを生物学的試験試料および生物学的対照試料と接触させる工程であって、生物学的試料中に存在する生物学的実体と、オリゴヌクレオチドのサブセット中に存在する第二の複数のオリゴヌクレオチドとの間に複合体が形成されて、オリゴヌクレオチドの第二のサブセット群を生成する、工程；および（d）オリゴヌクレオチドのそれぞれ第三、第四、第五またはそれ以降のサブセット群を生成するために、任意で、工程（b）〜（c）を一回、二回、三回またはより多く繰り返して、それによって、富化されたオリゴヌクレオチドプローブライブラリーを生成する工程を含む、富化されたオリゴヌクレオチドプローブライブラリーを生成する方法を提供する。関連する局面において、本発明は、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000または500000個の異なるオリゴヌクレオチド配列を含む複数のオリゴヌクレオチドであって、本段落における方法から得られ、ライブラリーが第一の表現型を第二の表現型と区別することができる、複数のオリゴヌクレオチドを提供する。いくつかの態様において、第一の表現型は疾患もしくは障害を含み、第二の表現型は健康な状態を含む；または第一の表現型は疾患もしくは障害を含み、第二の表現型は異なる疾患もしくは障害を含む；または第一の表現型は疾患もしくは障害のある病期もしくは進行を含み、第二の表現型は同じ疾患もしくは障害の異なる病期もしくは進行を含む；または第一の表現型は治療に対する正の応答を含み、第二の表現型は同じ治療に対する負の応答を含む。
さらに別の局面において、本発明は、（a）生物学的試験試料を、本発明によって提供されるオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドと接触させる工程；（b）工程（a）で本発明によって提供されるオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドと生物学的試験試料中の標的との間に形成された複合体の存在またはレベルを検出する工程；および（c）工程（b）で検出された存在またはレベルを、生物学的対照試料からの参照レベルと比較し、それによって疾患または障害を特徴決定する工程を含む、疾患または障害を特徴決定する方法を提供する。検出する工程は、複合体中のすべてもしくはいくつかのオリゴヌクレオチドの配列決定、複合体中のすべてもしくはいくつかのオリゴヌクレオチドの増幅、および/または複合体中のすべてもしくはいくつかのオリゴヌクレオチドの、アレイへのハイブリダイゼーションを実施する工程を含み得る。配列決定はハイスループットまたは次世代配列決定であり得る。
本発明の方法において、生物学的試験試料および生物学的対照試料は、それぞれ、組織試料、細胞培養物または生物学的流体を含み得る。いくつかの態様において、生物学的流体は体液を含む。本発明の方法の中で有用な体液は、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（CSF）、痰、唾液、骨髄、滑液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー腺液もしくは尿道球腺液、女性射精液、汗、糞便、体毛、涙液、嚢胞液、胸膜液および腹膜液、心膜液、リンパ液、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、月経分泌物、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌液、粘膜分泌液、水便、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液、胚盤胞腔液または臍帯血を含む。いくつかの好ましい態様において、体液は血液、血清または血漿を含む。生物学的流体は微小胞を含み得る。そのような場合、複合体は、オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドと少なくとも一つの微小胞との間で形成され得る。
生物学的試験試料および生物学的対照試料は、単離された微小胞をさらに含み得、任意で、微小胞は、クロマトグラフィー、ろ過、限外ろ過、遠心分離、超遠心分離、フローサイトメトリー、アフィニティー捕捉（たとえば平面、カラムまたはビーズへの）、ポリマー沈殿の少なくとも一つを使用し、かつマイクロ流体工学を使用して単離される。微小胞はまた、オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドとの接触の後で単離することもできる。
本発明の方法の様々な態様において、オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドはポリペプチドまたはその断片に結合する。ポリペプチドまたはその断片は可溶性または膜結合状態であることができ、任意で、膜は微小胞膜を含む。膜はまた、小胞の細胞または細胞の断片からの膜であることもできる。いくつかの態様において、ポリペプチドまたはその断片は表3または表4中のバイオマーカーを含む。たとえば、ポリペプチドまたはその断片は、表3におけるような一般的小胞マーカーまたは表4におけるような組織関連もしくは疾患関連のマーカーであることもできる。オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、生物学的試料中の微小胞表面抗原に結合し得る。たとえば、オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、微小胞に対してナイーブライブラリーから富化することができる。
本明細書に提供されるオリゴヌクレオチド、複数のオリゴヌクレオチドまたは方法によって検出される疾患または障害は、関心対象の任意の適切な疾患または障害、たとえば非限定的に、乳癌、アルツハイマー病、気管支喘息、膀胱移行上皮癌、巨細胞オステオブラストクラストーマ、脳腫瘍、結腸直腸腺癌、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、子宮頸部扁平上皮癌、急性心筋梗塞（AMI）/急性心不全、クローン病、II型糖尿病、食道癌、喉頭扁平上皮癌、急性および慢性骨髄白血病、肺癌、悪性リンパ腫、多発性硬化症、卵巣癌、パーキンソン病、前立腺腺癌、乾癬、関節リウマチ、腎細胞癌、皮膚有棘細胞癌、胃腺癌、甲状腺癌、精巣癌、潰瘍性大腸炎または子宮腺癌を含み得る。
いくつかの態様において、疾患または障害は、癌、前癌状態、炎症性疾患、免疫疾患、自己免疫疾患もしくは障害、心血管疾患もしくは障害、神経疾患もしくは障害、感染症または疼痛を含む。癌は、非限定的に、急性リンパ芽球性白血病；急性骨髄性白血病；副腎皮質癌；AIDS関連癌；AIDS関連リンパ腫；肛門癌；虫垂癌；星状細胞腫；非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍；基底細胞癌；膀胱癌；脳幹神経膠腫；脳腫瘍（脳幹神経膠腫、中枢神経系非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍、中枢神経系胚芽腫、星状細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣芽腫、上衣腫、髄芽腫、髄上皮腫、中間型松果体実質腫瘍、テント上原始神経外胚葉性腫瘍および松果体芽腫を含む）；乳癌；気管支腫瘍；バーキットリンパ腫；原発不明癌；カルチノイド腫瘍；原発不明癌腫；中枢神経系非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍；中枢神経系胚芽腫；子宮頸癌；小児癌；脊索腫；慢性リンパ球性白血病；慢性骨髄性白血病；慢性骨髄増殖性障害；結腸癌；結腸直腸癌；頭蓋咽頭腫；皮膚T細胞リンパ腫；内分泌膵島細胞腫瘍；子宮内膜癌；上衣芽腫；上衣腫；食道癌；鼻腔神経芽細胞腫；ユーイング肉腫；頭蓋外胚細胞腫瘍；性腺外胚細胞腫瘍；肝外胆管癌；胆嚢癌；胃癌；消化管カルチノイド腫瘍；消化管間質細胞腫瘍；消化管間質腫瘍（GIST）；妊娠性絨毛性腫瘍；神経膠腫；毛様細胞性白血病；頭頸部癌；心臓癌；ホジキンリンパ腫；下咽頭癌；眼内黒色腫；膵島腫瘍；カポジ肉腫；腎臓癌；ランゲルハンス細胞組織球症；喉頭癌；口唇癌；肝臓癌；肺癌；悪性線維性組織球腫；骨癌；髄芽腫；髄上皮腫；黒色腫；メルケル細胞癌；メルケル細胞皮膚癌；中皮腫；原発不明転移性扁平上皮性頸部癌；口腔癌；多発性内分泌腫瘍症候群；多発性骨髄腫；多発性骨髄腫/形質細胞腫瘍；菌状息肉腫；骨髄異形成症候群；骨髄増殖性腫瘍；鼻腔癌；鼻咽頭癌；神経芽細胞腫；非ホジキンリンパ腫；非黒色腫皮膚癌；非小細胞肺癌；口腔癌；口腔癌；口腔咽頭癌；骨肉腫；他の脳および脊髄の腫瘍；卵巣癌；卵巣上皮癌；卵巣胚細胞腫瘍；卵巣低悪性度腫瘍；膵臓癌；乳頭腫症；副鼻腔癌；副甲状腺癌；骨盤癌；陰茎癌；咽頭癌；中間型松果体実質腫瘍；松果体芽腫；下垂体腫瘍；形質細胞腫瘍/多発性骨髄腫；胸膜肺芽腫；原発性中枢神経系（CNS）リンパ腫；原発性肝細胞肝癌；前立腺癌；直腸癌；腎臓癌；腎細胞（腎臓）癌；腎細胞癌；気道癌；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；唾液腺癌；セザリー症候群；小細胞肺癌；小腸癌；軟部組織肉腫；扁平上皮癌；頸部扁平上皮癌；胃癌；テント上原始神経外胚葉性腫瘍；T細胞リンパ腫；精巣癌；咽喉癌；胸腺癌；胸腺腫；甲状腺癌；移行上皮癌；腎盂尿管移行上皮癌；絨毛性腫瘍；尿管癌；尿道癌；子宮癌；子宮肉腫；膣癌；外陰癌；ワルデンシュトレームマクログロブリン血症；またはウィルムス腫瘍の一つを含むことができる。前癌状態は非限定的にバレット食道を含むことができる。自己免疫疾患は、非限定的に、炎症性腸疾患（IBD）、クローン病（CD）、潰瘍性大腸炎（UC）、骨盤炎症、血管炎、乾癬、糖尿病、自己免疫性肝炎、多発性硬化症、重症筋無力症、I型糖尿病、関節リウマチ、乾癬、全身性エリテマトーデス（SLE）、橋本甲状腺炎、グレーブス病、強直性脊椎炎、シェーグレン病、CREST症候群、強皮症、リウマチ性疾患、臓器拒絶反応、原発性硬化性胆管炎または敗血症の一つを含むことができる。心血管疾患は、非限定的に、アテローム性動脈硬化症、うっ血性心不全、不安定プラーク、脳卒中、虚血、高血圧症、狭窄症、血管閉塞または血栓性イベントの一つを含むことができる。神経疾患は、非限定的に、多発性硬化症（MS）、パーキンソン病（PD）、アルツハイマー病（AD）、統合失調症、双極性障害、うつ病、自閉症、プリオン病、ピック病、認知症、ハンチントン病（HD）、ダウン症候群、脳血管疾患、ラズムッセン脳炎、ウイルス性髄膜炎、神経精神全身性エリテマトーデス（NPSLE）、筋萎縮性側索硬化症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、伝達性海綿状脳症、虚血再灌流傷害（たとえば脳卒中）、脳損傷、微生物感染または慢性疲労症候群の一つを含むことができる。疼痛は、非限定的に、線維筋痛症、慢性神経因性疼痛または末梢神経因性疼痛の一つを含むことができる。感染症は、非限定的に、細菌感染、ウイルス感染、酵母菌感染、ウィップル病、プリオン病、肝硬変、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、HIV、HCV、肝炎、梅毒、髄膜炎、マラリア、結核またはインフルエンザの一つを含むことができる。当業者は、本発明のオリゴヌクレオチドもしくは複数のオリゴヌクレオチドまたは方法を使用して、任意の数のこれらまたは他の関連する疾患および障害を評価することができることを理解するであろう。
本発明のいくつかの態様において、オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドおよびその使用方法は、特定の疾患または疾患状態を特徴決定するのに有用である。所望により、様々な疾患を特徴決定するのに有用なオリゴヌクレオチドのプールをアセンブルしてマスタープールを創製し、それを、様々な疾患を特徴決定するのに有用なプローブとして使用することができる。たとえば、本明細書に提供されるSEQ ID NO: 510599〜510763の組み合わせがそのようなプールを構成する。当業者はまた、特定の疾患または障害を特徴決定するのに有用なオリゴヌクレオチドのプールを創製することもできることを理解するであろう。オリゴヌクレオチドおよびそのプールは、本明細書に記載されるように修飾されることができる。
ある態様において、疾患または障害は乳癌を含み、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 510559〜510598のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30または少なくとも40個を含む。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの機能的局面が全体的または部分的に増強または維持される限り、様々な化学的修飾、付加、欠失、挿入、置換または他の修飾を組み込み得る。
もう一つの態様において、疾患または障害はアルツハイマー病を含み、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。関連する態様において、疾患または障害はアルツハイマー病を含み、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの機能的局面が全体的または部分的に増強または維持される限り、様々な化学的修飾、付加、欠失、挿入、置換または他の修飾を組み込み得る。
疾患または障害は気管支喘息を含み得、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。また、疾患または障害は気管支喘息を含み得、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの機能的局面が全体的または部分的に増強または維持される限り、様々な化学的修飾、付加、欠失、挿入、置換または他の修飾を組み込み得る。
いくつかの態様において、疾患または障害は膀胱移行上皮癌を含み、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの機能的局面が全体的または部分的に増強または維持される限り、様々な化学的修飾、付加、欠失、挿入、置換または他の修飾を組み込み得る。
もう一つの態様において、疾患または障害は巨細胞オステオブラストクラストーマを含み、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの機能的局面が全体的または部分的に増強または維持される限り、様々な化学的修飾、付加、欠失、挿入、置換または他の修飾を組み込み得る。
疾患または障害は脳腫瘍を含み得、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの機能的局面が全体的または部分的に増強または維持される限り、様々な化学的修飾、付加、欠失、挿入、置換または他の修飾を組み込み得る。
もう一つの態様において、疾患または障害は結腸直腸腺癌を含み、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの機能的局面が全体的または部分的に増強または維持される限り、様々な化学的修飾、付加、欠失、挿入、置換または他の修飾を組み込み得る。
さらに別の態様において、疾患または障害は慢性閉塞性肺疾患（COPD）を含み、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。関連する態様において、疾患または障害は慢性閉塞性肺疾患（COPD）を含み、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの機能的局面が全体的または部分的に増強または維持される限り、様々な化学的修飾、付加、欠失、挿入、置換または他の修飾を組み込み得る。
疾患または障害は子宮頸部扁平上皮癌であることができ、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの機能的局面が全体的または部分的に増強または維持される限り、様々な化学的修飾、付加、欠失、挿入、置換または他の修飾を組み込み得る。
疾患または障害は急性心筋梗塞（AMI）または急性心不全を含み得、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。関連する態様において、疾患または障害は急性心筋梗塞（AMI）または急性心不全を含み、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの機能的局面が全体的または部分的に増強または維持される限り、様々な化学的修飾、付加、欠失、挿入、置換または他の修飾を組み込み得る。
いくつかの態様において、疾患または障害はクローン病を含み、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。関連する態様において、疾患または障害はクローン病を含み、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの機能的局面が全体的または部分的に増強または維持される限り、様々な化学的修飾、付加、欠失、挿入、置換または他の修飾を組み込み得る。
疾患または障害はII型糖尿病を含み得、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。関連して、疾患または障害はII型糖尿病を含み得、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの機能的局面が全体的または部分的に増強または維持される限り、様々な化学的修飾、付加、欠失、挿入、置換または他の修飾を組み込み得る。
いくつかの態様において、疾患または障害は食道癌を含み、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの機能的局面が全体的または部分的に増強または維持される限り、様々な化学的修飾、付加、欠失、挿入、置換または他の修飾を組み込み得る。
もう一つの態様において、疾患または障害は喉頭扁平上皮癌を含み、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの機能的局面が全体的または部分的に増強または維持される限り、様々な化学的修飾、付加、欠失、挿入、置換または他の修飾を組み込み得る。
さらに別の態様において、疾患または障害は急性または慢性骨髄白血病を含み、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの機能的局面が全体的または部分的に増強または維持される限り、様々な化学的修飾、付加、欠失、挿入、置換または他の修飾を組み込み得る。
さらに別の態様において、疾患または障害は肺癌を含み、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの機能的局面が全体的または部分的に増強または維持される限り、様々な化学的修飾、付加、欠失、挿入、置換または他の修飾を組み込み得る。
疾患または障害は悪性リンパ腫を含み得、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの機能的局面が全体的または部分的に増強または維持される限り、様々な化学的修飾、付加、欠失、挿入、置換または他の修飾を組み込み得る。
疾患または障害はまた、多発性硬化症を含み得、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。関連して、疾患または障害は多発性硬化症を含み得、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの機能的局面が全体的または部分的に増強または維持される限り、様々な化学的修飾、付加、欠失、挿入、置換または他の修飾を組み込み得る。
ある態様において、疾患または障害は卵巣癌を含み、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの機能的局面が全体的または部分的に増強または維持される限り、様々な化学的修飾、付加、欠失、挿入、置換または他の修飾を組み込み得る。
もう一つの態様において、疾患または障害はパーキンソン病を含み、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。関連する態様において、疾患または障害はパーキンソン病を含み、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの機能的局面が全体的または部分的に増強または維持される限り、様々な化学的修飾、付加、欠失、挿入、置換または他の修飾を組み込み得る。
さらに別の態様において、疾患または障害は前立腺腺癌を含み、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの機能的局面が全体的または部分的に増強または維持される限り、様々な化学的修飾、付加、欠失、挿入、置換または他の修飾を組み込み得る。
さらに別の態様において、疾患または障害は乾癬を含み、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの機能的局面が全体的または部分的に増強または維持される限り、様々な化学的修飾、付加、欠失、挿入、置換または他の修飾を組み込み得る。
疾患または障害は乾癬であることができ、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの機能的局面が全体的または部分的に増強または維持される限り、様々な化学的修飾、付加、欠失、挿入、置換または他の修飾を組み込み得る。
疾患または障害はまた、関節リウマチであることができ、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの機能的局面が全体的または部分的に増強または維持される限り、様々な化学的修飾、付加、欠失、挿入、置換または他の修飾を組み込み得る。
いくつかの態様において、疾患または障害は関節リウマチを含み、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの機能的局面が全体的または部分的に増強または維持される限り、様々な化学的修飾、付加、欠失、挿入、置換または他の修飾を組み込み得る。
もう一つの態様において、疾患または障害は腎細胞癌を含み、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの機能的局面が全体的または部分的に増強または維持される限り、様々な化学的修飾、付加、欠失、挿入、置換または他の修飾を組み込み得る。
さらに別の態様において、疾患または障害は皮膚有棘細胞癌を含み、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの機能的局面が全体的または部分的に増強または維持される限り、様々な化学的修飾、付加、欠失、挿入、置換または他の修飾を組み込み得る。
様々な態様において、疾患または障害は胃腺癌を含み、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの機能的局面が全体的または部分的に増強または維持される限り、様々な化学的修飾、付加、欠失、挿入、置換または他の修飾を組み込み得る。
疾患または障害は甲状腺癌を含み得、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの機能的局面が全体的または部分的に増強または維持される限り、様々な化学的修飾、付加、欠失、挿入、置換または他の修飾を組み込み得る。
疾患または障害はまた、精巣癌を含み得、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの機能的局面が全体的または部分的に増強または維持される限り、様々な化学的修飾、付加、欠失、挿入、置換または他の修飾を組み込み得る。
疾患または障害は潰瘍性大腸炎であることができ、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。関連する態様において、疾患または障害は潰瘍性大腸炎を含み、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの機能的局面が全体的または部分的に増強または維持される限り、様々な化学的修飾、付加、欠失、挿入、置換または他の修飾を組み込み得る。
疾患または障害はまた、子宮腺癌であることができ、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの機能的局面が全体的または部分的に増強または維持される限り、様々な化学的修飾、付加、欠失、挿入、置換または他の修飾を組み込み得る。
ある局面において、本発明は、本明細書に提供される発明の方法を実施するための試薬を含むキットを提供する。類似の局面において、本発明は、本明細書に提供される発明の方法を実施するための試薬の使用を考慮する。諸態様において、試薬はオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、本明細書に提供されるものであることができる。試薬は、様々な他の有用な成分、たとえば非限定的に、（a）微小胞を単離するように構成された試薬（任意で、微小胞を単離するように構成された少なくとも一つの試薬は、微小胞抗原への結合物質、カラム、基体、ろ過ユニット、ポリマー、ポリエチレングリコール、PEG4000、PEG8000、粒子またはビーズを含む）；（b）オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドを増幅、配列決定、ハイブリダイズまたは検出するためにプライマーまたはプローブとして働くように構成された少なくとも一つのオリゴヌクレオチド；および（c）試料から1種または複数種の豊富なタンパク質を除去するように構成された試薬（任意で、1種または複数種の豊富なタンパク質は、アルブミン、免疫グロブリン、フィブリノーゲンおよびフィブリンのうち少なくとも1種を含む）の一つまたは複数を含み得る。
もう一つの局面において、本発明は、（a）表8に記載されるSEQ ID NO: 8〜21またはその可変配列；（b）表11に記載されるSEQ ID NO: 24〜43またはその可変配列；（c）SEQ ID NO: 44〜10527；（d）表12に記載されるSEQ ID NO: 10528〜10557またはその可変配列；もしくは（e）任意の前記配列の機能的断片のいずれかに対して、少なくとも約50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である核酸配列を含む、アプタマーを提供する。アプタマーは微小胞表面抗原を認識し得る。本発明のアプタマーは、本明細書において、DNAまたはRNAの形態で特定され得る。特記しない限り、当業者は、アプタマーは一般的に核酸の様々な形態で合成され得る事を認識するであろう。アプタマーはまた、様々な化学修飾を有してもよく、かつ依然として本発明の範囲内であり得る。
一部の態様において、本発明のアプタマーは、少なくとも一つの化学修飾を含むように改変されている。修飾は、限定するわけではないが、核酸の、糖位置での化学的置換；リン酸位置での化学的置換；および塩基位置での化学的置換を含み得る。一部の態様において、修飾は、ビオチン化、蛍光標識の取り込み、修飾ヌクレオチドの取り込み、2'-修飾ピリミジン、3'キャッピング、アミンリンカーへの結合、非免疫原性の高分子量化合物への結合、親油性化合物への結合、薬物への結合、細胞傷害性部分への結合、および放射性同位体を用いた標識、または本明細書に開示される他の修飾からなる群より選択される。修飾の位置は、所望に応じ変化し得る。例えば、ビオチン化、蛍光標識、または細胞傷害性部分が、アプタマーの5'末端に結合し得る。ビオチン化、蛍光標識、または細胞傷害性部分はまた、アプタマーの3'末端にも結合し得る。
一部の態様において、細胞傷害性部分は、ナノ粒子中に封入されている。ナノ粒子は、リポソーム、デンドリマー、および櫛形ポリマーからなる群より選択され得る。他の態様において、細胞傷害性部分は、小分子の細胞傷害性部分を含む。小分子の細胞傷害性部分は、限定するわけではないが、ビンブラスチンヒドラジド、カリチアマイシン、ビンカアルカロイド、クリプトフィシン、ツブリシン、ドラスタチン-10、ドラスタチン-15、アウリスタチンE、リゾキシン、エポチロンB、エポチロンD、タキソイド、メイタンシノイド、ならびにそれらの任意のバリアントおよび誘導体を含み得る。さらに別の態様において、細胞傷害性部分は、タンパク毒素を含む。例えば、タンパク毒素は、ジフテリア毒素、リシン、アブリン、ゲロニン、およびシュードモナス外毒素Aからなる群より選択され得る。本発明と共に使用するための非免疫原性の高分子量化合物は、ポリアルキレングリコール、例えばポリエチレングリコールを含む。適切な放射性同位体は、イットリウム-90、インジウム-111、ヨウ素-131、ルテチウム-177、銅-67、レニウム-186、レニウム-188、ビスマス-212、ビスマス-213、アスタチン-211、およびアクチニウム-225を含む。アプタマーは、γ線放出放射性同位体によって標識されていてもよい。
本発明の一部の態様において、活性物質がアプタマーに結合している。例えば、活性物質は、治療物質または診断物質であり得る。治療物質は、チロシンキナーゼ阻害剤、キナーゼ阻害剤、生物学的活性物質、生物学的分子、放射性核種、アドリアマイシン、アンサマイシン系抗生物質、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、ブスルファン、シスプラチン、カルボプラチン、カルムスチン、カペシタビン、クロラムブチル、シタラビン、シクロホスファミド、カンプトセシン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デクスラゾキサン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エトポシド、エポチロン、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルカプトプリン、メルファラン、メトトレキサート、ラパマイシン（シロリムス）、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニトロソ尿素、パクリタクセル、パミドロナート、ペントスタチン、プリカマイシン、プロカルバジン、リツキシマブ、ストレプトゾシン、テニポシド、チオグアニン、チオテパ、タキサン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、タキソール、コンブレタスタチン、ディスコデルモリド、トランスプラチナ（transplatinum）、抗血管内皮成長因子化合物（「抗VEGF」）、抗上皮細胞成長因子受容体化合物（「抗EGFR」）、5-フルオロウラシルおよび誘導体、放射性核種、ポリペプチド毒素、アポトーシス誘導物質、治療増感物質、酵素またはその活性断片、ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択され得る。
本発明は、治療的有効量の前記アプタマーまたはその塩、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む、薬学的組成物をさらに提供する。本発明はまた、治療的有効量のアプタマーまたはその塩、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む薬学的組成物も提供する。関連して、本発明は、それを必要とする対象に薬学的組成物を投与する工程を含む、疾患または障害を治療するかまたは寛解させる方法を提供する。対象に治療的有効量の組成物を投与する工程は、以下をもたらす：（a）活性物質単独の送達と比較した、疾患部位への活性物質の送達の増大；または（b）微小胞クリアランスの増大による、アプタマーの標的となる微小胞の血中濃度の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、もしくは90%の低下；または（c）該アプタマーの標的となる微小胞の生物学的活性の、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、もしくは90%の低下。ある態様において、微小胞の生物学的活性は、免疫抑制または遺伝情報の伝達を含む。疾患または障害は、限定するわけではないが、本明細書に開示するものを含み得る。例えば、疾患または障害は、新生物性の、増殖性の、または炎症性の、代謝性の、心血管の、または神経性の疾患または障害を含み得る。上記およびさらに「表現型」の項を参照すること。
本発明は、本明細書に開示されるアプタマーまたはその薬学的組成物を含むキットをさらに提供する。
ある局面において、本発明は、前記アプタマーを生物学的試料と接触させる工程および該生物学的試料中の微小胞に対する該アプタマーの結合の有無を検出する工程を含む方法を提供する。本明細書に開示するように、生物学的試料は、組織、流体、または細胞培養物試料であり得る。例えば、生物学的試料は、血液または血液成分を含み得る。一部の態様において、アプタマーは、生物学的試料と接触させる工程の前に基体に結合している。例えば、基体はビーズまたは平板ウェルを含み得る。アプタマーはまた、検出可能な標識に結合していてもよい。方法の様々な構成が、本明細書に提供される。例えば、図2A〜2Bおよび16Aを参照されたい。
関連する局面において、本発明は、微小胞集団を含有することが疑われる生物学的試料中の該微小胞集団の存在またはレベルを検出する方法であって、該生物学的試料を、該微小胞集団に特異的な1種または複数種の結合物質および1種または複数種の前記アプタマーと接触させる工程、ならびに、該1種または複数種の結合物質および該1種または複数種のアプタマーの両方によって認識された微小胞を検出し、それによって、該生物学的試料中の該微小胞集団の存在またはレベルを検出する工程を含む、方法を提供する。
生物学的試料は、組織試料、細胞培養物、または体液であり得る。体液は、任意の有用な流体であり得、限定するわけではないが、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（CSF）、痰、唾液、骨髄、滑液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー腺液もしくは尿道球腺液、女性射精液、汗、糞便、体毛、涙液、嚢胞液、胸膜液および腹膜液、心膜液、リンパ液、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、月経分泌物、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌液、粘膜分泌液、水便、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液、胚盤胞腔液、および臍帯血の1つまたは複数を含む。一部の態様において、体液は、血液、血清、または血漿を含む。
任意の有用な結合物質が、主題の方法に使用され得る。一部の態様において、1種または複数種の結合物質は、表3、表4から選択される微小胞表面抗原およびそれらの組み合わせに対する、抗体またはアプタマーを含む。例えば、1種または複数種の結合物質は、EpCam、CD9、PCSA、CD63、CD81、PSMA、B7H3、PSCA、ICAM、STEAP、KLK2、SSX2、SSX4、PBP、SPDEF、EGFR、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される微小胞表面抗原に対する抗体またはアプタマーであり得る。1種または複数種の結合物質はまた、EGFR、PBP、EpCAM、KLK2、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される微小胞表面抗原に対する抗体またはアプタマーを含み得る。
本発明は、様々な構成を意図する。例えば、「サンドイッチ」形式が使用され得る。例えば、図2A〜2Bを参照されたい。方法の一部の態様において、1種または複数種の結合物質は、生物学的試料と接触させる工程の前に基体に結合している。この構成において、1種または複数種のアプタマーは、検出物質として機能するために、検出可能な標識に結合していてもよい。他の態様において、1種または複数種の結合物質は、検出可能な標識に結合している。この構成において、1種または複数種のアプタマーは、捕捉物質として機能するために、生物学的試料と接触させる工程の前に基体に結合していてもよい。さらに、1種または複数種のアプタマーは、生物学的試料と接触させる工程の前に基体に結合していてもよく、かつ/または、1種または複数種のアプタマーは、検出可能な標識に結合している。このような場合、1種または複数種のアプタマーは、捕捉物質および検出物質のどちらか一方または両方として機能することができる。
もう一つの関連の局面において、本発明は、（a）生物学的試験試料を、本明細書に提供される1種または複数種のアプタマーと接触させる工程；（b）工程（a）において形成された生物学的試験試料中、1種または複数種のアプタマーと、1種または複数種のアプタマーと結合した標的との複合体の存在またはレベルを検出する工程；および（c）工程（b）において検出された存在またはレベルを、生物学的対照試料からの参照レベルと比較し、それにより、疾患または障害を特徴決定する工程を含む、疾患または障害を特徴決定する方法を提供する。参照レベルは、健康な試料個体、たとえば疾患または障害を有しない、または有するとは思われない個体中の標的のレベルから導出され得る。参照レベルはまた、治療された、抑制された、または代替の疾患を有する個体または試料から導出されてもよい。
生物学的試験試料および生物学的対照試料は、それぞれ、組織試料、細胞培養物または生物学的流体を含み得る。いくつかの態様において、生物学的流体は体液を含む。体液は、非限定的に末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（CSF）、痰、唾液、骨髄、滑液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー腺液もしくは尿道球腺液、女性射精液、汗、糞便、体毛、涙液、嚢胞液、胸膜液および腹膜液、心膜液、リンパ液、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、月経分泌物、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌液、粘膜分泌液、水便、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液、胚盤胞腔液または臍帯血の一つまたは複数を含む任意の有用な流体であることができる。いくつかの態様において、体液は血液、血清または血漿を含む。生物学的流体は、微小胞を含み得る、または含むことが疑われ得る。
1種または複数種のアプタマーはポリペプチドまたはその断片に結合し得る。結合は、所望により、乱雑的であってもよいし、または選択的であってもよい。ポリペプチドまたはその断片は、たとえば微小胞または細胞断片の膜中、可溶性であることもできるし、または膜結合状態であることができる。ポリペプチドまたはその断片は、表3または表4におけるバイオマーカーを含む。1種または複数種のアプタマーは、生物学的試料中の微小胞表面抗原に結合することができる。
本明細書において提供される、微小胞に結合するアプタマーを検出する方法、あるいは疾患または障害を特徴決定する方法は、疾患または障害の診断、予後判定またはセラノーシスを提供する工程を含み得る。疾患または障害は、非限定的に、本明細書に開示されるものを含むことができる。たとえば、疾患または障害は、癌、前癌状態、炎症性疾患、免疫疾患、自己免疫疾患もしくは障害、心血管疾患もしくは障害、神経疾患もしくは障害、感染症および/または疼痛を含み得る。例えば、本明細書の「表現型」の項を参照すること。
本発明はさらに、本明細書の発明の方法を実施するための試薬を含むキットおよび本発明のアプタマーに関連する方法を実施するための試薬の使用を提供する。たとえば、試薬は、本明細書に開示されるアプタマーを含み得る。試薬は、本明細書に開示される他の有用な成分、たとえば非限定的に、（a）微小胞を単離するように構成された試薬（任意で、微小胞を単離するように構成された少なくとも一つの試薬は、微小胞抗原への結合物質、カラム、基体、ろ過ユニット、ポリマー、ポリエチレングリコール、PEG4000、PEG8000、粒子またはビーズを含む）；（b）オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドを増幅、配列決定、ハイブリダイズまたは検出するためにプライマーまたはプローブとして働くように構成された少なくとも一つのオリゴヌクレオチド；および（c）試料から1種または複数種の豊富なタンパク質を除去するように構成された試薬（任意で、1種または複数種の豊富なタンパク質は、アルブミン、免疫グロブリン、フィブリノーゲンおよびフィブリンのうち少なくとも1種を含む）の、少なくとも一つをさらに含み得る。
ある局面において、本発明は、細胞のまたは細胞外の小胞試料を評価するための投入オリゴヌクレオチドライブラリーを含む組成物であって、投入オリゴヌクレオチドライブラリーを生成するための少なくとも二つのサブセットオリゴヌクレオチドライブラリーを含み、少なくとも二つのサブセットオリゴヌクレオチドライブラリーの少なくとも一つが、50％に等しくない全G+C含量（total G and C content）を有するヌクレオチドの量で製造される、組成物を提供する。たとえば、全G+C含量は50％未満であることもでき、全G+C含量は50％超であることもできる。一つの態様において、少なくとも一つのサブセットライブラリーは、50％超の全G+C含量で製造され、もう一つのサブセットライブラリーは、50％未満の全G+C含量で製造される。ある態様において、少なくとも二つのサブセットライブラリーは、それぞれ25％、50％および75％のG+C含量で製造された三つのサブセットライブラリーを含む。少なくとも二つのサブセットライブラリーは、表13中の少なくとも二つの行に類似する、または等しい量のヌクレオチドで製造されることができる。ヌクレオチドは、所望により、天然のヌクレオチドまたは修飾された天然のヌクレオチドからなることができる。ヌクレオチドはまた、非天然のヌクレオチドを含むことができる。そのような投入オリゴヌクレオチドライブラリーは本明細書の中で「GC」ライブラリーと呼ばれ得る。
関連する局面において、本発明は、投入ライブラリーを生成するために少なくとも二つのサブセットオリゴヌクレオチドライブラリーを接触させる工程を含む、本発明の投入オリゴヌクレオチドライブラリーを生成する方法を提供する。本明細書に記載される方法を使用して投入オリゴヌクレオチドライブラリーをスクリーニングまたは富化すると、様々なアプタマーまたはオリゴヌクレオチドプローブライブラリーを提供することができる。
ある局面において、本発明は、5'トランスポゾンアダプター領域と、トランスポゾンアダプター領域に対して5'に位置する0またはより多くのヌクレオチドを含むオフセット領域と、オフセット領域に対して5'に位置する可変領域と、可変領域に対して5'に位置する左プライマー領域とを含む配列を有するオリゴヌクレオチドを提供する。関連する局面において、本発明は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000、500000、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017または少なくとも1018個の異なるオリゴヌクレオチド配列を含み、各オリゴヌクレオチド配列が、5'トランスポゾンアダプター領域と、トランスポゾンアダプター領域に対して5'に位置する0またはより多くのヌクレオチドを含むオフセット領域と、オフセット領域に対して5'に位置する可変領域と、可変領域に対して5'に位置する左プライマー領域とを含む、複数のオリゴヌクレオチドを提供する。そのようなオリゴヌクレオチドは本明細書の中で「均衡」オリゴヌクレオチドと呼ばれ得る。
本発明の均衡オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、（a）トランスポゾンアダプター領域が20〜40ヌクレオチドを含む；（b）オフセット領域が0、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10ヌクレオチドを含む；（c）可変領域が20〜50ヌクレオチドを含む；および/または（d）左プライマー領域が20〜40ヌクレオチドを含むようなものであることができる。いくつかの態様において、均衡オリゴヌクレオチドは（、a）トランスポゾンアダプター領域が、配列
Figure 2016533752
に対して少なくとも約50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である核酸配列を含む；（b）オフセット領域が、以下の配列：5'-T（SEQ ID NO: 510765）、5'-CT（SEQ ID NO: 510766）および5'-ACT（SEQ ID NO: 510767）の少なくとも一つに対して少なくとも約50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である1、2、3、4、5、6、7、8、9または10ヌクレオチドを含む；（c）可変領域が20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49または50ヌクレオチドを含む；および/または（d）左プライマー領域が、SEQ ID NO: 510768および510769から選択される配列に対して少なくとも約50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である核酸配列を含むようなものである。可変領域は、本明細書に提供される「GC」ライブラリー配列を含み得る。
ある局面において、本発明は、均衡オリゴヌクレオチドまたは複数の均衡オリゴヌクレオチドをナイーブな投入ライブラリーとして使用して選択または富化プロセスを実施する工程を含む、アプタマーを同定する方法を提供する。そのような選択または富化プロセスは、非限定的にSELEXおよびその変形を含め、本明細書に記載または提供されている。ある態様において、選択プロセスは、関心対象の標的に対する少なくとも1ラウンドのポジティブ選択および任意で関心対象の標的以外の標的に対する少なくとも1ラウンドのネガティブ選択を含む。
もう一つの局面において、本発明は、均衡オリゴヌクレオチドまたは複数の均衡オリゴヌクレオチドを試料と接触させる工程および試料中の標的へのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドの結合の存在またはレベルを検出する工程を含む、方法を提供する。試料は、生物学的試料、たとえば有機試料、無機試料、組織、細胞培養物、体液、血液、血清、細胞、微小胞、タンパク質複合体、脂質複合体、糖質またはそれらの任意の組み合わせ、部分もしくは変種を含み得る。標的は、非限定的に細胞、オルガネラ、タンパク質複合体、リポタンパク質、糖質、微小胞、膜断片、小分子、重金属、毒素または薬物を含む、任意の有用な標的であることができる。
関連する局面において、本発明は、（a）微小胞を含む生物学的試料をオリゴヌクレオチドプローブライブラリーと接触させる工程であって、オリゴヌクレオチドプローブライブラリーが均衡オリゴヌクレオチドまたは複数の均衡オリゴヌクレオチドを含む、工程；（b）微小胞の少なくとも一部分に結合したオリゴヌクレオチドを同定する工程；および（c）同定されたオリゴヌクレオチドのプロファイルに基づいて試料を特徴決定する工程を含む、方法を提供する。
もう一つの関連する局面において、本発明は、（a）溶解状態の混合物を形成するために、試料を、少なくとも106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017または少なくとも1018個の異なるオリゴヌクレオチド配列のオリゴヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドプローブライブラリーと接触させる工程であって、オリゴヌクレオチドが、試料中の複数の実体に結合して複合体を形成することができ、オリゴヌクレオチドプローブライブラリーが均衡オリゴヌクレオチドまたは複数の均衡オリゴヌクレオチドを含む、工程；（d）工程（a）で形成された複合体を混合物から分割する工程；および（c）試料に関するオリゴヌクレオチドプロファイルを同定するために、工程（b）で分割された複合体中に存在するオリゴヌクレオチドを検出する工程を含む、方法を提供する。関連する局面において、本発明は、（a）生物学的試験試料を均衡オリゴヌクレオチドまたは複数の均衡オリゴヌクレオチドと接触させる工程；（b）工程（a）で均衡オリゴヌクレオチドまたは複数の均衡オリゴヌクレオチドと生物学的試験試料中の標的との間に形成された複合体の存在またはレベルを検出する工程；および（c）工程（b）で検出された存在またはレベルを、生物学的対照試料からの参照レベルと比較し、それによって疾患または障害を特徴決定する工程を含む、疾患または障害を特徴決定する方法を提供する。検出する工程は、複合体中のすべてもしくはいくつかのオリゴヌクレオチドの配列決定、複合体中のすべてもしくはいくつかのオリゴヌクレオチドの増幅、および/または複合体中のすべてもしくはいくつかのオリゴヌクレオチドの、アレイへのハイブリダイゼーションを実施する工程を含み得る。いくつかの態様において、配列決定はハイスループット配列決定を含む。
均衡オリゴヌクレオチドまたは複数の均衡オリゴヌクレオチドの使用を含む本発明の方法において、生物学的試験試料および生物学的対照試料は、それぞれ、組織試料、細胞培養物または生物学的流体を含み得る。いくつかの態様において、生物学的流体は体液を含む。本発明の方法の中で有用な体液は、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（CSF）、痰、唾液、骨髄、滑液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー腺液もしくは尿道球腺液、女性射精液、汗、糞便、体毛、涙液、嚢胞液、胸膜液および腹膜液、心膜液、リンパ液、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、月経分泌物、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌液、粘膜分泌液、水便、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液、胚盤胞腔液または臍帯血を含む。いくつかの好ましい態様において、体液は血液、血清または血漿を含む。生物学的流体は微小胞を含み得る。そのような場合、複合体は、オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドと少なくとも一つの微小胞との間で形成され得る。生物学的試験試料および生物学的対照試料は、単離された微小胞をさらに含み得、任意で、微小胞は、クロマトグラフィー、ろ過、限外ろ過、遠心分離、超遠心分離、フローサイトメトリー、アフィニティー捕捉（たとえば平面、カラムまたはビーズへの）、ポリマー沈殿の少なくとも一つを使用し、かつマイクロ流体工学を使用して単離される。微小胞はまた、オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドとの接触の後で単離することもできる。
均衡オリゴヌクレオチドまたは複数の均衡オリゴヌクレオチドの使用を含む本発明の方法の様々な態様において、オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドはポリペプチドまたはその断片に結合する。ポリペプチドまたはその断片は可溶性または膜結合状態であることができ、任意で、膜は微小胞膜を含む。膜はまた、小胞の細胞または細胞の断片からの膜であることもできる。いくつかの態様において、ポリペプチドまたはその断片は表3または表4中のバイオマーカーを含む。たとえば、ポリペプチドまたはその断片は、表3におけるような一般的小胞マーカーまたは表4におけるような組織関連もしくは疾患関連のマーカーであることもできる。オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、生物学的試料中の微小胞表面抗原に結合し得る。たとえば、オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、微小胞に対してナイーブライブラリーから富化することができる。
均衡オリゴヌクレオチドまたは複数の均衡オリゴヌクレオチドの使用を含む、本明細書に提供されるオリゴヌクレオチド、複数のオリゴヌクレオチドまたは方法によって検出される疾患または障害は関心対象の任意の適切な疾患または障害を含み得る。たとえば、疾患または障害は、癌、前癌状態、炎症性疾患、免疫疾患、自己免疫疾患もしくは障害、心血管疾患もしくは障害、神経疾患もしくは障害、感染症および/または疼痛を含み得る。たとえば本明細書の「表現型」の項を参照すること。疾患または障害は、非限定的に、乳癌、アルツハイマー病、気管支喘息、膀胱移行上皮癌、巨細胞オステオブラストクラストーマ、脳腫瘍、結腸直腸腺癌、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、子宮頸部扁平上皮癌、急性心筋梗塞（AMI）/急性心不全、クローン病、II型糖尿病、食道癌、喉頭扁平上皮癌、急性および慢性骨髄白血病、肺癌、悪性リンパ腫、多発性硬化症、卵巣癌、パーキンソン病、前立腺腺癌、乾癬、関節リウマチ、腎細胞癌、皮膚有棘細胞癌、胃腺癌、甲状腺癌、精巣癌、潰瘍性大腸炎または子宮腺癌を含み得る。
本発明はさらに、本明細書の方法を実施するための試薬を含むキットおよびまた本発明のGCライブラリーまたは均衡オリゴヌクレオチドに関連する方法を実施するための試薬の使用を提供する。たとえば、試薬は、GCライブラリーおよび/または均衡オリゴヌクレオチドライブラリーから導出された配列を有する一つまたは複数のオリゴヌクレオチドを含み得る。試薬は、本明細書に開示される他の有用な成分、たとえば非限定的に、（a）微小胞を単離するように構成された試薬（任意で、微小胞を単離するように構成された少なくとも一つの試薬は、微小胞抗原への結合物質、カラム、基体、ろ過ユニット、ポリマー、ポリエチレングリコール、PEG4000、PEG8000、粒子またはビーズを含む）；（b）オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドを増幅、配列決定、ハイブリダイズまたは検出するためにプライマーまたはプローブとして働くように構成された少なくとも一つのオリゴヌクレオチド；および（c）試料から1種または複数種の豊富なタンパク質を除去するように構成された試薬（任意で、1種または複数種の豊富なタンパク質は、アルブミン、免疫グロブリン、フィブリノーゲンおよびフィブリンのうち少なくとも1種を含む）の少なくとも一つをさらに含み得る。
（図１）競合アッセイ選択戦略を示す。アプタマーのランダムなプール（ライブラリー）を標的タンパク質、この場合はEpCAMと共にインキュベートする。洗浄および標的からの溶出ののち、溶出したアプタマーを再び標的に加え、結合させる。次いで、抗体を反応に加え、抗体のエピトープにおいてアプタマーと競合させる。次いで、抗体によって置換されたアプタマーを捕集する。
（図２Ａ〜２Ｆ）微小胞表面抗原のようなバイオマーカーを評価する方法を示す。図2Aは、捕捉物質の標的抗原を発現する小胞を捕捉する捕捉物質、たとえばアプタマーまたは抗体でコートされた平面基体の模式図である。捕捉物質は、罹病細胞から流出した小胞（「疾患小胞」）の表面に発現するタンパク質に結合し得る。同じくアプタマーまたは抗体であってもよい検出物質は、検出可能な標識、ここでは蛍光シグナルを有する。検出物質は、捕捉された小胞に結合し、その蛍光標識によって検出可能なシグナルを提供する。検出物質は、小胞と広く関連しているかまたは起始細胞もしくは疾患、たとえば癌と関連している抗原を、検出することができる。図2Bは、捕捉物質の標的抗原を発現する小胞を捕捉する、捕捉物質にコンジュゲートした粒子ビーズの模式図である。捕捉物質は、罹病細胞から流出した小胞（「疾患小胞」）の表面に発現するタンパク質に結合し得る。同じくアプタマーまたは抗体であってもよい検出物質は、検出可能な標識、ここでは蛍光シグナルを有する。検出物質は、捕捉された小胞に結合し、その蛍光標識によって検出可能なシグナルを提供する。検出物質は、小胞と広く関連しているかまたは起始細胞もしくは疾患、たとえば癌と関連している抗原を、検出することができる。図2Cは、表記バイオマーカーに対する捕捉物質と検出物質との様々な組み合わせを使用して実施することができるスクリーニングスキームの例である。バイオマーカーの組み合わせは、図2A〜2Bに示すようなアッセイを使用して検出することができる。図2D〜2Eは、表現型を特徴決定するために小胞を捕捉し、かつ検出するための例示的スキームを示す。図2Fは、表現型を特徴決定するために小胞ペイロードを評価するための例示的スキームを示す。
（図３Ａ〜３Ｂ）アプタマーヌクレオチド配列の非限定的な例およびその二次構造を示す。図3Aは、配列
Figure 2016533752
を有する32量体オリゴヌクレオチド、アプタマー4の二次構造を示す。図中、配列は、6個のチミンヌクレオチドが端部に付加された状態で示されており、これらのチミンヌクレオチドが、ビオチン分子を付着させるためのスペーサーとして働くことができる。この特定のオリゴは、標的EpCAMに対する高い結合親和性を有する（表5を参照）。配列決定されたオリゴのデータベース全体をこのオリゴの二次構造にモデル化することにより、さらなる候補EpCAM結合物質が同定される。図3Bは、図3Aのアプタマーとは異なる二次構造を有する配列
Figure 2016533752
を有するもう一つの32量体オリゴを示す。このアプタマーもまた、6チミンテールを有する状態で示されている。
（図４）標的が特定の疾患と関連するバイオマーカーであるとき、細胞サブトラクション法を使用して標的特異的なアプタマーのセットを生成するプロセスを示す。工程1において、オリゴヌクレオチドのランダムなプールを正常患者由来の生物学的試験試料と接触させる。工程2において、工程1において結合しなかったオリゴを、疾患患者から単離された生物学試料に加える。次いで、この工程からの結合オリゴを溶離させ、そのビオチン結合によって捕捉したのち、再び正常な生物学的試料と合わせる。次いで、非結合オリゴを再び疾患由来生物学的試料に加え、単離する。このプロセスを反復的に繰り返すことができる。最後の溶離アプタマーを患者試料に対して試験して、セットの感度および特異度を計測する。生物学的試料は、血漿もしくは血清を含む血液または循環系の他の成分、たとえば微小胞を含むことができる。
（図５）様々な標的濃度の標的EpCAMタンパク質への例示的アプタマー（アプタマーID BTX176881（SEQ ID NO: 3））の結合親和性を示す、結合アッセイの結果を示す。試験するアプタマーを、ビオチンテールによって基体に固定し、様々な濃度の標的（125、250および500nM）と共にインキュベートする。試験を表面プラズモン共鳴（SPR）機上で実施する。SPR機は、アプタマーと標的との結合および分離を検出する。標的は、結合イベントと分離イベントとが等しくなり、その結果、曲線のプラトーが現れるまで加える。そして、各濃度で曲線を記述する式を使用して、アプタマーのKDを算出することができる（表5を参照）。
（図６）微小胞集団を検出するための抗EpCAMアプタマー（アプタマー4；SEQ ID NO: 1）の使用を示す。表記の微小胞表面抗原： A）EGFR； B）PBP； C）EpCAM； D）KLK2、に対するビーズコンジュゲート抗体を使用して、患者血漿試料中の小胞を捕捉した。蛍光標識されたアプタマー4をマイクロビーズアッセイにおいて検出物質として使用した。図は、各プロット中、三つの癌試料（C1〜C3）および三つの正常試料（N1〜N3）に関する平均蛍光値（MFI値）を示す。各プロット中、試料は、左から右に、C1、C2、C3、N1、N2、N3の順である。
（図７Ａ）EPCAMアプタマーCAR003（SEQ ID NO: 4）の配列を示す。
（図７Ｂ）−30.00kcal/molの最小自由エネルギー（ΔG）を有するCAR003の最適な二次構造を示す。例示のために、アプタマーは、図7AのDNA配列に対応するRNAアプタマー（SEQ ID NO: 5）として示されている。
（図７Ｃ）アプタマープール精製を示す。図は、ゲル上で質をチェックしたのちすべての産物および分画がプール中に割り当てられたFPLCクロマトグラムを含む。
（図７Ｄ）合成後のCAR003アプタマーの様々なFPLC分画を有するSYBR GOLD染色ゲルを示す。様々な分画を、未完成鎖の量に基づき、高から低の順（プール1〜プール3）でプール中に組み合わせた。プール1〜3は、図7Cに示されたプールに対応する。
（図７Ｅ〜７Ｆ）25mM HEPESとPBS-BN（図7E）または25mM HEPESと1mM MgCl2（図7F）中の、EPCAMタンパク質へのCAR003の結合を示す。
（図７Ｇ）ウシ血清アルブミン（BSA）を添加したおよび添加していない表記塩中の、EpCAMへのCAR003の結合を示す。
（図７Ｈ）EPCAMタンパク質へのCAR003結合に対する変性の効果を示す。バー4本の各群中、アプタマーは、左から右に、アプタマー4、CAR003プール1、CAR003プール2、およびCAR003プール3である。
（図７Ｉ）EPCAM組み換えタンパク質（一定投入量5μg）に対するアプタマーの滴定を示す。
（図７Ｊ）EPCAM hisタグ付きタンパク質、BSAおよびHSA（各5μg）に対してCAR003アプタマーを用いたウェスタンブロットを示す。ゲルは、ブロックされた0.5％ F127であり、約50μg/mlのCAR003ビオチン化アプタマー、分画3でプロービングした。ブロットを、NeutrAvidin-HRP、次いでSuperSignal West Femto Chemiluminescent Substrateによって可視化した。
（図８Ａ〜８Ｄ）微小胞を基体に取り付ける方法を示す。図8Aは、小胞表面抗原へのカルボキシル化ミクロスフェアの直接コンジュゲートを示す。図8Bは、ビオチン官能化脂質アンカーを介するミクロスフェアへの微小胞の固定を示す。図8Cは、抗体がカルボキシル化ミクロスフェアとコンジュゲートされる、小胞表面抗原への抗体結合を示す。図8Dは、アプタマーがカルボキシル化ミクロスフェアにコンジュゲートされる、小胞表面抗原へのアプタマー結合を示す。
（図９）選択されたアプタマー、たとえば上記プロセスによって選択されたアプタマーの標的を同定するための模式図を含む。図は、基体901につながれた結合物質902、ここでは例としてアプタマーを示す。結合物質902は基体901に共有結合していることができる。結合物質902はまた、非共有結合的に結合していてもよい。たとえば、結合物質902は、基体に引き寄せられることができる標識、たとえば基体に共有結合しているアビジン/ストレプトアビジン分子と一緒に複合体を形成することができるビオチン基を含むことができる。結合物質902は微小胞904の表面抗原903に結合する。矢印（i）によって示される工程において、微小胞が分断されるが、結合物質902と表面抗原903との複合体は無傷のまま残る。分断された微小胞905は、矢印（ii）によって示される工程において、たとえば洗浄またはバッファ交換によって除去される。矢印（iii）によって示される工程において、表面抗原903が結合物質902から解放される。表面抗原903を分析してその正体を決定することができる。
（図１０Ａ〜Ｃ）様々な投入試料にコンジュゲートしたマイクロビーズに対する選択されたアプタマーの結合を示す。アプタマーは、乳癌由来の微小胞にコンジュゲートしたマイクロビーズに結合するとして、アプタマーライブラリーから選択されたものである。実験の詳細は本明細書において実施例に記載されている。各プロットは、異なるアプタマーを示す。Y軸が結合のレベルを示す。各試料群中、九つの精製されたアプタマー候補の結合が示されている。投入試料が、X軸上、以下のように左から右に示されている：1）癌エキソソーム：乳癌患者由来の血漿試料から単離された微小胞にコンジュゲートしたマイクロビーズに結合するアプタマー；2）癌非エキソソーム：超遠心分離によって微小胞を除去したのち乳癌患者由来の血漿試料にコンジュゲートしたマイクロビーズに結合するアプタマー；3）非癌エキソソーム：正常（すなわち非乳癌）患者由来の血漿試料から単離された微小胞にコンジュゲートしたマイクロビーズに結合するアプタマー；4）非癌非エキソソーム：超遠心分離によって微小胞を除去したのち乳癌患者由来の血漿試料にコンジュゲートしたマイクロビーズに結合するアプタマー。
（図１１Ａ〜Ｇ）関心対象の標的に対する出発アプタマーライブラリーを富化するために使用される選択スキームを示す。図11Aにおいて、「選択A」は、乳癌患者および非乳癌個人の血漿から単離された微小胞に対する13ラウンドのポジティブ選択を示す。Ca1は癌小胞選択などのラウンド1を指す。nCa1は非癌小胞選択などのラウンド1を指す。「選択B」は、「選択A」における3ラウンドのポジティブ選択後のアプタマープールを、乳癌患者および非乳癌個人の血漿から単離された微小胞に対するさらなる9ラウンドのポジティブおよびネガティブ選択（すなわち、ラウンド4〜12）のための投入物として使用した、派生物を示す。「noE」はネガティブ選択ラウンドを示す。図11Bは、アガロースゲル上で実施された表記ラウンドの富化ののち回収されたアプタマーライブラリーを示す。癌小胞（「Ca」）および非癌微小胞（「nCa」）に対して選択されたアプタマーが示されている。図11Cは、選択ラウンド1（R1）、7（R7）および13（R13）による、癌小胞（左寄り三つのカラム「Ca」）および非癌微小胞（右寄り三つのカラム「nCa」）に結合するアプタマーの富化を示す。表記選択ラウンド後の標識アプタマーをビーズ捕捉微小胞と共にインキュベートした。ビーズ捕捉微小胞に結合するアプタマーの数を決定した。Y軸は、全投入物と比較した結合アプタマーの割合を示す。ラウンド7からラウンド13への低下は非特異的結合物質の除去を示し得る。図11Dおよび図11Eは、「選択B」のラウンド9後にそれぞれ癌および非癌微小胞に関して実施されたさらなる選択を示す。図11Fは図11Dのもう一つの図を提示する。図11Gは、「選択B」のラウンド9後に、癌由来微小胞に対する選択ラウンド（Ca#）および非癌由来微小胞に対する選択ラウンド（nCa#）を交互に実施した第三の選択「選択C」を示す。
（図１２）配列GC含量に対する選択工程において認められたアプタマー頻度の分布を示す。この図のライブラリーは、プライマーアニーリング配列が隣接する、30ヌクレオチド長のランダム生成された配列で構成されるものであった。
（図１３Ａ〜Ｉ）生物学的試料タイプを区別するためのオリゴヌクレオチドプローブライブラリーの開発および使用を示す。
（図１４Ａ〜Ｌ）血漿由来微小胞をオリゴヌクレオチドプローブライブラリーでプロービングすることによって乳癌試料と正常（すなわち非癌）試料とを区別するために適用された、図13A〜Iで概説した手法の適用を示す。
（図１５Ａ〜ＡＮ）様々な適応症対正常な試料に関してオリゴヌクレオチドプローブライブラリー分析のクラスター分析を使用して作成されたヒートマップを含む。
（図１６Ａ〜Ｃ）表現型を特徴決定する方法におけるアプタマーの使用を示す。図16Aは、関心対象の標的を検出および/または定量するために使用することができるアッセイ構成を示す模式図1600である。図中、捕捉アプタマー1602が基体1601に取り付けられている。関心対象の標的1603が捕捉アプタマー1602と結合している。また、検出アプタマー1604も、関心対象の標的1603に結合している。検出アプタマー1604は標識1605を有し、この標識を検出して、捕捉アプタマー1602を介して基体1601に捕捉された標的を同定することができる。図16Bは、表現型を特徴決定するためのアプタマープールの使用を示す模式図1610である。関心対象の標的に対するアプタマーのプールを提供する（1611）。プールを、特徴決定の対象となる試験試料と接触させる（1612）。混合物を洗浄して非結合アプタマーを除去する。残るアプタマーを分離させ、捕集する（1613）。捕集したアプタマーを同定し（1614）、保持されたアプタマーの正体を使用して表現型を特徴決定する（1615）。図16Cは、図16Bの方法の具現化を示す模式図1620である。微小胞集団に結合すると同定されたアプタマーのプールを提供する（1621）。投入試料は、試験試料から単離された微小胞を含む（1622）。プールを、特徴決定の対象となる単離された微小胞と接触させる（1623）。混合物を洗浄して非結合アプタマーを除去し、残るアプタマーを分離させ、捕集する（1625）。捕集したアプタマーを同定し、保持されたアプタマーの正体を使用して表現型を特徴決定する（1626）。
（図１７Ａ〜Ｈ）ハイスループット（次世代）配列決定のための最適化アプタマーライブラリー設計を示す。
発明の詳細な説明
本発明の一つまたは複数の態様の詳細が以下の付随の説明に記載される。本明細書に記載されるものに類似している、または等しい任意の方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、ここでは、好ましい方法および材料を記載する。本発明の他の特徴、目的および利点は詳細な説明から明らかになる。本明細書中、別段明らかに指示されない限り、単数形は複数をも含む。別段定義されない限り、本明細書において使用されるすべての専門用語および科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書が優先する。
本明細書に開示されるものは、1種または複数種のバイオマーカーの存在またはレベルを含むことができるバイオマーカープロフィールを評価するために使用することができる組成物および方法である。本発明の組成物および方法は、微小胞表面抗原またはその機能的断片に結合するアプタマーの使用を含む。抗原は、一般にはタンパク質またはポリペプチドを含むが、脂質および/または糖質を含む、微小胞表面上に表示される任意の成分であることができる。概して、開示されるアプタマーは、DNAおよびRNAを含む核酸分子ならびにそれらの変異体である。開示される方法は、本発明の1種または複数種のアプタマーを使用して、関連の微小胞表面抗原またはその機能的断片のレベルまたは存在を決定する診断プロセスおよび技術を含む。または、本発明のアプタマーはまた、細胞、細胞断片、小胞もしくは任意の他の断片または表面抗原もしくはその機能的断片を含む複合体を捕捉、単離または富化するための結合物質として使用することもできる。
本発明の組成物および方法は、バイオマーカープロフィールの評価における使用のために同定される個々のオリゴヌクレオチドを含む。本発明はさらに、所与の試料中のバイオマーカープロフィールを検出するために使用することができるオリゴヌクレオチドプールの組成物および方法を開示する。
本発明の組成物および方法に開示されるアプタマーおよび配列は、本明細書中、DNAまたはRNAの形態で同定され得る。別段指定されない限り、当業者は、アプタマーが概していずれかの形態の核酸として合成され、様々な化学修飾を有し、本発明の範囲内であり得ることを理解するであろう。アプタマーという用語は、当技術分野において、特定の抗原へのモノクロナール抗体の結合と同様に、ワトソン−クリック塩基ペアリング以外の機構を通して関心対象の標的に特異的に結合する単一のオリゴヌクレオチドを指すために使用され得る。本開示の範囲内で、明示的に述べられない限り、または文脈において別段暗示されない限り、アプタマーおよびオリゴヌクレオチドという用語は、特定の実体が同定されたかどうか、または正確な結合モードが決定されたかどうかにかかわらず、関心対象の生物学的実体（たとえばバイオマーカー）を区別することができるオリゴヌクレオチドを指すために互換可能に使用することができる。
本発明のアプタマーはまた、インビトロまたはインビボ検出または画像化を提供して、任意の適切な診断用読み出し情報（たとえば診断、予後判定またはセラノーシス用）を提供するために使用することもできる。
それとは別に、本発明のアプタマーはまた、治療のために使用することもできるし、または細胞、組織もしくは臓器を特異的に標的化するための治療剤として使用することもできる。
アプタマー
SELEX法
アプタマーを生成するのに適した方法は、たとえば、1990年6月11日に出願され、今や放棄された米国特許出願第07/536,428号、「Nucleic Acid Ligands」と題する米国特許第5,475,096号および「Nucleic Acid Ligands」と題する米国特許第5,270,163号（WO91/19813も参照）に概して記載されている「Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment」（「SELEX法」）と呼ばれるプロセスを用いる方法である。各SELEX同定核酸リガンド、すなわち各アプタマーは、所与の標的化合物または分子に特異的なリガンドである。SELEXプロセスは、核酸が、多様な二次元および三次元構造を形成するのに十分な能力と、モノマーであるかポリマーであるかを問わず事実上いかなる化学物質とでもリガンドとして働く（すなわち、特異的結合対を形成する）のに十分な、それらのモノマー内で利用可能な化学的融通性とを有するという独自の洞察に基づく。任意のサイズまたは組成の分子が標的として働くことができる。
SELEX法は、出発点として、ランダム化された配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチドの大きなライブラリーまたはプールに依存する。オリゴヌクレオチドは、修飾されたまたは非修飾の、DNA、RNAまたはDNA/RNAハイブリッドであることができる。いくつかの例において、プールは、100％ランダムまたは部分的にランダムなオリゴヌクレオチドを含む。他の例において、プールは、ランダム化された配列内に組み込まれた少なくとも一つの固定および/または保存配列を含むランダムまたは部分的にランダムなオリゴヌクレオチドを含む。他の例において、プールは、オリゴヌクレオチドプールのすべての分子によって共有される配列を含み得る少なくとも一つの固定および/または保存配列をその5'および/または3'末端に含むランダムまたは部分的にランダムなオリゴヌクレオチドを含む。固定配列とは、PCRプライマーのためのハイブリダイゼーション部位、RNAポリメラーゼ（たとえばT3、T4、T7およびSP6）のためのプロモーター配列、制限部位またはホモポリマー配列、たとえばポリAもしくはポリTトラクト、触媒コア、アフィニティーカラムへの選択的結合のための部位ならびに関心対象のオリゴヌクレオチドのクローニングおよび/または配列決定を容易にするための他の配列のような配列である。保存配列とは、同じ標的に結合するいくつかのアプタマーによって共有される、前記固定配列以外の配列である。
プールのオリゴヌクレオチドは、好ましくは、ランダム化された配列部分および効率的な増幅に有用な固定配列を含む。一般に、出発プールのオリゴヌクレオチドは、30〜50個のランダムなヌクレオチドの内部領域の側面に位置する固定5'および3'末端配列を含む。ランダム化されたヌクレオチドは、化学合成およびランダムに切断された細胞核酸からのサイズ選択を含むいくつかの方法で生成することができる。また、選択/増幅反復の前または最中に、試験核酸中の配列変異を突然変異誘発によって導入する、または増大させることができる。
オリゴヌクレオチドのランダム配列部分は、任意の長さであることができ、リボヌクレオチドおよび/またはデオキシリボヌクレオチドを含むことができ、修飾されたまたは非天然の、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似物を含むことができる。たとえば、米国特許第5,958,691号；米国特許第5,660,985号；米国特許第5,958,691号；米国特許第5,698,687号；米国特許第5,817,635号；米国特許第5,672,695号およびPCT公開公報WO92/07065を参照すること。ランダムオリゴヌクレオチドは、当技術分野において周知の固相オリゴヌクレオチド合成技術を使用して、ホスホジエステル結合ヌクレオチドから合成することができる。たとえば、Froehler et al., Nucl. Acid Res. 14:5399-5467 (1986)およびFroehler et al., Tet. Lett. 27:5575-5578 (1986)を参照すること。ランダムオリゴヌクレオチドはまた、トリエステル合成法のような溶液相法を使用して合成することもできる。たとえば、Sood et al., Nucl. Acid Res. 4:2557 (1977)およびHirose et al., Tet. Lett., 28:2449 (1978)を参照すること。自動DNA合成装置上で実施される一般的な合成は、たいていのSELEX実験には十分な数である1014〜1016個の分子を生じさせる。配列設計中の十分に大きなランダム配列の領域は、合成される各分子が独自の配列を表す可能性を高める。
オリゴヌクレオチドの出発ライブラリーは、DNA合成装置上での自動化学合成によって生成され得る。ランダム化配列を合成するためには、合成プロセス中、各ヌクレオチド添加工程において四つすべてのヌクレオチドの混合物を加えて、ヌクレオチドのランダムな配合を可能にする。上述したように、一つの態様において、ランダムなオリゴヌクレオチドは完全にランダムな配列を含むが、しかし、他の態様において、ランダムなオリゴヌクレオチドは、非ランダムまたは部分的にランダムな配列の部分を含むこともできる。部分的にランダムな配列は、各添加工程において四つのヌクレオチドを異なるモル比で加えることによって創製することができる。
オリゴヌクレオチドの出発ライブラリーは、たとえばRNA、DNAまたはRNA/DNAハイブリッドであり得る。RNAライブラリーが出発ライブラリーとして使用される場合、それは一般に、T7 RNAポリメラーゼまたは修飾T7 RNAポリメラーゼを使用してDNAラブラリーをインビトロで転写することによって産生され、精製される。次いで、結合に好ましい条件下、ライブラリーを標的と混合し、同じ一般的選択スキームを使用して、結合、分割および増幅の工程ごとの反復に供すると、事実上、任意の所望の基準の結合親和性および選択性が達成される。より具体的には、核酸の出発プールを含む混合物から出発して、SELEX法は、（a）結合に好ましい条件下、混合物を標的と接触させる工程；（b）非結合核酸を、標的分子に特異的に結合した核酸から分割する工程；（c）核酸−標的複合体を分離させる工程；（d）核酸−標的複合体から分離させた核酸を増幅して、リガンド富化された核酸混合物を得る工程；および（e）結合、分割、分離および増幅の工程を所望のサイクル数だけ反復して、標的分子に対する高特異性で高親和性の核酸リガンドを得る工程を含む。RNAアプタマーが選択される場合、SELEX法は、（i）工程（d）における増幅の前に、核酸−標的複合体から分離させた核酸を逆転写する工程；および（ii）プロセスを再開する前に、工程（d）からの増幅された核酸を転写する工程をさらに含む。
多数の可能な配列および構造を含む核酸混合物内には、所与の標的に対する広い範囲の結合親和性が存在する。たとえばヌクレオチド20個のランダム化セグメントを含む核酸混合物は、420個の候補の可能性を有することができる。標的に対してより高い親和定数を有するものは標的に非常に結合しやすい。分割、分離および増幅ののち、第二の核酸混合物を生成し、より高い結合親和性の候補に関して富化する。さらなるラウンドの選択が漸進的により良好なリガンドを優先させ、最後に、得られる核酸混合物は主として一つまたはいくつかの配列のみで構成されるようになる。そして、それらをクローニングし、配列決定し、高純度リガンドまたはアプタマーとしての結合親和性に関して個々に試験することができる。
選択および増幅のサイクルは、所望の目的が達成されるまで繰り返される。もっとも一般的な場合、選択/増幅は、サイクルを繰り返しても結合強度の有意な改善が達成されなくなるまで継続される。この方法は一般に、約1014種の異なる核酸種をサンプリングするために使用されるが、約1018種もの異なる核酸種をサンプリングするために使用されることもある。概して、核酸アプタマー分子は、5〜20サイクルの手順において選択される。一つの態様において、不均一性は初回の選択段階のみで導入され、反復プロセス中には生じない。
SELEX法の一つの態様において、選択プロセスは、選択された標的に非常に強く結合する核酸リガンドの単離において非常に効率的であるため、一つの選択・増幅サイクルしか必要とされない。そのような効率的な選択は、たとえば、クロマトグラフィー型プロセスにおいて実施され得、その場合、カラム上に結合した標的と結合できる核酸の能力は、親和性が最高である核酸リガンドの分離および単離をカラムが十分に可能にすることができるような様式で作用する。
多くの場合、一つの核酸リガンドが同定されるまでSELEXの反復工程を実施することは必ずしも望ましくない。標的特異的核酸リガンド溶液は、いくつかの保存配列、および標的に対する核酸リガンドの親和性に有意に影響することなく置換または付加されることができるいくつかの配列を有する、核酸構造またはモチーフのファミリーを含み得る。完了前にSELEXプロセスを終了させることにより、核酸リガンド溶液ファミリーのいくつかのメンバーの配列を決定することが可能である。本発明は、試験試料を特徴決定するためにいっしょに使用することができるアプタマープールの同定およびその使用を提供する。たとえば、アプタマープールを複数ラウンドのポジティブ選択およびネガティブ選択を通して同定して、疾患または病状を示す微小胞を同定することができる。本発明はさらに、試料中のそのような微小胞を検出および/または定量し、それにより、診断、予後判定またはセラノーシスを提供することを可能にするための、そのようなアプタマープールの使用を提供する。
多様な核酸一次、二次および三次構造が存在することが知られている。非ワトソン−クリック型相互作用に非常に一般的に関与することが示された構造またはモチーフは、ヘアピンループ、対称および非対称バルジ、擬似ノットおよびそれらの無数の組合せと呼ばれている。そのようなモチーフのほぼすべての既知のケースが、それらがヌクレオチド30個以下の核酸配列中に形成されることができることを示唆する。この理由のため、多くの場合、連続したランダム化セグメントを用いるSELEX法は、ヌクレオチド約20〜約50個、いくつかの態様においてはヌクレオチド約30〜約40個のランダム化セグメントを含む核酸配列によって開始されることが好ましい。一例において、5'固定：ランダム：3'固定配列は、ヌクレオチド約30〜約50個のランダム配列を含む。
コアSELEX法は、いくつかの具体的な目的を達成するように改変されている。たとえば、米国特許第5,707,796号は、特定の構造的特徴を有する核酸分子、たとえば、ベントDNAを選択するための、SELEX法とゲル電気泳動法との併用を記載している。米国特許第5,763,177号は、標的分子と結合および/または標的分子に光架橋および/または標的分子を光不活性化することができる光反応性基を含む核酸リガンドを選択するためのSELEXベースの方法を記載している。米国特許第5,567,588号および米国特許第5,861,254号は、標的分子に対して高い親和性を有するオリゴヌクレオチドと、標的分子に対して低い親和性を有するオリゴヌクレオチドとの高効率分割を達成するSELEXベースの方法を記載している。米国特許第5,496,938号は、SELEXプロセスを実施したのち、改善された核酸リガンドを得る方法を記載している。米国特許第5,705,337号は、リガンドをその標的に共有結合させる方法を記載している。
SELEX法はまた、標的分子上の一つより多い部位に結合する核酸リガンドを得るために、また、標的上の特定の部位に結合する非核酸種を含む核酸リガンドを得るために、使用することもできる。SELEX法は、大小の生体分子、たとえば核酸結合タンパク質およびその生物学的機能の一部として核酸と結合することが知られていないタンパク質ならびに補因子および他の小分子を含む、任意の想定可能な標的に結合する核酸リガンドを単離し、同定するための手段を提供する。たとえば、米国特許第5,580,737号は、カフェインおよびその近縁類似物テオフィリンに高い親和性で結合することができる、SELEXによって同定された核酸配列を開示している。
カウンターSELEX法は、1種または複数種の非標的分子に対する交差反応性を有する核酸リガンド配列を除去することによって、標的分子に対する核酸リガンドの特異性を改善する方法である。カウンターSELEX法は、（a）核酸の候補混合物を調製する工程；（b）候補混合物を標的と接触させる工程であって、候補混合物に比べて標的に対して増大した親和性を有する核酸を候補混合物の残りから分割し得る、工程；（c）親和性増大核酸を候補混合物の残りから分割する工程；（d）親和性増大核酸を標的から分離させる工程；（e）1種または複数種の非標的分子に対して特異的親和性を有する核酸リガンドが除去されるように、親和性増大核酸を非標的分子と接触させる工程；および（f）標的分子のみに対して特異的親和性を有する核酸を増幅して、標的分子への結合のための相対的に高い親和性および特異性を有する核酸配列に関して富化された核酸の混合物を得る工程で構成される。SELEX法に関して上述したように、選択および増幅のサイクルは、所望の目標が達成されるまで繰り返される。
治療剤およびワクチンとしての核酸の使用において遭遇する一つの潜在的な問題が、ホスホジエステル形態のオリゴヌクレオチドが、細胞内および細胞外の酵素、たとえばエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼにより、所望の効果が発現する前に体液中で急速に分解され得ることである。したがって、SELEX法は、改善された特性、たとえば改善されたインビボ安定性または改善された送達特性をリガンドに付与する修飾ヌクレオチドを含む高親和性核酸リガンドの同定を包含する。そのような修飾の例は、リボースおよび/またはホスフェートおよび/または塩基位置における化学的置換を含む。修飾ヌクレオチドを含有するSELEX同定核酸リガンドは、たとえば、リボースの2'位、ピリミジンの5位およびプリンの8位が化学的に修飾されたヌクレオチド誘導体を含有するオリゴヌクレオチドを記載する米国特許第5,660,985号、様々な2'修飾ピリミジンを含有するオリゴヌクレオチドを記載する米国特許第5,756,703号および2'-アミノ(2'-NH2)、2'-フルオロ(2'-F)および/または2'-O-メチル(2'-OMe)置換基で修飾された1種または複数種のヌクレオチドを含有する高特異性核酸リガンドを記載する米国特許第5,580,737号に記載されている。
本発明において考慮される核酸リガンドの修飾は、さらなる電荷、分極性、疎水性、水素結合、静電気的相互作用および流出性を核酸リガンド塩基または核酸リガンド全体に組み込む他の化学基を提供する修飾を含むが、それらに限定されない。また、耐ヌクレアーゼ性であるオリゴヌクレオチド集団を生成するための修飾は、一つまたは複数の代替ヌクレオチド間結合、修飾糖、修飾塩基またはそれらの組合せを含むことができる。そのような修飾は、2'位糖修飾、5位ピリミジン修飾、8位プリン修飾、環外アミンの修飾、4-チオウリジンの置換、5-ブロモまたは5-ヨードウラシルの置換；主鎖修飾、ホスホロチオエートまたはアリルホスフェート修飾、メチル化および異例の塩基対組合せ、たとえばイソ塩基イソシチジンおよびイソグアノシンを含むが、これらに限定されない。修飾はまた、3'および5'修飾、たとえばキャッピングを含むことができる。
一つの態様においては、P(O)O基が、P(O)S（「チオエート」）、P(S)S（「ジチオエート」）、P(O)NR2（「アミデート」）、P(O)R、P(O)OR'、COもしくはCH2（「ホルムアセタール」）または3'-アミン(-NH-CH2-CH2-)（式中、各RまたはR'は、独立して、Hまたは置換もしくは非置換のアルキルである）によって置換されているオリゴヌクレオチドが提供される。結合基は、-O-、-N-または-S-結合によって隣接ヌクレオチドに取り付けられることができる。オリゴヌクレオチド内のすべての結合が同一である必要はない。本明細書において使用される語「ホスホロチオエート」は、一つまたは複数の硫黄原子によって置換されているホスホジエステル結合中の一つまたは複数の非架橋酸素原子を包含する。
さらなる態様において、オリゴヌクレオチドは、修飾された糖基を含み、たとえば、ヒドロキシル基の一つまたは複数が、ハロゲン、脂肪族基によって置換されている、またはエーテルもしくはアミンとして官能化されている。一つの態様において、フラノース残基の2'位が、O-メチル、O-アルキル、O-アリル、S-アルキル、S-アリルまたはハロ基のいずれかによって置換されている。2'修飾糖の合成法は、たとえば、Sproat, et al., Nucl. Acid Res. 19:733-738 (1991)；Cotten, et al., Nucl. Acid Res. 19:2629-2635 (1991)；およびHobbs, et al., Biochemistry 12:5138-5145 (1973)に記載されている。他の修飾が当業者に公知である。そのような修飾は、SELEXプロセス前の修飾であってもよいし、またはSELEXプロセス後の修飾（以前に同定された非修飾リガンドの修飾）であってもよいし、またはSELEXプロセスへの組み込みによって実施される修飾であってもよい。
SELEXプロセス前の修飾またはSELEXプロセスへの組み込みによって実施される修飾は、それらのSELEX標的に対する特異性および改善された安定性、たとえばインビボ安定性の両方を有する核酸リガンドを生じさせる。核酸リガンドに対して実施されるSELEXプロセス後の修飾は、核酸リガンドの結合能力に悪影響を及ぼすことなく、改善された安定性、たとえばインビボ安定性を生じさせ得る。
SELEX法は、米国特許第5,637,459号および米国特許第5,683,867号に記載されているように、選択されたオリゴヌクレオチドを、他の選択されたオリゴヌクレオチドおよび非オリゴヌクレオチド機能単位と組み合わせることを包含する。SELEX法は、たとえば、米国特許第6,011,020号、米国特許第6,051,698号およびPCT公開公報WO98/18480に記載されているように、選択された核酸リガンドを親油性または非免疫原性の高分子量化合物と組み合わせて診断または治療複合体にすることをさらに包含する。これらの特許および出願は、広範な形状および他の性質と、オリゴヌクレオチドの効率的な増幅および複製性ならびに他の分子の望ましい性質との組み合わせを教示している。
また、小さなフレキシブルペプチドに対する核酸リガンドをSELEX法によって同定することが研究されている。小さなペプチドはフレキシブルな構造を有し、通常、溶液中、複数の配座異性体の平衡において存在し、したがって、当初、結合親和性は、フレキシブルペプチドと結合したとき失われる配座エントロピーによって制限され得ると考えられていた。しかし、溶液中の小さなペプチドに対する核酸リガンドを特定する実施可能性が米国特許第5,648,214号において実証された。この特許においては、アミノ酸11個のペプチドであるサブスタンスPに対する高親和性RNA核酸リガンドが同定された。
標的に対して特異性および結合親和性を有する本発明のアプタマーは、本明細書に記載されるSELEX Nプロセスによって選択することができる。SELEXプロセスの一部として、標的に結合するように選択された配列は、その後、場合によっては、所望の結合親和性を有する最小配列を決定するために最小化される。選択された配列および/または最小化された配列は、場合によっては、結合親和性を高める、または配列中のどの位置が結合活性にとって不可欠であるのか決定するために、配列のランダムまたは定方向突然変異誘発を実施することによって最適化される。加えて、選択は、アプタマー分子をインビボでの分解に対して安定化させるための修飾ヌクレオチドを組み込んだ配列を用いて実施することもできる。
2'修飾SELEX法
アプタマーが治療剤としての使用に適するためには、好ましくは、インビボで安全かつ安定に合成することが低廉である。野生型RNAおよびDNAアプタマーは一般に、ヌクレアーゼによる分解を受けやすいため、インビボで安定ではない。ヌクレアーゼ分解に対する耐性は、2'位における修飾基の組み込みによって大きく高めることができる。
フルオロおよびアミノ基がオリゴヌクレオチドプールにうまく組み込まれ、次いで、そのプールからアプタマーが選択されている。しかし、これらの修飾は、得られるアプタマーの合成のコストを大きく増し、場合によっては、修飾オリゴヌクレオチドの分解および、その後の、DNA合成の基体としてのヌクレオチドの使用によって修飾ヌクレオチドが宿主DNA中に再循環される可能性のせいで、安全性の懸念を招くおそれがある。
本明細書に提供される、2'-O-メチル（「2'-OMe」）ヌクレオチドを含有するアプタマーは1つまたは複数の潜在的な欠点を解消し得る。2'-OMeヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドは耐ヌクレアーゼ性であり、安価に合成される。2'-OMeヌクレオチドは生物学的系中に遍在するが、天然のポリメラーゼは、生理学的条件下、2'-OMe NTPを基体として受け入れず、したがって、宿主DNA中への2'-OMeヌクレオチドの再循環に関して安全性の懸念はない。2'修飾アプタマーを生成するために使用されるSELEX法は、たとえば、いずれも参照により全体として本明細書に組み入れられる2002年12月3日に出願された米国特許仮出願第60/430,761号、2003年7月15日に出願された米国特許仮出願第60/487,474号、2003年11月4日に出願された米国特許仮出願第60/517,039号、2003年12月3日に出願された米国特許出願第10/729,581号および2004年6月21日に出願された「Method for in vitro Selection of 2'-O-methyl substituted Nucleic Acids」と題する米国特許出願第10/873,856号に記載されている。
方法
バイオマーカー検出および診断
本発明のアプタマーは、生物学的試料中のバイオマーカー、たとえば、タンパク質、核酸または微小胞のような関心対象の生物学的実体の存在またはレベルを評価するための様々な方法において使用することができる。アプタマーは、同族標的分子の存在またはレベルを評価するための結合物質として機能する。したがって、診断、予後判定またはセラノーシスに関する本発明の様々な態様において、本発明の1種または複数種のアプタマーは、本発明の1種または複数種のアプタマーを、選択された生物学的試料と接触させ、1種または複数種のアプタマーがその標的分子と結合する、リガンド−標的ベースのアッセイにおいて構成される。本発明のアプタマーは、評価される生物学的試料および検出されるバイオマーカーに基づいて候補バイオシグネチャーを同定するために使用される。さらなる態様において、アプタマーは、それ自体が特定の病状または疾患のバイオシグネチャーを提供し得る。バイオシグネチャーとは、1種または複数種の関心対象のバイオマーカーの存在、レベルまたは評価することができる他の特徴（非限定的に、配列、突然変異、再配列、転座、欠失、後成的修飾、メチル化、翻訳後修飾、対立遺伝子、活性、複合体パートナー、安定性、半減期などを含む）を含む生物学的試料のバイオマーカープロフィールをいう。バイオシグネチャーは、診断および/または予後判定基準、たとえば疾患の存在、病期決定、疾患モニタリング、疾患層別化または疾患の検出、転移もしくは再発もしくは進行の監視を評価するために使用することができる。たとえば、微小胞表面抗原に対するアプタマーを使用する本発明の方法は、微小胞抗原を含むバイオシグネチャーを選択された病状または疾患と相関させるのに有用である。バイオシグネチャーはまた、治療介入を含む治療モダリティに関する決定を下す際に臨床的に使用することもできる。バイオシグネチャーはさらに、手術を実施するかどうか、または手術と共にどの治療標準を使用すべきかを含む治療の決定を下すために臨床的に使用することもできる（たとえば術前または術後に）。説明のための例として、侵攻型の癌を示す循環バイオマーカーのバイオシグネチャーは、患者を治療するために、より積極的な外科処置および/またはより積極的な治療計画を必要とし得る。
バイオシグネチャーは、本発明に開示される任意の方法において、たとえば、対象が、罹患しているかどうか、疾患を発症する危険にあるかどうかを評価する、または疾患の病期もしくは進行を評価するために使用することができる。たとえば、バイオシグネチャーを使用して、対象が、前立腺癌、結腸癌または本明細書に記載される他の癌を有するかどうかを評価することができる。さらに、バイオシグネチャーを使用して、結腸癌のような疾患または病状の病期を決定することができる。微小胞を含むバイオシグネチャー/バイオマーカープロフィールは、微小胞内のペイロードの評価を含むことができる。たとえば、本発明の1種または複数種のアプタマーを使用して微小胞集団を捕捉し、それにより、微小胞抗原の読み出し情報を提供したのち、捕捉された微小胞内のペイロード内容物を評価し、それにより、ペイロード内容物のさらなるバイオマーカー読み出し情報を提供することができる。
表現型を特徴決定するためのバイオシグネチャーは、任意の数の有用な基準を含み得る。以下さらに説明するように、本明細書において使用される語「表現型」は、バイオシグネチャー/バイオマーカープロフィールに帰される任意の特性または特徴を意味することができる。表現型は、本発明の組成物および/または方法を使用して部分的または全体的に検出または同定することができる。いくつかの態様においては、バイオマーカーごとに少なくとも一つの基準が使用される。いくつかの態様においては、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90または少なくとも100の基準が使用される。たとえば、癌を特徴決定する場合、対象を癌と診断するとき、多数の異なる基準を使用することができる：1）対象由来の試料中のマイクロRNAの量が基準値よりも高い場合；2）細胞型特異的小胞（すなわち、特定の組織または臓器に由来する小胞）内のマイクロRNAの量が基準値よりも高い場合；または3）1種または複数種の癌特異的バイオマーカーを有する小胞内のマイクロRNAの量が基準値よりも高い場合。マイクロRNAの量が基準以下である場合にも、同様な規則を適用することができる。方法は、試料が品質管理尺度を満たす場合に対象に関する結果が提供されるような品質管理尺度をさらに含むことができる。いくつかの態様において、基準は満たされるが、品質管理が疑わしい場合、対象は再評価される。
セラノーシス
バイオシグネチャーは、治療関連の診断において、疾患を診断するのに有用な試験を提供する、または正しい治療計画を選択する、たとえばセラノーシスを提供するために使用することができる。セラノーシスは、罹病状態の治療法または治療に影響する能力を提供する診断試験を含む。セラノーシス試験は、診断または予後判定試験がそれぞれ診断または予後判定を提供するのと同様なやり方でセラノーシスを提供する。本明細書において使用されるセラノーシスは、予測的医療、個別化医療、統合医療、薬理診断学およびDx/Rxパターニングを含む、任意の所望の形態の治療関連の試験を包含する。治療関連の試験は、個々の対象における薬物応答を予測および評価する、すなわち、個別化医療を提供するために使用することができる。薬物応答の予測は、たとえば対象が暴露される、または他のやり方で治療される前にその対象が候補治療物質に対して応答者である可能性が高いのか、非応答者である可能性が高いのかを決定することであることができる。薬物応答の評価は、薬物に対する応答をモニターすること、たとえば治療の開始後、時間経過と共に対象の改善またはその欠如をモニターすることであることができる。治療関連の試験は、治療から恩恵を受ける可能性が特に高い対象をその治療に選択する、または個々の対象において治療効能の早期的かつ客観的指示を提供するのに有用である。このように、本明細書に開示されるバイオシグネチャーは、より有望な治療を選択するために治療を変更すべきであることを示し、それにより、有益な治療を遅らせる多大な損失を避け、効果のない薬物を投与する金銭的および罹患率の犠牲を避け得る。
本発明の組成物および方法は、非限定的に心血管疾患、癌、感染症、敗血症、神経疾患、中枢神経系関連の疾患、血管内関連の疾患および自己免疫関連の疾患を含む選択された疾患および障害と関連するバイオシグネチャーを同定または検出するために使用することができる。治療関連の診断はまた、薬物毒性、薬物耐性または薬物応答の予測に役立つ。治療関連の試験は、非限定的にたとえば免疫組織化学的試験、臨床化学、イムノアッセイ法、細胞ベースの技術、核酸試験または全身画像診断法を含む任意の適当な診断試験形式において展開されてもよい。治療関連の試験は、治療の決定を支援する試験、治療毒性をモニターする試験または治療に対する応答の試験をさらに含むことができるが、これらに限定されない。したがって、バイオシグネチャーを使用して、治療に対する対象の応答を予測またはモニターすることができる。バイオシグネチャーは、特定の治療を開始、排除または変更した後の様々な時点で対象ごとに判定することができる。
いくつかの態様において、本発明の組成物および方法は、バイオシグネチャーの1種または複数種の成分（すなわち、関心対象のマイクロRNA、小胞および/またはバイオマーカー）の量の変化、特定のバイオシグネチャーの1種または複数種の成分の量または成分に関して検出されるバイオシグネチャーに基づいて下される、対象が治療に応答しているかどうかの決定または予測を提供する。もう一つの態様において、対象の病状は、様々な時点でバイオシグネチャーを判定することによってモニターされる。病状の進行、後退または再発が判定される。また、時間経過と共に治療に対する応答を計測することもできる。したがって、本発明は、対象由来の生物学的試料からバイオシグネチャーを単離または検出する工程、特定のバイオシグネチャーの成分の全量を検出する工程、または1種または複数種の成分のバイオシグネチャー（たとえばバイオマーカーの存在、非存在または発現レベル）を検出する工程を含む、対象における疾患または他の病状の状態をモニターする方法を提供する。バイオシグネチャーは、疾患または病状の状態をモニターするために使用される。
また、小胞の1種または複数種の新規なバイオシグネチャーを同定することもできる。たとえば、ある薬物治療または治療計画に応答する対象から1種または複数種の小胞を単離し、それを基準、たとえばその薬物治療または治療計画に応答しない別の対象と比較することができる。バイオシグネチャー間の差を判定し、使用して、他の対象を、特定の薬物または治療計画に対する応答者または非応答者として同定することができる。
いくつかの態様において、バイオシグネチャーは、特定の疾患または病状が薬物に耐性であるかどうかを判定するために使用され、該疾患または病状が薬物耐性であるならば、医師は、そのような薬物治療のせいで貴重な時間を無駄にする必要はない。薬物選択または治療計画の早期確認を得るために、対象から得られた試料に関してバイオシグネチャーが判定される。そのバイオシグネチャーを使用して、特定の対象の疾患が薬物耐性と関連したバイオマーカーを有するかどうかを評価する。そのような判定は、医師が重要な時間および患者の財源を有効な治療に充てることを可能にする。
バイオシグネチャーは、癌を患う対象が、特定の癌治療に対して応答者である可能性が高いのか、非応答者である可能性が高いのかを同定するなど、癌のセラノーシスに使用することができる。主題の方法は、本明細書中、たとえば後述の「表現型」の項で列挙されたものを含む癌のセラノーシスに使用することができる。癌は、非限定的に、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌（小細胞癌腫（燕麦細胞癌）、混合小細胞/大細胞癌腫および複合小細胞癌腫を含む）、結腸癌、乳癌、前立腺癌、肝臓癌、膵臓癌、脳癌、腎臓癌、卵巣癌、胃癌、黒色腫、骨癌、胃癌、乳癌、神経膠腫、神経膠芽腫、肝細胞癌腫、乳頭状腎臓癌腫、頭頸部扁平上皮癌腫、白血病、リンパ腫、骨髄腫または他の固形腫瘍を含む。
癌を患う対象由来の試料中の生物学的試料（たとえば細胞、細胞断片、細胞由来細胞外小胞）中に存在する成分と結合したマーカーを含む循環バイオマーカーのバイオシグネチャーは、対象のための候補治療を選択するために使用することができる。バイオシグネチャーは、本明細書に提示される発明の方法にしたがって判定することができる。いくつかの態様において、候補治療は癌のための標準治療を含む。治療は、癌治療、たとえば放射線、外科手術、化学療法またはそれらの組み合わせであることができる。癌治療は、抗癌剤のような治療剤および化学療法計画であることができる。本発明の態様において使用されるさらなる薬物関連および規則は、いずれも参照により全体として本明細書に組み入れられる2010年2月12日出願の米国特許出願第12/658,770号；2010年2月11日出願のPCT国際公開公報第WO/2010/093465号；2010年10月27日出願のPCT国際公開公報第WO/2011/056688号；および2010年12月28日出願の米国特許仮出願第61/427,788号に見られる。たとえば、WO/2011/056688の「Table 4: Rules Summary for Treatment Selection」を参照すること。
バイオマーカー検出
本発明の組成物および方法は、生物学的試料と関連する表現型を特徴決定するために生物学的試料中の任意の有用なバイオマーカーを評価するために使用することができる。そのようなバイオマーカーは、すべての種類の生物学的実体、たとえばタンパク質、核酸、脂質、糖質、それらのいずれかの複合体および微小胞を含む。微小胞表面と結合した、または微小胞内に包含された様々な分子（本明細書においては「ペイロード」と呼ぶ）がバイオマーカーとして働くことができる。微小胞はまた、それ自体をバイオマーカーとして使用することもできる。
本発明のアプタマーは、微小胞集団のレベルまたは存在を評価するために使用することができる。たとえば図16B〜16Cを参照すること。本発明のアプタマーはまた、それらの特異的標的分子のレベルまたは存在を評価するために使用することもできる。たとえば図16Aを参照すること。加えて、本発明のアプタマーは、存在するアプタマーの標的分子を有する生物学的試料中に存在する成分を捕捉または単離するために使用される。たとえば、所与の微小胞表面抗原が細胞、細胞断片または細胞由来細胞外小胞上に存在する場合。非限定的に本発明によって提供されるアプタマーを含む、バイオマーカーへの結合物質は、細胞、細胞断片または細胞由来細胞外小胞を捕捉または単離するために使用されてもよい。たとえば図2A〜2B、16Aを参照すること。そのような捕捉または単離された実体をさらに特徴決定して、存在するさらなる表面抗原または内部「ペイロード」分子（すなわち、核酸分子、脂質、糖、ポリペプチドもしくはそれらの機能的断片またはバイオマーカーとして使用され得る、細胞環境中に存在する他の何か）を評価してもよく、その場合、1種または複数種のバイオマーカーが、所望の表現型、たとえば疾患または病状を評価するためのバイオシグネチャーを提供する。たとえば図2Fを参照すること。したがって、本発明のアプタマーは、関心対象の1種または複数種の微小胞表面抗原を評価するためだけでなく、生物学的試料中に存在する成分を分離するためにも使用され、その場合、その成分そのものをさらに評価して候補バイオシグネチャーを同定することができる。
本発明の方法は、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、50、75または100個の異なるバイオマーカーの多重化分析を含むことができる。たとえば、示差的に標識された複数の粒子を用いて、小胞異種集団のアッセイを実施することができる。少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、50、75または100個の示差的に標識された粒子があることができる。粒子は、たとえばタグにより、外部的に標識されてもよいし、または内在的に標識されてもよい。示差的に標識された各粒子を小胞のための捕捉物質、たとえば結合物質に結合させて、小胞を捕捉することができる。関心対象の表現型を特徴決定するために、一般的小胞バイオマーカー、起始細胞特異的バイオマーカーおよび疾患バイオマーカーに対する捕捉物質を含む複数の捕捉物質を選択することができる。そして、捕捉された小胞の1種または複数種のバイオマーカーを複数の結合物質によって検出することができる。結合物質は、検出を容易にするために直接標識されることができる。または、結合物質は二次的物質によって標識される。たとえば、結合物質は、小胞上のバイオマーカーに対する抗体であり得、その場合、結合物質はビオチンに結合する。二次的物質は、レポーターに結合したストレプトアビジンを含み、かつバイオマーカーを検出するために添加されることができる。いくつかの態様において、捕捉された小胞は、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、50、75または100個の異なるバイオマーカーに関してアッセイされる。たとえば、複数の検出物質、すなわち、捕捉された小胞または小胞集団の複数のバイオマーカーの検出は、得られるシグナルを増大させて、感度、特異度または両方の増大およびより少量の試料の使用を可能にすることができる。検出は、非限定的に表3に示すような一つより多い一般的小胞マーカーを含む一つより多いバイオマーカーを用いて実施することができる。
イムノアッセイベースの方法（たとえばサンドイッチアッセイ法）を使用して、小胞のバイオマーカーを検出することができる。例はELISA法を含む。結合物質をウェルに結合することができる。たとえば、小胞の抗原に対するアプタマーまたは抗体のような結合物質をウェルに取り付けることができる。捕捉された小胞上のバイオマーカーを、本明細書に記載される方法に基づいて検出することができる。図2Aは、サンドイッチタイプのイムノアッセイ法の例示的模式図を示す。捕捉物質は、関心対象の小胞抗原、たとえば一般的小胞バイオマーカー、起始細胞マーカーまたは疾患マーカーに対する捕捉物質であることができる。図中、捕捉された小胞は、関心対象の小胞抗原に対する蛍光標識された結合物質（検出物質）を使用して検出される。複数の捕捉結合物質を、たとえばアレイ上の区別可能なアドレスまたはイムノアッセイプレートの異なるウェルにおいて使用することができる。検出結合物質は、捕捉結合物質と同じ抗原に対するものであることもできるし、または他のマーカーに対して向けられたものであることもできる。捕捉結合物質は、任意の有用な結合物質、たとえばつながれたアプタマー、抗体またはレクチンであることができ、および/または、検出抗体は、たとえば検出可能な（たとえば標識された）アプタマー、抗体、レクチンまたは他の結合タンパク質もしくは実体で同様に置換されていることもできる。ある態様において、一般的小胞バイオマーカー、起始細胞マーカーおよび/または疾患マーカーに対する一つまたは複数の捕捉物質が、一般的小胞バイオマーカー、たとえば、非限定的にCD9、CD63およびCD81の一つまたは複数を含むテトラスパニン分子または本明細書の表3の他のマーカーに対する検出物質と共に使用される。微小胞表面抗原の例は、本明細書中、たとえば表3または4に開示されているか、または当技術分野において公知であり、本発明の方法および組成物に有用な例は、「Circulating Biomarkers for Disease」と題する、2011年4月6日に出願された国際公開公報第WO/2011/127219号に開示されている。
図2Dは、本発明の方法にしたがって小胞を分析するための例示的模式図を示す。捕捉物質を使用して小胞を捕捉し、検出物質を使用して捕捉された小胞を検出し、捕捉され、検出された微小胞のレベルまたは存在を使用して表現型を特徴決定する。捕捉物質、検出物質および表現型の特徴決定は、本明細書に記載されるもののいずれかであることができる。たとえば、捕捉物質は、関心対象の小胞抗原を認識する基体につながれた抗体またはアプタマーを含み、検出物質は、関心対象の抗原に対する標識された抗体またはアプタマーを含み、表現型の特徴決定は、疾患の診断、予後判定またはセラノーシスを含む。図2Dのi）に示すスキームにおいては、一般的小胞バイオマーカー（200）に対する一つまたは複数の捕捉物質によって小胞の集団を捕捉する。次いで、捕捉された小胞を、起始細胞バイオマーカー（201）および/または疾患特異的バイオマーカー（202）に対する検出物質で標識する。起始細胞検出物質のみが使用されるならば（201）、表現型を特徴決定する（203）ために使用されるバイオシグネチャーは、一般的小胞マーカー（200）および起始細胞バイオマーカー（201）を含むことができる。疾患検出物質のみが使用されるならば（202）、表現型を特徴決定する（203）ために使用されるバイオシグネチャーは、一般的小胞マーカー（200）および疾患バイオマーカー（202）を含むことができる。あるいはまた、検出物質を使用して起始細胞バイオマーカー（201）および疾患特異的バイオマーカー（202）の両方を検出する。この場合、表現型を特徴決定する（203）ために使用されるバイオシグネチャーは、一般的小胞マーカー（200）、起始細胞バイオマーカー（201）および疾患バイオマーカー（202）を含むことができる。バイオマーカーの組み合わせは、関心対象の表現型を特徴決定するように選択され、かつ本明細書中、たとえば表3または4に記載されるバイオマーカーおよび表現型から選択することができる。
図2Dのii）に示すスキームにおいては、起始細胞バイオマーカー（210）および/または疾患バイオマーカー（211）に対する一つまたは複数の捕捉物質によって小胞集団を捕捉する。次いで、捕捉された小胞を、一般的小胞バイオマーカー（212）に対する検出物質を使用して検出する。起始細胞捕捉物質のみが使用されるならば（210）、表現型を特徴決定する（213）ために使用されるバイオシグネチャーは、起始細胞バイオマーカー（210）および一般的小胞マーカー（212）を含むことができる。疾患バイオマーカー捕捉物質のみが使用されるならば（211）、表現型を特徴決定する（213）ために使用されるバイオシグネチャーは、疾患バイオマーカー（211）および一般的小胞バイオマーカー（212）を含むことができる。あるいはまた、一つまたは複数の起始細胞バイオマーカー（210）および一つまたは複数の疾患特異的バイオマーカー（211）に対する捕捉物質を使用して小胞を捕捉する。この場合、表現型を特徴決定する（213）ために使用されるバイオシグネチャーは、起始細胞バイオマーカー（210）、疾患バイオマーカー（211）および一般的小胞マーカー（213）を含むことができる。バイオマーカーの組み合わせは、関心対象の表現型を特徴決定するように選択され、かつ本明細書に記載されるバイオマーカーおよび表現型から選択することができる。
本発明の方法は、有用なバイオマーカーの任意の組み合わせを使用する、関心対象の微小胞の捕捉および検出を含む。たとえば、起始細胞、疾患特異的または一般的小胞マーカーの任意の所望の組み合わせに対する1種または複数種の結合物質を使用して微小胞集団を捕捉することができる。そして、起始細胞、疾患特異的または一般的小胞マーカーの任意の所望の組み合わせに対する1種または複数種の結合物質を使用して、捕捉された微小胞を検出することができる。図2Eは、そのような構成の流れ図を表す。起始細胞バイオマーカー（240）、疾患バイオマーカー（241）および一般的小胞バイオマーカー（242）の任意の一つまたは複数を使用して微小胞集団を捕捉する。その後、起始細胞バイオマーカー（243）、疾患バイオマーカー（244）および一般的小胞バイオマーカー（245）の任意の一つまたは複数を使用して、捕捉された微小胞集団を検出する。そして、捕捉され、検出された微小胞のバイオシグネチャーを使用して表現型を特徴決定する。バイオマーカー組み合わせは、関心対象の表現型を特徴決定するように選択され、かつ本明細書に記載されるバイオマーカーおよび表現型から選択することができる。
微小胞ペイロード分子をバイオシグネチャーパネルのメンバーとして評価することができる。ペイロード分子は、細胞、細胞断片または小胞膜内に含まれる生物学的実体のいずれかを含む。これらの実体は、非限定的に、核酸、たとえばmRNA、マイクロRNAまたはDNA断片；タンパク質、たとえば可溶性および膜関連タンパク質；糖質；脂質；代謝産物；および様々な小分子、たとえばホルモンを含む。ペイロードは、細胞環境中に小胞が形成されるとき封じ込められる細胞環境の一部であることができる。本発明のいくつかの態様においては、小胞表面抗原を検出することに加えて、ペイロードを分析する。特異的小胞集団を上記のように捕捉したのち、捕捉された小胞中のペイロードを使用して表現型を特徴決定することができる。たとえば、基体上に捕捉された小胞をさらに単離して、その中のペイロードを評価することができる。あるいはまた、捕捉することなく試料中の小胞を検出し、ソートする。そのように検出された小胞をさらに単離して、その中のペイロードを評価することができる。ある態様においては、小胞集団をフローサイトメトリーによってソートし、ソートされた小胞中のペイロードを分析する。図2Fのiv）に示すスキームにおいては、起始細胞バイオマーカー（220）、疾患バイオマーカー（221）および/または一般的小胞マーカー（222）の一つまたは複数を使用して小胞集団を捕捉および/または検出する（220）。単離された小胞のペイロードを評価する（223）。ペイロード内で検出されたバイオシグネチャーを使用して表現型を特徴決定することができる（224）。非限定的な例においては、一つまたは複数の関心対象の小胞抗原に対する抗体を使用して、患者由来の血漿試料中の小胞集団を分析することができる。抗体は、所望の小胞集団を単離するために基体につながれた捕捉抗体であることができる。あるいはまた、抗体を直接標識し、標識された小胞をフローサイトメトリーによるソートによって単離することができる。単離された小胞集団から抽出されるマイクロRNAまたはmRNAの存在またはレベルを使用してバイオシグネチャーを検出することができる。そして、そのバイオシグネチャーは、患者の診断、予後判定またはセラノーシスのために使用される。
他の態様においては、小胞または細胞ペイロードを、はじめに小胞の部分集団を捕捉または検出することなく、集団（たとえば細胞または小胞）中で分析する。たとえば、細胞のまたは細胞外の小胞集団は一般に、遠心分離法、ろ過法、クロマトグラフィー法または本明細書に記載され、当技術分野において公知である他の技術を使用して、試料から単離することができる。その後、そのような試料成分のペイロードを分析して、バイオシグネチャーを検出し、表現型を特徴決定することができる。図2Fのv）に示すスキームにおいては、小胞集団を単離し（230）、単離された小胞のペイロードを評価する（231）。ペイロード内で検出されたバイオシグネチャーを使用して表現型を特徴決定することができる（232）。非限定的な例においては、サイズ排除および膜ろ過を使用して、患者由来の血漿試料から小胞集団を単離する。小胞集団から抽出されたマイクロRNAまたはmRNAの存在またはレベルを使用してバイオシグネチャーを検出する。そして、そのバイオシグネチャーは、患者の診断、予後判定またはセラノーシスのために使用される。
小胞集団を検出するために使用されるバイオマーカーは、関心対象の微小胞集団、たとえば、非限定的に癌、前癌状態、炎症性疾患、免疫疾患、自己免疫疾患もしくは障害、心血管疾患もしくは障害、神経疾患もしくは障害、感染症または疼痛を含む選択された病状または疾患の診断、予後判定またはセラノーシスを提供する微小胞の集団を検出するように選択されることができる。さらなる詳細に関しては、本明細書の「表現型」の項を参照すること。ある態様において、バイオマーカーは、EpCam（上皮細胞接着分子）、CD9（テトラスパニンCD9分子）、PCSA（前立腺細胞表面抗原、Rokhlin et al., 5E10: a prostate-specific surface-reactive monoclonal antibody. Cancer Lett. 1998 131:129-36を参照）、CD63（テトラスパニンCD63分子）、CD81（テトラスパニンCD81分子）、PSMA（FOLH1、葉酸ヒドロラーゼ（前立腺特異的膜抗原）1）、B7H3（CD276分子）、PSCA（前立腺幹細胞抗原）、ICAM（細胞間接着分子）、STEAP（STEAP1、前立腺の6回膜貫通上皮抗原1）、KLK2（カリクレイン関連ペプチダーゼ2）、SSX2（滑膜肉腫、Xブレイクポイント2）、SSX4（滑膜肉腫、Xブレイクポイント4）、PBP（前立腺結合タンパク質）、SPDEF（ets転写因子を含むSAM標的化ドメイン）、EGFR（上皮細胞成長因子受容体）およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。これらのマーカーの一つまたは複数は、非限定的に癌腫、前立腺癌、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、卵巣癌、黒色腫、脳癌または本明細書に開示される他のタイプの癌を含む癌を検出する場合のような特定の病状のためのバイオシグネチャーを提供することができる。ある態様においては、これらのマーカーの一つまたは複数への結合物質を使用して微小胞集団を捕捉し、本発明のアプタマーを使用して、本明細書に記載されるような捕捉小胞の検出を支援する。他の態様においては、本発明のアプタマーを使用して微小胞集団を捕捉し、これらのマーカーの一つまたは複数への結合物質を使用して、本明細書に記載されるような捕捉小胞の検出を支援する。結合物質は、本明細書に開示される、または当技術分野において公知であるような任意の有用な結合物質、たとえば抗体またはアプタマーであることができる。
表現型を特徴決定する方法は、関心対象の生物学的試料中に存在する成分または成分の集団を評価するための技術の組み合わせを用いることができる。たとえば、本発明のアプタマーを使用して、一つの細胞もしくは一つの細胞外小胞または細胞集団もしくは小胞集団を評価することができる。試料は、それぞれが別々に分析されるいくつかのアリコートに分割され得る。たとえば、一つまたは複数のアリコートのタンパク質含量を測定し、一つまたは複数の他のアリコートのマイクロRNA含量を測定する。タンパク質含量とマイクロRNA含量とを組み合わせて表現型を特徴決定することができる。もう一つの態様においては、関心対象の生物学的試料中に存在する成分を単離し、その中のペイロードを評価する（たとえば、本発明のアプタマーを使用して小胞の集団または部分集団を捕捉し、単離された小胞中に存在する核酸またはタンパク質をさらに評価する）。
一つの態様において、微小胞表面マーカーへの結合物質を使用することにより、所与の表面マーカーを有する小胞の集団を単離することができる。たとえば図2A、2B、16Aを参照すること。結合物質は、本発明の方法を使用して微小胞表面マーカーを標的化することが同定されたアプタマーであることができる。単離された小胞は、さらなるバイオマーカー、たとえば表面含有物またはペイロードに関して評価されるが、それは、アプタマー特異的標的の検出と同時に実施することもできるし、アプタマー特異的標的検出の前または後で実施することもできる。
バイオシグネチャーは、本明細書に開示されるように、循環バイオマーカー、たとえばマイクロRNA、タンパク質、小胞または他のバイオマーカーの存在、レベルまたは濃度を検出することによって定性的または定量的に検出することができる。これらのバイオシグネチャー成分は、当業者には公知のいくつかの技術を使用して検出することができる。たとえば、バイオマーカーは、マイクロアレイ解析、ポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）（PCRベースの方法、たとえばリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応法（RT-PCR）、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応法（Q-PCR/qPCR）などを含む）、対立遺伝子特異的プローブとのハイブリダイゼーション、酵素的突然変異検出、ライゲーション連鎖反応法（LCR）、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ法（OLA）、フローサイトメトリーヘテロ二本鎖解析法、ミスマッチの化学的切断、質量分析法、核酸配列決定法、一本鎖コンフォメーション長多型解析法（SSCP）、変性勾配ゲル電気泳動法（DGGE）、温度勾配ゲル電気泳動法（TGGE）、制限断片長多型解析法、連続的遺伝子発現解析法（SAGE）またはそれらの組み合わせによって検出することができる。核酸のようなバイオマーカーは、検出前に増幅することができる。バイオマーカーはまた、イムノアッセイ法、免疫ブロット法、免疫沈降法、酵素結合免役吸着アッセイ法（ELISA；EIA）、ラジオイムノアッセイ法（RIA）、フローサイトメトリー法または電子顕微鏡（EM）によって検出することもできる。
バイオシグネチャーは、本明細書に記載されるような、捕捉物質および検出物質のいずれとしても機能する本発明のアプタマーを使用して検出することができる。捕捉物質は、抗体、アプタマー、またはバイオマーカーを認識しかつバイオマーカーを捕捉するために使用することができる他の実体を含むことができる。捕捉することができるバイオマーカーは、循環バイオマーカー、たとえば体液中に溶解したタンパク質、核酸、脂質または生物学的複合体を含む。同様に、捕捉物質は、小胞を捕捉するために使用することもできる。検出物質は、抗体、またはバイオマーカーを認識しかつバイオマーカー小胞を検出するために使用することができる他の実体、もしくは小胞を認識しかつ小胞を検出するのに有用である他の実体を含むことができる。いくつかの態様において、検出物質は標識され、その標識が検出され、それにより、バイオマーカーまたは小胞が検出される。検出物質は、結合物質、たとえば抗体またはアプタマーであることができる。他の態様において、検出物質は、膜タンパク質標識物質のような小分子を含む。たとえば、Alroyらの米国特許公開公報US2005/0158708に開示された膜タンパク質標識物質を参照すること。ある態様においては、本明細書に記載されるように小胞が単離または捕捉され、その小胞を検出するために一つまたは複数の膜タンパク質標識物質が使用される。多くの場合、捕捉および検出物質によって認識される抗原または他の小胞部分は互換可能である。
非限定的な態様において、起始細胞特異的抗原を表面に有し、癌特異的抗原を表面に有する小胞は、細胞特異的抗原に特異的である結合物質を使用して、たとえば捕捉抗体またはアプタマーを基体につなぐことによって捕捉され、次いで、その小胞は、疾患特異的抗原への結合物質を使用して、たとえば検出に使用される結合物質を蛍光色素で標識し、その色素によって放出される蛍光放射線を検出することによって検出される。
結合物質（たとえば本発明のアプタマー）の標的分子が病状または疾患の評価に関して情報提供的である場合、その同じ結合物質は、標的分子（たとえば関心対象の微小胞表面抗原）を含む成分を捕捉するために使用されることもできるし、標的分子、たとえば結合物質1−抗原−結合物質2*を検出するために、検出可能な標識を含むように改変されることもできることが当業者には明らかであろう（ここで、*は検出可能な標識を示し；結合物質1および結合物質2は、同じ結合物質であってもよいし、または異なる結合物質であってもよい（たとえば同じアプタマーまたは異なるアプタマー））。加えて、結合物質1および結合物質2は、全く異なるカテゴリーの結合物質（たとえば、抗体、アプタマー、合成抗体、ペプチド−核酸分子またはその標的分子と特異的に結合するように構成されている任意の分子）から選択することができる。そのような結合分子は、標的分子に対するそれらの結合特異性のみに基づいて選択することができる。
本発明のアプタマーを使用してバイオマーカーを検出する、または試料成分を捕捉する技術は、平面基体、たとえばアレイ（たとえばバイオチップまたはマイクロアレイ）を、特定のバイオシグネチャーの検出を容易にする捕捉物質として基体に固定化された分子と共に使用することを含む。アレイは、一つまたは複数のバイオマーカーをアッセイするためのキットの一部として提供することができる。本発明の組成物および方法において有用である上記結合物質のさらなる例が、参照により全体として本明細書に組み入れられる「Circulating Biomarkers for Disease」と題する2011年4月6日出願の国際公開公報第ＷＯ/2011/127219号に開示されている。本発明のアプタマーは、前駆症状的疾患を含む疾患の検出および診断のためのアレイに含められることができる。いくつかの態様において、アレイは、関心対象のバイオマーカーを特異的に同定するように選択された生体分子を含むカスタムアレイを含む。カスタマイズされたアレイは、統計的性能を高めるバイオマーカー、たとえばバイオシグネチャーを同定するさらなる生体分子を検出するように修正されることができ、それが、多変量予測モデル（たとえばロジスティック回帰、弁別分析または回帰木モデル）における交差確認エラー率の改善につながる。いくつかの態様において、カスタマイズされたアレイは、疾患、病状または徴候の生物学を研究し、所定の生理学的状態においてバイオシグネチャーをプロファイリングするように構成される。カスタマイズされたアレイに含まれるマーカーは、統計的基準、たとえば、表現型または生理学的状態を区別する際に所望のレベルの統計的有意性を有することに基づいて選択される。いくつかの態様において、マイクロアレイ上の生体分子を排除または包含するために、p値＝0.05の標準有意性が選択される。p値は、複数の比較に関して補正することができる。説明のための例として、有疾患対象または無疾患対象由来の試料から抽出された核酸を、何千もの遺伝子配列に結合する高密度マイクロアレイにハイブリダイズさせることができる。有疾患試料または無疾患試料の間でレベルが有意に異なる核酸を、試料を有疾患または無疾患として区別するためのバイオマーカーとして選択することができる。選択されたバイオマーカーを検出するために、カスタマイズされたアレイを構成することができる。いくつかの態様において、カスタマイズされたアレイは、比較的少ない数、たとえば何千ではなく何十または何百のアドレス指定可能な結合物質を有するアレイをいう低密度マイクロアレイを含む。低密度アレイは基体上に形成されることができる。いくつかの態様において、カスタマイズ可能な低密度アレイは、プレートウェル中のPCR増幅、たとえばTaqMan（登録商標）Gene Expression Assays（Applied Biosystems by Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA）を使用する。
本発明のアプタマーまたは他の有用な結合物質は、固い表面もしくは基体に直接的に結合してもよいし、または間接的に結合してもよい。たとえば図2A〜2B、9、16Aを参照すること。固い表面または基体は、非限定的に、マイクロアレイおよびウェルによって提供される面、粒子、たとえばビーズ、カラム、光ファイバ、ワイプ、ガラスおよび修飾または官能化ガラス、石英、雲母、ジアゾ化膜（紙またはナイロン）、ポリホルムアルデヒド、セルロース、酢酸セルロース、紙、セラミックス、金属、メタロイド、半導体、量子ドット、コートされたビーズまたは粒子、他のクロマトグラフィー材料、磁性粒子；プラスチック（アクリル樹脂、ポリスチレン、スチレンまたは他の材料のコポリマー、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、Teflon材料などを含む）、多糖類、ナイロンもしくはニトロセルロース、樹脂、シリカもしくはシリカ系材料、たとえばシリコンおよび変性シリコン、炭素、金属、無機ガラス、プラスチック、セラミックス、導電性ポリマー（ポリピロールおよびポリインドールのようなポリマーを含む）；ミクロもしくはナノ構造化面、たとえば核酸タイリングアレイ、ナノチューブ、ナノワイヤもしくはナノ粒子状装飾面；または多孔質面もしくはゲル、たとえばメタクリレート、アクリルアミド、糖ポリマー、セルロース、シリケートまたは他の繊維状もしくはストランド状ポリマーを含む、結合物質を直接的または間接的に取り付けることができる任意の物理的に分離可能な固体であることができる。加えて、当技術分野において公知であるように、基体は、パッシブまたは化学的誘導体化コーティングを使用して、デキストラン、アクリルアミド、ゼラチンまたはアガロースのようなポリマーを含む任意の数の材料でコートされてもよい。そのようなコーティングは、生物学的試料とのアレイの使用を容易にすることができる。
以下の実施例に提供されるように、アプタマーまたは他の有用な結合物質は、検出可能な実体または標識にコンジュゲートさせることができる。適切な標識は、非限定的に、磁気標識、蛍光部分、酵素、化学発光プローブ、金属粒子、非金属コロイド粒子、高分子色素粒子、顔料分子、顔料粒子、電気化学的活性種、半導体ナノ結晶または量子ドットもしくは金粒子を含む他のナノ粒子、フルオロフォア、量子ドットまたは放射性標識を含む。タンパク質標識は、以下に記すような、緑色蛍光タンパク質（GFP）およびそのバリアント（たとえばシアン色蛍光タンパク質および黄色蛍光タンパク質）；および発光タンパク質、たとえばルシフェラーゼを含む。放射性標識は、非限定的に、放射性同位体（放射性核種）、たとえば3H、11C、14C、18F、32P、35S、64Cu、68Ga、86Y、99Tc、111In、123I、124I、125I、131I、133Xe、177Lu、211Atまたは213Biを含む。蛍光標識は、非限定的に、とりわけ、希土類キレート（たとえばユーロピウムキレート）、ローダミン；非限定的にFITC、5-カルボキシフルオレセイン、6-カルボキシフルオレセインを含むフルオレセインタイプ；非限定的にTAMRAを含むローダミンタイプ；ダンシル；リサミン；シアニン；フィコエリスリン；テキサスレッド；Cy3、Cy5、ダポキシル、NBD、カスケードイエロー、ダンシル、PyMPO、ピレン、7-ジエチルアミノクマリン-3-カルボン酸および他のクマリン誘導体、マリーナブルー（商標）、パシフィックブルー（商標）、カスケードブルー（商標）、2-アントラセンスルホニル、PyMPO、3,4,9,10-ペリレン-テトラカルボン酸、2,7-ジフルオロフルオレセイン（オレゴングリーン（商標）488-X）、5-カルボキシフルオレセイン、テキサスレッド（商標）-X、Alexa Fluor 430、5−カルボキシテトラメチルローダミン（5-TAMRA）、6-カルボキシテトラメチルローダミン（6-TAMRA）、BODIPY FL、ビマンおよびAlexa Fluor 350、405、488、500、514、532、546、555、568、594、610、633、647、660、680、700および750ならびにそれらの誘導体を含む。たとえば「The Handbook--A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies」第10版（インターネット上、probes(dot)invitrogen(dot)com/handbookで入手可能）を参照すること。蛍光標識は、FAM、dRHO、5-FAM、6FAM、dR6G、JOE、HEX、VIC、TET、dTAMRA、TAMRA、NED、dROX、PET、BHQ、Gold540およびLIZの一つまたは複数であることができる。
従来技術を使用して、アプタマーは直接的または間接的に標識されることができ、たとえば、標識はビオチン−ストレプトアビジンを介してアプタマーに取り付けられる（たとえば、ビオチン化アプタマーを合成すると、それがストレプトアビジン分子に結合することができ、そのストレプトアビジン分子そのものが、検出可能な標識にコンジュゲートする；非限定的な例は、ストレプトアビジン、フィコエリスリンにコンジュゲートされている（SAPE））。多工程手法を使用する化学結合の方法は、ビオチン化、たとえばこれらの化合物のスクシンイミドエステルを使用するトリニトロフェノール（TNP）またはジゴキシゲニンの結合を含む。ビオチン化は、たとえば、D-ビオチニル-N-ヒドロキシスクシンイミドの使用によって達成することができる。スクシンイミド基は、7を超えるpHでアミノ基と効果的に反応し、約pH8.0〜約pH8.5で優先的に反応する。または、アプタマーは標識されず、後で二次抗体と接触させられ、第一の抗体が関心対象の抗原と結合したのち、その二次抗体が標識される。
また、様々な酵素−基体標識を本発明の組成物または方法と共に使用し得る。そのような酵素−基体標識は市販されている（たとえば米国特許第4,275,149号）。酵素は概して、様々な技術を使用して計測することができる色素生成基体の化学的変化を触媒する。たとえば、酵素は、基体における変色を触媒し得、それを分光測光的に計測することができる。または、酵素は、基体の蛍光または化学発光を変化させ得る。酵素標識の例は、ルシフェラーゼ（たとえばホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ；米国特許第4,737,456号）、ルシフェリン、2,3-ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ、たとえばセイヨウワサビワサビペルオキシダーゼ（HRP）、アルカリホスファターゼ（AP）、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖類オキシダーゼ（たとえばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼおよびグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ）、複素環オキシダーゼ（たとえばウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼ）、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼなどを含む。酵素−基体組み合わせの例は、セイヨウワサビワサビペルオキシダーゼ（HRP）と基体としての水素ペルオキシダーゼ（水素ペルオキシダーゼが色素前駆体（たとえばオルトフェニレンジアミン（OPD）または3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン塩酸塩（TMB））を酸化させる）；アルカリホスファターゼ（AP）と色素生成基体としてのパラニトロフェニルホスフェート；およびβ-D-ガラクトシダーゼ（β-D-Gal）と色素生成基体（たとえばp-ニトロフェニル-β-D-ガラクトシダーゼ）または蛍光生成基体4−メチルウンベリフェニル-β-D-ガラクトシダーゼを含むが、それらに限定されない。
アプタマーは、平面基体のような基体に結合することができる。平面アレイは概して、アレイフォーマットにある生体分子のアドレス指定可能位置（たとえばパッド、アドレスまたは微小位置）を含む。アレイのサイズはアレイの組成および最終用途に依存する。2個の異なる分子から何千個もの分子までを含むアレイを製造することができる。概して、アレイは、アレイの最終用途および製造方法に依存して、2個から100,000個以上までの分子を含む。本発明と共に使用するためのマイクロアレイは、関心対象のバイオシグネチャー中に存在するバイオマーカー、たとえばマイクロRNAまたはそのバイオシグネチャーを構成する他の生体分子もしくは小胞を同定または捕捉する少なくとも一つの生体分子を含む。いくつかのアレイにおいては、異なる組成または同一組成のいずれかの複数の基体が使用される。したがって、平面アレイは、より小さい複数の基体を含み得る。
本発明は、バイオマーカー、たとえば関心対象のバイオシグネチャーと結合したバイオマーカーを検出するための多くのタイプのアレイを利用することができる。有用なアレイまたはマイクロアレイは、非限定的に、DNAマイクロアレイ、たとえばcDNAマイクロアレイ、オリゴヌクレオチドマイクロアレイおよびSNPマイクロアレイ、マイクロRNAアレイ、タンパク質マイクロアレイ、抗体マイクロアレイ、組織マイクロアレイ、細胞マイクロアレイ（トランスフェクションマイクロアレイとも呼ばれる）、化学物質マイクロアレイおよび糖質アレイ（グリコアレイ）を含む。これらのアレイは上記でさらに詳細に説明されている。いくつかの態様において、マイクロアレイは、バイオマーカー結合が間接的に（たとえば蛍光を介して）モニターされる、認識分子（たとえばアプタマーまたは抗体）の高密度固定化アレイを提供するバイオチップを含む。
バイオシグネチャーの一つまたは複数のバイオマーカーを検出するために使用することができ、かつ1種または複数種のアプタマーを含むアレイまたはマイクロアレイは、いずれも参照により全体として本明細書に組み入れられる米国特許第6,329,209号；第6,365,418号；第6,406,921号；第6,475,808号；および第6,475,809号ならびに米国特許出願第10/884,269号に記載されている方法にしたがって製造することができる。本明細書に記載されるバイオマーカーのセットの特定の選択を検出するためのカスタムアレイは、これらの特許に記載されている方法を使用して製造することができる。また、非限定的にAffymetrix（Santa Clara, CA）、Illumina（San Diego, CA）、Agilent（Santa Clara, CA）、Exiqon（Denmark）またはInvitrogen（Carlsbad, CA）から市販されているものを含む市販のマイクロアレイを使用して本発明の方法を実施することもできる。カスタムおよび/または市販のアレイは、本明細書に記載されるような、タンパク質、核酸ならびに他の生物学的分子および実体（たとえば細胞、小胞、ビリオン）の検出のためのアレイを含む。
いくつかの態様においては、複数の捕捉分子、たとえばタンパク質、ペプチドまたはさらなる核酸分子がアレイ上に配置される。特定の態様において、タンパク質は、タンパク質の変性を最小限にする、タンパク質の活性の変化を最小限にする、またはタンパク質とタンパク質が固定化される表面との間の相互作用を最小限にする方法および材料を使用して固定化される。捕捉分子は、本発明の1種または複数種のアプタマーを含むことができる。一つの態様において、アレイは、アプタマーのプールのハイブリダイゼーションのために構成される。そして、アレイは、試料に結合するプールメンバーを同定するために使用されることができ、それにより、表現型の特徴決定を容易にする。さらなる詳細に関しては、図16B〜16Cおよび関連の開示を参照すること。
有用なアレイ表面は、任意の所望の形、形態またはサイズであり得る。表面の非限定的な例は、チップ、連続面、曲面、フレキシブル面、フィルム、プレート、シートまたはチューブを含む。表面は、約1平方ミクロンから約500cm2までの範囲の面積を有することができる。表面の面積、長さおよび幅は、実施されるアッセイの要件にしたがって異なり得る。考慮される要素は、たとえば、取り扱い易さ、表面を形成している材料の制限、検出システムの要件、付着システム（たとえばアレイヤ）の要件などを含み得る。
特定の態様においては、結合アイランドまたは固定化生体分子の群またはアレイを分離するための物理的手段を用いることが望ましく、そのような物理的分離は、様々な関心対象溶液への様々な群またはアレイの暴露を容易にする。したがって、特定の態様において、アレイは、任意の数のウェルを有するマイクロウェルプレート内に配置される。そのような態様においては、ウェルの底がアレイ形成のための面として働いてもよいし、またはアレイが他の面に形成されたのち、ウェルの中に配置されてもよい。ウェルを有しない面が使用されるような特定の態様においては、結合アイランドが形成されてもよいし、または分子を表面に固定化し、アイランドまたは生体分子に対応するように空間的に配設された穴を有するガスケットがその表面に配置されてもよい。そのようなガスケットは好ましくは液密である。ガスケットは、アレイを製造するプロセスの任意の時点で表面に配置され得、群またはアレイの分離がもはや所望でないならば、取り除かれてもよい。
いくつかの態様において、固定化された分子は、その固定化された分子と接触する生物学的試料中に存在する一つまたは複数のバイオマーカーまたは小胞に結合することができる。いくつかの態様において、固定化された分子は、その固定化された分子と接触する一つまたは複数の小胞中に存在する分子を修飾する、またはその分子によって修飾される。試料を接触させることは一般に、試料をアレイの上に重ねることを含む。
溶液中の分子またはアレイ上に固定化された分子の修飾または結合は、当技術分野において公知の検出技術を使用して検出することができる。そのような技術の例は、免疫学的技術、たとえば競合的結合アッセイ法およびサンドイッチアッセイ法；共焦点スキャナ、共焦点顕微鏡またはCCDベースのシステムのような機器および蛍光、蛍光偏光（FP）、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）、全内反射蛍光（TIRF）、蛍光相関分光法（FCS）のような技術を使用する蛍光検出法；比色/分光分析技術；表面で吸着される物質の質量の変化を計測する表面プラズモン共鳴法；従来の放射性同位体結合およびシンチレーション近接アッセイ法（SPA）を含む、放射性同位体を使用する技術；質量分析法、たとえばマトリックス支援レーザー脱離/イオン化質量分析法（MALDI）およびMALDI飛行時間（TOF）型質量分析法；タンパク質フィルムの厚さを計測する光学的方法である偏光解析法；表面に吸着する物質の質量を計測するための非常に高感度の方法である水晶結晶板微量天秤法（QCM）；走査型プローブ顕微鏡法、たとえば原子間力顕微鏡法（AFM）、走査力顕微鏡法（SFM）または走査型電子顕微鏡法（SEM）；ならびに電気化学、インピーダンス、音響、マイクロ波およびIR/ラマン検出のような技術を含む。たとえば、いずれも参照により全体として本明細書に組み入れられるMere L, et al., "Miniaturized FRET assays and microfluidics: key components for ultra-high-throughput screening," Drug Discovery Today 4(8):363-369 (1999)およびその中に引用されている参照文献；Lakowicz J R, Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2nd Edition, Plenum Press (1999)またはJain KK: Integrative Omics, Pharmacoproteomics, and Human Body Fluids. In: Thongboonkerd V, ed., ed. Proteomics of Human Body Fluids: Principles, Methods and Applications. Volume 1: Totowa, N. J.: Humana Press, 2007を参照すること。
マイクロアレイ技術は、質量分析法（MS）および他のツールと組み合わせることができる。質量分析計へのエレクトロスプレーインタフェースをマイクロ流体装置中の毛管と一体化させることができる。たとえば、一つの市販のシステムは、固有かつ明確な電気泳動移動度を有する蛍光標識であるeTagレポーターを含み；各標識が切断可能な結合を介して生物学的または化学的プローブに結合している。各eTagレポーターの明確な移動度アドレスが、これらのタグの混合物が毛管電気泳動によって速やかに逆重畳積分され、定量化されることを可能にする。このシステムは、同じ試料からの同時並行的な遺伝子発現、タンパク質発現およびタンパク質機能分析を可能にする。参照により全体として本明細書に組み入れられるJain KK: Integrative Omics, Pharmacoproteomics, and Human Body Fluids. In: Thongboonkerd V, ed., ed. Proteomics of Human Body Fluids: Principles, Methods and Applications. Volume 1: Totowa, N. J.: Humana Press, 2007。
バイオチップは、マイクロ流体またはナノ流体アッセイのための構成要素を含むことができる。マイクロ流体装置は、バイオマーカーを単離または分析する、たとえばバイオシグネチャーを決定するために使用することができる。マイクロ流体システムは、小胞を単離、捕捉または検出し、マイクロRNAを検出し、循環バイオマーカーを検出し、バイオシグネチャーを検出するための一つまたは複数のプロセスまたは他のプロセスの小型化および区画化を可能にする。マイクロ流体装置は、システムの少なくとも一つの局面において一つまたは複数の検出試薬を使用することができ、そのような検出試薬を使用して一つまたは複数のバイオマーカーを検出することができる。一つの態様において、装置は、単離または結合した小胞上のバイオマーカーを検出する。様々なプローブ、抗体、タンパク質または他の結合物質を使用して、マイクロ流体システム内のバイオマーカーを検出することができる。検出物質は、マイクロ流体装置の様々な区画中に固定化されてもよいし、または装置の様々なチャネルを通してハイブリダイゼーションまたは検出反応に導入されてもよい。
マイクロ流体装置中の小胞を溶解させ、その内容物、たとえばタンパク質または核酸、たとえばDNAまたはRNA、たとえばmiRNAまたはmRNAをマイクロ流体装置内で検出することができる。核酸は、マイクロ流体装置内で、検出前に増幅されてもよいし、または直接検出されてもよい。したがって、マイクロ流体システムはまた、様々なバイオマーカーの検出を多重化するために使用することもできる。ある態様においては、小胞がマイクロ流体装置内で捕捉され、捕捉された小胞が溶解され、小胞ペイロード由来のマイクロRNAのバイオシグネチャーが判定される。バイオシグネチャーは、小胞を捕捉するために使用される捕捉物質をさらに含むことができる。
新規なナノ加工技術が、高密度の精密アレイ、たとえば不均一ナノアレイとしても知られるヌクレオチドベースのチップおよびタンパク質アレイの加工に依存するバイオセンシング用途の可能性を開拓している。ナノ流体工学が、マイクロチップ中の流体分析対象物の量をナノリットルレベルまでさらに減らすことを可能にし、ここで使用されるチップがナノチップと呼ばれる。たとえば、参照により全体として本明細書に組み入れられるUnger M et al., Biotechniques 1999; 27(5): 1008-14、Kartalov EP et al., Biotechniques 2006; 40(1):85-90を参照すること。現在、市販のナノチップは、試料を試薬と合わせ、混合し、反応をモニターすることによって実施することができる簡単な一工程アッセイ、たとえば総コレステロール、総タンパク質またはグルコースアッセイを提供する。液クロマトグラフィー（LC）およびナノLC分離に基づくゲルフリーの分析法（いずれも参照により全体として本明細書に組み入れられるCutillas et al. Proteomics, 2005; 5:101-112およびCutillas etal., Mol Cell Proteomics 2005; 4:1038-1051）をナノチップと組み合わせて使用することもできる。
疾患、病状、症候群または生理学的状態を同定するのに適したアレイはキットに含まれることができる。キットは本発明のアプタマーを含むことができ、非限定的な例としてアレイの結合アイランドまたは区域の上への固定化のために分子を調製するのに有用な1種または複数種の試薬、固定化された分子への小胞の結合を検出するのに有用な試薬ならびに取り扱い説明を含むことができる。
生物学的試料中の特定のバイオシグネチャーの検出を容易にする高速検出装置が、本明細書においてさらに提供される。装置は、チップ上で生物学的試料調製をポリメラーゼ連鎖反応（PCR）と統合することができる。装置は、生物学的試料中の小胞の特定のバイオシグネチャーの検出を容易にすることができ、ある例が、参照により全体として本明細書に組み入れられるPipper et al., Angewandte Chemie, 47(21), p. 3900-3904 (2008)に記載されているように提供されている。バイオシグネチャーは、参照により全体として本明細書に組み入れられるLi et al., Adv Dent Res 18(1):3-5 (2005)に記載されているように、診断用途のために、マイクロ/ナノエレクトロケミカルシステム（MEMS/NEMS）センサおよび口腔液を使用して組み込むことができる。
粒子アレイ
平面アレイに代わるものとして、粒子を使用するアッセイ法、たとえばビーズベースのアッセイ法もまた、本発明のアプタマーを使用することができる。アプタマーは市販のビーズと容易にコンジュゲートする。たとえば、Srinivas et al. Anal. Chem. 2011 Oct. 21, Aptamer functionalized Microgel Particles for Protein Detectionを参照すること。また、治療物質および診断物質としてのアプタマーに関するレビュー文献、Brody and Gold, Rev. Mol. Biotech. 2000, 74:5-13を参照すること。
高感度オートメーションと合致した特定の活性を有する同族リガンドおよびレポーター分子によるビーズコーティングを使用するマルチパラメーターアッセイ法または他のハイスループット検出アッセイ法を使用することができる。ビーズベースのアッセイシステムにおいては、バイオマーカーまたは小胞のための結合物質、たとえば捕捉物質（たとえば捕捉抗体）をアドレス指定可能なミクロスフェア上に固定化することができる。個々の結合アッセイそれぞれのための各結合物質を別個のタイプのミクロスフェア（すなわちマイクロビーズ）に結合することができ、図2Bに示すように、アッセイ反応がそのミクロスフェアの表面で起こる。小胞のための結合物質は、ビーズに結合した捕捉抗体であることができる。別々の蛍光強度を有する染色されたミクロスフェアは、それらの適切な結合物質または捕捉プローブを別々に付加される。所望のとおり、異なる結合物質を有する異なるビーズセットをプールしてカスタムビーズアレイを生成することができる。そして、ビーズアレイを試料と共に一つの反応容器中でインキュベートしてアッセイを実施する。
また、ビーズベースのアッセイ法を本発明の1種または複数種のアプタマーと共に使用することもできる。ビーズ基体が、アプタマーを含む1種または複数種の結合物質を取り付けるためのプラットフォームを提供することができる。多重化の場合、複数の異なるビーズセット（たとえばIllumina, Luminex）が、異なる結合物質（異なる標的分子に特異的）を有することができる。たとえば、ビーズは、関心対象の抗原の存在を検出する（定量的または定性的に）ために使用される本発明のアプタマーにコンジュゲートさせることもできるし、または選択された生物学的試料中に存在する成分（たとえば、アプタマーが結合するように構成されている標的分子を含む細胞、細胞断片または小胞）を単離するために使用することもできる。市販のキットの使用を通して、有機起源の任意の分子をポリスチレンビーズにうまくコンジュゲートさせることができる。
一つまたは複数の本発明のアプタマーは、非限定的に磁気捕捉法、蛍光活性化細胞ソーティング（FACS）またはレーザーサイトメトリーを含む任意のビーズベースの基体と共に使用することができる。磁気捕捉法は、磁気活性化細胞ソーター（MACS）マイクロビーズまたは磁気カラムの使用を含むことができるが、それらに限定されない。本発明のアプタマーを使用するように修正することができるビーズまたは粒子ベースの方法の例は、米国特許第4,551,435号、第4,795,698号、第4,925,788号、第5,108,933号、第5,186,827号、第5,200,084号または第5,158,871号；第7,399,632号；第8,124,015号；第8,008,019号；第7,955,802号；第7,445,844号；第7,274,316号；第6,773,812号；第6,623,526号；第6,599,331号；第6,057,107号；第5,736,330号；国際公開公報第WO/2012/174282号；第WO/1993/022684号に記載されている方法およびビーズシステムを含む。
フローサイトメトリー法
生物学的試料由来の循環バイオマーカー、たとえばタンパク質抗原またはバイオマーカー包含細胞、細胞断片もしくは小胞の単離または検出はまた、サイトメトリープロセスにおいて本発明のアプタマーを使用して達成されてもよい。非限定的な例として、本発明のアプタマーは、ビーズまたはミクロスフェアのような粒子の使用を含むアッセイ法において使用することができる。本発明は、粒子にコンジュゲートし得るアプタマーを結合物質として提供する。流体流中に懸濁した微視的粒子をソートするためにはフローサイトメトリー法を使用することができる。粒子が通過するとき、粒子は選択的に荷電され、出るとき、別々の流路の中にそらされることができる。したがって、元の混合物、たとえば生物学的試料から高い精度および速度で集団を分離することが可能である。フローサイトメトリー法は、光学/電子検出装置の中を流れる単一細胞の物理的および/または化学的特徴の同時マルチパラメータ分析を可能にする。一つの波長（色）の光ビーム、通常はレーザービームが流体力学的に集束した流体流に向けて送られる。いくつかの検出器：光ビームと平行である一つの検出器（前方散乱またはFSC）、それに対して垂直であるいくつかの検出器（側方散乱またはSSC）および一つまたは複数の蛍光検出器が、流れが光ビームを通過する点に照準を定めている。
ビーム中を通過する各懸濁粒子は光を何らかのやり方で散乱させ、粒子中の蛍光化学物質が励起されると、光源よりも低い周波数の光を放出し得る。散乱光と蛍光とのこの組み合わせが検出器によって捕捉され、各検出器（蛍光放出ピークごとに一つ）における明るさの変動を分析することにより、個々の粒子それぞれの物理的および化学的構造に関する様々な事実を演繹することが可能である。FSCは細胞サイズと相関し、SSCは、粒子の内部複雑さ、たとえば核の形状、細胞質顆粒の量およびタイプまたは膜の粗さに依存する。いくつかのフローサイトメーターは蛍光の必要性を除いており、光散乱だけを計測に使用する。
フローサイトメーターは、毎秒数千個の粒子を「リアルタイム」で分析することができ、指定された性質を有する粒子をアクティブに分別し、単離することができる。フローサイトメーターは、各分析期間中、多数の単一細胞に関する設定パラメータのハイスループット自動化定量および分離を提供する。フローサイトメーターは複数のレーザーおよび蛍光検出器を有し、それにより、多数の標識を使用してそれらの表現型により標的集団をより正確に特定することが可能になる。したがって、フローサイトメーター、たとえばマルチカラーフローサイトメーターを使用して、複数の蛍光標識または色を有する一つまたは複数の小胞を検出することができる。いくつかの態様において、フローサイトメーターはまた、様々な小胞集団を、たとえばサイズごとに、または異なるマーカーごとに、ソートまたは単離することもできる。
フローサイトメーターは、一つまたは複数のレーザー、たとえば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはより多くのレーザーを有し得る。いくつかの態様において、フローサイトメーターは、一つより多い色または蛍光標識、たとえば少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20の異なる色または蛍光標識を検出することができる。たとえば、フローサイトメーターは、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20個の蛍光検出器を有することができる。
一つまたは複数の小胞を検出または分析し、異なる小胞集団をソートまたは分離するために使用することができる市販のフローサイトメーターの例は、MoFlo（商標）XDP Cell Sorter（Beckman Coulter, Brea, CA）、MoFlo（商標）Legacy Cell Sorter（Beckman Coulter, Brea, CA）、BD FACSAria（商標）Cell Sorter（BD Biosciences, San Jose, CA）、BD（商標）LSRII（BD Biosciences, San Jose, CA）およびBD FACSCalibur（商標）（BD Biosciences, San Jose, CA）を含むが、これらに限定されない。以下さらに説明するように、小胞の多重分析には、マルチカラーまたはマルチ蛍光サイトメーターを使用することができる。いくつかの態様において、フローサイトメーターは、一つまたは複数の特徴に基づいて一つより多い小胞集団をソートし、それにより、捕集またはソートすることができる。たとえば、二つの小胞集団はサイズが異なり、各集団内の小胞は、類似したサイズ範囲を有し、示差的に検出またはソートすることができる。もう一つの態様において、二つの異なる小胞集団は示差的に標識される。
フローサイトメーターから得られるデータは、ヒストグラムを生成するために一次元にプロットすることもできるし、または二次元でドットプロットとして見ることもできるし、またはより新規なソフトウェアを用いて三次元で見ることもできる。これらのプロット上の領域は、ゲートと呼ばれる一連のサブセット抽出によって順次に分けることができる。特に血液学に関する診断および臨床目的のためには特定のゲート制御プロトコルが存在する。プロットは、多くの場合、対数目盛において作成される。異なる蛍光色素の放出スペクトルは重なり合うため、検出器におけるシグナルは電子的かつ計算的に補正されなければならない。バイオマーカーを標識するための蛍光体は、参照により本明細書に組み入れられるOrmerod, Flow Cytometry 2nd ed., Springer-Verlag, New York (1999)およびNida et al., Gynecologic Oncology 2005; 4 889-894に記載されたものを含み得る。非限定的にフローサイトメトリー法を含む多重化アッセイ法においては、一つまたは複数の異なる標的分子を評価することができる。いくつかの態様において、標的分子の少なくとも一つは、本発明のアプタマーを使用して評価されるバイオマーカー、たとえば微小胞表面抗原である。
マイクロ流体工学
本発明の1種または複数種のアプタマーは、任意の有用な平面またはビーズ基体の上に配置することができる。本発明の一つの局面において、本発明の1種または複数種のアプタマーは、マイクロ流体装置上に配置され、それにより、関心対象のポリペプチド抗原またはその機能的断片を含む生物学的試料の成分の評価、特徴決定または単離を容易にする。たとえば、循環抗原またはその抗原を含む細胞、細胞断片もしくは細胞由来の小胞は、本発明の1種または複数種のアプタマーを使用して（または、さらなる結合物質と共に）評価することができる。また、「Lab-on-a-Chip」システム、バイオメディカルマイクロエレクトロメカニカルシステム（Bio-MEM）またはマルチコンポーネント集積システムとも呼ばれ得るマイクロ流体装置を小胞の単離および分析のために使用することができる。そのようなシステムは、小胞の結合、バイオシグネチャーの検出および他のプロセスを可能にするプロセスを小型化し、区画化する。
マイクロ流体装置はまた、サイズ差別選択またはアフィニティー選択による小胞の単離に使用することもできる。たとえば、マイクロ流体装置は、サイズに基づいてまたは生物学的試料から小胞を単離するための一つもしくは複数の結合物質を使用することによって生物学的試料から小胞を単離するための、一つまたは複数のチャネルを使用することができる。生物学的試料は、小胞の通過を選択的に可能にする一つまたは複数のマイクロ流体チャネルに導入することができる。選択は、小胞の性質、たとえば小胞のサイズ、形状、変形性またはバイオシグネチャーに基づくことができる。
一つの態様においては、異種小胞集団をマイクロ流体装置に導入することができ、一つまたは複数の異なる同種小胞集団を得ることができる。たとえば、異なるチャネルが、異なる小胞集団を選択するための異なるサイズ選択または結合物質を有することができる。したがって、マイクロ流体装置は複数の小胞を単離することができ、その場合、その複数の小胞の少なくとも一つのサブセットが、その複数の小胞の別のサブセットとは異なるバイオシグネチャーを含む。たとえば、マイクロ流体装置は、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90または100個の異なる小胞サブセットを単離することができ、その場合、小胞の各サブセットが異なるバイオシグネチャーを含む。
いくつかの態様において、マイクロ流体装置は、小胞のさらなる富化または選択を可能にする一つまたは複数のチャネルを含むことができる。第一のチャネルを通過した後の富化された小胞集団を第二のチャネルに導入することができ、その第二のチャネルが、所望の小胞または小胞集団の通過が第二のチャネル中に存在する1種または複数種の結合物質などによってさらに富化されることを可能にする。
アレイベースのアッセイ法およびビーズベースのアッセイ法をマイクロ流体装置と共に使用することができる。たとえば、結合物質をビーズに結合することができ、マイクロ流体装置中でビーズと小胞との間の結合反応を実施することができる。また、マイクロ流体装置を使用して多重化を実施することもできる。異なる区画が異なる小胞集団のための異なる結合物質を含むことができ、各集団は異なる起始細胞特異的小胞集団である。一つの態様において、各集団は異なるバイオシグネチャーを有する。ミクロスフェアと小胞との間のハイブリダイゼーション反応をマイクロ流体装置中で実施することができ、反応混合物を検出装置に送ることができる。検出装置、たとえばデュアルまたはマルチレーザー検出システムは、マイクロ流体システムの一部であることができ、かつレーザーを使用して各ビーズまたはミクロスフェアをそのカラーコーディングによって同定することができ、かつ別のレーザーが、各ビーズと関連するハイブリダイゼーションシグナルを検出することができる。
任意の適切なマイクロ流体装置を本発明の方法に使用することができる。小胞と共に使用され得る、または小胞との使用に適合され得るマイクロ流体装置の例は、それぞれ参照により全体として本明細書に組み入れられる米国特許第7,591,936号、第7,581,429号、第7,579,136号、第7,575,722号、第7,568,399号、第7,552,741号、第7,544,506号、第7,541,578号、第7,518,726号、第7,488,596号、第7,485,214号、第7,467,928号、第7,452,713号、第7,452,509号、第7,449,096号、第7,431,887号、第7,422,725号、第7,422,669号、第7,419,822号、第7,419,639号、第7,413,709号、第7,411,184号、第7,402,229号、第7,390,463号、第7,381,471号、第7,357,864号、第7,351,592号、第7,351,380号、第7,338,637号、第7,329,391号、第7,323,140号、第7,261,824号、第7,258,837号、第7,253,003号、第7,238,324号、第7,238,255号、第7,233,865号、第7,229,538号、第7,201,881号、第7,195,986号、第7,189,581号、第7,189,580号、第7,189,368号、第7,141,978号、第7,138,062号、第7,135,147号、第7,125,711号、第7,118,910号、第7,118,661号、第7,640,947号、第7,666,361号、第7,704,735号；および国際特許公開公報WO2010/072410に記載されているものを含むが、それらに限定されない。本明細書に開示される方法と共に使用するためのもう一つの例が、Chen et al., "Microfluidic isolation and transcriptome analysis of serum vesicles," Lab on a Chip, Dec. 8, 2009 DOI:10.1039/b916199fに記載されている。
本発明と共に使用するための他のマイクロ流体装置は、非限定的に、それぞれ参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,376,252号、第6,408,878号、第6,645,432号、第6,719,868号、第6,793,753号、第6,899,137号、第6,929,030号、第7,040,338号、第7,118,910号、第7,144,616号、第7,216,671号、第7,250,128号、第7,494,555号、第7,501,245号、第7,601,270号、第7,691,333号、第7,754,010号、第7,837,946号；米国特許出願第2003/0061687号、第2005/0084421号、第2005/0112882号、第2005/0129581号、第2005/0145496号、第2005/0201901号、第2005/0214173号、第2005/0252773号、第2006/0006067号；ならびに欧州特許第0527905号および第1065378号に開示されているものを含む、エラストマー層、弁およびポンプを含む装置を含む。いくつかの場合、装置の大部分またはすべてはエラストマー材料で構成されている。特定の装置は、装置を通過する溶液流量を調整するための一つまたは複数のエラストマー弁を含む装置によって熱サイクリング反応（たとえばPCR）を実施するように設計されている。装置は、反応部位のアレイを含むことができ、それにより、複数の反応を実施することを可能にする。したがって、装置は、小胞から単離されたマイクロRNAを含む循環マイクロRNAを多重的に評価するために使用することができる。ある態様において、マイクロ流体装置は、（a）エラストマー基体中に形成された第一の複数の流路；（b）第一の複数の流路と交差して反応部位のアレイを画定する、エラストマー基体中に形成された第二の複数の流路であって、各反応部位が、第一および第二の流路の一つの交点に位置する、第二の複数の流路；（c）各反応部位内の溶液を他の反応部位の溶液から単離するように作動させることができる、第一および第二の複数の流路に沿って配置され、反応部位の間で離間した複数の単離弁であって、それぞれが流路の一つまたは複数にかぶさり、それと交差する一つまたは複数の制御チャネルを含む単離弁；および（d）反応部位を互いから単離するための弁を同時に作動させるための手段を含む。装置の基本構造への様々な変更が本発明の範囲内で想定される。マイクロRNAは、PCR法を使用することにより、各反応部位の中で検出することができる。たとえば、方法は、（i）マイクロ流体装置を提供する工程であって、マイクロ流体装置が、第一の流体チャネルを介して互いに流体的に連絡した第一端および第二端を有する第一の流体チャネル；それぞれが末端壁で終端する複数の流路であって；各流路が第一の流体チャネルから分岐し、それと流体的に連絡しており、該第一の流体チャネルから流路の一つに入る水性流体が第一の流体チャネルを通ってのみ流路から出ることができる、複数の流路；および試料流体を導入するための、第一の流体チャネルと流体的に連絡した入口を含み；各流路が、閉じたとき流路の一端を第一の流体チャネルから隔離し、それにより、弁と末端壁との間に隔離された反応部位が形成されるようにする弁と関係し；制御チャネル；各弁が、作動力が制御チャネルに加えられたとき、弁と関連する流路の中へと撓み、それにより、弁を閉じる可撓性の膜であり；作動力が制御チャネルに加えられたとき、各流路中の弁が閉じられて、各流路中に隔離された反応部位を製造する、工程；（ii）試料流体を入口に導入する工程であって、試料流体が流路を満たす、工程；（iii）弁を作動させて、流路内で試料流体を別々の部分へと分離する工程；（iv）試料流体中の核酸を増幅する工程；（v）試料流体の部分を分析して、増幅が反応を生じさせたかどうかを判定する工程を含むことができる。試料流体は、増幅可能な核酸標的、たとえばマイクロRNAを含むことができ、条件は、PCR産物の形成を生じさせるようなポリメラーゼ連鎖反応（PCR）条件であることができる。
マイクロ流体装置は、チャネル中の表面に付いた、またはチャネル中に存在する1種または複数種の結合物質を有することができる。たとえば、マイクロチャネルは、一つまたは複数の捕捉物質、たとえば、表3における一つまたは複数の一般的微小胞抗原または非限定的にEpCam、CD9、PCSA、CD63、CD81、PSMA、B7H3、PSCA、ICAM、STEAP、KLK2、SSX2、SSX4、PBP、SPDEFおよびEGFRを含む、表4における起始細胞もしくは癌関連抗原のための捕捉物質を有することができる。捕捉物質は、本発明の方法によって選択されたアプタマーであり得る。また、チャネルの表面を本発明のブロッキングアプタマーと接触させることもできる。一つの態様において、マイクロチャネル表面をアビジンで処理し、ビオチン化された捕捉物質、たとえば抗体をチャネルに注入してアビジンと結合させることができる。他の態様において、捕捉物質は、マイクロ流体装置のチャンバーまたは他の構成要素の中に存在する。捕捉物質はまた、マイクロ流体チャネル中で動かすように操作することができるビーズに取り付けることもできる。一つの態様において、捕捉物質は磁性ビーズに取り付けられる。ビーズは、磁石を使用して操作することができる。
生物学的試料は、少なくとも毎分約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45または50μl、たとえば毎分約1〜50、5〜40、5〜30、3〜20または5〜15μlの速度でマイクロ流体装置またはマイクロチャネル中に流すことができる。一つまたは複数の小胞をマイクロ流体装置中で捕捉し、直接検出することができる。または、分析の前に、捕捉された小胞を解放し、マイクロ流体装置から出してもよい。もう一つの態様においては、一つまたは複数の捕捉された小胞をマイクロチャネル中で溶解させ、その溶解産物を分析して、たとえば小胞内のペイロードを検査することもできる。溶解バッファをチャネル中に流し、捕捉された小胞を溶解させることができる。たとえば、溶解バッファは、少なくとも毎分約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、26、27、28、29、30、35、40、45または50μl、たとえば毎分約1〜50、5〜40、10〜30、5〜30または10〜35μlの速度で装置またはマイクロチャネル中に流すことができる。溶解産物を捕集し、たとえばRT-PCR、PCR、質量分析、ウエスタンブロットまたは他のアッセイを実施することによって分析して、小胞の一つまたは複数のバイオマーカーを検出することができる。
表現型
本明細書に開示されるものは、本発明の方法および組成物を使用して表現型を特徴決定するための生成物およびプロセスである。本明細書において使用される語「表現型」は、本発明の組成物および/または方法を部分的または完全に使用して同定されるバイオマーカープロフィールに帰される任意の特性または特徴を意味することができる。たとえば、表現型とは、対象から得られた試料に関して特徴決定されたバイオマーカープロフィールに基づく診断用、予後判定用、またはセラノーシス用の判断であることができる。表現型は、任意の観測可能な特徴または特性、たとえば疾患もしくは病状、病期もしくは病状期、疾患もしくは病状に対する感受性、病期もしくは病状の予後、生理学的病状または治療剤に対する応答/潜在的応答であることができる。表現型は、対象の遺伝的構成ならびに環境要因の影響および二つの間の相互作用ならびに核酸配列に対する後成的修飾から生じることができる。
対象における表現型は、対象から生物学的試料を取得し、本発明の組成物および/または方法を使用してその試料を分析することによって特徴決定することができる。たとえば、対象または個体の表現型の特徴決定は、疾患または病状を検出すること（前駆症状早期検出を含む）、疾患または病状の予後判定、診断またはセラノーシスを判断すること、または疾患または病状の病期または進行を決定することを含むことができる。表現型の特徴決定はまた、特定の疾患、病状、病期および病状期に適切な治療または治療効能を同定すること、疾患進行、特に疾患再発、転移拡散または疾患回帰の予測および尤度分析を含むこともできる。表現型はまた、病状または疾患の臨床的に明確なタイプまたはサブタイプ、たとえば癌または腫瘍であることもできる。表現型決定はまた、生理学的病状の判定または移植後のような臓器窮迫もしくは臓器拒絶反応の評価であることもできる。本明細書に記載される組成物および方法は、個体ベースにおける対象の評価を可能にし、それが、治療におけるより効率的かつ経済的な決定の利点を提供することができる。
ある局面において、本発明は、疾患または病状の診断、予後判定および/またはセラノーシスを提供するための、微小胞のようなバイオマーカーの分析に関する。セラノーシスは、疾患または疾患状態の治療法または治療に影響する能力を提供する診断試験を含む。セラノーシス試験は、診断または予後判定試験がそれぞれ診断または予後判定を提供するのと同様なやり方でセラノーシスを提供する。本明細書において使用されるセラノーシスは、予測的医療、個別化医療、統合医療、薬理診断学およびDx/Rxパターニングを含む、任意の所望の形態の治療関連の試験を包含する。治療関連の試験は、個々の対象における薬物応答を予測および評価する、すなわち、個別化医療を提供するために使用することができる。薬物応答の予測は、たとえば対象が暴露される、または他のやり方で治療される前にその対象が候補治療物質に対して応答者である可能性が高いのか、非応答者である可能性が高いのかを決定することであることができる。薬物応答の評価は、薬物に対する応答をモニターすること、たとえば治療の開始後、時間経過と共に対象の改善またはその欠如をモニターすることであることができる。治療関連の試験は、治療から恩恵を受ける可能性が特に高い対象をその治療に選択する、または個々の対象において治療効能の早期的かつ客観的指示を提供するのに有用である。したがって、本発明の組成物および方法を使用する分析は、より有望な治療を選択するために治療を変更すべきであることを示し、それにより、有益な治療を遅らせる多大な損失を避け、効果のない薬物を投与する金銭的および罹病率の犠牲を避け得る。
したがって、本発明の組成物および方法は、対象が疾患または障害に対する治療に応答する可能性があるかどうかを予測するのに役立ち得る。表現型の特徴決定は、対象の応答者/非応答者状態を予測することを含み、応答者は疾患に対する治療に応答し、非応答者はその治療に応答しない。微小胞などのバイオマーカーを対象において解析し、治療に応答するかまたは応答しないことが知られている以前の対象のそれに対して比較することができる。対象におけるバイオマーカープロファイルが、治療に応答することが知られている以前の対象のバイオマーカープロファイルとより密接に合致するならば、その対象を、その治療に対する応答者として特徴決定または予測することができる。同様に、対象におけるバイオマーカープロファイルが、治療に応答しなかった以前の対象のバイオマーカープロファイルとより密接に合致するならば、その対象を、その治療に対する非応答者として特徴決定または予測することができる。治療は、本明細書で開示されたものを非限定的に含む任意の適切な疾患、障害または他の病態に対する治療であることができる。
いくつかの態様において、表現型は、表1または16に記載されたもののような疾患または病態を含む。たとえば、表現型は、腫瘍、新生物または癌の存在またはそれらを発生させる可能性の検出、あるいは、腫瘍、新生物または癌の特徴決定（例えば病期、悪性度、侵攻性、転移または再発の可能性など）を含むことができる。本明細書に記載される方法または組成物によって検出または評価することのできる癌は、乳癌、卵巣癌、肺癌、結腸癌、過形成性ポリープ、腺腫、結腸直腸癌、高度異形成、低度異形成、前立腺肥大症、前立腺癌、黒色腫、膵臓癌、脳癌（たとえば神経膠芽腫など）、血液悪性腫瘍、肝細胞癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、頭頸部癌、食道癌、消化管間質腫瘍（GIST）、腎細胞癌（RCC）または胃癌を含むが、これらに限定されない。結腸直腸癌はCRCデュークスBまたはデュークスC〜Dであり得る。血液悪性腫瘍は、B細胞慢性リンパ球性白血病、B細胞リンパ腫DLBCL、B細胞リンパ腫DLBCL胚中心様、B細胞リンパ腫DLBCL活性化B細胞様およびバーキットリンパ腫であり得る。
表現型は、前癌状態、たとえば光線角化症、萎縮性胃炎、白板症、紅色肥厚症、リンパ腫様肉芽腫症、前白血病、線維症、頸部異形成、子宮頸部異形成、色素性乾皮症、バレット食道、結腸直腸ポリープまたは悪性腫瘍に発展する可能性がある他の異常な組織増殖もしくは病変であることができる。悪性転換性ウイルス感染症、たとえばHIVおよびHPVもまた、本発明にしたがって評価することができる表現型を提示する。
本発明の方法によって特徴決定することができる癌は、非限定的に、癌腫、肉腫、リンパ腫もしくは白血病、胚細胞腫、芽細胞腫または他の癌を含むことができる。癌腫は、非限定的に、上皮新生物、扁平上皮新生物、扁平上皮癌腫、基底細胞新生物、基底細胞癌腫、移行上皮乳頭腫および癌腫、腺腫および腺癌腫（腺）、腺腫、腺癌腫、形成性胃組織炎インスリノーマ、グルカゴノーマ、ガストリノーマ、ビポーマ、胆管癌腫、肝細胞癌、腺様嚢胞癌腫、虫垂カルチノイド腫、プロラクチノーマ、好酸性顆粒細胞腫、ヒュルトレ細胞腺腫、腎細胞癌腫、グラビッツ腫、多発性内分泌腺腫、子宮内膜腺腫、付属器および皮膚付属器新生物、粘膜表皮新生物、嚢胞、粘液および漿液新生物、嚢胞腺腫、腹膜偽粘液腫、管、小葉および髄質新生物、腺房細胞新生物、複合上皮新生物、ウォーシン腫、胸線腫、特定化生殖腺新生物、性索間質腫、きょう膜腫、顆粒膜細胞腫、男性胚細胞腫、セルトリライディッヒ細胞腫、グロムス腫、傍神経節腫、褐色細胞腫、グロムス腫、母斑および黒色腫、メラノサイト母斑、悪性黒色腫、黒色腫、結節性黒色腫、異形成母斑、悪性黒子黒色腫、表在拡大型黒色腫および悪性末端性ほくろ性黒色腫を含む。肉腫は、非限定的に、アスクン腫瘍、ブドウ状肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性血管内皮腫、悪性神経鞘腫、骨肉腫、軟部組織肉腫、たとえば胞巣状軟部肉腫、血管肉腫、葉状嚢肉腫、皮膚線維肉腫、デスモイド腫、線維形成性小円形細胞腫、類上皮肉腫、骨外性軟骨肉腫、骨外性骨肉腫、線維肉腫、血管外皮腫、血管肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、リンパ肉腫、悪性線維性組織球腫、神経線維肉腫、横紋筋肉腫および滑膜肉腫を含む。リンパ腫および白血病は、非限定的に、慢性リンパ球性白血病/小リンパ球性リンパ腫、B細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫（たとえばワルデンシュトレームマクログロブリン血症）、脾臓辺縁帯リンパ腫、形質細胞性骨髄腫、形質細胞腫、モノクローナル免疫グロブリン沈着症、重鎖病、maltリンパ腫とも呼ばれる節外性辺縁帯B細胞リンパ腫、結節辺縁帯B細胞リンパ腫（nmzl）、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、縦隔（胸腺）大細胞型B細胞リンパ腫、血管内大細胞型B細胞リンパ腫、原発性滲出液リンパ腫、バーキットリンパ腫/白血病、T細胞前リンパ球性白血病、T細胞大顆粒リンパ球性白血病、活性NK細胞白血病、成人T細胞白血病/リンパ腫、節外性NK/T細胞リンパ腫、鼻型腸症型T細胞リンパ腫、肝脾T細胞リンパ腫、芽球NK細胞リンパ腫、菌状息肉腫/セザリー症候群、原発性皮膚CD30陽性T細胞リンパ増殖性疾患、原発性皮膚未分化大細胞リンパ腫、リンパ腫様丘疹症、血管免疫芽細胞T細胞リンパ腫、末梢性T細胞リンパ腫、不特定の未分化大細胞リンパ腫、古典的ホジキンリンパ腫（結節性硬化症、混合細胞充実度、リンパ球豊富、リンパ球枯渇または非枯渇）および結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫を含む。胚細胞腫は、非限定的に、胚細胞腫、未分化胚細胞腫、精上皮腫、非胚細胞腫、胎児性癌腫、内胚葉洞腫、絨毛癌腫、奇形腫、多胚腫および生殖腺芽細胞腫を含む。芽細胞腫は、非限定的に、腎芽腫、髄芽腫および網膜芽細胞腫を含む。他の癌は、非限定的に、口唇癌腫、喉頭癌腫、下咽頭癌腫、舌癌腫、唾液腺癌腫、胃癌腫、腺癌腫、甲状腺癌腫（髄様および甲状腺乳頭癌腫）、腎癌腫、腎実質癌腫、子宮頸癌腫、子宮内膜癌腫、子宮内膜癌腫、絨毛癌腫、精巣癌腫、泌尿器癌腫、黒色腫、脳腫瘍、たとえば神経膠芽腫、星状細胞腫、髄膜腫、髄芽腫および末梢神経外胚葉性腫瘍、胆嚢癌腫、気管支癌腫、多発性骨髄腫、基底細胞腫、奇形腫、網膜芽細胞腫、脈絡膜黒色腫、精上皮腫、横紋筋肉腫、頭蓋咽頭腫、骨肉腫、軟骨肉腫、筋肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫、ユーイング肉腫および形質細胞腫を含む。
さらなる態様において、解析される癌は、非小細胞肺癌および小細胞肺癌を含む肺癌（小細胞癌腫（燕麦細胞癌）、混合小細胞/大細胞癌腫および複合小細胞癌腫を含む）、結腸癌、乳癌、前立腺癌、肝臓癌、膵臓癌、脳癌、腎臓癌、卵巣癌、胃癌、皮膚癌、骨癌、胃癌、乳癌、膵臓癌、神経膠腫、神経膠芽腫、肝細胞癌、乳頭状腎臓癌腫、頭頸部扁平上皮癌腫、白血病、リンパ腫、骨髄腫または固形腫瘍であってもよい。
複数の態様において、癌は、急性リンパ芽球性白血病；急性骨髄性白血病；副腎皮質癌；AIDS関連癌；AIDS関連リンパ腫；肛門癌；虫垂癌；星状細胞腫；非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍；基底細胞癌；膀胱癌；脳幹神経膠腫；脳腫瘍（脳幹神経膠腫、中枢神経系非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍、中枢神経系胚芽腫、星状細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣芽腫、上衣腫、髄芽腫、髄上皮腫、中間型松果体実質腫瘍、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、および松果体芽腫を含む）；乳癌；気管支腫瘍；バーキットリンパ腫；原発不明癌；カルチノイド腫瘍；原発不明癌腫；中枢神経系非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍；中枢神経系胚芽腫；子宮頸癌；小児癌；脊索腫；慢性リンパ球性白血病；慢性骨髄性白血病；慢性骨髄増殖性障害；結腸癌；結腸直腸癌；頭蓋咽頭腫；皮膚T細胞リンパ腫；内分泌膵島細胞腫瘍；子宮内膜癌；上衣芽腫；上衣腫；食道癌；鼻腔神経芽細胞腫；ユーイング肉腫；頭蓋外胚細胞腫瘍；性腺外胚細胞腫瘍；肝外胆管癌；胆嚢癌；胃癌；消化管カルチノイド腫瘍；消化管間質細胞腫瘍；消化管間質腫瘍（GIST）；妊娠性絨毛性腫瘍；神経膠腫；毛様細胞性白血病；頭頸部癌；心臓癌；ホジキンリンパ腫；下咽頭癌；眼内黒色腫；膵島腫瘍；カポジ肉腫；腎臓癌；ランゲルハンス細胞組織球症；喉頭癌；口唇癌；肝臓癌；悪性線維性組織球腫；骨癌；髄芽腫；髄上皮腫；黒色腫；メルケル細胞癌；メルケル細胞皮膚癌；中皮腫；原発不明転移性扁平上皮性頸部癌；口腔癌；多発性内分泌腫瘍症候群；多発性骨髄腫；多発性骨髄腫/形質細胞腫瘍；菌状息肉腫；骨髄異形成症候群；骨髄増殖性腫瘍；鼻腔癌；鼻咽頭癌；神経芽細胞腫；非ホジキンリンパ腫；非黒色腫皮膚癌；非小細胞肺癌；口腔癌；口腔癌；口腔咽頭癌；骨肉腫；その他の脳および脊髄の腫瘍；卵巣癌；卵巣上皮癌；卵巣胚細胞腫瘍；卵巣低悪性度腫瘍；膵臓癌；乳頭腫症；副鼻腔癌；副甲状腺癌；骨盤癌；陰茎癌；咽頭癌；中間型松果体実質腫瘍；松果体芽腫；下垂体腫瘍；形質細胞腫瘍/多発性骨髄腫；胸膜肺芽腫；原発性中枢神経系（CNS）リンパ腫；原発性肝細胞肝癌；前立腺癌；直腸癌；腎臓癌；腎細胞（腎臓）癌；腎細胞癌；気道癌；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；唾液腺癌；セザリー症候群；小細胞肺癌；小腸癌；軟部組織肉腫；扁平上皮癌；扁平上皮性頸部癌；胃癌；テント上原始神経外胚葉性腫瘍；T細胞リンパ腫；精巣癌；咽喉癌；胸腺癌；胸腺腫；甲状腺癌；移行上皮癌；腎盂尿管移行上皮癌；絨毛性腫瘍；尿管癌；尿道癌；子宮癌；子宮肉腫；膣癌；外陰癌；ワルデンシュトレームマクログロブリン血症；またはウィルムス腫瘍を含む。本発明の方法は、これらおよび他の癌を特徴決定するために使用することができる。したがって、表現型の特徴決定は、本明細書に開示される癌のいずれかの診断、予後判定またはセラノーシスを提供することであることができる。
いくつかの態様において、癌は、急性骨髄性白血病（AML）、乳癌、胆管癌、結腸直腸腺癌、肝外胆管腺癌、女性生殖器悪性腫瘍、胃腺癌、食道腺癌、消化管間質腫瘍（GIST）、神経膠芽腫、頭頸部扁平上皮癌、白血病、肝臓肝細胞癌、低悪性度の神経膠腫、肺細気管支肺胞上皮癌（BAC）、肺非小細胞肺癌（NSCLC）、肺小細胞癌（SCLC）、リンパ腫、男性生殖器悪性腫瘍、胸膜の悪性孤立線維性腫瘍（MSFT）、黒色腫、多発性骨髄腫、神経内分泌腫瘍、結節びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、非上皮性卵巣癌（非EOC）、卵巣表面上皮癌、膵臓腺癌、下垂体癌、乏突起膠腫、前立腺腺癌、後腹膜もしくは腹膜癌、後腹膜もしくは腹膜肉腫、小腸悪性腫瘍、軟部組織腫瘍、胸腺癌、甲状腺癌またはブドウ膜黒色腫を含む。本発明の方法は、これらおよび他の癌を特徴決定するために使用することができる。したがって、表現型の特徴決定は、本明細書に開示される癌の一つの診断、予後判定またはセラノーシスを提供することであることができる。
該表現型はまた、炎症性疾患、免疫疾患、または自己免疫疾患であり得る。例えば、該疾患は、炎症性腸疾患（IBD）、クローン病（CD）、潰瘍性大腸炎（UC）、骨盤炎症、血管炎、乾癬、糖尿病、自己免疫性肝炎、多発性硬化症、重症筋無力症、I型糖尿病、関節リウマチ、乾癬、全身性エリテマトーデス（SLE）、橋本甲状腺炎、グレーブス病、強直性脊椎炎、シェーグレン病、CREST症候群、強皮症、リウマチ性疾患、臓器拒絶反応、原発性硬化性胆管炎、または敗血症であり得る。
該表現型はまた、アテローム性動脈硬化症、うっ血性心不全、不安定プラーク、脳卒中、または虚血等の心血管疾患を含み得る。該心血管疾患または病態は、高血圧症、狭窄、血管閉塞、または血栓性事象であり得る。
該表現型はまた、多発性硬化症（MS）、パーキンソン病（PD）、アルツハイマー病（AD）、統合失調症、双極性障害、うつ病、自閉症、プリオン病、ピック病、認知症、ハンチントン病（HD）、ダウン症候群、脳血管疾患、ラズムッセン脳炎、ウイルス性髄膜炎、神経精神全身性エリテマトーデス（NPSLE）、筋萎縮性側索硬化症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、伝達性海綿状脳症、虚血再灌流傷害（例えば、脳卒中）、脳損傷、微生物感染、または慢性疲労症候群等の神経系疾患を含み得る。該表現型はまた、線維筋痛症、慢性神経因性疼痛、または末梢性神経因性疼痛等の病態であり得る。
該表現型はまた、細菌、ウイルス、または酵母菌感染症等の感染症を含み得る。例えば、該疾患もしくは病態は、ウィップル病、プリオン病、肝硬変、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、HIV、肝炎、梅毒、髄膜炎、マラリア、結核、またはインフルエンザであり得る。HIVまたはHCV様粒子等のウイルスタンパク質は、ウイルスの状態を特徴決定するために、小胞中で評価され得る。
該表現型はまた、周産期または妊娠に関連した病態（例えば、子癇前症もしくは早産）、鉄代謝に関連する代謝性疾患もしくは病態等の代謝性疾患もしくは病態を含み得る。例えば、ヘプシジンは、鉄分不足を特徴決定するために、小胞中で評価され得る。該代謝性疾患または病態はまた、糖尿病、炎症、または周産期の病態であり得る。
本発明の組成物および方法は、バイオマーカーにより評価され得るこれらならびに他の疾患および障害を特徴決定するために使用され得る。したがって、表現型の特徴決定は、本明細書に開示される疾患および障害のうち1つの診断、予後判定、またはセラノーシスを提供することが可能である。
対象
対象の1つ以上の表現型を、対象から得られる生体試料中の小胞などの一つまたは複数の小胞を分析することによって決定することができる。対象または患者としては、ウシ、トリ、イヌ、ウマ、ネコ、ヒツジ、ブタ、または霊長類動物（ヒトおよび非ヒト霊長類を含む）等の哺乳動物を挙げることができるが、これらに限定されない。対象はまた、シベリアトラ等の絶滅の危機に瀕しているために重要な哺乳動物、ヒトによって消費用に農場で育てられる動物等の経済的に重要な哺乳動物、またはペットとして、または動物園で飼育されている動物等の、ヒトにとって社会的に重要な動物が含まれ得る。このような動物の例としては、ネコおよびイヌ等の肉食動物、ブタ（pig）、雄ブタ、およびイノシシを含むブタ（swine）、ウシ、雄ウシ、ヒツジ、キリン、シカ、ヤギ、バイソン、およびラクダ、またはウマ等の反芻動物または有蹄動物が挙げられるが、これらに限定されない。また、絶滅の危機に瀕したトリ、または、動物園で飼育されるトリ、ならびに家禽（fowl）、さらに具体的には、家畜化された家禽、すなわち、シチメンチョウ、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ホロホロチョウ等の家禽類（poultry）も含まれる。また、家畜化されたブタおよびウマ（競争馬を含む）も含まれる。加えて、農業および水産、ならびに他の活動と関係がある動物等の、商業活動と関係がある任意の動物種も含まれ、ここで、疾患のモニタリング、診断、および治療の選択は、経済的生産性および/または食物連鎖の安全性のため、畜産において通常の業務である。
該対象は、癌等の既存の疾患もしくは病態を有し得る。あるいは、該対象は、いかなる既知の既存の病態を有していなくてもよい。該対象はまた、癌の治療等の、現行または過去の治療に対し非応答性であり得る。
試料
本発明の組成物および方法によって使用および/または評価される試料は、非限定的に組織切片、たとえば外科的もしくは他の処置の間に除去された生検材料もしくは組織、体液、検死試料、組織学的目的に採取された凍結切片および細胞培養物を含む、バイオマーカー評価に使用することができる任意の適切な生物学的試料を含む。そのような試料は、血液および血液分画または産物（たとえば血清、バフィーコート、血漿、血小板、赤血球など）、痰、悪性浸出液、頬細胞組織、培養細胞（たとえば初代培養物、外植片および形質転換細胞）、糞便、尿、他の生物学的または体液（たとえば前立腺液、胃液、腸液、腎臓液、肺液、脳脊髄液など）などを含む。試料は、新鮮な凍結ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）ブロックである、ホルマリン固定パラフィン包埋されている、またはRNA保存液＋ホルマリン固定液内にある生物学的材料を含むことができる。患者ごとに一つより多いタイプの一つより多い試料を使用することができる。
本明細書に記載される方法において使用される試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）試料であることができる。FFPE試料は、固定組織、非染色スライド、骨髄コアまたはクロット、コア針生検材料、悪性液および微細針吸引液（FNA）の一つまたは複数であることができる。ある態様において、固定組織は、手術または生検からの腫瘍含有ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）ブロックを含む。もう一つの態様において、非染色スライドは、パラフィンブロックからの非染色荷電アンベークドスライドを含む。もう一つの態様において、骨髄コアまたはクロットはカルシウム除去コアを含む。ホルマリン固定コアおよび/またはクロットはパラフィン包埋されていることができる。さらに別の態様において、コア針生検材料は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはより多くの、たとえば3〜4個のパラフィン包埋生検試料を含む。18ゲージ針生検を使用することができる。悪性流体は、5×5×2mmの細胞ペレットを生成するのに十分な量の新鮮な胸/腹水を含むことができる。流体は、パラフィンブロック中でホルマリン固定されることができる。ある態様において、コア針生検材料は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはより多くの、たとえば4〜6のパラフィン包埋吸引液を含む。
試料は、当業者によって理解される技術にしたがって処理され得る。試料は、非限定的に、新鮮な、凍結された、または固定された細胞または組織であることができる。いくつかの態様において、試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）組織、新鮮な組織または新鮮凍結（FF）組織を含む。試料は、対象試料由来の一次または不死化細胞系を含む培養細胞を含むことができる。試料はまた、対象由来の試料からの抽出物をいうこともできる。たとえば、試料は、組織または体液から抽出されたDNA、RNAまたはタンパク質を含むことができる。そのような目的のために多くの技術および市販のキットが利用可能である。個体由来の新鮮な試料は、さらなる処理、たとえば細胞溶解および抽出の前に、RNAを保存するための剤で処理することができる。試料は、他の目的のための捕集された凍結試料を含むことができる。試料は、関連する情報、たとえば年齢、性別および対象中に存在する臨床症候；試料の出所；ならびに試料の捕集および貯蔵の方法と関連させることができる。試料は一般的に対象から得られる。
生検は、診断用または予後判定用の評価のために、および組織標本そのものに組織試料を取り出すプロセスを含む。当技術分野において公知の任意の生検技術を本発明の分子プロファイリング法に適用することができる。適用される生検技術は、とりわけ、評価される組織タイプ（たとえば結腸、前立腺、腎臓、膀胱、リンパ節、肝臓、骨髄、血液細胞、肺、乳房など）、腫瘍のサイズおよびタイプ（たとえば固形または懸濁状態、血液または腹水）に依存することができる。代表的な生検技術は、切除生検、切開生検、針生検、外科的生検および骨髄生検を含むが、これらに限定されない。「切除生検」とは、腫瘍塊全体をそれを包囲する正常組織の小さな縁と共に取り出す生検をいう。「切開生検」とは、腫瘍の断面直径を含むくさび状組織の取り出しをいう。分子プロファイリングは、腫瘍塊の「コア針生検」または概して腫瘍塊内から細胞の懸濁液を得る「微細針吸引生検」を使用することができる。生検技術は、たとえばHarrison's Principles of Internal Medicine, Kasper, et al., eds., 16th ed., 2005, Chapter 70およびPart V全体で詳述されている。
概して、参照により本明細書に組み入れられるSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989)およびAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1989)およびPerbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley & Sons, New York (1988)およびWatson et al., Recombinant DNA, Scientific American Books, New York and in Birren et al (eds) Genome Analysis: A Laboratory Manual Series, Vols. 1-4 Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998)ならびに米国特許第4,666,828号；第4,683,202号；第4,801,531号；第5,192,659号および第5,272,057号におけるような、当技術分野において公知であり、具体的には説明されない標準的分子生物学的技術が踏襲される。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、概してPCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)におけるように実施することができる。
本発明の組成物および方法を用いて評価される生物学的試料は任意の有用な体液または生物学的液体であることができ、たとえば、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（CSF）、痰、唾液、骨髄、滑液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液（前立腺液を含む）、カウパー腺液もしくは尿道球腺液、女性射精液、汗、糞便、体毛、涙液、嚢胞液、胸膜液および腹膜液、心膜液、リンパ液、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、月経分泌物、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌液、粘膜分泌液、水便、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液、他の洗浄液、細胞、細胞培養物、または細胞培養上清を含むがこれらに限定されない。生物学的試料はまた、胎児もしくは母体起源であってもよい胚盤胞腔液、臍帯血または母体循環物を含むこともある。生物学的試料はまた、小胞および他の循環バイオマーカーを得ることができる、細胞培養物、組織試料、または生検材料であってもよい。たとえば、関心対象の細胞を培養し、培養物から小胞を単離することができる。様々な態様において、本明細書に開示されるバイオマーカーまたはより具体的にはバイオシグネチャーは、様々な方法、たとえば血液、血漿、血清または前記生物学的試料のいずれかからの核酸分子の抽出、ポリペプチド（または機能的断片）バイオマーカーを同定するためのタンパク質または抗体アレイの使用ならびに核酸およびポリペプチド分子の同定および評価のための当技術分野において公知の他のアレイ、配列決定、PCRおよびプロテオミック技術を使用して、そのような生物学的試料から直接評価することができる（たとえば、核酸もしくはポリペプチドバイオマーカーまたはそれらの機能的断片の存在またはレベルの同定）。加えて、そのような試料中に存在する1つまたは複数の成分をまず単離または富化して、選択されたバイオマーカーの存在またはレベルを評価するため、所与のバイオシグネチャーを評価するために、さらに処理することができる。（例えば、微小胞を試料から単離した後に、タンパク質および/または核酸バイオマーカーに関してプロファイリングする）。
表1は、本発明の方法による解析のために使用され得る、疾患、病態または生物学的状態と対応する生物学的試料との非限定的なリストを示す。
（表１）様々な疾患、病態または生物学的状態に対する生物学的試料の例
Figure 2016533752
Figure 2016533752
本発明の方法は、血液試料または血液由来物を使用して表現型を特徴決定するために使用することができる。血液由来物は血漿および血清を含む。血漿は、全血の液体成分であり、全血量の約55％までを構成する。血漿は、主に水ならびに小量のミネラル、塩、イオン、栄養素および溶解状態のタンパク質で構成されている。全血中、赤血球、白血球および血小板が血漿内に懸濁している。血清とは、フィブリノーゲンまたは他の凝固因子を有しない血漿（すなわち、全血から血球および凝固因子を差し引いたもの）をいう。
生物学的試料は、生物学的試料の直接評価によるのか、生物学的試料から得られる一つまたは複数の小胞のプロファイリングによるのかにかかわらず、バイオマーカーの解析を実施しない当事者のような第三者を通して得ることができる。たとえば、試料は、試料が由来する対象の臨床医、医師または他の健康管理者を通して得ることができる。または、生物学的試料は、小胞を解析する同じ当事者によって得ることもできる。加えて、アッセイされる生物学的試料は、保管（たとえば凍結）されるか、または他の様式で保存条件下に貯蔵される。
さらに、生物学的試料は、起始細胞に由来しかつ対象の生物学的液体において細胞外でまたは細胞外環境で利用可能である、小胞または細胞膜断片を含むことができる。
本発明の方法は、一つまたは複数の小胞を評価する工程、例えば小胞集団を評価する工程を含むことができる。本明細書において使用される小胞とは、細胞から流出した膜小胞である。小胞または膜小胞は、非限定的に、循環微小胞（cMV）、微小胞、エキソソーム、ナノ小胞、デキソソーム、ブレブ、小水疱、プロスタソーム、微粒子、内腔内小胞、膜断片、内腔内エンドソーム小胞、エンドソーム様小胞、エキソサイトーシスビヒクル、エンドソーム小胞、エンドソーマル小胞、アポトーシス体、多胞体、分泌小胞、リン脂質小胞、リポソーム小胞、アルゴソーム、テキサソーム、セクレソーム、トレロソーム、メラノソーム、オンコソームまたはエキソサイトーシスビヒクルを含む。さらに、小胞は、様々な細胞プロセスによって産生され得るが、本発明の方法は、そのような小胞が生物学的試料中に存在し、本明細書に開示される方法によって特徴決定することができる限り、任意の一つの機構に限定されない、または依存しない。断りない限り、ある種の小胞を使用する方法を他の種類の小胞に適用することができる。小胞は、ペイロードとも呼ばれる可溶性成分を含むことができる内部区画を包囲する細胞膜に類似した脂質二重層を有する球形構造を含む。いくつかの態様において、本発明の方法は、直径約40〜100nmの小さな分泌小胞であるエキソソームを使用する。種類および特徴の決定を含む膜小胞の考察に関しては、Thery et al., Nat Rev Immunol. 2009 Aug; 9(8):581-93を参照すること。様々な種類の小胞のいくつかの性質は表2におけるものを含む。
（表２）小胞の性質
Figure 2016533752
略号:ホスファチジルセリン（PPS）、電子顕微鏡（EM）
小胞は、原形質膜または内部膜に由来する流出膜結合粒子または「微粒子」を含む。小胞は、細胞から細胞外環境に放出され得る。小胞を放出する細胞は、非限定的に、外胚葉、内胚葉または中胚葉から生じるかまたはそれらに由来する、細胞を含む。細胞は、遺伝子的、環境的および/または他の変動または変更を有することもある。たとえば、細胞は腫瘍細胞であり得る。小胞は、ソース細胞における任意の変化を反映し、それにより、発生する細胞、たとえば様々な遺伝子突然変異を有する細胞における変化を反映することができる。一つの機構において、小胞は、細胞膜のセグメントが自発的に陥入し、最終的に開口分泌されるとき、細胞内に生成される（たとえば、Keller et al., Immunol. Lett. 107(2):102-8 (2006)を参照すること）。小胞はまた、原形質膜の部分の脱出膨出（ブレブ形成）分離および封止から生じるか、または腫瘍起源の種々の膜結合タンパク質を含有する任意の細胞内膜に画定された小胞構造の輸送から生じる、脂質二重膜によって画定された細胞由来構造も含み、これには、腫瘍由来マイクロRNAまたは細胞内タンパク質を非限定的に含む、小胞内腔中に含有される分子とともに腫瘍由来タンパク質に選択的に結合する宿主循環に由来する表面結合分子を含む。ブレブおよびブレブ形成は、Charras et al., Nature Reviews Molecular and Cell Biology, Vol. 9, No. 11, p. 730-736 (2008)にさらに記載されている。腫瘍細胞から循環または体液中に流出した小胞は「腫瘍由来循環小胞」と呼ばれることもある。そのような小胞がエキソソームである場合、それは腫瘍由来循環エキソソーム（CTE）と呼ばれることもある。場合によっては、小胞は、特定の起始細胞に由来することもできる。CTEは一般に、起始細胞特異的小胞と同様に、ときには特異的な様式で、たとえば体液からのCTEまたは起始細胞特異的小胞の単離を可能にする一つまたは複数の固有のバイオマーカーを有する。たとえば、細胞または組織特異的マーカーは、起始細胞を同定するために使用される。そのような細胞または組織特異的マーカーの例は本明細書に開示されており、さらに、bioinfo.wilmer.jhu.edu/tiger/で入手可能なTissue-specific Gene Expression and Regulation（TiGER）データベース、Liu et al. (2008) TiGER: a database for tissue-specific gene expression and regulation. BMC Bioinformatics. 9:271、genome.dkfz-heidelberg.de/menu/tissue_db/index.htmlで入手可能なTissueDistributionDBsにおいてアクセスすることもできる。
小胞は、約10nm、20nmまたは30nmよりも大きい直径を有することができる。小胞は、40nm、50nm、100nm、200nm、500nm、1000nm、1500nm、2000nmよりも大きい、または10,000nmよりも大きい直径を有することができる。小胞は、約20〜2000nm、約20〜1500nm、約30〜1000nm、約30〜800nm、約30〜200nmまたは約30〜100nmの直径を有することができる。いくつかの態様において、小胞は、10,000nm、2000nm、1500nm、1000nm、800nm、500nm、200nm、100nm、50nm、40nm、30nm、20nm未満または10nm未満の直径を有する。本明細書において数値に関して使用される「約」という用語は、その数値の上下10％の変動が、指定された値に帰される範囲内であることを意味する。様々な種類の小胞の一般的なサイズが表2に示されている。小胞を評価して、一つの小胞またはいくつかの小胞の直径を計測することができる。たとえば、小胞集団の直径の範囲または小胞集団の平均直径を測定することができる。小胞直径は、当技術分野において公知の方法、たとえば電子顕微鏡法のような画像化技術を使用して評価することができる。ある態様において、一つまたは複数の小胞の直径は、光学粒子検出を使用して測定される。たとえば、「Optical Detection and Analysis of Particles」と題する2010年7月6日発行の米国特許第7,751,053号および「Optical Detection and Analysis of Particles」と題する2010年7月15日発行の米国特許第7,399,600号を参照すること。
いくつかの態様において、本発明の方法は、たとえば、生物学的試料の事前の単離、精製または濃縮なしに生物学的試料において、小胞を直接評価する工程を含む。たとえば、試料中の小胞の量それ自体が、診断、予後判定またはセラノーシス用の判断を提供するバイオシグネチャーを提供することができる。または、試料中の小胞は、解析の前に試料から単離、捕捉、精製または濃縮することもできる。前記のように、本明細書において使用される単離、捕捉または精製は、試料中の他の成分からの、部分的単離、部分的捕捉または部分的精製を含む。小胞単離は、本明細書に記載されるような様々な技術、たとえばクロマトグラフィー、ろ過法、遠心分離法、フローサイトメトリー、アフィニティー捕捉法（たとえば平面またはビーズに対する）および/またはマイクロ流体工学を使用して実施することができる。図13A〜Iおよび16B〜16Cは、アプタマープールを用いて微小胞を評価するための本発明の方法の概要を示す。
小胞特徴を参照と比較することによって表現型特徴決定を提供するために、エキソソームのような小胞を評価することができる。いくつかの態様においては、小胞の表面抗原が評価される。表面抗原は、小胞の解剖学的起源および/または細胞ならびに他の表現型情報、たとえば腫瘍の状態の指標を提供することができる。たとえば、患者試料、たとえば血液、血清または血漿のような体液中に見られる小胞は、結腸直腸起源および癌の存在を示す表面抗原に関して評価される。表面抗原は、表面タンパク質、脂質、糖質および他の膜成分を非限定的に含む、小胞膜表面上で検出することができる、情報をもたらす任意の生物学的実体を含み得る。たとえば、腫瘍抗原を発現する結腸由来の小胞の陽性検出は、患者が結腸直腸癌を有していることを示すことができる。このように、本発明の方法を使用して、たとえば、対象から得られた一つまたは複数の小胞の疾患特異的および細胞特異的バイオマーカーを評価することにより、解剖学的または細胞起源と関連する任意の疾患または病態を特徴決定することができる。
もう一つの態様において、本発明の方法は、表現型特徴決定を提供するために一つまたは複数の小胞ペイロードを評価する工程を含む。小胞のペイロードは、小胞内に封じ込められた状態で検出することができる情報をもたらす任意の生物学的実体を含み、タンパク質および核酸、たとえばゲノムもしくはcDNA、mRNAまたはそれらの機能的断片およびマイクロRNA（miR）を非限定的に含む。加えて、本発明の方法は、小胞表面抗原（小胞ペイロードに加えて、またはそれを除いて）を検出して表現型特徴決定を提供することに関する。たとえば、小胞は、小胞表面抗原に特異的である結合物質（たとえば抗体またはアプタマー）を使用して特徴決定することができ、結合した小胞をさらに評価して、本明細書に開示される一つまたは複数のペイロード成分を同定することができる。本明細書に記載されるように、関心対象の表面抗原または関心対象のペイロードを有する小胞のレベルを参照と比較して表現型を特徴決定することができる。たとえば、試料中の癌関連表面抗原または小胞ペイロード、たとえば腫瘍関連mRNAまたはマイクロRNAの、参照に比べた場合の過剰発現は、その試料中の癌の存在を示すことができる。評価されるバイオマーカーは、所望の標的試料の選択および所望の参照試料と標的試料との比較に基づいて、存在しても存在しなくてもよく、増加していても減少していてもよい。標的試料の非限定的な例は、疾患、治療/非治療、長期的研究におけるような様々な時点を含み、参照試料の非限定的な例は、非疾患、正常、様々な時点および候補治療に対する感受性または耐性を含む。
小胞単離および分析
試料処理
小胞または小胞の集団は、分析前および/または分析中に単離、精製、濃縮または他のやり方で富化され得る。別段指定されない限り、本明細書の中で小胞またはバイオマーカー成分を参照して使用される用語「精製」、用語「単離」または類似の語は、細胞または有機体からのそのような成分の部分的または完全な精製または単離を含むことを意図する。小胞の分析は、生物学的試料の一つまたは複数の小胞集団の量を定量化することを含むことができる。たとえば、不均一な小胞集団を定量化することができるし、または均一な小胞集団、たとえば特定のバイオマーカープロファイル有する小胞の集団、特定のバイオシグネチャーを有する小胞の集団または特定の細胞型に由来する小胞の集団を不均一な小胞集団から単離し、定量化することができる。小胞の分析はまた、本明細書に記載されるように、小胞の一つまたは複数の特定のバイオマーカープロファイルまたはバイオシグネチャーを定量的または定性的に検出することを含むこともできる。
小胞は、たとえばバイオ流体バンクに貯蔵および保管され、所望により分析のために回収されることができる。小胞はまた、生きた対象または死亡した対象から事前に収穫および貯蔵されている生物学的試料から単離されてもよい。加えて、小胞は、King et al., Breast Cancer Res 7(5):198-204 (2005)に記載されているように、捕集された生物学的試料から単離されてもよい。小胞は、保管または貯蔵された試料から単離することができる。または、小胞は、生物学的試料から単離され、試料の貯蔵または保管なしで分析されてもよい。さらには、第三者が、生物学的試料を採取または貯蔵してもよいし、あるいは分析のために小胞を採取または貯蔵してもよい。
富化された小胞集団を生物学的試料から得ることができる。たとえば、小胞は、サイズ排除クロマトグラフィー、密度勾配遠心分離、分画遠心分離、ナノ膜限外ろ過、免役吸着捕捉、アフィニティー精製、マイクロ流体分離またはこれらの組み合わせを使用して生物学的試料から濃縮または単離され得る。
サイズ排除クロマトグラフィー、たとえばゲル透過カラム、遠心分離または密度勾配遠心分離およびろ過法を使用することができる。たとえば、小胞は、分画遠心分離、アニオン交換および/またはゲル透過クロマトグラフィー（たとえば米国特許第6,899,863号および第6,812,023号に記載）、スクロース密度勾配、オルガネラ電気泳動（たとえば米国特許第7,198,923号に記載）、磁気活性化細胞分別（MACS）またはナノ膜限外ろ過濃縮器によって単離することができる。単離または濃縮法の種々な組み合わせを使用することができる。
極めて豊富なタンパク質、たとえば血液試料中のアルブミンおよび免疫グロブリンが、生物学的試料からの小胞の単離を妨げることもある。たとえば、血液のような生物学的試料中に見られるもっとも豊富なタンパク質に特異的である複数の抗体を使用するシステムを使用して、生物学的試料から小胞を単離することができる。このようなシステムは、いくつかのタンパク質を一度に除去することができ、それによって、起始細胞特異小胞のような、より低い存在量の種を顕在化させる。このタイプのシステムは、生物学的試料、たとえば血液、脳脊髄液または尿からの小胞の単離に使用することができる。生物学的試料からの小胞の単離はまた、Chromy et al. J Proteome Res 2004; 3:1120-1127に記載されているような極めて豊富なタンパク質の除去法によって増強され得る。もう一つの態様において、生物学的試料からの小胞の単離はまた、Zhang et al., Mol Cell Proteomics 2005; 4:144-155に記載されているような糖ペプチド捕捉を使用して血清タンパク質を除去することによって増強され得る。加えて、尿のような生物学的試料からの小胞は、Pisitkun et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2004; 101:13368-13373に記載されているように、分画遠心分離ののち、細胞質または抗細胞質エピトープに対する抗体との接触によって単離され得る。
血漿は、アルブミン、免疫グロブリンおよび凝固タンパク質、たとえばフィブリノーゲンをはじめとする多種多様なタンパク質を含有する。血漿タンパク質の約60％が、血漿の浸透圧に影響して脂質およびステロイドホルモンの輸送を支援するタンパク質アルブミン（たとえばヒト血清アルブミンまたはHSA）を含む。グロブリンは、血漿タンパク質の約35％を構成し、イオン、ホルモンおよび脂質の輸送に使用されて免疫機能を支援する。血漿タンパク質の約4％が、血液の凝固に不可欠であり、かつ不溶性タンパク質フィブリンに転換されることができるフィブリノーゲンを含む。他のタイプの血液タンパク質は、プレアルブミン、α1アンチトリプシン、α1酸糖タンパク質、α1フェトタンパク質、ハプトグロビン、α2マクログロブリン、セルロプラスミン、トランスフェリン、補体タンパク質C3およびC4、β2ミクログロブリン、βリポタンパク質、γグロブリンタンパク質、C反応性タンパク質（CRP）、リポタンパク質（カイロミクロン、VLDL、LDL、HDL）、他のグロブリン（α、βおよびγ型）、プロトロンビンおよびマンノース結合レクチン（MBL）を含む。これらのタンパク質のいずれも、タンパク質のクラスまたはその誘導体（たとえばフィブリノーゲンの開裂から誘導されるフィブリン）を含め、生物学的試料に対して実施されるさらなる分析の前に、生物学的試料から選択的に枯渇させることができる。理論によって拘束されることなく、そのようなバックグラウンドタンパク質の除去は、より高感度、正確または精密な、試料中の関心対象のバイオマーカーの検出を容易にし得る。
血液または血液派生物（たとえば血漿または血清）中の豊富なタンパク質は、非限定的に、アルブミン、IgG、トランスフェリン、フィブリノーゲン、IgA、α2マクログロブリン、IgM、α1アンチトリプシン、補体C3、ハプトグロブリン、アポリポタンパク質A1、アポリポタンパク質A3、アポリポタンパク質B；α1酸糖タンパク質、セルロプラスミン、補体C4、C1q、IgD、プレアルブミン（トランスチレチン）およびプラスミノーゲンを含む。そのようなタンパク質は、市販のカラムおよびキットを使用して枯渇させることができる。そのようなカラムの例は、Agilent Technologies（Santa Clara, CA）のMultiple Affinity Removal Systemを含む。このシステムは、製造業者によると、以下の性能特性を有する以下のカートリッジを含む、様々なタンパク質プロファイルを枯渇させるように設計された様々なカートリッジを含む：総タンパク質の約94％（アルブミン、IgG、アンチトリプシン、IgA、トランスフェリン、ハプトグロビン、フィブリノーゲン、α2マクログロブリン、α1酸糖タンパク質（オロソムコイド）IgM、アポリポタンパク質AI、アポリポタンパク質AII、補体C3およびトランスチレチン）を除去するHuman 14；総タンパク質の約85〜90％（アルブミン、IgG、IgA、トランスフェリン、ハプトグロビン、アンチトリプシンおよびフィブリノーゲン）を除去するHuman 7；総タンパク質の約85〜90％（アルブミン、IgG、IgA、トランスフェリン、ハプトグロビンおよびアンチトリプシン）を除去するHuman 6；総タンパク質の約69％（アルブミンおよびIgG）を除去するHuman Albumin/IgG；および総タンパク質の約50〜55％（アルブミン）を除去するHuman Albumin。Sigma-AldrichのProteoPrep（登録商標）20 Plasma Immunodepletion Kitは、もっとも豊富な20種のタンパク質、すなわち、血漿または血清中の総タンパク質質量の約97〜98％をヒト血漿または血清から特異的に除去するためのものである（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）。製造者によると、ProteoPrep（登録商標）20は、アルブミン、IgG、トランスフェリン、フィブリノーゲン、IgA、α2マクログロブリン、IgM、α1アンチトリプシン、補体C3、ハプトグロブリン、アポリポタンパク質A1、A3およびB；α1酸糖タンパク質、セルロプラスミン、補体C4、C1q、IgD、プレアルブミンおよびプラスミノーゲンを除去する。Sigma-Aldrichはまた、アルブミン（HSA）および免疫グロブリン（IgG）を除去するためのProteoPrep（登録商標）カラムを製造している。Beckman Coulter（Fullerton, CA）のProteomeLab IgY-12 High Capacity Proteome Partitioningキットは、ヒト生物学的流体、たとえば血清および血漿から12種の極めて豊富なタンパク質（アルブミン、IgG、トランスフェリン、フィブリノーゲン、IgA、α2マクログロブリン、IgM、α1アンチトリプシン、ハプトグロブリン、オロソムコイド、アポリポタンパク質A-I、アポリポタンパク質A-II）を除去するように特異的に設計されている。概して、そのようなシステムは、免疫枯渇に依存して、たとえば小さなリガンドおよび/または完全抗体を使用して標的タンパク質を除去する。Millipore（EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA）のPureProteome（商標）Human Albumin/Immunoglobulin Depletion Kitは、ヒト血清または血漿試料からのアルブミンおよびすべての免疫グロブリン（すなわちIgG、IgA、IgM、IgEおよびIgD）の高い枯渇効率（一般に>99％）を可能にする磁性ビーズベースのキットである。同じくMilliporeのProteoExtract（登録商標）Albumin/IgG Removal Kitは、体液試料からアルブミンおよびIgGの>80％を枯渇させるように設計されている。他の同様なタンパク質枯渇製品は、非限定的に、Aurum（商標）Affi-Gels Blueミニキット（Bio-Rad, Hercules, CA, USA）；Vivapure（登録商標）抗HSA/IgGキット（Sartorius Stedim Biotech, Goettingen, Germany）、Qproteomeアルブミン/IgG枯渇キット（Qiagen, Hilden, Germany）；Seppro（登録商標）MIXED12-LC20カラム（GenWay Biotech, San Diego, CA, USA）；Abundant Serum Protein Depletion Kit（Norgen Biotek Corp., Ontario, Canada）；GBC Human Albumin/IgG/Transferrin 3 in 1 Depletion Column/Kit（Good Biotech Corp., Taiwan）を含む。これらのシステムおよび類似のシステムを使用すると、生物学的試料から豊富なタンパク質を除去し、それによってタンパク質および小胞のような低存在量の循環バイオマーカーを検出する能力を改善することができる。
トロンボプラスチンは、プロトロンビンをトロンビンに転換することによって血液凝固を支援する血漿タンパク質である。トロンビンは他方で、可溶性フィブリノーゲンをフィブリンの不溶性ストランドに転換するセリンプロテアーゼとして作用し、また、多くの他の凝固関連反応を触媒する。したがって、トロンボプラスチンは、血漿からのフィブリノーゲン/フィブリン（血液凝固因子）の析出を促進するために使用することができるタンパク質である。免疫アフィニティータンパク質除去に加えて、またはその代わりとして、血液試料をトロンボプラスチンで処理してフィブリノーゲン/フィブリンを枯渇させることができる。トロンボプラスチン除去は、上記のような免疫アフィニティータンパク質除去に加えて、またはそれに代えて、当技術分野において公知の方法を使用して実施することができる。他のタンパク質および/または他の試料粒子状物質の析出もまた、試料中の小胞のような循環バイオマーカーの検出を改善することができる。たとえば、当技術分野において公知であるような硫酸アンモニウム処理を使用して、免疫グロブリンおよび他の極めて豊富なタンパク質を析出させることができる。
ある態様において、本発明は、生物学的試料中の一つまたは複数の循環バイオマーカー、たとえば微小胞の存在またはレベルを検出する方法であって、（a）一つまたは複数の循環バイオマーカーを含む、または含むことが疑われる生物学的試料を提供する工程；（b）工程（a）で提供された生物学的試料から1種または複数種の豊富なタンパク質を選択的に枯渇させる工程;（c）工程（b）で枯渇させた試料から一つまたは複数の循環バイオマーカーのアフィニティー選択を実施し、それによって一つまたは複数の循環バイオマーカーの存在またはレベルを検出する工程を含む、方法を提供する。生物学的試料は、体液、たとえば末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（CSF）、痰、唾液、骨髄、滑液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー腺液もしくは尿道球腺液、女性射精液、汗、糞便、体毛、涙液、嚢胞液、胸膜液および腹膜液、心膜液、リンパ液、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、月経分泌物、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌液、粘膜分泌液、水便、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液、胚盤胞腔液、臍帯血またはそれらのいずれかの派生物を含み得る。いくつかの態様において、生物学的試料は末梢血、血清または血漿を含む。小胞検出の前に血漿から1種または複数種の豊富なタンパク質を選択的に枯渇させる例示的なプロトコルおよび結果を、2013年11月26日に出願された国際特許公開公報WO/2014/082083号の実施例40に見ることができる。この特許公開公報は参照により全体として本明細書に組み入れられる。
豊富なタンパク質とは、下流での処理または分析を潜在的に妨害するのに十分な高さの濃度で試料中に存在するタンパク質を含み得る。一般に、豊富なタンパク質は、試料の任意のさらなる分析の標的ではない。豊富なタンパク質は、試料中の全タンパク質質量の少なくとも10-5、10-4、10-3、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98または少なくとも99％を構成し得る。いくつかの態様において、豊富なタンパク質は、たとえば希少な関心対象標的の場合、試料中の全タンパク質質量の10-5％未満で存在する。本明細書に記載されるように、血液またはその派生物の場合、1種または複数種の豊富なタンパク質は、アルブミン、IgG、トランスフェリン、フィブリノーゲン、フィブリン、IgA、α2マクログロブリン、IgM、α1アンチトリプシン、補体C3、ハプトグロブリン、アポリポタンパク質A1、A3およびB；α1酸糖タンパク質、セルロプラスミン、補体C4、C1q、IgD、プレアルブミン（トランスチレチン）、プラスミノーゲン、それらのいずれかの派生物およびそれらの組み合わせのうち1種または複数種を含み得る。血液または血液派生物中の1種または複数種の豊富なタンパク質はまた、アルブミン、免疫グロブリン、フィブリノーゲン、プレアルブミン、α1アンチトリプシン、α1酸糖タンパク質、α1フェトタンパク質、ハプトグロビン、α2マクログロブリン、セルロプラスミン、トランスフェリン、補体タンパク質C3およびC4、β2ミクログロブリン、βリポタンパク質、γグロブリンタンパク質、C反応性タンパク質（CRP）、リポタンパク質（カイロミクロン、VLDL、LDL、HDL）、他のグロブリン（α、βおよびγ型）、プロトロンビン、マンノース結合レクチン（MBL）、それらのいずれかの派生物およびそれらの組み合わせのうち1種または複数種を含み得る。
いくつかの態様において、1種または複数種の豊富なタンパク質を選択的に枯渇させる工程は、フィブリンの析出を起こさせるために生物学的試料をトロンボプラスチンと接触させる工程を含む。1種または複数種の豊富なタンパク質はまた、免疫アフィニティー、析出またはそれらの組み合わせによって枯渇させてもよい。たとえば、試料をトロンボプラスチンで処理してフィブリンを析出させることができ、その後、所望により、試料をカラムに通してHSA、IgGおよび他の豊富なタンパク質を除去し得る。
1種または複数種の豊富なタンパク質を「選択的に枯渇させる」工程は、該豊富なタンパク質を、試料中の別の実体、たとえば下流で処理または分析するための関心対象の標的をはじめとする別のタンパク質または微小胞の枯渇よりも高い割合で、試料から枯渇させる工程を含む。1種または複数種の豊富なタンパク質を選択的に枯渇させる工程は、該豊富なタンパク質を、試料中の別の実体、たとえば下流で処理または分析するための関心対象の標的をはじめとする別のタンパク質または微小胞よりも、1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、104倍、105倍、106倍、107倍、108倍、109倍、1010倍、1011倍、1012倍、1013倍、1014倍、1015倍、1016倍、1017倍、1018倍、1019倍、1020倍またはより高い割合で枯渇させる工程を含み得る。ある態様において、豊富なタンパク質の枯渇と比較して、標的の関心対象の枯渇は皆無かそれに近い。いくつかの態様において、生物学的試料から1種または複数種の豊富なタンパク質を選択的に枯渇させる工程は、1種または複数種の豊富なタンパク質の少なくとも25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％または100％を枯渇させる工程を含む。
極めて豊富なタンパク質および他の望ましくない実体の除去はさらに、非ストリンジェントなサイズ排除工程で促進することができる。たとえば、高分子量カットオフサイズ排除工程を使用して試料を処理して、低分子量タンパク質および他の実体は別として高分子量小胞を優先的に富化することができる。いくつかの態様においては、試料を、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000または10000キロダルトン（kDa）よりも大きい分子量カットオフ（MWCO）を有するカラム（たとえばゲルろ過カラム）またはフィルターで処理する。ある態様においては、700kDaろ過カラムが使用される。そのような工程において、小胞は、保持されるか、より低分子量の実体よりもゆっくりとカラムまたはフィルター中を流れる。そのようなカラムおよびフィルターは当技術分野において公知である。
生物学的試料からの小胞の単離または富化はまた、音波処理（たとえば、超音波を加えることによる）、洗浄剤、他の膜活性化物質またはそれらの任意の組み合わせの使用によって増強することができる。たとえば、超音波エネルギーを潜在的腫瘍部位に加えることができ、理論によって拘束されることなく、組織からの小胞の放出を増大させて、富化された微小胞集団を可能にし、それを、本明細書に開示される一つまたは複数の方法を使用して生物学的試料から分析または評価することができる。
本明細書に記載される循環バイオマーカーを検出する方法、たとえば抗体アフィニティー単離により、様々な濃度または単離手法を使用して結果の一貫性を望みどおり最適化することができる。そのような工程は、ろ過または他の工程中でのかく拌、たとえば振とうまたはボルテックス、様々な単離技術、たとえばPEGを用いるポリマーベースの単離および様々なレベルへの濃縮を含むことができる。当業者には、小胞含有試料を試験する様々な段階でそのような処理を適用することができることが理解されよう。一つの態様においては、試料そのもの、たとえば血漿または血清のような体液をボルテックスする。いくつかの態様においては、一つまたは複数の試料処理工程、たとえば小胞単離を実施したのち、試料をボルテックスする。かく拌は、所望により、いくつかまたはすべての適切な試料処理工程で実施することができる。様々な工程で添加物を導入して、プロセスを改善する、たとえば関心対象バイオマーカーの凝集または分解を制御することができる。
結果はまた、所望により、試料を様々な物質で処理することによって最適化することもできる。そのような物質は、凝集を抑制するための添加物および/またはpHもしくはイオン強度を調節するための添加物を含む。凝集を抑制するための添加物は、ブロッキング物質、たとえばウシ血清アルブミン（BSA）、乳またはStabilGuard（登録商標）（BSAフリーのブロッキング物質；製品コードSG02、Surmodics, Eden Prairie, MN）、カオトロピック物質、たとえばグアニジウム塩酸塩および洗浄剤または界面活性剤を含む。有用なイオン洗浄剤は、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS、ラウリル硫酸ナトリウム（SLS））、ラウレス硫酸ナトリウム（SLS、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム（SLES））、ラウリル硫酸アンモニウム（ALS）、臭化セトリモニウム、塩化セトリモニウム、ステアリン酸セトリモニウムなどを含む。有用な非イオン（両性イオン）洗浄剤は、ポリエチレングリコール類、ポリソルベート20（Tween 20とも知られる）、他のポリソルベート（たとえば40、60、65、80など）、Triton-X（たとえばX100、X114）、3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホネート（CHAPS）、CHAPSO、デオキシコール酸、デオキシコール酸ナトリウム、NP-40、グリコシド、オクチルチオグリコシド、マルトシドなどを含む。いくつかの態様においては、単離および/または検出中、微小胞を含有する試料を処理するために、血小板凝集を減らすことが示されている界面活性剤Pluronic F-68が使用される。F68は、0.1％〜10％濃度、たとえば1％、2.5％または5％濃度で使用することができる。溶液のpHおよび/またはイオン強度は、様々な酸、塩基、バッファーまたは塩、たとえば非限定的に、塩化ナトリウム（NaCl）、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、トリス緩衝生理食塩水（TBS）、リン酸ナトリウム、塩化カリウム、リン酸カリウム、クエン酸ナトリウムおよび生理食塩水クエン酸ナトリウム（SSC）バッファーで調節することができる。いくつかの態様においては、NaClを0.1％〜10％、たとえば1％、2.5％または5％の最終濃度で加える。いくつかの態様においては、Tween 20を0.005〜2％、たとえば0.05％、0.25％または0.5％最終濃度で加える。本発明と共に使用するためのブロッキング物質は、不活性タンパク質、たとえば乳タンパク質、無脂肪ドライミルクタンパク質、アルブミン、BSA、カゼインまたは血清、たとえば仔ウシ血清（NBCS）、ヤギ血清、ウサギ血清またはサケ血清を含む。タンパク質は、0.1％〜10％の濃度、たとえば1％、2％、3％、3.5％、4％、5％、6％、7％、8％、9％または10％の濃度で加えることができる。いくつかの態様においては、BSAを0.1％〜10％の濃度、たとえば1％、2％、3％、3.5％、4％、5％、6％、7％、8％、9％または10％の濃度で加える。ある態様においては、2005年7月13日に出願された米国特許出願第11/632946号に示された方法にしたがって試料を処理する。この出願は参照により全体として本明細書に組み入れられる。市販されているブロッカー、たとえばPierce（Thermo Fisher Scientificの一部門、Rockford, IL）のSuperBlock、StartingBlock、Protein-Freeを使用してもよい。いくつかの態様においては、SSC/洗浄剤（たとえば20×SSCと0.5％のTween 20または0.1％のTriton-X 100）を0.1％〜10％の濃度、たとえば1.0％または5.0％の濃度で加える。
小胞および他の循環バイオマーカーを検出する方法は、本明細書に記載されるプロトコルおよび処理の様々な組み合わせによって望みどおり最適化することができる。検出プロトコルは、かく拌、単離法および添加物の様々な組み合わせによって最適化することができる。いくつかの態様においては、単離工程の前後で患者試料をボルテックスし、BSAおよび/またはF68をはじめとするブロッキング物質で試料を処理する。そのような処置は、大きな凝集塊またはタンパク質もしくは他の生物学的デブリの形成を減らし得、ひいては、より一貫した検出読み取り値を提供し得る。
ろ過および限外ろ過
小胞は、対象からの生物学的試料をろ過モジュールに通してろ過すること、小胞を含む保持物をそのろ過モジュールから捕集すること、それにより生物学的試料から小胞を単離することにより、生物学的試料から単離することができる。方法は、対象からの生物学的試料を、フィルターを含むろ過モジュール（本明細書の中では選択膜とも呼ばれる）に通してろ過する工程；および小胞を含む保持物をそのろ過モジュールから捕集する工程、それによって小胞を生物学的試料から単離する工程を含むことができる。たとえば、一つの態様において、フィルターは、約100キロダルトンよりも大きな分子を保持する。そのような場合、微小胞は概して、ろ過プロセスの保持物中に見いだされるが、一方で、より小さな実体、たとえばタンパク質、タンパク質複合体、核酸などはろ液の中へと通過する。
方法は、一つまたは複数の小胞のバイオシグネチャーを決定するときに使用することができる。方法は、ろ過からの保持物を複数の基体に接触させる工程をさらに含むこともでき、各基体は一つまたは複数の捕捉物質に結合され、複数の基体の各サブセットは、複数の基体の別のサブセットとは異なる捕捉物質または捕捉物質の組み合わせを含む。
試料中の小胞のバイオシグネチャーを決定する方法であって、障害を有する対象からの生物学的試料をろ過モジュールに通してろ過する工程、ろ過モジュールから、一つまたは複数の小胞を含む保持物を捕集する工程、および一つまたは複数の小胞のバイオシグネチャーを決定する工程を含む、方法も、本明細書において提供される。一つの態様において、ろ過モジュールは、約100または150キロダルトンよりも大きな分子を保持するフィルターを含む。
本明細書に開示される方法は、対象からの生物学的試料をろ過モジュールに通してろ過すること、ろ過モジュールから、一つまたは複数の小胞を含む保持物を捕集すること、一つまたは複数の小胞のバイオシグネチャーを決定すること、バイオシグネチャーに基づいて対象における表現型を特徴決定することによって、対象における表現型を特徴決定する工程をさらに含むことができ、その特徴決定は少なくとも70％の感度である。いくつかの態様において、特徴決定する工程は、バイオシグネチャーを有する一つまたは複数の小胞の量を測定することを含む。さらに、特徴決定は約80％〜100％の感度であることができる。
複数の小胞の多重分析の方法も、本明細書において提供される。いくつかの態様において、方法は、対象からの生物学的試料をろ過モジュールに通してろ過する工程；ろ過モジュールから、複数の小胞を含む保持物を捕集する工程；複数の小胞を複数の捕捉物質に付加する工程であって、複数の捕捉物質が複数の基体に結合され、複数の基体の各サブセットが複数の基体の別のサブセットとは示差的に標識されている、工程；複数の小胞の少なくともサブセットを捕捉する工程；および捕捉した小胞の少なくともサブセットに関してバイオシグネチャーを決定する工程を含む。一つの態様において、各基体は一つまたは複数の捕捉物質に結合し、複数の基体の各サブセットは、複数の基体の別のサブセットと比較して異なる捕捉物質または捕捉物質の組み合わせを含む。いくつかの態様において、複数の基体の少なくともサブセットは、一つまたは複数の標識を含むなど、固有に標識されている。基体は、粒子もしくはビーズまたはそれらの任意の組み合わせであることができる。いくつかの態様において、フィルターは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000または10000キロダルトン（kDa）よりも大きな分子を保持する。一つの態様において、ろ過モジュールは、約100または150キロダルトンよりも大きな分子を保持するフィルターを含む。一つの態様において、ろ過モジュールは、約9、20、100または150キロダルトンよりも大きな分子を保持するフィルターを含む。さらに別の態様において、ろ過モジュールは、約7000kDaよりも大きな分子を保持するフィルターを含む。
いくつかの態様において、複数の小胞の多重分析の方法は、対象からの生物学的試料を、約100キロダルトンよりも大きな分子を保持するフィルターを含むろ過モジュールに通してろ過する工程；ろ過モジュールから、複数の小胞を含む保持物を捕集する工程；複数の小胞を、マイクロアレイに結合されている複数の捕捉物質に付加する工程；複数の小胞の少なくともサブセットをマイクロアレイ上に捕捉する工程；および捕捉した小胞の少なくともサブセットに関してバイオシグネチャーを決定する工程を含む。いくつかの態様において、フィルターは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000または10000キロダルトン（kDa）よりも大きな分子を保持する。一つの態様において、ろ過モジュールは、約100または150キロダルトンよりも大きな分子を保持するフィルターを含む。一つの態様において、ろ過モジュールは、約9、20、100または150キロダルトンよりも大きな分子を保持するフィルターを含む。さらに別の態様において、ろ過モジュールは、約7000kDaよりも大きな分子を保持するフィルターを含む。
生物学的試料は、ろ過による単離の前に浄化することができる。浄化は、細胞デブリおよび他の望ましくない物質の選択的除去を含む。たとえば、循環バイオマーカーの検出を妨害し得る細胞デブリおよび他の成分を除去することができる。浄化は、低速遠心分離、たとえば約5,000×g、4,000×g、3,000×g、2,000×g、l,000×gまたはそれ未満での低速遠心分離による浄化であることができる。そして、小胞を含有する上清、すなわち浄化された生物学的試料を捕集し、ろ過して、浄化された生物学的試料から小胞を単離することができる。いくつかの態様において、生物学的試料は、ろ過による小胞の単離の前に浄化されない。
いくつかの態様において、試料からの小胞の単離は、超遠心分離のような高速遠心分離を使用しない。たとえば、単離は、約100,000×g以上のような遠心分離速度の使用を要しないこともある。いくつかの態様において、試料からの小胞の単離は、50,000×g、40,000×g、30,000×g、20,000×g、15,000×g、12,000×gまたは10,000×g未満の速度を使用する。
関心対象試料をろ過するために、任意の数の適用可能なフィルター形態を使用することができる。いくつかの態様において、生物学的試料から循環バイオマーカーを単離するために使用されるろ過モジュールは繊維ベースのろ過カートリッジである。たとえば、繊維は、ポリプロピレン中空繊維のような中空ポリマー繊維であることができる。生物学的試料は、本明細書に開示されるような生物学的流体のような試料流体を、ぜん動ポンプのようなポンプ装置を備えたモジュールに汲み込むことにより、ろ過モジュールに導入することができる。ポンプ流量は、たとえば約0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9または10mL/分とさまざまであることができる。流量は、ろ過モジュールの構成、たとえばサイズおよびスループットを考慮して調節することができる。
ろ過モジュールは膜ろ過モジュールであることができる。たとえば、膜ろ過モジュールは、かく拌セル装置（たとえば電磁かく拌機を含む）に収容された親水性ポリフッ化ビニリデン（PVDF）フィルターディスク膜のようなフィルターディスク膜を含むことができる。いくつかの態様において、試料は、フィルター膜の各側で生じる圧力勾配の結果としてフィルターを透過する。
フィルターは、低い疎水性吸収率および/または高い親水性を有する材料を含むことができる。たとえば、フィルターは、小胞保持および大部分のタンパク質の透過のための平均孔径と、親水性であり、それによってタンパク質吸着を抑制する表面とを有することができる。たとえば、フィルターは、ポリプロピレン、PVDF、ポリエチレン、ポリフルオロエチレン、セルロース、第二次酢酸セルロース、ポリビニルアルコールおよびエチレンビニルアルコール（EVAL（登録商標）、Kuraray Co., Okayama, Japan）からなる群から選択される材料を含むことができる。フィルターに使用することができるさらなる材料は、ポリスルホンおよびポリエーテルスルホンを含むが、これらに限定されない。
ろ過モジュールは、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、400、500、600、700、800または900キロダルトン（kDa）よりも大きな分子を保持するフィルター、たとえば、それぞれ約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、400、500、600、700、800または900kDaのMWCO（分子量カットオフ）を有するフィルターを有することができる。諸態様において、ろ過モジュールは、1000kDa、1500kDa、2000kDa、2500kDa、3000kDa、3500kDa、4000kDa、4500kDa、5000kDa、5500kDa、6000kDa、6500kDa、7000kDa、7500kDa、8000kDa、8500kDa、9000kDa、9500kDa、10000kDaまたは10000kDaよりも大きいMWCOを有する。9kDa、20kDaおよび/または150kDaの範囲のMWCOを有する限外ろ過膜を使用することができる。いくつかの態様において、ろ過モジュール内のフィルターは、約0.01μm〜約0.15μm、いくつかの態様においては約0.05μm〜約0.12μmの平均孔径を有する。いくつかの態様において、いくつかの態様において、フィルターは、約0.06μm、0.07μm、0.08μm、0.09μm、0.1μm、0.11μmまたは0.2μmの平均孔径を有する。
ろ過モジュールは、市販のカラム、たとえばタンパク質を濃縮またはタンパク質を単離（たとえば限外ろ過）するために一般に使用されるカラムであることができる。例は、Millpore（Billerica, MA）のカラム、たとえばAmicon（登録商標）遠心フィルターまたはPierce（登録商標）（Rockford, IL）のカラム、たとえばPierce Concentratorフィルター装置を含むが、これらに限定されない。Pierceの有用なカラムは、9kDa、20kDaおよび/または150kDaのMWCOを有する使い捨て限外ろ過遠心分離装置を含む。これらの濃縮装置は、円錐形装置に溶接された高性能再生セルロース膜からなる。フィルターは、いずれも参照により全体として本明細書に組み入れられる米国特許第6,269,957号または第6,357,601号に記載されているようなフィルターであることができる。
単離された小胞を含む保持物をろ過モジュールから捕集することができる。保持物は、フィルターから保持物を流し出すことによって捕集することができる。理論によって拘束されることなく、保持物をより容易に捕集し、手荒な、または時間のかかる捕集技術の使用を最小限にするために、表面親水性を有し、それによってタンパク質吸着を抑制するフィルター組成物の選択を使用することができる。
そして、捕集した保持物を、その後の分析、たとえば、本明細書にさらに記載される保持物中の一つまたは複数の小胞のバイオシグネチャーの評価に使用することができる。分析は、捕集された保持物に対して直接実施することができる。または、一つまたは複数の小胞の分析の前に、捕集した保持物をさらに濃縮または精製することもできる。たとえば、本明細書に記載されるように、サイズ排除クロマトグラフィー、密度勾配遠心分離、分画遠心分離、免役吸着捕捉、アフィニティー精製、マイクロ流体分離またはそれらの組み合わせを使用して、保持物をさらに濃縮する、または小胞を保持物からさらに単離することができる。いくつかの態様において、保持物はもう一つのろ過工程を受けることができる。または、フィルターを使用する小胞の単離の前に、小胞は、非限定的にサイズ排除クロマトグラフィー、密度勾配遠心分離、分画遠心分離、免役吸着捕捉、アフィニティー精製、マイクロ流体分離またはそれらの組み合わせを含む技術を使用して濃縮または単離される。
バイオマーカーを濃縮し、単離するために、フィルターの組み合わせを使用することができる。たとえば、生物学的試料をまず、約0.01μm〜約10μm、たとえば0.01μm〜約2μmまたは約0.05μm〜約1.5μmのポロシティまたは孔径を有するフィルターに通してろ過し得、次いで試料をろ過する。たとえば、生物学的試料を、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000または10000キロダルトン（kDa）よりも大きな分子を保持するフィルター、たとえば、それぞれ約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000または10000kDaよりも大きいMWCO（分子量カットオフ）を有するフィルターを有するろ過モジュールに通してろ過する前に、まず生物学的試料を、約0.01μm〜約10μm、たとえば0.01μm〜約2μmまたは約0.05μm〜約1.5μmのポロシティまたは孔径を有するフィルターに通してろ過し得る。いくつかの態様において、フィルターは、約0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9または2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0または10.0μmの孔径を有する。フィルターはシリンジフィルターであってもよい。したがって、一つの態様において、方法は、生物学的試料を、約1μmよりも大きいポロシティを有するシリンジフィルターのようなフィルターに通してろ過したのち、約100または150キロダルトンよりも大きな分子を保持するフィルターを含むろ過モジュールに通してろ過する工程を含む。ある態様において、フィルターは1.2μMフィルターであり、ろ過ののち、試料を、150kDaカットオフを有する7mlまたは20ml濃縮カラムに通す。複数の濃縮カラムがたとえば直列に使用されてもよい。たとえば、7000MWCOろ過ユニットを使用したのち150MWCOユニットを使用することができる。
ろ過モジュールはマイクロ流体装置の構成要素であることができる。「Lab-on-a-Chip」システム、バイオメディカルマイクロエレクトロメカニカルシステム（Bio-MEM）またはマルチコンポーネント集積システムと呼ばれることもあるマイクロ流体装置を小胞の単離および分析のために使用することができる。このようなシステムは、小胞の結合、バイオマーカーの検出を可能にするプロセスおよび本明細書にさらに記載される他のプロセスを小型化し、区画化する。
ろ過モジュールおよび評価は、Grant, R., et al., A filtration-based protocol to isolate human Plasma Membrane-derived Vesicles and exosomes from blood plasma, J Immunol Methods (2011) 371:143-51（Epub 2011 Jun 30）に記載されているようなものであることができる。この参考文献は参照により全体として本明細書に組み入れられる。
また、マイクロ流体装置を、ろ過モジュールを含めることにより、小胞の単離に使用することもできる。たとえば、マイクロ流体装置は、サイズに基づいて小胞を生物学的試料から単離するための一つまたは複数のチャネルを使用することができる。生物学的試料は、小胞の通過を選択的に許す一つまたは複数のマイクロ流体チャネルに導入することができる。マイクロ流体装置は、小胞の性質、たとえばサイズ、形状、変形性、バイオマーカープロファイルまたはバイオシグネチャーに基づいて小胞を選択するために、結合物質または一つより多いろ過モジュールをさらに含むことができる。
ろ過工程からの保持物を、その中の微小胞または他のバイオマーカーの評価の前に、さらに処理することができる。ある態様において、保持物は、バイオマーカー評価の前に、たとえば適切な希釈剤、たとえば生物学的に適合性のバッファーで希釈される。いくつかの場合、保持物は連続希釈される。ある局面において、本発明は、生物学的試料から微小胞集団を検出する方法であって、（a）0.01μm〜約10μmの孔径または約1kDa〜10000kDaの分子量カットオフ（MWCO）を有する選択膜を使用して生物学的試料を濃縮する工程；（b）濃縮工程からの保持物を一つまたは複数のアリコートへと希釈する工程；および（c）保持物の一つまたは複数のアリコートそれぞれを、微小胞集団中の少なくとも一つの微小胞の分子に特異的な一つまたは複数の結合物質と接触させる工程を含む、方法を提供する。関連する局面において、本発明は、生物学的試料から微小胞集団を検出する方法であって、（a）0.01μm〜約10μmの孔径または約1kDa〜10000kDaの分子量カットオフ（MWCO）を有する選択膜を使用して生物学的試料を濃縮する工程；および（b）濃縮工程からの保持物の一つまたは複数のアリコートを、微小胞集団中の少なくとも一つの微小胞の分子に特異的な一つまたは複数の結合物質と接触させる工程を含む、方法を提供する。
選択膜は、所望のバイオマーカーを保持物中に保持するためのサイズであることもでき、所望のバイオマーカーがフィルターを透過してろ液に入ることを可能にするためのサイズであることもできる。フィルター膜は、特定の孔径またはMWCO値を有するように選択することができる。選択膜は、約0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9または2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0または10.0μmの孔径を有することができる。選択膜はまた、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000または10000kDaのMWCOを有することができる。
保持物は、任意の数の所望のアリコートへと分離および/または希釈することができる。たとえば、任意の希釈なしの複数のアリコートまたは同じ希釈度を使用して再現精度を測定することができる。もう一つの例においては、異なる希釈度の複数のアリコートを使用して濃度曲線を構築することができる。ある態様において、保持物は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350または400のアリコートに分離および/または希釈される。アリコートは、同じ希釈度または異なる希釈度であることができる。
希釈倍率とは、混合物（希釈剤とアリコートとの混合物）の最終量をアリコートの初期量で割った比率である。保持物は、約0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000および/または100000の希釈倍率で一つまたは複数のアリコートへと希釈することができる。たとえば、保持物は、約500の希釈倍率で一つまたは複数のアリコートへと希釈することができる。
濃度を推定するために、または曲線を形成するために、保持物を複数のアリコートへと希釈することができる。方法のある態様において、保持物は、約100、250、500、1000、10000および100000の希釈倍率で一つまたは複数のアリコートへと希釈される。所望に応じて、方法は、保持物、たとえば一つまたは複数の結合物質と共に複合体を形成した保持物の各アリコート中の微小胞の量を検出する工程をさらに含むことができる。曲線を使用して、検出された各アリコート中の微小胞の量の線形範囲を希釈倍率に対して決定することができる。線形範囲内の一つまたは複数のアリコート中で測定された微小胞の量を使用して、生物学的試料に関して検出された微小胞の濃度を測定することができる。その濃度を参照濃度と比較して、たとえば本明細書に記載されるように表現型を特徴決定することができる。
本発明はまた、対象からの生物学的試料をろ過モジュールに通してろ過する工程および小胞を含むろ液を捕集し、それによって生物学的試料から小胞を単離する工程を含む、関連する方法を提供する。そのような場合、細胞および他の大きな実体は保持物中に保持されることができ、一方で、微小胞はろ液の中へと透過する。微小胞を保持し、ろ過するための戦略を連携させて使用することができることが理解されよう。たとえば、試料を、微小胞が透過することを許す選択膜でろ過し、それによって微小胞を大きな粒子（細胞、複合体など）から単離することができる。そして、微小胞を含むろ液を、微小胞を保持する選択膜によってろ過し、それによって微小胞をより小さな粒子（タンパク質、核酸など）から単離することができる。単離された微小胞を本発明の方法にしたがってさらに評価して、たとえば表現型を特徴決定することができる。
沈殿
小胞は、ポリマー沈殿法を使用して単離することができる。この方法は、本明細書に記載される他の単離法と併用することができるし、またはそれに代えて用いることができる。一つの態様において、小胞を含有する試料をポリエチレングリコール（PEG）の製剤と接触させる。ポリマー製剤を、小胞含有試料と共にインキュベートしたのち、遠心分離によって沈殿させる。PEGは、小胞に結合することができ、かつ、捕捉成分、たとえば抗体のようなPEG化結合タンパク質の添加により、小胞を特異的に捕捉するように処理することができる。当業者は、PEGに加えて、他のポリマー、たとえば、メトキシポリエチレングリコール類を含むPEG誘導体、ポリ（エチレンオキシド）および様々な分子量を有する式HO-CH2-(CH2-0-CH2-)n-CH2-OHの様々なポリマーを使用することができることを理解するであろう。単離の効率は、ポリマー鎖の長さおよび使用されるポリマーの濃度をはじめとする様々な要因に依存し得る。好ましい態様においては、PEG4000またはPEG8000が、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％または10％、たとえば4％または8％の濃度で使用され得る。
本発明のいくつかの態様において、小胞は、ポリマー沈殿法を使用して試料から濃縮され、単離された小胞は、別の手法を使用してさらに分離される。第二の工程を使用して、たとえば特定のバイオマーカーを示す小胞の亜集団を同定することができる。第二の分離工程は、本明細書に記載されるように、サイズ排除、結合物質、抗体捕捉工程、マイクロビーズを含むことができる。
ある態様において、小胞は、System Biosciences（Mountain View, CA USA）のExoQuick（商標）およびExoQuick-TC（商標）キットにしたがって単離される。これらのキットは、ポリマーベースの沈殿法を使用して小胞をペレット化する。同様に、小胞は、Invitrogen/Life Technologies（Carlsbad, CA USA）のTotal Exosome Isolationキット（血清から）またはTotal Exosome Isolationキット（細胞培地から）を使用して単離することもできる。Total Exosome Isolation試薬は、小胞のような溶解しにくい成分を溶解状態から出させることにより、それらが短時間の低速遠心分離法によって捕集すされることを可能にする。試薬は生物学的試料に加えられ、溶液は2℃〜8℃で一晩インキュベートされる。沈殿した小胞は標準的遠心分離によって回収される。
結合物質
結合物質（結合試薬とも呼ばれる）は、標的バイオマーカーに結合することができる物質を含む。結合物質は、標的バイオマーカーに特異的であることができる、すなわち、標的バイオマーカーに結合することができる。標的は、本明細書に開示される任意の有用なバイオマーカー、たとえば小胞表面のバイオマーカーであることができる。いくつかの態様において、標的は一つの分子、たとえば一つのタンパク質であり、結合物質はその一つのタンパク質に特異的である。他の態様において、標的は、類似したエピトープまたは部分を有する分子の群、たとえばファミリーまたはタンパク質であることができ、結合物質は、タンパク質のファミリーまたは群に特異的である。分子の群はまた、分子のクラス、たとえばタンパク質、DNAまたはRNAであることもできる。結合物質は、小胞の成分またはバイオマーカーに結合することによって小胞を捕捉するために使用される捕捉物質であることができる。いくつかの態様において、捕捉物質は、小胞上の抗原に結合する抗体もしくはその断片またはアプタマーを含む。捕捉剤は、任意で基体に結合され、本明細書にさらに記載されるように小胞を単離するために使用することができる。
結合物質は、循環バイオマーカー、たとえば小胞または小胞の成分に結合する物質である。結合物質は捕捉物質および/または検出物質として使用することができる。捕捉物質は、たとえば小胞の成分またはバイオマーカーに結合することにより、循環バイオマーカーに結合し、それを捕捉することができる。たとえば、捕捉物質は、小胞上の抗原に結合する捕捉抗体または捕捉抗原であることができる。検出物質が、循環バイオマーカーに結合し、それによってバイオマーカーの検出を容易にすることができる。たとえば、基体に隔離されている抗体またはアプタマーを含む捕捉物質を使用して試料中の小胞を捕捉し、標識を担持する抗体またはアプタマーを含む検出物質を使用して、検出物質の標識の検出により、捕捉された小胞を検出することができる。いくつかの態様において、小胞は、同じ小胞バイオマーカーを認識する捕捉および検出物質を使用して評価される。たとえば、小胞集団は、テトラスパニンを使用して、たとえば基体に結合した抗CD9抗体を使用することによって捕捉することができ、捕捉された小胞は、捕捉された小胞を標識するための蛍光標識された抗CD9抗体を使用して検出することができる。他の態様において、小胞は、様々な小胞バイオマーカーを認識する捕捉および検出物質を使用して評価される。たとえば、小胞集団は、細胞特異的マーカーを使用して、たとえば基体に結合した抗PCSA抗体を使用することによって捕捉することができ、捕捉された小胞は、捕捉された小胞を標識するための蛍光標識された抗CD9抗体を使用して検出することができる。同様に、小胞集団は、一般的小胞マーカーを使用して、たとえば基体に結合した抗CD9抗体を使用することによって捕捉することができ、捕捉された小胞は、捕捉された小胞を標識するための、細胞特異的または疾患特異的マーカーに対する蛍光標識された抗体を使用して検出することができる。
結合物質によって認識されるバイオマーカーは本明細書の中で抗原と呼ばれることもある。別段指定されない限り、本明細書の中で使用される抗原は、結合物質のタイプまたはバイオマーカーの免疫原性にかかわらず、結合物質によって捕縛されることができる任意の実体を包含するものである。抗原は、その機能的断片をさらに包含する。たとえば、抗原は、結合物質によって捕縛されることができるタンパク質の断片を含め、結合物質によって捕縛されることができるタンパク質バイオマーカーを包含することができる。
一つの態様において、小胞は、小胞上のバイオマーカーに結合する捕捉物質を使用して捕捉される。本明細書にさらに記載されるように、捕捉物質を基体に結合させ、それを使用して小胞を単離することができる。一つの態様において、捕捉物質は、物質または試料中に存在する小胞のアフィニティー捕捉または単離のために使用される。
結合物質は、小胞を生物学的試料から濃縮または単離したのち、使用することができる。たとえば、まず小胞を生物学的試料から単離することができ、その後、特異的バイオシグネチャーを有する小胞を単離または検出する。特異的バイオシグネチャーを有する小胞は、バイオマーカーのための結合物質を使用して単離または検出することができる。特異的バイオマーカーを有する小胞は、不均一な小胞集団から単離または検出することができる。または、事前の単離または濃縮工程なしで、小胞を含む生物学的試料に対して結合物質を使用してもよい。たとえば、結合物質は、特異的バイオシグネチャーを有する小胞を生物学的試料から直接単離または検出するために使用される。
結合物質は、核酸、タンパク質または小胞の成分に結合することができる他の分子であることができる。結合物質は、DNA、RNA、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、Fab、Fab'、一本鎖抗体、合成抗体、アプタマー（DNA/RNA）、ペプトイド、zDNA、ペプチド核酸（PNA）、ロックド核酸（LNA）、レクチン、合成または天然化学物質（薬物、標識試薬を含むが、それらに限定されない）、デンドリマーまたはそれらの組み合わせを含むことができる。たとえば、結合物質は捕捉抗体であることができる。本発明の態様において、結合物質は膜タンパク質標識物質である。たとえば、Alroyらの米国特許出願公開公報US2005/0158708号に開示されている膜タンパク質標識物質を参照すること。ある態様において、小胞は、本明細書に記載されるように単離または捕捉され、小胞を検出するために一つまたは複数の膜タンパク質標識物質が使用される。
いくつかの例においては、一つの結合物質を用いて小胞を単離または検出することができる。他の例においては、異なる結合物質の組み合わせを用いて小胞を単離または検出してもよい。たとえば、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、50、75または100個の異なる結合物質を使用して、生物学的試料から小胞を単離または検出してもよい。さらに、以下さらに記載されるように、小胞のための一つまたは複数の異なる結合物質は小胞のバイオシグネチャーを形成することができる。
また、多重化のために様々な結合物質を使用することもできる。たとえば、異なる結合物質によって各小胞集団を単離または検出することにより、一つより多い小胞集団の単離または検出を実施することができる。異なる結合物質は異なる粒子に結合することができ、異なる粒子は標識されている。もう一つの態様においては、様々な結合物質を含むアレイを多重分析に使用することができ、様々な結合物質は、示差的に標識される、またはアレイ上の結合物質の位置に基づいて確かめられることができる。多重化は、以下に記載されるように、標識または検出法の分解能まで達成することができる。結合物質は、小胞を検出するために、たとえば起始細胞特異小胞を検出するために使用することができる。結合物質または多数の結合物質は、それら自体が、小胞のためのバイオシグネチャーを提供する結合物質プロファイルを形成することができる。一つまたは複数の結合物質は、参照により全体として本明細書に組み入れられる、2011年4月6日に出願された「Circulating Biomarkers for Disease」と題する国際特許公開公報WO/2011/127219号の図2から選択することができる。たとえば、不均一な小胞集団からの小胞の示差的検出または単離において、二つ、三つ、四つまたはより多くの結合物質を使用して小胞集団を検出または単離するならば、その小胞集団に特定の結合物質プロファイルがその特定の小胞集団のためのバイオシグネチャーを提供する。小胞は、任意の数の結合物質を多重に使用して検出することができる。したがって、結合物質は、小胞のためのバイオシグネチャーを形成するために使用することもできる。そのバイオシグネチャーを使用して表現型を特徴決定することができる。
結合物質はレクチンであることができる。レクチンは、多糖類および糖タンパク質に選択的に結合するタンパク質であり、植物および動物中に広く分布している。たとえば、スノードロップ（Galanthus nivalis）に由来するGalanthus nivalisアグルチニン（「GNA」）の形態のレクチン、ラッパスイセン（Narcissus pseudonarcissus）に由来するNarcissus pseudonarcissusアグルチニン（「NPA」）の形態のレクチンおよび「シアノビリン」と呼ばれる藍藻類Nostoc ellipsosporumのようなレクチン（Boyd et al Antimicrob Agents Chemother 41(7):1521 1530, 1997、Hammar et al. Ann N Y Acad Sci 724:166 169, 1994、Kaku et al. Arch Biochem Biophys 279(2):298 304, 1990）を使用して小胞を単離することができる。これらのレクチンは、高いマンノース含量を有する糖タンパク質に結合することができる（Chervenak et al. Biochemistry 34(16):5685 5695, 1995）。高マンノース糖タンパク質とは、α-1→3またはα-1→6マンノース−マンノース結合の形態のマンノース−マンノース結合を有する糖タンパク質をいう。
結合物質は、一つまたは複数のレクチンに結合する物質であることができる。レクチン捕捉は、バイオマーカーカテプシンDの単離に適用することができる。理由は、カテプシンDは、レクチンGalanthus nivalisアグルチニン（GNA）およびコンカナバリンA（ConA）に結合することができるグリコシル化タンパク質であるからである。
レクチンを使用して小胞を捕捉する方法および装置は、それぞれ参照により全体として本明細書に組み入れられる、2010年11月30日に出願された「METHODS AND SYSTEMS FOR ISOLATING, STORING, AND ANALYZING VESICLES」と題する国際特許公開公報WO/2011/066589号；2009年12月3日に出願された「AFFINITY CAPTURE OF CIRCULATING BIOMARKERS」と題する国際特許公開公報WO/2010/065765号；2010年6月4日に出願された「METHODS AND MATERIALS FOR ISOLATING EXOSOMES」と題する国際特許公開公報WO/2010/141862号；および2007年3月9日に出願された「EXTRACORPOREAL REMOVAL OF MICROVESICULAR PARTICLES」と題する国際特許公開公報WO/2007/103572号に記載されている。
結合物質は抗体であることができる。たとえば、小胞は、小胞上に存在する一つまたは複数の抗原に特異的な一つまたは複数の抗体を使用して単離され得る。たとえば、小胞は、その表面上にCD63を有することができ、CD63のための抗体、すなわち捕捉抗体を使用して小胞を単離することができる。または、腫瘍細胞由来の小胞はEpCamを発現することができ、EpCamおよびCD63のための抗体を使用して小胞を単離することができる。小胞を単離するための他の抗体は、CD9、PSCA、TNFR、CD63、B7H3、MFG-E8、EpCam、Rab、CD81、STEAP、PCSA、PSMAまたは5T4に対する抗体、すなわち捕捉抗体を含むことができる。小胞を単離するための他の抗体は、DR3、STEAP、epha2、TMEM211、MFG-E8、組織因子（TF）、unc93A、A33、CD24、NGAL、EpCam、MUC17、TROP2またはTETSに対する抗体、すなわち捕捉抗体を含むことができる。
いくつかの態様において、捕捉物質は、CD9、CD63、CD81、PSMA、PCSA、B7H3、EpCam、PSCA、ICAM、STEAPまたはEGFRに対する抗体である。捕捉物質はまた、小胞のバイオマーカーを同定するために使用することもできる。たとえば、CD9に対する抗体のような捕捉物質は、CD9を小胞のバイオマーカーとして同定するであろう。いくつかの態様においては、たとえば多重分析において、複数の捕捉物質を使用することができる。複数の捕捉物質は、CD9、CD63、CD81、PSMA、PCSA、B7H3、EpCam、PSCA、ICAM、STEAPおよびEGFRの一つまたは複数に対する結合物質を含むことができる。いくつかの態様において、複数の捕捉物質は、CD9、CD63、CD81、PSMA、PCSA、B7H3、MFG-E8および/またはEpCamに対する結合物質を含む。さらに他の態様において、複数の捕捉物質は、CD9、CD63、CD81、PSMA、PCSA、B7H3、EpCam、PSCA、ICAM、STEAPおよび/またはEGFRに対する結合物質を含む。複数の捕捉物質は、TMEM211、MFG-E8、組織因子（TF）および/またはCD24に対する結合物質を含む。
本明細書の中で参照される抗体は、免疫グロブリン分子または免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分、すなわち、抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含む分子および合成抗体であることができる。免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子の任意のクラス（たとえばIgG、IgE、IgM、IgDまたはIgA）またはサブクラスであることができる。抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、二特異性、合成、ヒト化およびキメラ抗体、一本鎖抗体、Fab断片およびF（ab'）2断片、FvもしくはFv'部分、Fab発現ライブラリーによって産生された断片、抗イディオタイプ（抗Id）抗体または上記のいずれかのエピトープ結合断片を含むが、これらに限定されない。抗体が優先的に抗原に結合し、かつ、たとえば、別の分子と約30％、20％、10％、5％または1％未満の交差反応性しか有さない場合、抗体は、すなわち概して任意の分子は、抗原（または他の分子）に「特異的に結合」する。
結合物質はまた、ポリペプチドまたはペプチドであることができる。ポリペプチドは、その広い意味で使用され、サブユニットアミノ酸、アミノ酸類似物またはペプチド模倣物の配列を含み得る。サブユニットはペプチド結合によって連結され得る。ポリペプチドは、天然もの、天然ポリペプチドの加工形態（たとえば酵素消化による）、化学合成されたものまたは組み換え発現されたものであり得る。本発明の方法に使用するためのポリペプチドは、標準的技術を使用して化学合成され得る。ポリペプチドは、特殊な性質を運ぶために、Dアミノ酸（Lアミノ酸特異プロテアーゼに耐性）、Dアミノ酸とLアミノ酸との組み合わせ、βアミノ酸または様々な他のデザイナーもしくは非天然アミノ酸（たとえばβメチルアミノ酸、Cαメチルアミノ酸およびNαメチルアミノ酸など）を含み得る。合成アミノ酸は、リジンに代わるオルニチンおよびロイシンもしくはイソロイシンに代わるノルロイシンを含み得る。加えて、ポリペプチドは、新規な性質を有するポリペプチドを調製するために、ペプチド模倣結合、たとえばエステル結合を有することができる。たとえば、還元ペプチド結合、すなわちR1-CH2-NH-R2（式中、R1およびR2はアミノ酸残基または配列である）を組み込むポリペプチドを生成し得る。還元ペプチド結合は、ジペプチドサブユニットとして導入され得る。そのようなポリペプチドは、プロテアーゼ活性に対して耐性であり、インビボで長い半減期を有するであろう。ポリペプチドはまた、分子の主鎖に沿って側鎖が窒素原子（アミノ酸におけるようにα炭素ではなく）に付加されているペプトイド（N置換グリシン）を含むことができる。ポリペプチドおよびペプチドは、本出願を通して互換可能に使用されるものとする。すなわち、用語「ペプチド」が使用されている場合、それはポリペプチドをも含み得、用語「ポリペプチド」が使用されている場合、それはペプチドをも含み得る。用語「タンパク質」もまた、別段指定されない限り、本出願を通して用語「ポリペプチド」および用語「ペプチド」と互換可能に使用されるものとする。
小胞は、結合物質を使用して単離、捕捉または検出され得る。結合物質は、小胞「ハウスキーピングタンパク質」または一般的小胞バイオマーカーに結合する物質であることができる。バイオマーカーは、CD63、CD9、CD81、CD82、CD37、CD53、Rab-5b、アネキシンV、MFG-E8または他の一般に認められる小胞マーカー、たとえば表3にリストされたものであることができる。さらには、疾患または病状のための候補バイオシグネチャーを同定する際に、本明細書または表3に開示されたマーカーのいずれかを選択することができ、一つまたは複数の選択されたバイオマーカーは、疾患または病状に関与する機序において直接的または間接的な役割または機能を有する。
結合物質はまた、特定の細胞型、たとえば腫瘍細胞または特定の起始細胞に由来する小胞に結合する物質（たとえば、組織因子、EpCam、B7H3、RAGEまたはCD24のための結合物質）であることもできる。小胞を単離または検出するために使用される結合物質は、2011年4月6日に出願された「Circulating Biomarkers for Disease」と題する国際特許公開公報WO/2011/127219号の図1から選択される抗原のための結合物質であることができる。この出願は参照により全体として本明細書に組み入れられる。小胞のための結合物質はまた、WO/2011/127219号の図2にリストされたものから選択することもできる。結合物質は、テトラスパニン、MFG-E8、アネキシンV、5T4、B7H3、カベオリン、CD63、CD9、Eカドヘリン、組織因子、MFG-E8、TMEM211、CD24、PSCA、PCSA、PSMA、Rab-5B、STEAP、TNFR1、CD81、EpCam、CD59、CD81、ICAM、EGFRまたはCD66のような抗原のための結合物質であることができる。血小板のための結合物質は、糖タンパク質、たとえばGpIa-IIa、GpIIb-IIIa、GpIIIb、GpIbまたはGpIXであることができる。結合物質は、CD9、Erb2、Erb4、CD81、Erb3、MUC16、CD63、DLL4、HLA-Drpe、B7H3、IFNAR、5T4、PCSA、MICB、PSMA、MFG-E8、Muc1、PSA、Muc2、Unc93a、VEGFR2、EpCAM、VEGF A、TMPRSS2、RAGE、PSCA、CD40、Muc17、IL-17-RAおよびCD80の一つまたは複数を含む抗原のための結合物質であることができる。たとえば、結合物質は、CD9、CD63、CD81、B7H3、PCSA、MFG-E8、MUC2、EpCam、RAGEおよびMuc17の一つまたは複数であることができる。一つまたは複数の結合物質、たとえば二つ以上の抗原のための一つまたは複数の結合物質を小胞の単離または検出のために使用することができる。使用される結合物質は、特定の細胞型に由来する小胞または起始細胞特異小胞を単離または検出する所望に基づいて選択することができる。結合物質は、表4中の一つまたは複数の小胞マーカーに対する結合物質であることができる。
結合物質はまた、固い表面または基体に直接的または間接的に結合されることができる。固い表面または基体は、非限定的に、マイクロアレイおよびウェルによって提供される面、粒子、たとえばビーズ、カラム、光ファイバ、ワイプ、ガラスおよび修飾または官能化ガラス、石英、雲母、ジアゾ化膜（紙またはナイロン）、ポリホルムアルデヒド、セルロース、酢酸セルロース、紙、セラミックス、金属、メタロイド、半導体、量子ドット、コートされたビーズもしくは粒子、他のクロマトグラフィー材料、磁性粒子；プラスチック（アクリル樹脂、ポリスチレン、スチレンまたは他の材料のコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン類、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE、Teflon（登録商標）など）、多糖類、ナイロンもしくはニトロセルロース、樹脂、シリカもしくはシリカ系材料、たとえばシリコンおよび変性シリコン、炭素、金属、無機ガラス、プラスチック、セラミックス、導電性ポリマー（ポリピロールおよびポリインドールのようなポリマーを含む）；ミクロもしくはナノ構造化面、たとえば核酸タイリングアレイ、ナノチューブ、ナノワイヤもしくはナノ粒子状装飾面；または多孔質面もしくはゲル、たとえばメタクリレート類、アクリルアミド類、糖ポリマー、セルロース、シリケートまたは他の繊維状もしくはストランド状ポリマーを含む、結合物質を直接的または間接的に取り付けることができる任意の物理的に分離可能な固体であることができる。加えて、当技術分野において公知であるように、基体は、パッシブまたは化学的誘導体化コーティングを使用して、デキストラン類、アクリルアミド類、ゼラチンまたはアガロースのようなポリマーを含む任意の数の材料でコートされてもよい。そのようなコーティングは、生物学的試料とのアレイの使用を容易にすることができる。
たとえば、小胞を単離するために使用される抗体は、固い基体、たとえば市販の（たとえばNunc（Milan Italy）からの）プレートのようなウェルに結合させることができる。各ウェルを抗体でコートすることができる。いくつかの態様において、小胞を単離するために使用される抗体は、アレイのような固い基体に結合される。アレイは、分子相互作用、結合アイランド、生体分子、ゾーン、ドメインの所定の空間配置、または別々の境界内に付着された結合アイランドもしくは結合物質の空間配置を有することができる。さらに、用語「アレイ」は、本明細書の中で、表面がアレイの複数のコピーを担持する場合にそうであるように、表面に配置された複数のアレイを指すために使用され得る。複数のアレイを担持するそのような表面はマルチアレイまたは反復アレイとも呼ばれ得る。
アレイは一般に、結合イベントによって試料中の実体、たとえば小胞の存在を検出することができるアドレス可能な部分を含む。アレイはマイクロアレイとも呼ばれ得る。アレイまたはマイクロアレイは、非限定的に、DNAマイクロアレイ、たとえばcDNAマイクロアレイ、オリゴヌクレオチドマイクロアレイおよびSNPマイクロアレイ、マイクロRNAアレイ、タンパク質マイクロアレイ、抗体マイクロアレイ、組織マイクロアレイ、細胞マイクロアレイ（トランスフェクションマイクロアレイとも呼ばれる）、化学物質マイクロアレイおよび糖質アレイ（グリコアレイ）を含む。DNAアレイは一般に、試料中に存在する配列に結合することができるアドレス可能なヌクレオチド配列を含む。マイクロRNAアレイ、たとえばUniversity of LouisvilleのMMChipまたはAgilentから市販されているシステムを使用してマイクロRNAを検出することができる。タンパク質マイクロアレイは、タンパク質−タンパク質相互作用を同定するために、たとえば非限定的に、プロテインキナーゼの基体、転写因子タンパク質活性化を同定するために、または生物学的に活性な小分子の標的を同定するために、使用することができる。タンパク質アレイは、様々なタンパク質分子、一般には抗体、または関心対象タンパク質に結合するヌクレオチド配列のアレイを含み得る。非限定的な例において、タンパク質アレイは、特定のタンパク質を表面上に有する小胞を検出するために使用することができる。抗体アレイは、たとえば細胞または組織溶解産物溶液からの試料からタンパク質または他の生物学的物質を検出するための捕捉分子として使用される、タンパク質チップ上にスポット塗布された抗体を含む。たとえば、抗体アレイは、体液、たとえば血清または尿から小胞関連バイオマーカーを検出するために使用することができる。組織マクロアレイは、多重組織学的解析を可能にするためにアレイ様式でアセンブルされた別々の組織コアを含む。トランスフェクションマイクロアレイとも呼ばれる細胞マイクロアレイは、細胞と相互作用してアドレス可能な位置でそれらの捕捉を容易にすることができる様々な捕捉物質、たとえば抗体、タンパク質または脂質を含む。細胞アレイはまた、小胞と細胞膜との類似性のせいで、小胞を捕捉するために使用することもできる。化学物質マイクロアレイは化学物質のアレイを含み、化学物質に結合するタンパク質または他の生物学的物質を検出するために使用することができる。糖質アレイ（グリコアレイ）は糖質のアレイを含み、たとえば、糖成分に結合するタンパク質を検出することができる。当業者は、本発明の方法にしたがって類似の技術または改良を使用することができることを理解するであろう。
結合物質はまた、ビーズまたはマイクロスフェアのような粒子に結合させることもできる。たとえば、小胞の成分に特異的な抗体を粒子に結合させることができ、抗体結合粒子を使用して生物学的試料から小胞を単離させる。いくつかの態様において、マイクロスフェアは、磁性であってもよいし、または蛍光標識されてもよい。加えて、小胞を単離するための結合物質は、そのものが固い基体であることができる。たとえば、ラテックスビーズ、たとえばアルデヒド/スルフェートビーズ（Interfacial Dynamics, Portland, OR）を使用することができる。
また、磁性ビーズに結合した結合物質を使用して小胞を単離することもできる。たとえば、結腸癌スクリーニングのために、生物学的試料、たとえば患者からの血清を捕集することができる。試料を、磁性マイクロビーズに結合した抗CCSA-3（結腸癌特異抗原）と共にインキュベートすることができる。低密度マイクロカラムをMACSセパレータの磁場中に配置することができ、その後、カラムをバッファー溶液、たとえばトリス緩衝生理食塩水で洗浄する。次いで、磁性免疫複合体をカラムに付加し、結合しない非特異物質を捨てることができる。カラムをセパレータから取り外し、それの捕集管に載せることにより、CCSA-3選択小胞を回収することができる。バッファーをカラムに加えることができ、カラムと共に提供されたプランジャを適用することにより、磁気標識された小胞を解放することができる。単離された小胞をIgG溶出バッファー中に希釈したのち、複合体を遠心分離して小胞からマイクロビーズを分けることができる。単離されたペレット状の起始細胞特異小胞をバッファー、たとえばリン酸緩衝生理食塩水中に再び懸濁させ、定量化することができる。または、抗体捕捉された起始細胞特異小胞と磁性マイクロビーズとの間の強い接着力のせいで、遠心分離を要することなく、捕捉された小胞の解放のためにトリプシンのようなタンパク質分解酵素を使用することができる。タンパク質分解酵素は、抗体捕捉起始細胞特異小胞と共に、小胞を解放するのに少なくとも十分な期間、インキュベートすることができる。
小胞を単離するための結合物質、たとえば抗体は、好ましくは、結合物質が小胞の成分に結合するのに少なくとも十分な期間、関心対象の小胞を含む生物学的試料と接触させる。たとえば、抗体は、約10分間、30分間、1時間、3時間、5時間、7時間、10時間、15時間、1日間、3日間、7日間または10日間を非限定的に含む、数秒間から数日間にわたる様々な期間、生物学的試料と接触させ得る。
参照により全体として本明細書に組み入れられる、2011年4月6日に出願された「Circulating Biomarkers for Disease」と題する国際特許公開公報WO/2011/127219号の図1にリストされた抗原に特異的な抗体のような結合物質または国際特許公開公報WO/2011/127219号の図2にリストされた結合物質は、検出を容易にするために標識されることができる。適切な標識は、非限定的に、磁気標識、蛍光部分、酵素、化学発光プローブ、金属粒子、非金属コロイド粒子、ポリマー色素粒子、顔料分子、顔料粒子、電気化学的活性種、半導体ナノ結晶または量子ドットもしくは金粒子を含む他のナノ粒子、蛍光体、量子ドットまたは放射性標識を含む。様々なタンパク質、放射性、蛍光、酵素および他の標識が先にさらに記載されている。
結合物質は直接的または間接的に標識されることができる。たとえば、標識はビオチン−ストレプトアビジンを介して抗体に取り付けられる。または、抗体は標識されず、後で第二の抗体と接触させられ、第一の抗体が関心対象の抗原に結合したのち、その第二の抗体が標識される。
使用される単離または検出の方法に依存して、結合物質は、固い表面または基体、たとえば上記アレイ、粒子、ウェルまたは他の基体に結合され得る。細胞表面への抗体の直接化学結合の方法は当技術分野において公知であり、たとえば、グルタルアルデヒドまたはマレイミド活性化抗体を使用する結合を含み得る。多工程手法を使用する化学結合の方法は、ビオチン化、トリニトロフェノール（TNP）またはジゴキシゲニンの結合（たとえばこれらの化合物のスクシンイミドエステル類を使用する）を含む。ビオチン化は、たとえば、D−ビオチニル−N−ヒドロキシスクシンイミドの使用によって達成することができる。スクシンイミド基は、7よりも高いpH値、優先的には約pH8.0〜約pH8.5でアミノ基と効果的に反応する。ビオチン化は、たとえば、細胞をジチオトレイトールで処理したのち、ビオチンマレイミドを付加することによって達成することができる。
粒子ベースのアッセイ法
平面アレイに代わるものとして、粒子またはマイクロスフェアを使用するアッセイ法、たとえばビーズベースのアッセイ法を結合物質と共に使用することが可能である。たとえば、抗体またはアプタマーを市販のビーズと容易にコンジュゲートさせる。たとえば、Fan et al., Illumina universal bead arrays. Methods Enzymol. 2006 410:57-73、Srinivas et al. Anal. Chem. 2011 Oct. 21, Aptamer functionalized Microgel Particles for Protein Detectionを参照すること。また、治療および診断物質としてのアプタマーに関するレビュー記事であるBrody and Gold, Rev. Mol. Biotech. 2000, 74:5-13を参照すること。
高感度自動化と合致した比活性を有する同族リガンドおよびレポータ分子によるビーズコーティングを使用する、マルチパラメーターアッセイ法または他のハイスループット検出アッセイ法を使用することができる。ビーズベースのアッセイシステムにおいては、バイオマーカーまたは小胞のための結合物質、たとえば捕捉物質（たとえば捕捉抗体）をアドレス可能なマイクロスフェア上に固定化することができる。個々の結合アッセイ法それぞれのための各結合物質を異なるタイプのマイクロスフェア（すなわちマイクロビーズ）に結合することができ、図2Bに示すように、そのマイクロスフェアの表面でアッセイ反応が起こる。小胞のための結合物質は、ビーズに結合された捕捉抗体またはアプタマーであることができる。別々の蛍光強度で染色されたマイクロスフェアは、それらの適切な結合物質または捕捉プローブを別々に付加される。望むならば、様々な結合物質を担持する様々なビーズセットをプールしてカスタムビーズアレイを生成することもできる。そして、ビーズアレイを試料と共に一つの反応容器の中でインキュベートしてアッセイ法を実施する。
本発明の方法に有用な様々な粒子/ビーズ基体およびシステムは先にさらに記載されている。
フローサイトメトリー
本発明の様々な態様においては、先にさらに詳細に説明されているフローサイトメトリーを使用して生物学的試料中の微小胞集団を評価する。望むならば、一つまたは複数の一般的小胞バイオマーカーを使用して小胞を標識することにより、微小胞集団を試料中の他の粒子（たとえば細胞デブリ、タンパク質凝集塊など）から分別することができる。一般的小胞マーカーは表3中のマーカーであることができる。一般に使用される小胞マーカーは、CD9、CD63および/またはCD81のようなテトラスパニンを含む。一つまたは複数のテトラスパニンを含む小胞は、その小胞がテトラスパニン陽性であることを示すために、本明細書の中で「Tet+」と呼ばれることもある。分別された微小胞を、本明細書に記載される方法を使用してさらに評価することができる。たとえば、フローまたは他の方法を使用して、分別された微小胞上の表面抗原を検出することができる。いくつかの態様においては、分別された微小胞内のペイロードを評価する。実例として、微小胞の集団を、関心対象の表面抗原への標識された結合物質と接触させ、接触させた微小胞をフローサイトメトリーによって分別し、微小胞内のペイロードを評価する。ペイロードは、所望により、ポリペプチド、核酸（たとえばmRNAまたはマイクロRNA）または他の生物学的実体であり得る。そのような評価は、本明細書に記載される表現型の特徴決定のため、たとえば癌の診断、予後判定またはセラノーシスのために使用される。
ある態様においては、フローソーティングを使用して微小胞集団を他の生物学的複合体と区別する。非限定的な例においては、フロー法を使用してAgo2+/Tet+およびAgo2+/Tet粒子を検出して、Ago2+小胞を小胞フリーのAgo2+複合体からそれぞれ分離する。
多重化
多重実験は、一つのアッセイにおいて複数の分析対象物を同時に計測することができる実験を含む。小胞および関連するバイオマーカーを多重に評価することができる。様々な循環バイオマーカー、たとえばマイクロRNA、タンパク質または小胞集団を多重化するために様々な結合物質を使用することができる。異なる結合物質を使用して様々なバイオマーカー、たとえば様々な小胞集団を単離または検出することができる。生物学的試料中の各集団が、上記のような異なるシグナル伝達標識、たとえば蛍光体、量子ドットまたは放射性標識によって標識されることができる。標識は、結合物質に直接コンジュゲートさせることもできるし、または小胞に結合する結合物質を検出するために間接的に使用することもできる。二つ以上のアフィニティー要素に結合する二つよりも多い示差的に標識された小胞集団が合計シグナルを生成することができるため、多重化アッセイにおいて検出される集団の数は標識の分解能およびシグナルの合計に依存する。
少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、50、75または100個の異なる循環バイオマーカーの多重化を実施し得る。たとえば、起始細胞に特異的な小胞の一つの集団を、異なる起始細胞に特異的な小胞の第二の集団と共にアッセイすることができ、その場合、各集団は異なる標識によって標識される。または、特定のバイオマーカーまたはバイオシグネチャーを有する小胞の集団を、異なるバイオマーカーまたはバイオシグネチャーを有する小胞の第二の集団と共にアッセイすることもできる。いくつかの場合、何百または何千の小胞が一つのアッセイにおいて評価される。
一つの態様において、多重分析は、一つよりも多い小胞集団を含む複数の小胞を複数の基体、たとえばビーズに付加することによって実施される。各ビーズは一つまたは複数の捕捉物質に結合される。複数のビーズはサブセットに分割され、同じ捕捉物質または捕捉物質の組み合わせを有するビーズがビーズのサブセットを形成して、ビーズの各サブセットが、ビーズの別のサブセットとは異なる捕捉物質または捕捉物質の組み合わせを有するようにする。そして、ビーズを使用して、捕捉物質に結合する成分を含む小胞を捕捉することができる。様々なサブセットを使用して様々な小胞集団を捕捉することができる。そして、一つまたは複数のバイオマーカーを検出することにより、捕捉された小胞を分析することができる。
フローサイトメトリーを粒子ベースまたはビーズベースのアッセイ法と組み合わせて使用することができる。高感度自動化と合致した比活性を有する同族リガンドおよびレポーター分子によるビーズコーティングを使用して、マルチパラメトリックアッセイ法または他のハイスループット検出アッセイ法を使用することができる。たとえば、各サブセット中のビーズは別のサブセットから示差的に標識されることができる。粒子ベースのアッセイシステムにおいては、小胞のための結合物質または捕捉物質、たとえば捕捉抗体をアドレス可能なビーズまたはマイクロスフェア上に固定化することができる。個々の結合アッセイ法（たとえば、結合物質が抗体であるときはイムノアッセイ法）のそれぞれのための各結合物質を異なるタイプのマイクロスフェア（すなわち、マイクロビーズ）に結合することができ、そのマイクロスフェアの表面で結合アッセイ反応が起こる。マイクロスフェアは、異なる標識によって区別することができる。たとえば、特定の捕捉物質を有するマイクロスフェアは、異なる捕捉物質を有する別のマイクロスフェアと比較して異なるシグナル伝達標識を有するであろう。たとえば、マイクロスフェアは、特定の結合物質を有するマイクロスフェアの蛍光強度が、異なる結合物質を有する別のマイクロスフェアの蛍光強度とは異なるよう、異なる蛍光強度で染色されることができる。異なる捕捉物質によって捕縛されたバイオマーカーは、異なる標識を使用して示差的に検出することができる。
マイクロスフェアは、少なくとも二つの異なる標識または色素によって標識または染色されることができる。いくつかの態様において、マイクロスフェアは、少なくとも3、4、5、6、7、8、9または10個の異なる標識で標識される。複数のマイクロスフェア中の異なるマイクロスフェアは一つよりも多い標識または色素を有することができ、その場合、マイクロスフェアの様々なサブセットは、標識または色素の様々な比率および組み合わせを有して、様々な結合物質による様々なマイクロスフェアの検出を可能にする。たとえば、標識および色素の様々な比率および組み合わせが様々な蛍光強度を可能にすることができる。または、様々な比率および組み合わせを使用して、結合物質を同定するための様々な検出パターンを生成し得る。マイクロスフェアは、外部的に標識または染色されてもよいし、内在性の蛍光またはシグナル伝達標識を有してもよい。ビーズはその適切な結合物質とは別に付加されることができ、したがって、様々な結合物質が結合されている示差的に標識されたマイクロスフェア上の様々な結合物質に基づいて様々な小胞集団を単離することができる。
もう一つの態様においては、複数の捕捉物質を含む平面基体を使用して多重分析を実施することができる。複数の捕捉物質は、一つまたは複数の小胞集団および検出された捕捉された小胞の一つまたは複数のバイオマーカーを捕捉することができる。平面基材は、本明細書の中でさらに記載されるマイクロアレイまたは他の基体であることができる。
結合物質
小胞は、小胞の新規な成分のための結合物質、たとえば関心対象の小胞に特異的な新規な抗原に対する抗体を使用して単離または検出され得る。関心対象の小胞に特異的である新規な抗原は、アレイまたは複数の粒子のような基体に結合した公知の組成の様々な試験化合物を使用して単離または同定され得、これにより、多大な化学的/構造的空間を、その空間の小さな部分を使用するだけで十分にサンプリングすることが可能になる。同定された新規な抗原はまた、小胞のためのバイオマーカーとして働くことができる。たとえば、起始細胞特異小胞に関して同定された新規な抗原が有用なバイオマーカーであることができる。
試料の接触に関して使用される「物質」または「試薬」は、標的ポリペプチド、ペプチド、核酸分子、レプチン、脂質または本明細書に記載される、または当技術分野において公知であるように検出することができる任意の他の生物学的実体をはじめとする標的分子と結合する、ハイブリダイズする、会合する、または他のやり方で標的分子を検出する、または標的分子の検出を容易にするように設計された任意の実体を意味することができる。そのような物質/試薬の例は当技術分野において周知であり、非限定的に、汎用または特異的核酸プライマー、核酸プローブ、抗体、アプタマー、ペプトイド、ペプチド核酸、ロックド核酸、レクチン、デンドリマー、化学物質または明細書に記載される、または当技術分野において公知である他の実体を含む。
結合物質は、均一または不均一な小胞集団を試験化合物に対してスクリーニングすることによって同定することができる。基体表面上の各試験化合物の組成は公知であるため、これは、アフィニティー要素のためのスクリーンを構成する。たとえば、試験化合物アレイは、基体アドレス可能な位置上の特定の位置に試験化合物を含み、小胞のための一つまたは複数の結合物質を同定するために使用することができる。試験化合物はすべて、無関連であることもできるし、またはコア配列または構造の小さな変化に基づいて関連していることもできる。様々な試験化合物が、所与の試験化合物の変異体（たとえばポリペプチドアイソフォーム）、構造的または組成的に無関連である試験化合物またはそれらの組み合わせを含み得る。
試験化合物は、ペプトイド、多糖、有機化合物、無機化合物、ポリマー、脂質、核酸、ポリペプチド、抗体、タンパク質、多糖または他の化合物であることができる。試験化合物は天然または合成であることができる。試験化合物は、いくつかの結合または結合の組み合わせ（たとえばアミド、エステル、エーテル、チオール、ラジカル付加、金属配位など）、樹枝状構造、円形構造、空洞構造または特異的な付加が実施されるための足場として働く複数の近接した結合部位を有する他の構造のいずれかに基づく直鎖状または分岐状のヘテロポリマー化合物を含む、またはそれらからなることができる。これらの試験化合物は、当技術分野の標準的方法を使用して、基体にスポット塗布することもできるし、またはインサイチューで合成することもできる。加えて、試験化合物は、協同的結合のような有用な相互作用を検出するために、スポット塗布することもできるし、またはインサイチューで組み合わせて合成することもできる。
試験化合物は、公知のアミノ酸配列を有するポリペプチドであることができ、したがって、小胞との試験化合物の結合の検出が、結合物質として使用することができる公知のアミノ配列のポリペプチドの同定をもたらすことができる。たとえば、均一な小胞集団を、可変アミノ酸長を有する数個〜1,000,000個の試験ポリペプチドを含むスライド上のスポット塗布されたアレイに付加することができる。ポリペプチドは、C末端を介して表面に付着することができる。ポリペプチドの配列は、システインを除く19のアミノ酸からランダムに生成することができる。結合反応は、各ポリペプチド結合標的に対する特異性比を決定することができるよう、非特異的競合物、たとえば別の色素で標識された余剰細菌タンパク質を含むことができる。最高の特異性および結合を有するポリペプチドを選択することができる。各スポット上のポリペプチドの正体は公知であり、したがって、容易に同定することができる。均一な小胞集団、たとえば起始細胞特異小胞に特異的な新規な抗原が同定されたならば、その後、後に記載される方法において、そのような抗原を使用してそのような起始細胞特異小胞を単離し得る。
また、小胞の結合物質としての抗体を同定するためにアレイを使用することもできる。試験抗体をアレイに付着させ、不均一小胞集団に対してスクリーニングして、小胞を単離または同定するために使用することができる抗体を同定することができる。また、起始細胞特異小胞のような均一な小胞の集団を抗体アレイによってスクリーニングすることもできる。均一な小胞集団を単離または検出するための抗体を同定すること以外に、その均一な集団に特異的な一つまたは複数のタンパク質バイオマーカーを同定することができる。アレイに付着した事前に選択された試験抗体または試験抗体のカスタム選択を用いる市販のプラットフォームを使用することができる。たとえば、Full Moon Biosystemsの抗体アレイを前立腺癌細胞由来の小胞によってスクリーニングして、Bc1-XL、ERCC1、ケラチン15、CD81/TAPA-1、CD9、上皮特異抗原（ESA）およびマスト細胞キマーゼに対する抗体を結合物質として同定することができ、同定されたタンパク質を小胞のためのバイオマーカーとして使用することができる。バイオマーカーは、小胞の中または上に存在する、または存在しないことができ、過小発現または過剰発現していることができ、突然変異または修飾されていることができ、状態を特徴決定するために使用することができる。
結合物質として使用される抗体または合成抗体はまた、ペプチドアレイによって同定することもできる。もう一つの方法は、抗体ファージディスプレイによる合成抗体生成の使用である。抗体（たとえばFab）のM13バクテリオファージライブラリーは、外被タンパク質への融合物としてファージ粒子の表面上に提示される。各ファージ粒子は、固有の抗体を提示し、また、コードするDNAを含むベクターを封入する。非常に多様なライブラリーを構築し、ファージプールとして表すことができ、それを、固定化抗原への結合のため抗体選択に使用することができる。抗原結合ファージは固定化抗原によって保持され、非結合ファージは洗浄によって除去される。保持されたファージプールを大腸菌（Escherichia coli）宿主の感染によって増幅することができ、増幅されたプールをさらなる選択ラウンドに使用して、最終的に、抗原結合クローンによって支配される集団を得ることができる。この段階で、個々のファージクローンを単離し、DNA配列決定に供して、表示された抗体の配列を解読することができる。ファージディスプレイおよび当技術分野において公知の他の方法の使用を通して、小胞に対する高アフィニティーデザイナー抗体を生成することができる。
また、ビーズベースのアッセイ法を使用して、小胞を単離または検出するための新規な結合物質を同定することもできる。試験抗体またはペプチドを粒子にコンジュゲートさせることができる。たとえば、特定の組織または腫瘍タイプからの小胞を標的化することができる新規な抗体を発見し、かつ特異的に選択するために、ビーズを、抗体またはペプチドにコンジュゲートさせ、使用して、小胞集団の表面に発現したタンパク質を検出し、定量化することができる。市販のキットを製造業者の取り扱い指示にしたがって使用することにより、有機起源の任意の分子をポリスチレンビーズにうまくコンジュゲートさせることができる。各ビーズセットを特定の検出可能な波長に着色することができ、それぞれを、公知の抗体またはペプチドに結合することができ、それを使用して、どのビーズが、以前にコンジュゲートされた抗体またはペプチドのエピトープにマッチするエキソソームタンパク質に結合しているかを特異的に計測することができる。ビーズは、上記のように、異なる強度を有する各ビーズが異なる結合物質を有するよう、別々の蛍光強度で染色することができる。
たとえば、精製された小胞の調製物は、実験的に決定されたアッセイのダイナミックレンジにしたがって、アッセイバッファー中、適切な濃度に希釈することができる。十分な量の結合したビーズを調製することができ、抗体結合ビーズ約1μlをウェル中に分取し、約50μlの最終量まで調節することができる。抗体コンジュゲートビーズを真空対応プレートに加えたならば、ビーズを洗浄して、正しい結合条件を確保することができる。そして、試験される各ウェルに適切な量の小胞を加えることができ、混合物をたとえば15〜18時間インキュベートすることができる。検出抗体希釈溶液を使用して十分な量の検出抗体を調製し、混合物と共に1時間以上インキュベートすることができる。そして、ビーズを洗浄したのち、ストレプトアビジンフィコエリスリンで構成された検出抗体（ビオチン発現）混合物を加えることができる。そして、これらのビーズを洗浄し、何回か真空吸引したのち、サスペンションアレイシステム上、計器と共に提供されたソフトウェアを使用して分析することができる。すると、その分析から、小胞を選択的に抽出するために使用することができる抗原の正体を解明することができる。
特定の組織、細胞または腫瘍タイプからの小胞を発見し、かつ特異的に選択し、かつ富化するために、イメージングシステムを使用するアッセイ法を使用して、小胞の表面に発現したタンパク質を検出し、定量化することができる。マルチウェル多重炭素コートされたプレートにコンジュゲートした抗体、ペプチドまたは細胞を使用することができる。パターン化炭素作用面に配列させた捕捉抗体の使用を通してウェル中の多くの分析対象物の同時計測を達成することができる。そして、増強電気化学発光プレートを備えた電極ウェル中、試薬で標識された抗体を用いて分析対象物を検出することができる。有機起源の任意の分子を炭素コートプレートにうまくコンジュゲートさせることができる。小胞の表面に発現したタンパク質をこのアッセイから同定し、それらを、特定の組織または腫瘍タイプからの小胞を特異的に選択し、富化するための標的として使用することができる。
結合物質はまた、特異的標的に対するアプタマーであることもできる。本明細書の中で結合物質に関して使用される「特異的」とは、ある物質が、その標的に対し、他の標的に対してよりも大きなアフィニティー、一般にははるかに大きなアフィニティーを有することを意味することができるが、結合物質がその標的に対して絶対的に特異的であることを求めない。
マイクロ流体工学
小胞を単離または同定する方法は、マイクロ流体装置と組み合わせて使用することができる。本明細書に記載されるような小胞を単離または同定する方法は、マイクロ流体装置を使用して実施することができる。「Lab-on-a-Chip」システム、バイオメディカルマイクロエレクトロメカニカルシステム（Bio-MEM）またはマルチコンポーネント集積システムとも呼ばれ得るマイクロ流体装置を小胞の単離および分析のために使用することができる。そのようなシステムは、小胞の結合、バイオシグネチャーの検出および他のプロセスを可能にするプロセスを小型化し、区画化する。
マイクロ流体装置はまた、サイズ示差選択またはアフィニティー選択による小胞の単離に使用することもできる。たとえば、マイクロ流体装置は、サイズに基づいて、または生物学的試料から小胞を単離するための一つまたは複数の結合物質を使用することによって生物学的試料から小胞を単離するための一つまたは複数のチャネルを使用することができる。生物学的試料を、小胞の通過を選択的に許す一つまたは複数のマイクロ流体チャネルに導入することができる。選択は、小胞の性質、たとえば小胞のサイズ、形状、変形性またはバイオシグネチャーに基づくことができる。
一つの態様においては、不均一な小胞集団をマイクロ流体装置に導入することができ、一つまたは複数の異なる均一な小胞集団を得ることができる。たとえば、様々なチャネルが、様々な小胞集団を選択するための様々なサイズ選択または結合物質を有することができる。したがって、マイクロ流体装置は複数の小胞を単離することができ、その場合、その複数の小胞の少なくとも一つのサブセットが、その複数の小胞の別のサブセットとは異なるバイオシグネチャーを含む。たとえば、マイクロ流体装置は、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90または100個の異なる小胞サブセットを単離することができ、その場合、小胞の各サブセットが異なるバイオシグネチャーを含む。
いくつかの態様において、マイクロ流体装置は、小胞のさらなる富化または選択を可能にする一つまたは複数のチャネルを含むことができる。第一のチャネルを通過した後の富化された小胞集団を第二のチャネルに導入することができ、これにより、所望の小胞または小胞集団の通過は、例えば第二のチャネル中に存在する一つまたは複数の結合物質などによってさらに富化される。
アレイベースのアッセイ法およびビーズベースのアッセイ法をマイクロ流体装置と共に使用することができる。たとえば、結合物質をビーズに結合することができ、マイクロ流体装置中でビーズと小胞との間の結合反応を実施することができる。また、マイクロ流体装置を使用して多重化を実施することもできる。様々な区画が様々な小胞集団のための様々な結合物質を含むことができ、各集団は異なる起始細胞特異小胞集団である。一つの態様において、各集団は異なるバイオシグネチャーを有する。マイクロスフェアと小胞との間のハイブリダイゼーション反応をマイクロ流体装置中で実施することができ、反応混合物を検出装置に送ることができる。検出装置、たとえばデュアルまたはマルチレーザー検出システムは、マイクロ流体システムの一部であることができ、レーザーを使用して各ビーズまたはマイクロスフェアをそのカラーコーディングによって同定することができ、別のレーザーが、各ビーズと関連するハイブリダイゼーションシグナルを検出することができる。
様々なマイクロ流体装置および方法が先に記載されている。
複合単離法
当業者は、所望により、試料処理ならびに小胞のような循環バイオマーカーの単離および濃縮の様々な方法を組み合わせることができることを理解するであろう。たとえば、生物学的試料は、凝集を防ぐ、望まれない粒子状物質を除去する、および/または極めて豊富なタンパク質を枯渇させるために処理することができる。使用される工程は、下流の分析工程を最適化するように選択することができる。次に、小胞のようなバイオマーカーを、たとえばクロマトグラフィー、遠心分離、密度勾配、ろ過、沈殿またはアフィニティー技術によって単離することができる。任意の数の後続工程を組み合わせることができる。たとえば、すべてまたは大多数の微小胞を単離または濃縮するために、試料を、クロマトグラフィー、遠心分離法、密度勾配、ろ過および沈殿の一つまたは複数に供することもできる。後続の工程において、たとえば、一つまたは複数の関心対象の標的への結合物質を使用するアフィニティー技術を使用して、所望のバイオマーカープロファイルを有する微小胞を単離または同定することができる。マイクロ流体システムを用いてこれらの工程のいくつかまたはすべてを実施することができる。
微小胞を単離し、分析するための例示的かつ非限定的な単離スキームは以下を含む：血漿または血清の捕集→極めて豊富なタンパク質の除去→限外ろ過→ナノ膜の濃縮→フローサイトメトリーまたは粒子ベースのアッセイ法。
本明細書に開示される、または当技術分野において公知である方法を使用すると、小胞のような循環バイオマーカーを、少なくとも約2倍、3倍、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍、75倍、80倍、90倍、95倍、100倍、110倍、120倍、125倍、130倍、140倍、150倍、160倍、170倍、175倍、180倍、190倍、200倍、225倍、250倍、275倍、300倍、325倍、350倍、375倍、400倍、425倍、450倍、475倍、500倍、525倍、550倍、575倍、600倍、625倍、650倍、675倍、700倍、725倍、750倍、775倍、800倍、825倍、850倍、875倍、900倍、925倍、950倍、975倍、1000倍、1500倍、2000倍、2500倍、3000倍、4000倍、5000倍、6000倍、7000倍、8000倍、9000倍または少なくとも10,000倍に単離または濃縮することができる。いくつかの態様において、小胞は、少なくとも1桁、2桁、3桁、4桁、5桁、6桁、7桁、8桁、9桁、10桁またはより多く単離または濃縮される。
濃縮または単離したならば、その循環バイオマーカーを評価して、たとえば本明細書に記載される表現型を特徴決定することができる。いくつかの態様においては、濃縮または単離工程そのものが関心対象の表現型の解明に光明を投じる。たとえば、アフィニティー法は、関心対象の特異的バイオマーカーの存在またはレベルを検出することができる。
本明細書に記載される様々な単離および検出システムは、そのような疾患および障害に関するような診断、予後判定、疾患層別化、セラノーシス、応答者/非応答者状態の予測、疾患モニタリング、治療モニタリングなどにとって情報提供的である、小胞のような循環バイオマーカーを単離または検出するために使用することができる。単離技術の組み合わせは本発明の範囲内である。非限定的な例においては、試料をクロマトグラフィーカラムに通して、電気泳動易動度のサイズのような性質に基づいて小胞を単離したのち、その小胞をマイクロ流体装置に通すことができる。結合物質は、これらの工程の前、最中または後で使用することができる。
本発明の方法および組成物は、本明細書に記載されるような方法を使用して単離または検出された微小胞と共に使用することができる。様々な非限定的な例として、本発明の方法によって提供されたアプタマーを、タンパク質または微小胞のようなバイオマーカーのための捕捉および/または検出物質として使用することができ；体液のような試料を本発明のオリゴヌクレオチドプローブライブラリーと接触させることができ、その後、本明細書に記載される一つまたは複数の技術（たとえばクロマトグラフィー、遠心分離、フローサイトメトリー、ろ過、アフィニティー単離、ポリマー沈殿など）を使用して試料中の微小胞を単離し；本明細書に記載される一つまたは複数の技術（たとえばクロマトグラフィー、遠心分離、フローサイトメトリー、ろ過、アフィニティー単離、ポリマー沈殿など）を使用して試料中の微小胞を単離したのち、微小胞を本発明のアプタマーまたはオリゴヌクレオチドプローブライブラリーと接触させる。そのようなプロセスの任意の適切な工程で、極めて豊富なタンパク質のような混入物質を全体的または部分的に除去することができる。微小胞および他のバイオマーカーの評価のためのそのような技術のこれらおよび様々な他の有用な反復が本発明によって考慮されている。
バイオマーカー
本明細書に記載されるように、本発明の方法および組成物は、一つまたは複数の関心対象のバイオマーカーの存在またはレベルを検出するためのアッセイにおいて使用することができる。バイオマーカーは、本明細書に開示される、または当技術分野において公知である任意の有用なバイオマーカーであることができる。ある態様において、バイオマーカーはタンパク質またはポリペプチドを含む。本明細書において使用される「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、別段述べられない限り、互換可能に使用される。バイオマーカーは、本明細書に開示される、または当技術分野において公知であるような、DNA、RNAおよびそれらのいずれかの様々な亜種を含む核酸であることができる。バイオマーカーは脂質を含むことができる。バイオマーカーは糖質を含むことができる。バイオマーカーはまた、複合体、たとえばタンパク質、核酸、脂質および/または糖質を含む複合体であることができる。いくつかの態様において、バイオマーカーは微小胞を含む。ある態様において、本発明は、アプタマーのプールを使用して、プールの各メンバーによって標的化される正確な微小胞抗原を知ることなく、関心対象の微小胞集団の存在および/またはレベルを評価する方法を提供する。たとえば図16B〜Cを参照すること。他の場合、微小胞と結合したバイオマーカーが本発明の方法にしたがって評価される。たとえば図2A〜2F；図16Aを参照すること。
一つより多いバイオマーカーを含むバイオシグネチャーは、一つのタイプのバイオマーカーまたは複数のタイプのバイオマーカーを含むことができる。非限定的な例として、バイオシグネチャーは、複数のタンパク質、複数の核酸、複数の脂質、複数の糖質、複数のバイオマーカー複合体、複数の微小胞またはそれらのいずれかの組み合わせを含むことができる。たとえば、バイオシグネチャーは、1種または複数種の微小胞、1種または複数種のタンパク質および1種または複数種のマイクロRNAを含み得、その場合、1種または複数種のタンパク質および/あるいは1種または複数種のマイクロRNAは、場合によっては適宜、表面抗原および/またはペイロードとして微小胞と結合している。
いくつかの態様において、小胞は、小胞表面抗原を使用して検出される。一般的に発現される小胞表面抗原は、「ハウスキーピングタンパク質」または一般的小胞バイオマーカーと称され得る。バイオマーカーは、CD63、CD9、CD81、CD82、CD37、CD53、Rab-5b、アネキシンV、またはMFG-E8であってよい。四つの膜貫通ドメインを有する膜タンパク質のファミリーであるテトラスパニンを一般的小胞バイオマーカーとして使用することができる。テトラスパニンはCD151、CD53、CD37、CD82、CD81、CD9およびCD63を含む。TSPAN1（TSP-1）、TSPAN2（TSP-2）、TSPAN3（TSP-3）、TSPAN4（TSP-4、NAG-2）、TSPAN5（TSP-5）、TSPAN6（TSP-6）、TSPAN7（CD231、TALLA-1、A15）、TSPAN8（CO-029）、TSPAN9（NET-5）、TSPAN10（オキュロスパニン）、TSPAN11（CD151様）、TSPAN12（NET-2）、TSPAN13（NET-6）、TSPAN14、TSPAN15（NET-7）、TSPAN16（TM4-B）、TSPAN17、TSPAN18、TSPAN19、TSPAN20（UP1b、UPK1B）、TSPAN21（UP1a、UPK1A）、TSPAN22（RDS、PRPH2）、TSPAN23（ROM1）、TSPAN24（CD151）、TSPAN25（CD53）、TSPAN26（CD37）、TSPAN27（CD82）、TSPAN28（CD81）、TSPAN29（CD9）、TSPAN30（CD63）、TSPAN31（SAS）、TSPAN32（TSSC6）、TSPAN33およびTSPAN34を含む、哺乳動物において同定された30種類超のテトラスパニンが存在する。他の一般的に認められた小胞マーカーは、表3に記載されたものを含む。1つまたは複数のこれらのタンパク質は、本発明の方法および組成物を使用した表現型の特徴決定のために有用なバイオマーカーであり得る。
（表３）複数の細胞型由来の小胞中に認められるタンパク質
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本明細書に記載される任意のタイプのバイオマーカーを主題の方法および組成物によって使用および/または評価することができる。例示的なバイオマーカーは非限定的に表4におけるバイオマーカーを含む。マーカーは、自由に循環している、または他の生物学的分子との複合体であることができるタンパク質としてまたはmRNAとして検出することができる。表4におけるマーカーはまた、適宜、本明細書に開示されるような表現型の特徴決定のための小胞の捕捉および/または検出に使用することもできる。いくつかの場合、複数の捕捉および/または検出物質を使用して特徴決定を増強する。たとえば図2D〜Eを参照すること。マーカーは、小胞表現抗原および/または小胞ペイロードとして検出することができる。「例示的クラス」は、マーカーが既知のマーカーであるところの適応症を示す。当業者は、特定の場合、マーカーを代替設定において使用することもできることを理解するであろう。たとえば、一つのタイプの疾患を特徴決定するために使用することができるマーカーを、適宜、別の疾患を特徴決定するために使用してもよい。様々な系統の腫瘍のバイオマーカーとして使用することができる腫瘍マーカーの非限定的な例を考えてみる。表4におけるバイオマーカー参考例は、当技術分野において一般に使用されているものである。遺伝子の別名および記述は、GeneCards（登録商標）（www.genecards.org）、HUGO Gene Nomenclature（www.genenames.org）、Entrez Gene（www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=gene）、UniProtKB/Swiss-Prot（www.uniprot.org）、UniProtKB/TrEMBL（www.uniprot.org）、OMIM（www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=OMIM）、GeneLoc（genecards.weizmann.ac.il/geneloc/）およびEnsembl（www.ensembl.org）を含む多様なオンラインデータベースを使用して見いだすことができる。概して、以下の遺伝子記号および名称は、HUGOによって承認されたものに対応し、タンパク質名は、UniProtKB/Swiss-Protによって推奨されるものである。また、一般的な代替が提供されている。いくつかの場合、バイオマーカーは、「ENSG」の後に番号が続く形態であるEnsembl参照番号、たとえばLAMP2に対応するENSG00000005893によって参照される。表4において、簡潔に示すためだけに、「ENSG00000」を表すために「E.」が使用されることがある。たとえば、「E.005893」は「ENSG00000005893」を表す。タンパク質名が前駆体を示す場合、その成熟タンパク質が同じく暗示される。本出願を通じて、遺伝子およびタンパク質記号は互換可能に使用され得、意味は、必要に応じて文脈から導き出すことができる。
（表４）例示的なバイオマーカー
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本発明の方法および組成物に組み込むことができるさらなるバイオマーカーの例は、非限定的に、2012年6月14日に出願された国際特許出願PCT/US2012/042519（WO 2012/174282）および2012年8月8日に出願された国際特許出願PCT/US2012/050030（WO 2013/022995）に開示されているものを含む。
本発明の様々な態様において、本明細書に開示される病状または疾患のいずれかを検出または評価するために使用されるバイオマーカーまたはバイオシグネチャーは、いくつかの異なるマーカーカテゴリーの一つに入る一つまたは複数のバイオマーカーを含むことができ、その場合、カテゴリーは、非限定的に、1）疾患特異的バイオマーカー；2）細胞または組織特異的バイオマーカー；3）小胞特異的バイオマーカー（たとえば一般的小胞バイオマーカー）；4）血管形成特異的バイオマーカー；および5）免疫調節バイオマーカーの、一つまたは複数を含む。全てのそのようなマーカーの例が本明細書に開示され、当業者に公知である。さらには、特定の疾患または病状において役割を有することが特徴として決定されている当技術分野において公知のバイオマーカーを、本発明の組成物および方法における標的としての使用に適合させることもできる。さらなる態様において、小胞と結合しているそのようなバイオマーカーは、すべてが小胞表面バイオマーカーであることもできるし、または小胞表面マーカーと小胞ペイロードマーカー（すなわち、小胞によって包囲された分子）との組み合わせであることもできる。評価されるバイオマーカーは、供給源の組み合わせに由来することができる。たとえば、疾患または障害は、タンパク質、核酸、小胞、循環バイオマーカー、組織試料由来のバイオマーカーなどの組み合わせを評価することによって検出または特徴決定され得る。加えて、本明細書に記されるように、評価される生物学的試料は、任意の生物学的流体であることもできるし、またはそのような生物学的流体内に存在する個々の成分（たとえば小胞、核酸、タンパク質またはそれらの複合体）を含むことができる。
EpCAMは、多くの腫瘍細胞上に発現するpan-上皮分化抗原である。これは、カドヘリン−カテニン経路、ひいては細胞内シグナル伝達および極性を担う基本的WNT経路と複雑に関連している。これは、胃腸、泌尿器および他の癌腫の治療において免疫治療標的として使用されている（Chaudry MA, Sales K, Ruf P, Lindhofer H, Winslet MC (April 2007). Br. J. Cancer 96 (7): 1013-9）。これは非分化多能性幹細胞中に発現する。EpCAMは、少なくとも二つのタイプI膜タンパク質を含み、かつ、ホモタイプカルシウム非依存性細胞接着分子として機能するファミリーのメンバーである。この遺伝子における突然変異が先天性タフティング腸疾患を生じさせる。EpCAMは、様々な系統の癌細胞由来の微小胞の表面に観測されている。EpCAMは、本明細書の様々な例において例示的な表面抗原として使用される。当業者は、EpCAMを使用する様々な態様および例を、同様に他の微小胞表面抗原にも適用できることを理解するであろう。
治療
本明細書において使用される「治療有効量」とは、哺乳動物における疾患または病状の一つまたは複数の症候を軽減する組成物の量（ある程度、熟練した医療実施者の判断による）をいう。加えて、組成物の「治療有効量」とは、疾患または病状と関連する、またはその原因となる生理学的または生化学的パラメータを部分的または完全のいずれかに正常に戻す量を意味する。医療当業者は、たとえば静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、経口投与または吸入によって投与されたとき特定の病状または障害を治療または予防するために、組成物の治療有効量を決定することができる。治療的に有効であるために求められる組成物の正確な量は、数多くの要因、たとえば活性剤の比活性、用いられる送達装置、剤の物理的特徴、投与の目的、さらには多くの患者固有の考慮事項に依存する。しかし、治療有効量の決定は、本明細書に記載される開示を考慮すると、通常の医療当業者の技能の範囲内である。
本明細書において使用される語「治療する」、「治療」、「治療法」および「治療処置」は治癒的治療または予防的治療をいう。「予防的治療」の例は、標的の疾患（たとえば癌または他の増殖性疾患）またはそれに関連する病状の可能性の予防または軽減である。治療を必要とする者は、すでに疾患または病状を有する者ならびに予防される疾患または病状を有しやすい者を含む。本明細書において使用される語「治療する」、「治療」、「治療法」および「治療処置」はまた、疾患または関連の病状と戦うための哺乳動物の管理および看護をも指し、かつ疾患、病状の症候、副作用または他の合併症を緩和するための組成物の投与を含む。癌の治療処理は、手術、化学療法、放射線療法、遺伝子療法および免疫療法を含むが、それらに限定されない。
本明細書において使用される語「剤」または「薬」または「治療物質」とは、化学物質、化学物質の混合物、生物学的高分子または治療的性質を有することが疑われる生物学的材料、たとえばバクテリア、植物、真菌もしくは動物（特に哺乳動物）細胞または組織から作られる抽出物をいう。剤または薬は、精製、実質的に精製または部分的に精製されることができる。本発明の「剤」はまた、放射線治療剤または「化学療法剤」を含む。
本明細書において使用される語「診断物質」とは、罹病組織、たとえば腫瘍の画像化に使用される任意の化学物質をいう。
本明細書において使用される語「化学療法剤」とは、癌、新生物性および/もしくは増殖性疾患に対して活性を有する、または癌細胞を直接死滅させる能力を有する剤をいう。
本明細書において使用される「薬学的製剤」とは、有意な毒物学的有害作用を有しない、ヒトおよび獣医学的用途のための製剤を含む。本明細書において使用される「薬物学的に許容される製剤」とは、本発明の核酸分子をその所望の活性にとってもっとも適した物理的位置で効果的に分散させることができる組成物または製剤をいう。
本明細書において使用される語「薬学的に許容される担体」は、薬学的投与と適合性であるあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などを含むことを意図する。薬学的に有効な物質のためのそのような媒体および剤の使用は当技術分野において周知である。任意の従来の媒体または剤が有効成分化合物と不適合性である場合を除き、組成物におけるその使用は考慮される。
癌治療剤としてのアプタマー−毒素コンジュゲート
これまでの広範な研究が、一定範囲の適応症のための、主に癌の治療に向けられ、第一に血液腫瘍に焦点を当てた潜在的治療としての抗体−毒素コンジュゲート（「免疫コンジュゲート」）の概念を広く展開している。タンパク質毒素、高効力小分子細胞毒、放射性同位体およびリポソーム封入薬物を含む、標的化送達のための多様な異なるペイロードが前臨床および臨床試験において試験されている。これらの努力は血液腫瘍のための三つのFDA承認治療を生み出すことに成功したが、クラスとしての免疫コンジュゲート（特に固形腫瘍のための）は、歴史的に、非ヒト化抗体に対する中和抗体応答を発生させる傾向、固形腫瘍への限られた浸透、毒素コンジュゲートの結果としての標的結合親和性の損失および全体的治療指数を制限する抗体半減期と毒素コンジュゲート半減期との不均衡を含む抗体の複数の異なる性質に帰すことができる、失望させる結果しかもたらしていない（Reff and Heard, Critical Reviews in Oncology/Hematology, 40 (2001):25-35によって考察されている）。
アプタマーは、その吸収、分布、代謝および排泄（「ADME」）の性質が本質的に異なり、概して、概して抗体と関連する免疫エフェクター機能（たとえば抗体依存的細胞傷害性、補体依存的細胞傷害性）の多くを欠くことを除き、機能的には抗体に類似している。先に記載したアプタマーおよび抗体の性質の多くを比較する中で、いくつかの要因が、アプタマーを介する毒素送達が、抗体を用いる送達に対していくつかの具体的な利点を提供し、最終的には、治療としてより高い潜在能力をそれらに与えることを示唆する。抗体を介する毒素送達に対するアプタマーを介する毒素送達の利点のいくつかの例は以下のとおりである。
1）アプタマー−毒素コンジュゲートは完全に化学合成される。化学合成は、コンジュゲートの性質に対してより多大な制御を提供する。たとえば、化学量論比（アプタマーに対する毒素の比）および取り付けの部位を正確に定めることができる。様々なリンカー化学物質を容易に試験することができる。アプタマーフォールディングの可逆性は、コンジュゲート中の活性の損失が起こりにくく、かつコンジュゲート条件の調節においてより多くのフレキシビリティーを提供して収率を最大化することを意味する。
2）より小さなサイズがより良好な腫瘍への浸透を可能にする。固形腫瘍への抗体の不十分な浸透が、コンジュゲート手法の効能を制限する要因としてしばしば挙げられている。Colcher, D., Goel, A., Pavlinkova, G., Beresford, G., Booth, B., Batra, S. K. (1999) "Effects of genetic engineering on the pharmacokinetics of antibodies," Q. J. Nucl. Med., 43:132-139を参照すること。非PEG化抗テナシンCアプタマーの性質を対応する抗体と比較した研究が、腫瘍中への効率的な吸収（腫瘍：血液比によって決定される）を実証し、腫瘍に限局化されたアプタマーが予想外に長命である（t1/2＞12時間）ことを証明している（Hicke, B. J., Stephens, A. W., "Escort aptamers: a delivery service for diagnosis and therapy", J. Clin. Invest., 106:923-928 (2000)）。
3）調節可能PK。ペイロードの性質に合致するようにアプタマー半減期/代謝を容易に調節して、全身的暴露を最小限にしながらも毒素を腫瘍に送達する能力を最適化することができる。アプタマー主鎖の適切な修飾および高分子量PEGの付加がアプタマーの半減期をコンジュゲート毒素/リンカーの固有の半減期に合致させることを可能にし、非機能的毒素担持代謝産物への全身的暴露を最小限にし（t1/2（アプタマー）＜＜t1/2（毒素）の場合に予想される）、持続性の非コンジュゲートアプタマーがコンジュゲートアプタマーの吸収を機能的にブロックする可能性を下げる（t1/2（アプタマー）＞＞t1/2（毒素）の場合に予想される）。
4）相対的に低い材料要求基準。投薬レベルが細胞傷害性ペイロードに固有の毒性によって制限されることがあり得る。そのようなものとして、一つの治療過程がおそらく相対的に小さな量（＜100mg）のアプタマーしか必要とせず、オリゴヌクレオチド合成のコストがアプタマーベースの治療の障害となる可能性を減らす。
5）この適応症の場合には非経口投与が好ましい。患者/医師受諾を促すために代替の剤形を開発する特別な必要性はない。
本発明は、本発明によって提供される、治療的有効量のアプタマーまたはその塩、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む、薬学的組成物を提供する。本発明はまた、治療的有効量のアプタマーまたはその塩、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む薬学的組成物も提供する。関連して、本発明は、それを必要とする対象に薬学的組成物を投与する工程を含む、疾患または障害を治療するかまたは寛解させる方法を提供する。対象に治療的有効量の組成物を投与する工程は、以下をもたらす：（a）活性物質単独の送達と比較した、疾患部位への活性物質の送達の増大；または（b）微小胞クリアランスの増大による、アプタマーの標的となる微小胞の血中濃度の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、もしくは90%の低下；または（c）該アプタマーの標的となる微小胞の生物学的活性の、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、もしくは90%の低下。ある態様において、微小胞の生物学的活性は、免疫抑制または遺伝情報の伝達を含む。疾患または障害は、限定するわけではないが、本明細書に開示するものを含み得る。例えば、疾患または障害は、新生物性の、増殖性の、または炎症性の、代謝性の、心血管の、または神経性の疾患または障害を含み得る。例えば、「表現型」の項を参照すること。
アプタマー同定法
核酸配列は、二次および三次モチーフ、特にそれらのヌクレオチド配列へとフォールディングする。これらのモチーフは、配列が標的分子、たとえばタンパク質および他のアミノ酸配列上の特定の位置に結合することを可能にする位置において核酸配列に正および負の電荷を配置する。これらの結合配列は当技術分野においてアプタマーとして知られている。相対的に短いヌクレオチドの伸長（たとえば10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39または40個のヌクレオチド）においてさえ何兆もの特有のヌクレオチド配列が可能であるせいで、多様なモチーフを生成して、ほぼいかなる所望のタンパク質または他の標的のためのアプタマーも得ることができる。
アプタマーは、特定の長さ、一般には20〜80塩基対長、たとえば20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79または80塩基対長のオリゴヌクレオチドをランダムに生成することによって創製される。そして、これらのランダムなヌクレオチドを関心対象のタンパク質標的と共にインキュベートする。いくつかの洗浄工程ののち、標的に結合するオリゴヌクレオチドを捕集し、増幅する。そして、増幅されたアプタマーを標的に加え、プロセスを多くの場合15〜20回繰り返す。このプロセスの一般的なバージョンが当業者にSELEX法として知られている。
最終結果は、標的に対して高い親和性を有する1種または複数種のアプタマーを含む。本発明は、所望の特徴を提供するために使用することができる、そのような得られたアプタマーのさらなる処理：1）所望のエピトープに対するアプタマーを同定するための競合的結合アッセイ；2）高親和性結合アプタマーをインシリコで同定するためのモチーフ分析；および3）特定の疾患を検出するために使用することができるアプタマーを同定するための、微小胞ベースのアプタマー選択アッセイ、を提供する。方法は、以下でより詳細に、さらに実施例において、説明される。
本発明はさらに、本発明の方法によって発見される配列と相同性が高いアプタマー配列を考慮する。「高い相同性」とは、一般に、ポリヌクレオチド配列と参照配列との間で40％以上、好ましくは60％以上、より好ましくは80％以上、よりさらに好ましくは85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはより高い相同性をいう。ある態様において、参照配列は、本明細書に提供される1種または複数種のアプタマーの配列を含む。相同率（同一率とも呼ばれる）は一般に、二つの最適に整列させた配列の間で実施される。比較のために配列を整列させる方法は当技術分野において周知である。配列の最適な整列および比較は、たとえば"Wilbur and Lipman, Proc Natl Acad Sci USA 80: 726-30 (1983)"中のアルゴリズムを使用して実施することができる。また、相同性算出は、BLASTを使用して実施することができる。BLASTは、NCBIサーバー：www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/（Altschul S F, et al, Nucleic Acids Res. 1997; 25(17):3389-402；Altschul S F, et al, J Mol. Biol. 1990; 215(3):403-10）で見いだすことができる。参照配列、たとえば本明細書の方法によって同定された配列よりも長い、または長さがそれに等しい単離されたポリヌクレオチドの場合、比較は、参照配列の完全長を用いて実施される。単離されたポリヌクレオチドが参照配列よりも短い、たとえば本明細書の方法によって同定された配列よりも短い場合、比較は、参照配列のうち同じ長さのセグメント（相同性算出によって求められる任意のループは除外する）に対して実施される。
本発明はさらに、本発明の方法によって見いだされる配列の機能的断片であるアプタマー配列を考慮する。アプタマー配列に関連して、アプタマー配列の「機能的断片」は、完全長配列と同じ標的に結合する配列を含み得る。いくつかの場合、候補アプタマー配列は、5'リーダー配列および/または3'テール配列を含むライブラリーのメンバーからの配列である。そのようなリーダー配列またはテール配列は、増幅または捕捉などのためのプライマー結合を容易にするように働き得る。これらの態様において、完全長配列の機能的断片は、リーダーおよび/またはテール配列を有しない、候補アプタマー配列の部分配列を含み得る。
競合的抗体付加
公知のアプタマー製造法は、結合したすべてのアプタマーを標的配列から溶離させる工程を含み得る。いくつかの場合、これは、所望のアプタマー配列を同定するのに十分ではない。たとえば、アッセイ中に抗体を交換しようとするとき、交換される抗体の特定のエピトープに結合するアプタマーだけを捕集することが望ましい場合もある。本発明は、抗体エピトープに結合するアプタマーの選択的捕集を可能にするために、交換される抗体をアプタマー/標的反応に付加する工程を含む方法を提供する。ある態様において、方法は、ランダムに生成されたオリゴヌクレオチドを含む反応混合物を関心対象の標的と共にインキュベートする工程、標的に結合しない非結合アプタマーを反応混合物から除去する工程、関心対象のエピトープに結合する抗体を反応混合物に加える工程、および抗体によって置換されるアプタマーを捕集する工程を含む。標的はタンパク質であることができる。例えば、EpCamの特定のエピトープに対するアプタマーを同定するための方法を示す、図1を参照すること。
モチーフ分析
大部分のアプタマー実験においては、標的に結合する複数のアプタマー配列が同定される。これらのアプタマーは様々な結合親和性を有する。これら多くのアプタマーをそれぞれの親和性を評価するのに十分な量で生成するには時間と労力を要する。大きなサブセットを物理的にスクリーニングすることなく最高の親和性を有する多数のアプタマーを同定するために、本発明は、関心対象の標的に対する一つまたは複数の高親和性アプタマーの二次元構造の分析を含む方法を提供する。ある態様において、方法は、類似した二次元構造、すなわちモチーフを有するが、必ずしも類似した一次配列を有するわけではないアプタマーを求めてデータベースをスクリーニングする工程を含む。ある態様において、方法は、本明細書に開示される、または当技術分野において公知であるような従来の方法（たとえば表面プラズモン共鳴結合アッセイ法、図5を参照）を使用して高親和性アプタマーを同定する工程、高親和性アプタマーの二次元構造を近似する工程、および高親和性アプタマーに類似した二次元構造を有すると予測されるアプタマーを配列のプールから同定する工程を含む。これにより、方法は、関心対象の標的にも結合する候補のプールを提供する。オリゴの二次元構造は、当技術分野において公知の方法を使用して、たとえば、内容が参照により全体として本明細書に組み入れられるMathews, D., Sabina, J., Zucker, M. & Turner, H. Expanded sequence dependence of thermodynamic parameters provides robust prediction of RNA secondary structure. J. Mol. Biol. 288, 911-940 (1999)；Hofacker et al., Monatshefte f. Chemie 125: 167-188 (1994)；およびHofacker, I. L. Vienna RNA secondary structure server. Nucleic Acids Res. 31, 3429-3431 (2003)に記載されているように、市販のソフトウェアプログラム、たとえばViennaまたはmFoldを使用して実施される自由エネルギー（ΔG）算出によって予測することができる。図3を参照すること。配列のプールは、ランダムに生成されたアプタマー候補のプールから、ハイスループット配列決定プラットフォーム、たとえばLife Technologiesのイオントレントプラットフォームを使用して配列決定することができる。高親和性アプタマーに類似した二次元構造を有すると予測されるアプタマーを配列のプールから同定する工程は、得られた配列を好みのソフトウェアプログラムにロードして、高親和性アプタマーと同様な二次元構造を有する配列プールのメンバーを同定する工程を含み得る。そして、配列のプールの親和性をインサイチューで、たとえば表面プラズモン共鳴結合アッセイ法などで測定することができる。
アプタマーサブトラクション法
疾患、たとえば癌を検出するためのアッセイ法を開発するためには、一般に、正常および疾患患者由来の既知のバイオマーカーの大きな集団をスクリーニングして、疾患と相関するマーカーを同定する。このプロセスは、弁別マーカーがすでに記載されている場合しかうまく行かない。この問題に対処するために、本発明は、はじめに非標的微小胞または細胞と共にインキュベートすることにより、大きなアプタマープールから非弁別アプタマーを減じる工程を含む方法を提供する。非標的細胞は、正常な細胞または正常な細胞から流出した微小胞であることができる。そして、正常な微小胞または細胞に結合しなかったアプタマーを罹病微小胞または細胞と共にインキュベートする。そして、罹病微小胞または細胞に結合するが、正常細胞には結合しなかったアプタマーが、疾患を検出するためのアッセイ法にとって可能な候補である。このプロセスは、疾患試料中の特定のマーカーの存在を知ることからは独立している。
サブトラクション法は、所望の標的集団を優先的に認識するアプタマーを同定するために使用することができる。ある態様において、サブトラクション法は、対照（たとえば正常または非疾患）集団由来の標的よりも疾患標的集団由来の標的を優先的に認識するアプタマーを同定するために使用される。疾患標的集団は、疾患個体由来の小胞の集団であり得、一方で、対照集団は非疾患個体由来の小胞を含む。疾患は、癌または本明細書に開示される、または当技術分野において公知である他の疾患であることができる。したがって、方法は、対照標的よりも疾患標的を優先的に同定するアプタマーを提供する。
対照試料、たとえば、関心対象の疾患を有しない、たとえば癌を有しない「正常」個体由来の血漿から循環微小胞を単離することができる。試料中の微小胞を、本明細書に開示される、または当技術分野において公知である方法を使用して単離する。たとえば、小胞は、以下の方法：ろ過法、限外ろ過法、ナノ膜限外ろ過法、ExoQuick試薬（System Biosciences, Inc., Mountain View, CA）、遠心分離、分子クラウディング試薬（たとえばLife TechnologiesのTEXIS）を使用する超遠心分離、ポリマー沈殿（例えば、ポリエチレングリコール (PEG)）、アフィニティー単離法、アフィニティー選択法、免疫沈降、クロマトグラフィー、サイズ排除、またはこれらの方法のいずれかの組み合わせの一つにより、血漿から単離することができる。各場合に単離される微小胞は、複数の小胞タイプの混合物であり、様々なサイズを有するが、超遠心分離法は、エキソソームサイズの小胞を生成するより強い傾向を有し得る。ランダムに生成されたオリゴヌクレオチドライブラリー（たとえば、本明細書の実施例に記載されるように製造される）を、単離した正常な小胞と共にインキュベートする。これらの小胞に結合しないアプタマーは、たとえば小胞をスピンダウンし、非結合アプタマーを含む上清を捕集することによって単離する。そして、これらの非結合アプタマーを、疾患患者から単離された小胞と接触させて（たとえば上記と同じ方法を使用して）、アプタマーに疾患小胞を認識させる。次に、疾患小胞に結合したアプタマーを捕集する。ある態様において、小胞は、単離したのち、カオトロピック剤（たとえばSDSまたは類似した洗浄剤）を使用して溶解させ、その後、溶解混合物をアフィニティーカラムに通すことによってアプタマーを捕捉する。アフィニティーカラムは、ビオチンにコンジュゲートしたアプタマープールの場合には、ストレプトアビジンビーズを含み得る。その後、単離したアプタマーを増幅する。そして、このプロセスを、たとえば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20回またはそれ以上、繰り返すことができる。
本発明の一つの局面においては、関心対象の生物学的試料を特徴決定するために使用することができるアプタマープロフィールを同定する。ある態様においては、ランダムに生成されたオリゴヌクレオチド、たとえば少なくとも10、102、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017、1018、1019個または少なくとも1020個のオリゴヌクレオチドのプールを、対照集団由来の関心対象の生物学的成分または標的と接触させる。対照集団由来の関心対象の生物学的成分または標的に結合しないオリゴヌクレオチドを単離したのち、試験集団由来の関心対象の生物学的成分または標的と接触させる。試験集団由来の関心対象の生物学的成分または標的に結合するオリゴヌクレオチドを保持する。保持されたオリゴヌクレオチドを使用して、保持されたオリゴヌクレオチドを対照集団由来の関心対象の生物学的成分または標的と接触させ、対照集団由来の関心対象の生物学的成分または標的に結合しない保持されたオリゴヌクレオチドを単離し、それらの単離されたオリゴヌクレオチドを試験集団由来の関心対象の生物学的成分または標的と再び接触させ、結合するオリゴヌクレオチドを単離することにより、プロセスを繰り返すことができる。「成分」または「標的」は、オリゴヌクレオチドが結合することができる、試料中に存在する任意のもの（たとえばポリペプチド、ペプチド、核酸分子、糖質、脂質など）であることができる。そして、プロセスを、たとえば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20回またはより多くの回数、繰り返すことができる。得られるオリゴヌクレオチドは、対照集団に対して試験集団を示差的に検出することができるアプタマーを含む。これらのアプタマーはアプタマープロフィールを提供し、アプタマープロフィールは、1種または複数種のアプタマーを使用して判定されるバイオシグネチャー、たとえば、1種または複数種のアプタマーを使用して検出される成分または標的の存在またはレベルを含むバイオシグネチャーを含む。
例示的なプロセスが図4に示されており、これは対照としての正常（非癌）個体からの小胞を使用して、癌小胞を優先的に認識するアプタマーを同定する方法を実証する。図中、エキソソームが例示されているが、当業者は、他の微小胞を同じやり方で使用することができることを理解するであろう。得られるアプタマーは、正常な小胞から癌小胞を示差的に検出することができるプロフィールを提供することができる。当業者は、同じ工程を使用して、関心対象の任意の疾患または病状を特徴決定するためのアプタマープロフィールを導出することができることを理解するであろう。
ある態様において、本発明は、上記方法によって同定された、ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドまたはその断片を提供する。本発明はさらに、上記方法によって同定されたヌクレオチド配列と少なくとも60％同一であるヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチドを提供する。より好ましくは、単離された核酸分子は、上記方法によって同定されたヌクレオチド配列と少なくとも65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはより多く同一である。参照配列、たとえば上記方法によって同定された配列よりも長い、または長さがそれに等しい単離されたポリヌクレオチドの場合、比較は、参照配列の完全長を用いて実施される。単離されたポリヌクレオチドが参照配列よりも短い、たとえば上記方法によって同定された配列よりも短い場合、比較は、参照配列のうち同じ長さのセグメント（相同性算出によって求められる任意のループは除外する）に対して実施される。
関連の局面において、本発明は、アプタマープロフィールを使用して生物学的表現型を特徴決定する方法を提供する。アプタマープロフィールは、上記方法を使用して決定することができる。アプタマープロフィールは、試験試料に関して決定し、対照アプタマープロフィールと比較することができる。表現型は、癌のような疾患または障害であり得る。表現型の特徴決定は、非限定的に、診断、予後判定またはセラノーシスを提供することを含むことができる。したがって、アプタマープロフィールは、試料が採取された対象に関する診断、予後判定および/またはセラノーシス用の読み出し情報を提供することができる。
もう一つの態様において、アプタマープロフィールは、アプタマー分子のプールを試験試料と接触させ、同じアプタマープールを対照試料と接触させ、試験試料中の成分または標的に示差的に結合するが、対照試料中の成分または標的には示差的に結合しない（またはその反対）1種または複数種のアプタマー分子を同定することにより、試験試料に関して決定される。生物学的試験試料または対照試料に関して使用される「成分」または「標的」は、アプタマーが結合することができる、試料中に存在する任意のものであることができる（たとえばポリペプチド、ペプチド、核酸分子、糖質、脂質など）。たとえば、試料が血漿または血清試料であるならば、アプタマー分子は、無疾患対象に比べて疾患状態においてのみ発現する、または示差的に発現（過剰または過少発現）するポリペプチドバイオマーカーに結合し得る。試験試料中のアプタマープロフィールと対照試料中のアプタマープロフィールとの比較は、アプタマー結合の定性的および定量的尺度に基づき得る（たとえば、結合と非結合または試験試料中の結合レベルと参照対照試料中の異なる結合レベル）。
ある局面において、本発明は、生物学的試験試料をアプタマー分子のプールと接触させる工程、プールを対照生物学的試料と接触させる工程、前記試験試料中の成分に結合するが、対照試料には結合しない1種または複数種のアプタマーを同定し、それにより、前記生物学的試験試料のアプタマープロフィールを同定する工程を含む、標的特異的アプタマープロフィールを同定する方法を提供する。ある態様において、アプタマーのプールは、疾患試料に対して選択され、参照試料と比較され、疾患試料中の成分に結合するが、参照試料中の成分には結合しないサブセット中のアプタマーを従来の配列決定技術によって配列決定して、結合するサブセットを同定し、それにより、特定の疾患試料のアプタマープロフィールを同定することができる。このようにして、アプタマープロフィールは、スクリーニングされる他の試料中の疾患を検出するための個別化プラットフォームを提供する。さらには、適切な参照または対照試料を選択することにより、アプタマープロフィールは、試験試料が採取された対象に関する診断、予後判定および/またはセラノーシス用の読み出し情報を提供することができる。
関連の局面において、本発明は、（a）生物学的対照試料をオリゴヌクレオチドのプールと接触させる工程；（b）生物学的対照試料に結合しない、オリゴヌクレオチドのプールの第一のサブセットを単離する工程；（c）生物学的試験試料をオリゴヌクレオチドのプールの第一のサブセットと接触させる工程；および（d）生物学的試験試料に結合するオリゴヌクレオチドのプールの第二のサブセットを単離し、それにより、アプタマーのプールを選択する工程を含む、アプタマーのプールを選択する方法を提供する。オリゴヌクレオチドのプールは任意の数の所望の配列を含み得、たとえば、少なくとも10、102、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017、1018、1019個または少なくとも1020個のオリゴヌクレオチドが出発プール中に存在し得る。工程（a）〜（d）は、アプタマーのプールをさらに磨くために繰り返されてもよい。ある態様において、これらの工程は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19回または少なくとも20回繰り返される。
本明細書に記載されるように、生物学的試験試料および生物学的対照試料は微小胞を含み得る。ある態様において、生物学的試験試料および場合によっては生物学的対照試料は体液を含む。体液は、非限定的に、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（CSF）、痰、唾液、骨髄、滑液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー腺液、尿道球腺液、女性射精液、汗、糞便、体毛、涙液、嚢胞液、胸膜液、腹膜液、悪性流体、心膜液、リンパ液、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、月経分泌物、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌液、粘膜分泌液、水便、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液または他の洗浄液を含み得る。生物学的試験試料および場合によっては生物学的対照はまた、腫瘍試料、たとえば腫瘍または腫瘍組織由来の細胞を含み得る。他の態様において、生物学的試験試料および場合によっては生物学的対照試料は細胞培地を含む。諸態様において、生物学的試験試料は疾患試料を含み、生物学的対照試料は非疾患試料を含む。したがって、アプタマーのプールを使用して、疾患の診断、予後判定および/またはセラノーシス用の読み出し情報を提供し得る。
前記のように、本発明は、微小胞を評価するために使用することができる。微小胞は、複数の情報を含む一つの生物学的実体を提供するため、強力なバイオマーカーである。記載したような例の場合、小胞は、それぞれが相補的な情報を提供する複数の表面抗原を有することができる。癌マーカーおよび組織特異的マーカーを考えてみる。両マーカーが試料中に個々に存在するならば、たとえば両方が循環タンパク質または核酸であるならば、癌マーカーおよび組織特異的マーカーが同じ解剖学的部位に由来するかどうかを確かめることができない場合がある。しかし、癌マーカーおよび組織特異的マーカーの両方が一つの微小胞上の表面抗原であるならば、小胞そのものが二つのマーカーを連結し、かつ疾患（癌マーカーによって）および疾患の起源（組織特異的マーカーによって）の指示を提供する。さらに、小胞は、評価することができる任意の数の表面抗原およびペイロードを有することができる。したがって、本発明は、複数の細胞外微小胞を、ランダムに生成された結合物質のライブラリーと接触させる工程、細胞外微小胞の一つまたは複数の成分に対して親和性を有する結合物質のライブラリーのサブセットを同定する工程を含む、結合物質を同定する方法を提供する。結合物質は、アプタマー、抗体および/または本明細書に開示される、または当技術分野において公知である任意の他の有用なタイプの結合物質を含み得る。
関連の局面において、本発明は、（a）参照微小胞集団を、1種または複数種の微小胞表面マーカーに結合することができる複数のリガンドと接触させる工程、（b）複数の参照リガンドを単離する工程であって、複数の参照リガンドが、参照微小胞集団に対して親和性を有しない複数のリガンドのサブセットを含む、工程；（c）1種または複数種の試験微小胞を複数の参照リガンドと接触させる工程；および（d）複数の参照リガンドから、1種または複数種の試験微小胞上の表面マーカーと一緒に複合体を形成するリガンドのサブセットを同定し、それにより、複数の標的リガンドを同定する工程を含む、複数の標的リガンドを同定する方法を提供する。語「リガンド」は、別の化学的実体に結合してより大きな複合体を形成する分子または分子群を指すことができる。したがって、結合物質はリガンドを含む。複数のリガンドが、アプタマー、抗体および/または本明細書に記載される、または当技術分野において公知である他の有用な結合物質を含み得る。
本発明はさらに、上記方法を実施するための1種または複数種の試薬を含むキットを提供する。ある態様において、1種または複数種の試薬は、アプタマー、抗体および本明細書に記載される、または当技術分野において公知である他の有用な結合物質の一つまたは複数を含む潜在的結合物質のライブラリーを含む。
ネガティブおよびポジティブアプタマー選択
アプタマーは、結合物質に依存する数多くのタイプのアッセイを含む様々な生物学的アッセイにおいて使用することができる。たとえば、アプタマーは、免疫ベースアッセイにおいて抗体の代わりに、または抗体と共に使用することができる。本発明は、アッセイ工程を通じていかなる面（基体、チューブ、フィルター、ビーズ、他の抗原など）にも結合せず、関心対象の抗原に特異的に結合するアプタマーを同定するアプタマースクリーニング法を提供する。アッセイは、ネガティブ選択に依存して、最終アッセイの非標的抗原成分に結合するアプタマーを除去する。ネガティブ選択に続きポジティブ選択を実施して、所望の抗原に結合するアプタマーを同定する。
ある局面において、本発明は、（a）候補アプタマーのプールを一つまたは複数のアッセイ成分と接触させる工程であって、アッセイ成分が関心対象の標的を含まない、工程；（b）（a）において一つまたは複数のアッセイ成分に結合しない、候補アプタマーのプールのメンバーを回収する工程；（c）（b）において回収された候補アプタマーのプールのメンバーを、1種または複数種の交絡する標的の存在下、関心対象の標的と接触させる工程；および（d）工程（c）において関心対象の標的に結合する候補アプタマーを回収し、それにより、関心対象の標的に特異的なアプタマーを同定する工程を含む、関心対象の標的に特異的なアプタマーを同定する方法を提供する。本方法において、工程（a）および（b）は、非標的実体に結合するアプタマーを除去するためのネガティブ選択を提供する。逆に、工程（c）および（d）は、関心対象の標的に結合するが、他の交絡する標的、たとえば関心対象の標的を含む生物学的試料中に存在し得る他の抗原には結合しないアプタマーを同定することによるポジティブ選択を提供する。候補アプタマーのプールは、少なくとも10、102、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017、1018、1019または少なくとも1020の核酸配列を含み得る。方法を実施するための一つの例示的なアプローチが、実施例7において提供される。
いくつかの態様において、工程（a）〜（b）は任意選択である。他の態様において、工程（a）〜（b）は、工程（c）におけるポジティブ選択が実施される前に、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19回または少なくとも20回繰り返される。ポジティブ選択もまた、複数のラウンドで実施することができる。工程（c)〜(d）は、関心対象の標的に特異的なアプタマーを同定する前に、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19回または少なくとも20回繰り返すことができる。複数のラウンドが改善された選択のストリンジェンシーを提供し得る。
いくつかの態様において、ネガティブ選択中にアプタマープールと接触させる一つまたは複数のアッセイ成分は、基体、ビーズ、平面アレイ、カラム、チューブ、ウェルまたはフィルターの一つまたは複数を含む。当業者は、アッセイ成分が、生物学的アッセイの一部であり得る任意の物質を含むことができることを理解するであろう。
関心対象の標的は、アプタマーによって認識されたとき検出することができる任意の適切な実体であることができる。ある態様において、関心対象の標的はタンパク質またはポリペプチドを含む。本明細書において使用される「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、別段述べられない限り、互換可能に使用される。関心対象の標的は、DNA、RNAおよび本明細書に開示される、または当技術分野において公知であるようなそれらのいずれかの様々な亜種を含む核酸であることができる。関心対象の標的は脂質を含むことができる。関心対象の標的は糖質を含むことができる。関心対象の標的はまた、複合体、たとえばタンパク質、核酸、脂質および/または糖質を含む複合体であることができる。いくつかの態様において、関心対象の標的は微小胞を含む。そのような場合、アプタマーは、微小胞表面抗原、たとえばタンパク質への結合物質であることができる。一般的な微小胞表面抗原は、テトラスパニン、CD9、CD63、CD81、CD63、CD9、CD81、CD82、CD37、CD53、Rab-5b、アネキシンVおよびMFG-E8を含む。さらなる一般的な微小胞表面抗原が本明細書の表3に提供されている。
微小胞表面抗原はまた、疾患または障害のバイオマーカーであることができる。そのような場合、アプタマーを使用して、疾患または障害の診断、予後判定またはセラノーシスを提供し得る。たとえば、一つまたは複数のタンパク質は、PSMA、PCSA、B7H3、EpCam、ADAM-10、BCNP、EGFR、IL1B、KLK2、MMP7、p53、PBP、SERPINB3、SPDEF、SSX2およびSSX4の一つまたは複数を含み得る。これらのマーカーは、前立腺癌を検出するために使用することができる。さらなる微小胞表面抗原が本明細書の表3〜4に提供されている。
1種または複数種の交絡する標的は、関心対象の標的以外の抗原であることができる。たとえば、交絡する標的は、アッセイされる試料中に存在し得る別の実体であることができる。非限定的な例として、評価される試料が個体由来の血漿試料である例を考えてみる。関心対象の標的は、試料中に存在するタンパク質、たとえば微小胞表面抗原であり得る。この場合、交絡する標的は、血漿試料中に存在する可能性が高い任意の他の抗原から選択することもできる。したがって、ポジティブ選択は、関心対象の標的を認識するが交絡する標的とはするとしても最小限しか相互作用しない、候補アプタマーを提供するであろう。いくつかの態様において、関心対象の標的および1種または複数種の交絡する標的は、同じタイプの生物学的実体、たとえばすべてのタンパク質、すべての核酸、すべての糖質またはすべて脂質を含む。非限定的な例として、関心対象の標的は、SSX4、SSX2、PBP、KLK2、SPDEFおよびEpCAMからなる群より選択されるタンパク質であることができ、1種または複数種の交絡する標的はこの群の他のメンバーを含む。他の態様において、関心対象の標的および1種または複数種の交絡する標的は、様々なタイプの生物学的実体、たとえばタンパク質、核酸、糖質および脂質の任意の組み合わせを含む。1種または複数種の交絡する標的もまた、様々なタイプの生物学的実体、たとえばタンパク質、核酸、糖質および脂質の任意の組み合わせを含み得る。
ある態様において、本発明は、上記方法によって同定された単離されたポリヌクレオチドまたはその断片を提供する。本発明はさらに、上記方法によって同定されたヌクレオチド配列と少なくとも60％同一であるヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチドを提供する。より好ましくは、単離された核酸分子は、上記方法によって同定されたヌクレオチド配列と少なくとも65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはより多く同一である。参照配列、たとえば上記方法によって同定された配列よりも長い、または長さがそれに等しい単離されたポリヌクレオチドの場合、比較は、参照配列の完全長とで実施される。単離されたポリヌクレオチドが参照配列よりも短い、たとえば上記方法によって同定された配列よりも短い場合、比較は、参照配列のうち同じ長さのセグメント（相同性算出によって求められる任意のループは除外する）に対して実施される。
関連の局面において、本発明は、（a）アプタマーのプールを、第一の試料由来の微小胞の集団と接触させる工程；（b）第一の試料由来の微小胞の集団に対して親和性を示すアプタマーのサブプールを富化する工程；（c）サブプールを、第二の試料由来の微小胞の第二の集団と接触させる工程；および（d）第二の試料由来の微小胞の第二の集団に対して親和性を示すアプタマーの第二のサブプールを枯渇させ、それにより、第一の試料由来の微小胞の集団に対して優先的親和性を有するアプタマーの群を選択する工程を含む、アプタマーの群を選択する方法を提供する。
第一の試料および/または第二の試料は、本明細書に開示されるような生物学的流体を含み得る。たとえば、生物学的流体は、非限定的に、血液、血液由来物、血漿、血清または尿を含み得る。第一の試料および/または第二の試料はまた、細胞培養物由来であってもよい。
ある態様において、第一の試料は癌試料を含み、第二の試料は対照試料、たとえば非癌試料を含む。第一の試料および/または第二の試料はそれぞれプールされた試料を含み得る。たとえば、第一の試料および/または第二の試料は、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100人、または100人より多くの個体からの体液を含むことができる。そのような場合、プールのメンバーは、所望の表現型を代表するように選択され得る。非限定的な例において、第一の試料プールのメンバーは癌患者由来であり得、第二の試料プールのメンバーは非癌対照由来であり得る。
工程（a）〜（d）は、第一の試料由来の微小胞の集団に対して優先的親和性を有するアプタマーでプールをさらに富化するために所望の回数、繰り返すことができる。たとえば、工程（a）〜（d）は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20回、または20回より多く繰り返すことができる。工程（d）からの産出物を、繰り返される工程（a）への投入物として使用することができる。態様において、工程（a）〜（d）を繰り返す前に、第一の試料および/または第二の試料を異なる試料と交換する。非限定的な例において、第一の試料プールのメンバーは癌患者由来であり得、第二の試料プールのメンバーは非癌対照由来であり得る。工程（a）〜（d）の後続の反復中、第一の試料プールは、それ以前のラウンドとは異なる癌患者由来の試料を含み得る。同様に、第二の試料プールは、それ以前のラウンドとは異なる対照由来の試料を含み得る。
方法は、選択されたアプタマー群のメンバーを、たとえばDNA配列決定によって同定する工程をさらに含み得る。配列決定は、所望により、次世代配列決定によって実施されてもよい。
方法はまた、選択されたアプタマー群の標的を同定する工程を含み得る。アプタマー標的を同定する方法は本明細書に開示されている。
アプタマー標的同定
上記方法およびキットは、二つのバイオマーカー集団を区別する結合物質を同定するために使用することができる。本発明はさらに、この項に記載されるように、結合物質の標的を同定する方法を提供する。たとえば、方法は、結合物質によって認識される標的微小胞の表面マーカーを同定する工程をさらに含み得る。
ある態様において、本発明は、（a）標的を結合物質と結合させるために結合物質を標的と接触させる工程であって、標的が微小胞の表面抗原を含む、工程；（b）標的と結合物質との結合を分断しない条件下で、微小胞を分断する工程；（c）標的と結合物質との複合体を単離する工程；および（d）結合物質によって結合した標的を同定する工程を含む、結合物質の標的を同定する方法を提供する。結合物質は、上記方法によって同定された結合物質、たとえばアプタマー、リガンド、抗体または二つのバイオマーカー集団を区別することができる他の有用な結合物質であることができる。
方法を実施するための例示的模式図が図9に示されている。図は、基体901につながれた結合物質902、ここでは例としてアプタマーを示す。結合物質902は基体901に共有結合していることができる。結合物質902はまた、非共有結合的に結合していてもよい。たとえば、結合物質902は、基体に引き寄せることができる標識、たとえば基体に共有結合しているアビジン/ストレプトアビジン分子と一緒に複合体を形成することができるビオチン基を含むことができる。これにより、溶液中にある間にアプタマーと微小胞との間で複合体を形成させることができ、その後、ビオチン標識を使用してアプタマーが捕捉される。結合物質902は微小胞904の表面抗原903に結合する。矢印（i）によって示される工程において、微小胞は分断されるが、一方で、結合物質902と表面抗原903との複合体は無傷のまま残る。分断された微小胞905は、矢印（ii）によって示される工程において、たとえば洗浄またはバッファ交換によって除去される。矢印（iii）によって示される工程において、表面抗原903が結合物質902から解放される。本明細書に開示される、および/または当技術分野において公知である方法を使用して表面抗原903を分析してその正体を決定することができる。方法の標的は、微小胞と結合した任意の有用な生物学的実体であることができる。たとえば、標的は、タンパク質、核酸、脂質もしくは糖質または本明細書に開示される、または当技術分野において公知である他の生物学的実体を含み得る。
方法のいくつかの態様において、微小胞を分断する前に、標的を結合物質と架橋させる。理論によって拘束されることなく、この工程は、微小胞が分断される間、結合物質と標的との複合体を維持することを支援し得る。本明細書に開示される、または当技術分野において公知である任意の有用な架橋法を使用することができる。諸態様において、架橋は、光架橋、イミドエステル架橋剤、ジメチルスベリミデート、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル架橋剤、ビススルホスクシンイミジルスベレート（BS3）、アルデヒド、アクロレイン、クロトンアルデヒド、ホルムアルデヒド、カルボジイミド架橋剤、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド（DDC）、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド（DIC）、1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩（EDCまたはEDAC）、スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル）シクロヘキサン-1-カルボキシレート（SMCC）、スルホスクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート（スルホ-SMCC）、スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミジル-2-(6-[ビオチンアミド]-2-(p-アジドベンズアミド)ヘキサノアミド)エチル-1,3'-ジチオプロピオネート（スルホ-SBED）、2-[N2-(4-アジド-2,3,5,6-テトラフルオロベンゾイル)-N6-(6-ビオチンアミドカプロイル)-L-リジニル]エチルメタンチオスルホネート（Mts-Atf-ビオチン；Thermo Fisher Scientific Inc, Rockford IL.から市販）、2-{N2-[N6-(4-アジド-2,3,5,6-テトラフルオロベンゾイル-6-アミノカプロイル)-N6-(6-ビオチンアミドカプロイル)-L-リジニルアミド]}エチルメタンチオスルホネート（Mts-Atf-LC-ビオチン；Thermo Fisher Scientific Incから市販）、光反応性アミノ酸（たとえばL-フォトロイシンおよびL-フォトメチオニン、たとえば、Suchanek, M., et al. (2005). Photo-leucine and photo-methionine allow identification of protein-protein interactions. Nat. Methods 2:261-267を参照）、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）架橋剤、NHS−アジド試薬（たとえばNHS−アジド、NHS-PEG4-アジド、NHS-PEG12-アジド；いずれもThermo Fisher Scientific, Inc.から市販）、NHS-ホスフィン試薬（たとえばNHS-ホスフィン、スルホ-NHS-ホスフィン；いずれもThermo Fisher Scientific, Inc.から市販）またはそれらの任意の組み合わせもしくは変形を含む。
微小胞を分断するために多様な方法を使用することができる。たとえば、微小胞膜は、機械的力、化学物質またはそれらの組み合わせを使用して分断することができる。諸態様において、微小胞の分断は、洗浄剤、界面活性剤、溶媒、酵素またはそれらの任意の有用な組み合わせの一つ又は複数の使用を含む。酵素は、リゾチーム、リソスタフィン、ザイモラーゼ、セルラーゼ、ムタノリシン、グリカナーゼ、プロテアーゼおよびマンナーゼの一つまたは複数を含み得る。洗浄剤または界面活性剤は、オクチルチオグルコシド（OTG）、オクチルβ-グルコシド（OG）、非イオン洗浄剤、Triton X、Tween 20、脂肪アルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、セトステアリルアルコール、オレイルアルコール、ポリオキシエチレングリコールアルキルエーテル（Brij）、オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノドデシルエーテル、ポリオキシプロピレングリコールアルキルエーテル、グルコシドアルキルエーテル、デシルグルコシド、ラウリルグルコシド、オクチルグルコシド、ポリオキシエチレングリコールオクチルフェノールエーテル、ポリオキシエチレングリコールアルキルフェノールエーテル、ノノキシノール-9、グリセロールアルキルエステル、グリセリルラウレート、ポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル、ポリソルベート、ソルビタンアルキルエステル、コカミドMEA、コカミドDEA、ドデシルジメチルアミンオキシド、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのブロックコポリマー、ポロキサマー、ポリエトキシ化獣脂アミン（POEA）、両性イオン洗浄剤、3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホネート（CHAPS）、直鎖アルキルベンゼンスルホネート（LAS）、アルキルフェノールエトキシレート（APE）、コカミドプロピルヒドロキシスルタイン、ベタイン、コカミドプロピルベタイン、レシチン、イオン洗浄剤、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、臭化セトリモニウム（CTAB）、塩化セチルトリメチルアンモニウム（CTAC）、オクテニジン二塩酸塩、塩化セチルピリジニウム（CPC）、塩化ベンザルコニウム（BAC）、塩化ベンゼトニウム（BZT）、5-ブロモ-5-ニトロ-1,3-ジオキサン、塩化ジメチルジオクタデシルジメチルアンモニウム、臭化ジオクタデシルジメチルアンモニウム（DODAB）、デオキシコール酸ナトリウム、ノニルフェノキシポリエトキシエタノール（TergitolタイプNP-40；NP-40）、ラウリル硫酸アンモニウム、ラウレス硫酸ナトリウム（ラウリルエーテル硫酸ナトリウム（SLES））、ミレス硫酸ナトリウム、アルキルカルボキシレート、ステアリン酸ナトリウム、ラウロイルサルコシン酸ナトリウム、カルボキシレート系フッ素系界面活性剤、ペルフルオロノナノエート、ペルフルオロオクタノエート（PFOAまたはPFO）およびバイオサーファクタントの一つまたは複数を含み得る。使用することができる機械的分断法は、非限定的に、機械的剪断、ビーズミリング、ホモジネーション、マイクロ流体化、音波処理、フレンチプレス、衝突、コロイドミル、減圧、浸透圧性ショック、加熱分解、凍結融解、乾燥またはそれらの任意の組み合わせを含む。
図9に示すように、結合物質は基体につながれてもよい。結合物質は、結合物質と標的との複合体が形成される前または形成された後でつなぐことができる。基体は、本明細書に開示される、または当技術分野において公知であるような任意の有用な基体であることができる。ある態様において、基体はミクロスフェアを含む。もう一つの態様において、基体は平面基体を含む。結合物質はまた、標識されることもできる。標的と結合物質との複合体を単離する工程は、標識を介して結合物質を捕捉する工程を含み得る。たとえば、標識はビオチン標識であることができる。そのような場合、結合物質は、ビオチン−アビジン結合イベントによって基体に取り付けることができる。
結合物質からの解放ののち標的を同定する方法は関心対象の標的のタイプに依存する。たとえば、標的がタンパク質を含む場合、標的を同定する工程は、質量分析法（MS）、ペプチドマスフィンガープリンティング法（PMF；タンパク質フィンガープリンティング法）、配列決定法、N末端アミノ酸分析法、C末端アミノ酸分析法、エドマン分解法、クロマトグラフィー法、電気泳動法、二次元ゲル電気泳動法（2Dゲル）、抗体アレイおよびイムノアッセイ法の使用を含み得る。核酸は、配列決定法によって同定することができる。
当業者は、この方法を使用して、小胞と結合していないものを含む任意の適切な標的を同定することができることを理解するであろう。たとえば、図9に関連して、矢印（i）によって示される工程（すなわち、微小胞を分断する工程）を除くすべての工程は、循環する標的、たとえばタンパク質、核酸、脂質、糖質またはそれらの組み合わせに関して実施することもできる。
試料特徴決定
本発明のアプタマーは、生物学的試料を特徴決定するために使用することができる。たとえば、アプタマーを使用して、試料中のバイオマーカーに結合させることができる。結合したバイオマーカーの存在またはレベルは、例の特徴、たとえば試料に関連する疾患または障害の診断、予後判定またはセラノーシスを示すことができる。
ある局面において、本発明は、（a) 表8に記載のSEQ ID NO: 8〜21もしくはその可変配列；（b) 表11に記載のSEQ ID NO: 24〜43もしくはその可変配列；（c) SEQ ID NO: 44〜10527；（d) 表12に記載のSEQ ID NO: 10528〜10557もしくはその可変配列；または （e) 任意の前記配列の機能的断片のいずれかと、少なくとも約50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、または100％の相同性を有する核酸配列を含むアプタマーを提供する。関連する局面において、本発明は、（a）生物学的試験試料を本発明の1種または複数種のアプタマー、例えば、本段落におけるアプタマーおよびその改変物のいずれかと接触させる工程；（b）工程（a）において形成された、1種または複数種のアプタマーと、生物学的試験試料中の1種または複数種のアプタマーと結合した標的との複合体の存在またはレベルを検出する工程；（c）生物学的対照試料を1種または複数種のアプタマーと接触させる工程；（d）工程（c）において形成された、1種または複数種のアプタマーと、生物学的対照試料中の1種または複数種のアプタマーと結合した標的との複合体の存在またはレベルを検出する工程；および（e）工程（b）および（d）において検出された存在またはレベルを比較し、それにより、疾患または障害を特徴決定する工程を含む、疾患または障害を特徴決定する方法を提供する。
生物学的試験試料および生物学的対照試料はそれぞれ組織試料、細胞培養物または生物学的流体を含むことができる。いくつかの態様において、生物学的試験試料および生物学的対照試料は同じ試料タイプを含み、たとえば、いずれも組織試料である、またはいずれも流体試料である。他の態様においては、異なる試料タイプが試験試料および対照試料に使用されてもよい。たとえば、対照試料は、作り変えられた、または他のやり方で人造的な試料を含み得る。
生物学的流体は体液を含み得る。体液は、非限定的に、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（CSF）、痰、唾液、骨髄、滑液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー腺液もしくは尿道球腺液、女性射精液、汗、糞便、体毛、涙液、嚢胞液、胸膜液および腹膜液、心膜液、リンパ液、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、月経分泌物、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌液、粘膜分泌液、水便、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液、胚盤胞腔液または臍帯血の一つまたは複数を含み得る。いくつかの態様において、体液は血液、血清または血漿を含む。
生物学的流体は微小胞を含み得る。たとえば、生物学的流体は、組織、細胞培養物または試料中の細胞から放出された微小胞を含む体液であることができる。微小胞は循環微小胞であることができる。
1種または複数種のアプタマーは標的バイオマーカー、たとえば試料を特徴決定するのに有用なバイオマーカーに結合することができる。バイオマーカーは、ポリペプチドもしくはその断片または本明細書に記載される、または当技術分野において公知である他の有用なバイオマーカー（脂質、糖質、複合体、核酸など）を含み得る。諸態様において、ポリペプチドまたはその断片は可溶性または膜結合状態である。膜結合状態のポリペプチドは細胞表面抗原または微小胞表面抗原を含み得る。バイオマーカーは、表3または表4から選択されるバイオマーカーであることができる。
特徴決定は、疾患または障害の診断、予後判定またはセラノーシスを含むことができる。本発明の組成物および方法を使用して、非限定的に癌、前癌状態、炎症性疾患、免疫疾患、自己免疫疾患もしくは障害、心血管疾患もしくは障害、神経疾患もしくは障害、感染症および/または疼痛を含む様々な疾患および障害を特徴決定することができる。さらなる詳細に関しては、例えば、本明細書の「表現型」の項を参照すること。諸態様において、疾患または障害は増殖性または新生物性疾患または障害を含む。たとえば、疾患または障害は癌であることができる。いくつかの態様において、癌は、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、結腸直腸癌、黒色腫または脳癌を含む。
図16Aは、本発明の1種または複数種のアプタマーを使用して関心対象の標的を検出および/または定量するために使用することができるアッセイ構成を示す模式図1600である。捕捉アプタマー1602が基体1601に取り付けられている。基体は、平面基体、ウェル、マイクロビーズまたは本明細書に開示される、または当技術分野において公知であるような他の有用な基体であることができる。関心対象の標的1603が捕捉アプタマー1602と結合している。関心対象の標的は、アプタマーまたは他の結合物質によって認識されたとき検出されることができる任意の適切な実体であることができる。関心対象の標的はタンパク質もしくはポリペプチド、DNA、RNAおよびそれらの様々な亜種を含む核酸、脂質、糖質、複合体、たとえばタンパク質、核酸、脂質および/または糖質を含む複合体を含み得る。いくつかの態様において、関心対象の標的は微小胞を含む。標的の関心対象は微小胞表面抗原であることができる。関心対象の標的は、表3または4における小胞関連バイオマーカーを含むバイオマーカーであり得る。投入された微小胞は、本明細書に記載される様々な技術、たとえばクロマトグラフィー法、ろ過法、遠心分離法、フローサイトメトリー法、アフィニティー捕捉法（たとえば平面、カラムまたはビーズに対する）および/またはマイクロ流体工学を使用して試料から単離することができる。また、検出アプタマー1604が関心対象の標的1603に結合している。検出アプタマー1604は標識1605を有し、この標識を検出すると、捕捉アプタマー1602を介して基体1601に捕捉された標的を同定することができる。標識は、蛍光、放射性標識、酵素または本明細書に開示されるような他の検出可能な標識であることができる。捕捉アプタマー1602または検出アプタマー1604のいずれかが別の検出物質、たとえば抗体で置換されることができる。たとえば、標的は、抗体で捕捉され、アプタマーで検出されてもよいし、その逆であってもよい。関心対象の標的が複合体を含む場合、捕捉および検出物質（アプタマー、抗体など）は同じまたは異なる標的を認識することができる。たとえば、標的が微小胞であるとき、捕捉物質が一つの微小胞表面抗原を認識し得、一方で、検出物質が別の微小胞表面抗原を認識する。あるいはまた、捕捉物質および検出物質が同じ表面抗原を認識することもできる。
本発明のアプタマーは、DNAまたはRNAの形態で様々な目的のために同定および/または使用され得る。別段指定されない限り、当業者は、アプタマーが概して様々な形態の核酸に合成され得ることを理解するであろう。アプタマーはまた、様々な化学的修飾を有し得、本発明の範囲内にとどまり得る。
いくつかの態様において、本発明のアプタマーは、少なくとも一つの化学的修飾を含むように修飾されている。修飾は、非限定的に、糖位置の化学的置換；リン酸位置の化学的置換；および核酸の塩基位置の化学的置換を含み得る。いくつかの態様において、修飾は、ビオチン化、蛍光標識の組み込み、修飾されたヌクレオチドの組み込み、2'修飾ピリミジン、3'キャッピング、アミンリンカーへのコンジュゲート、非免疫原性の高分子量化合物へのコンジュゲート、親油性化合物へのコンジュゲート、薬物へのコンジュート、細胞障害性部分へのコンジュゲートおよび放射性同位体による標識または本明細書に開示される他の修飾からなる群から選択される。修飾の位置は、望みどおり変更することができる。たとえば、ビオチン化、蛍光標識または細胞障害性部分は、アプタマーの5'末端にコンジュゲートさせることができる。ビオチン化、蛍光標識または細胞障害性部分はまた、アプタマーの3'末端にコンジュゲートさせることもできる。
いくつかの態様において、細胞毒性部分はナノ粒子中に封入される。ナノ粒子は、リポソーム、デンドリマーおよび/または櫛型ポリマーからなる群から選択することができる。他の態様において、細胞障害性部分は小分子細胞障害性部分を含む。小分子細胞障害性部分は、非限定的に、ビンブラスチンヒドラジド、カリケアマイシン、ビンカアルカロイド、クリプトフィシン、チューブリシン、ドラスタチン10、ドラスタチン15、アウリスタチンE、リゾキシン、エポチロンB、エピチロンD、タキソイド、マイタンシノイドならびにそれらの任意の変異体および誘導体を含むことができる。さらに他の態様において、細胞障害性部分はタンパク質毒素を含む。たとえば、タンパク質毒素は、ジフテリア毒素、リシン、アブリン、ゲロニンおよびシュードモナス外毒素Aからなる群から選択することができる。本発明と共に使用するための非免疫原性の高分子量化合物は、ポリアルキレングリコール類、たとえばポリエチレングリコールを含む。適切な放射性同位体は、イットリウム90、インジウム111、ヨウ素131、ルテチウム177、銅67、レニウム186、レニウム188、ビスマス212、ビスマス213、アスタチン211およびアクチニウム225を含む。アプタマーは、γ線放出性放射性同位体で標識されてもよい。
本発明のいくつかの態様においては、有効物質がアプタマーにコンジュゲートされる。たとえば、有効物質は治療物質または診断物質であり得る。治療物質は、チロシンキナーゼ阻害剤、キナーゼ阻害剤、生物学的有効物質、生物学的分子、放射性核種、アドリアマイシン、アンサマイシン抗生物質、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、ブスルファン、シスプラチン、カルボプラチン、カルムスチン、カペシタビン、クロラムブシル、シタラビン、シクロホスファミド、カンプトテシン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デクスラゾキサン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エトポシド、エポチロン、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イフォスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルカプトプリン、メルファラン、メトトレキサート、ラパマイシン（シロリムス）、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニトロソウレア、パクリタキセル、パミドロネート、ペントスタチン、プリカマイシン、プロカルバジン、リツキシマブ、ストレプトゾシン、テニポシド、チオグアニン、チオテパ、タキサン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、タキソール、コンブレタスタチン、ディスコルデモリド、トランスプラチナ（transplatinum）、抗血管内皮成長因子化合物（「抗VEGF」）、抗上皮細胞増殖因子受容体化合物（「抗EGFR」）、5-フルオロウラシルおよび誘導体、放射性核種、ポリペプチド毒素、アポトーシス誘導物質、治療感作物質、酵素またはその活性断片およびそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。
試料を特徴決定するためのオリゴヌクレオチドプール
生物学に存在する複雑性および不均一さが生物学的システムおよび疾患の理解力を試す。様々なレベルで、たとえば細胞、組織、個体および疾患状態の中および間で多様性が存在する。たとえば図13Aを参照すること。図13Bは、そのような試料を特徴決定するために評価することができる様々な生物学的実体を概観する。図に示すように、評価がDNAからRNA、タンパク質、そして最後にタンパク質複合体へと移るにつれ、多様性および複雑性の量は劇的に増す。本発明のオリゴヌクレオチドプローブライブラリー法は、複雑な生物学的ソース、たとえば組織試料、細胞、循環腫瘍細胞、微小胞および複合体、たとえばタンパク質およびタンパク脂質複合体を特徴決定するために使用することができる。
生物学的試料を特徴決定するための現在の方法は、そのような複雑性および多様性に十分に対処し得ない。図13Cに示すように、そのような現在の方法は、多くの場合、多様性の計測と複雑性の計測との間で妥協を強いられる。一例として、ハイスループット配列決定技術を考えてみる。次世代手法は、一つのアッセイで幾千もの分子標的を調べる場合もある。しかし、そのような手法は、個々のDNAおよび/またはRNA分子をプロービングするだけであり、したがって、タンパク質および生物学的複合体の大きな多様性を見逃してしまう。他方、フローサイトメトリーは生物学的複合体をプロービングすることができるが、小数の既定のリガンドに限られる。たとえば、一つのアッセイは、既定の標的に対する一握りの示差的に標識された抗体しかプロービングすることができない。
本発明のオリゴヌクレオチドプローブライブラリーは、現在の生物学的検出技術に伴う上記難題を解決することができる。出発ライブラリーのサイズは、ライブラリーメンバーと同じ数の様々な実体を計測するように調節することができる。この実施例において、初期のトレーニングされていないオリゴヌクレオチドライブラリーは、1012またはより多くの生物学的特徴を計測する能力を有する。所望により、より大きい、および/または異なるライブラリーを構築することができる。この技術は、何が「異なるはずである」という仮定なしで、試料間の違いを見いだすように適合されている。たとえば、プローブライブラリーは、個々のタンパク質、タンパク質変性、タンパク質複合体、脂質、核酸、様々なフォールドまたはコンフォメーションまたは関心対象の試料を区別するものに基づいて区別し得る。したがって、方法は、様々な関心対象集団を同定するために使用することができる生物学的試料中の差を同定するための不偏の手法を提供する。
様々な構造および複合体にある任意の数のバイオマーカーを含み得る表面を有する微小胞に関連して、試料を評価するためのオリゴヌクレオチドライブラリープローブの使用は、トポロジカルオリゴヌクレオチドプロファイリング：TOP（商標）と呼ばれることができる。前記のように、用語「アプタマー」および用語「オリゴヌクレオチド」は本明細書に中では一般に互換可能に使用され、「典型的な」個々のアプタマーとTOPプローブとの間のいくつかの違いは以下のとおりである。個々のアプタマーは、抗体様「キー・イン・ロック」結合モードで公知の特異標的に結合するように選択された個々のオリゴヌクレオチドを含み得る。個々のアプタマーは、所期の標的への特異性および結合アフィニティーに基づいて個々に評価され得る。しかし、TOPプローブは、マルチプローブシグネチャーを生成することを意図したオリゴヌクレオチドのライブラリーを含み得る。TOPプローブは数多くの潜在的な結合様式（静電気、疎水性、ワトソン−クリック、マルチオリゴ複合体など）を含む。TOPプローブシグネチャーは、不均一な患者亜集団を同定する能力を有する。たとえば、本明細書の中で実証されるように、一つのTOPプローブライブラリーをアセンブルして複数の疾患状態を区別することができる。典型的なシングルアプタマーとは違って、結合標的は、単離または同定されてもよいし、またはされなくてもよい。個々のアプタマーを同定するスクリーニング法、たとえばSELEXを使用して、オリゴヌクレオチドのナイーブライブラリーを富化してTOPプローブライブラリーを同定することもできることが理解されよう。
本発明の概略的な方法が図13Dに概説されている。方法への一つの投入物は、1012またはより多くの生物学的特徴を計測する能力を有するランダム化オリゴヌクレオチドライブラリーを含む。この図に概説されるように、方法は、二つの投入試料タイプの間で異なる所望の数（たとえば約105〜106）を同定する。ランダム化オリゴヌクレオチドライブラリーを第一および第二の試料タイプと接触させ、各試料に結合するオリゴヌクレオチドを同定する。結合したオリゴヌクレオチド集団を比較し、一方または他方の生物学的投入試料に特異的に結合するオリゴヌクレオチドをオリゴヌクレオチドプローブライブラリーのために保持し、一方で、両方の生物学的投入試料に結合するオリゴヌクレオチドを捨てる。そして、このトレーニングされたオリゴヌクレオチドプローブライブラリーを新たな試験試料と接触させることができ、試験試料に結合するオリゴヌクレオチドの正体を決定する。結合したオリゴヌクレオチドのプロファイルに基づいて試験試料を特徴決定する。たとえば図13Hを参照すること。
細胞外小胞が、多くの相関するソースによって駆動される生物学的複雑性および多様性をプロファイリングするための魅力的な手段を提供する。患者微小胞集団の間には、または様々な条件下（たとえばストレス、食事、運動、休息、疾患など）の一人の患者由来の微小胞集団の中でさえ、多大な不均一性があることができる。様々な疾患状態における微小胞集団内の分子表現型の多様性は、小胞バイオマーカーによる微小胞単離および分別の後でさえ、表面結合リガンドを同定する難題を呈することができる。この状況は、小胞表面−膜タンパク質複合体によってさらに複雑化する。オリゴヌクレオチドプローブライブラリーを使用してそのような難題に対処し、生物学的表現型の特徴決定を可能にすることができる。手法は、多様なオリゴヌクレオチドライブラリーの力とハイスループット（次世代）配列決定技術とを組み合わせて、細胞外微小胞の複雑性をプロービングする。図13Eを参照すること。
TOP（商標）プロファイリングは、試料中の様々なバイオマーカーの有無の検出に加えて、動的イベントの定量的計測を提供し得る。たとえば、結合プローブは、タンパク質複合体または他の翻訳後修飾を検出して、同じタンパク質を有するが生物学的構成が異なる試料の区別を可能にし得る。そのような構成が図13F〜Gに示されている。図13Fには、例示的微小胞試料集団：試料集団Aからの様々な表面マーカーを有する微小胞が示されている。図示される結合プロービングオリゴヌクレオチド1301を所与の空間的関係で二つの表面マーカー1302および1303と接触させる。ここで、これらの機能性複合体および空間的関係に特有のプローブを保持し得る。対照的に、図13Fに示された微小球試料集団Bにおいては、二つの表面マーカー1302および1303が異なる空間的関係において見られる。ここでは、相互作用成分1302および1303の空間的関係の非存在により、プローブ1301は結合していない。
TOP（商標）プロファイリングを使用して試料を評価するための例示的手法1310が図13Hに示されている。プロービングライブラリー1311を試料1312と混合する。試料は、本明細書に記載されるようなもの、たとえば、疾患を有する、または有することが疑われる対象からの体液であることができる。プローブを試料に結合させ（1313）、微小胞をペレット化する（1315）。非結合オリゴヌクレオチドを含む上清1314を捨てる。ペレット1315に結合したオリゴヌクレオチドプローブを溶出させ（1316）、配列決定する（1317）。配列決定1317によって決定された、結合したオリゴヌクレオチドプローブによって生成されたプロファイル1318を使用して試料1312を特徴決定する。たとえば、プロファイル1318を参照と比較して、たとえば、プロファイルが、疾患または健康な状態もしくは関心対象の他の表現型特徴決定を示す参照プロファイルと類似しているか、異なるかを決定することができる。比較は、疾患の存在を示し得、診断、予後判定またはセラノーシスを提供し得る、あるいは試料1312と関連する表現型を他のやり方で特徴決定し得る。図13Iは、TOP（商標）プロファイリングを使用して表現型を特徴決定するためのもう一つの模式図を示す。患者試料、たとえば本明細書に開示される体液を捕集する（1321）。試料をTOP（商標）ライブラリープールと接触させる（1322）。接触させた試料から、たとえば超遠心分離、ろ過、ポリマー沈殿または本明細書に開示される他の適切な技術もしくは技術の組み合わせを使用して、微小胞（MV）を単離する（1323）。単離された微小胞に結合したオリゴヌクレオチドを捕集し、その正体を決定する（1324）。結合したオリゴヌクレオチドの正体は、任意の有用な技術、たとえば配列決定、ハイスループット配列決定（たとえばNGS）、増幅、たとえば非限定的にqPCRまたは平面もしくは粒子ベースのアレイなどへのハイブリダイゼーションによって決定することができる。結合したオリゴヌクレオチドの正体を使用して、試料を、たとえば疾患関連の微小胞を含有するものとして特徴決定する。
ある局面において、本発明は、試料を様々なオリゴヌクレオチドのプール（例えばアプタマープール）と接触させ、プール中の様々なオリゴヌクレオチドが試料に結合する頻度を測定することによって、試料を特徴決定する方法を提供する。たとえば、非癌患者由来の微小胞に比べて癌患者由来の微小胞に優先的に結合するオリゴヌクレオチドのプールを同定する。たとえば癌を有することが疑われる患者由来の試験試料を捕集し、オリゴヌクレオチドのプールと接触させる。試験試料に結合するオリゴヌクレオチドを試験試料から溶離させ、捕集し、同定し、結合したオリゴヌクレオチドの組成を、癌試料に結合することが知られているものと比較する。溶離したオリゴヌクレオチドを同定するために、様々な配列決定、増幅およびハイブリダイゼーション技術を使用することができる。例えば、大きなオリゴヌクレオチドプールが使用される場合、オリゴヌクレオチド同定は、次世代配列決定法などのハイスループット法によってまたはハイブリダイゼーションを介して実施することができる。試験試料がオリゴヌクレオチドプールによって同様なやり方で癌患者由来の微小胞に結合しているならば（たとえばバイオインフォマティックス分類法によって判定）、試料は同じく癌を示す。この方法を使用すると、オリゴヌクレオチドプールの各メンバーの正確な標的を必ずしも知ることなく、1種または複数種の微小胞抗原に結合するオリゴヌクレオチドプールを使用して試料を特徴決定することができる。本明細書の実施例19〜20は本発明の態様を示す。
ある局面において、本発明は、微小胞試料を、前記微小胞試料中に存在する1種または複数種の標的に結合することができる複数のオリゴヌクレオチドと接触させる工程、試料と一緒に複合体を形成するオリゴヌクレオチドのセットを同定する工程であって、ここで、該セットが、試料の状態を特徴決定することが事前に確認されており、それにより試料の状態を特徴決定する、工程を含む、試験試料の状態を特徴決定する方法を提供する。
関連の局面において、本発明は、（a）微小胞試料を複数のオリゴヌクレオチドと接触させ、微小胞試料と一緒に複合体を形成するオリゴヌクレオチドのセットを単離する工程、（b）オリゴヌクレオチドそれぞれの配列および/またはコピー数を決定し、それにより、試験試料と結合したオリゴヌクレオチドのセットを同定する工程を含む、試験試料と結合したオリゴヌクレオチドのセットを同定する方法を提供する。
さらに別の関連の局面において、本発明は、微小胞試料を、非癌試料由来の微小胞に比べて癌試料由来の微小胞と一緒に優先的に複合体を形成することが事前に確認されている複数のオリゴヌクレオチドと接触させる工程を含む、試料を癌性試料または癌の素因を有する試料として診断する方法を提供する。
オリゴヌクレオチドは、配列決定法、たとえばダイターミネーター（Sanger）配列決定法またはハイスループット法によって同定することができる。ハイスループット法は、次世代技術、たとえばMPSS（Massively parallel signature sequencing）法；Polony配列決定法；454パイロ配列決定法；Illumina（Solexa）配列決定法；SOLiD配列決定法；イオントレント半導体配列決定法；DNAナノボール配列決定法；Heliscope単分子配列決定法；単分子リアルタイム（SMRT）配列決定法または他の方法、たとえばナノポアDNA配列決定法；トンネル電流DNA配列決定法；ハイブリダイゼーションによる配列決定法；質量分析による配列決定法；マイクロ流体Sanger配列決定法；顕微鏡ベースの技術；RNAP配列決定法；インビトロウイルスハイスループット配列決定法を含む、多数の核酸を高速で配列決定するための技術を含むことができる。オリゴヌクレオチドはまた、ハイブリダイゼーション技術によって同定され得る。たとえば、プールの様々なメンバーとハイブリダイズし、それにより、プールの様々なメンバーを検出するためのアドレス指定可能な場所を有するマイクロアレイを使用することができる。
複数またはプールのオリゴヌクレオチドは、試料の特徴決定を可能にするための任意の所望の数のオリゴヌクレオチドを含むことができる。様々な態様において、プールは、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000または少なくとも10000個の異なるオリゴヌクレオチドメンバーを含む。
複数のオリゴヌクレオチドは、一段階または複数段階のポジティブ選択またはネガティブ選択を通して事前に選択することができ、ここで、ポジティブ選択は、試験試料に比べて実質的に類似した特徴を有する試料に対するオリゴヌクレオチドの選択を含み、およびネガティブ選択は、試験試料に比べて実質的に異なる特徴を有する試料に対するオリゴヌクレオチドの選択を含む。実質的に類似した特徴とは、ポジティブ選択に使用される試料が関心対象の一つまたは複数の特徴において試験試料に典型的であることをいう。たとえば、ポジティブ選択に使用される試料は癌患者または細胞系由来であることができ、試験試料は、癌を有する、または癌を有することが疑われる患者由来の試料であることができる。実質的に異なる特徴とは、ネガティブ選択に使用される試料が関心対象の一つまたは複数の特徴において試料とは異なることをいう。たとえば、ネガティブ選択に使用される試料は、癌を有しない個体または細胞系由来であることができ（たとえば「正常」またはそうでなければ「対照」試料）、試験試料は、癌を有する、または癌を有することが疑われる患者由来の試料であることができる。癌は、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、結腸直腸癌、黒色腫、脳癌または他の癌であることができる。
検出および/または区別する所望の表現型に典型的な試料を選択することにより、特徴決定は、任意の数の疾患または障害の診断、予後判定またはセラノーシスを含むことができる。本発明の組成物および方法を使用して、非限定的に癌、前癌状態、炎症性疾患、免疫疾患、自己免疫疾患もしくは障害、心血管疾患もしくは障害、神経疾患もしくは障害、感染症および/または疼痛を含む様々な疾患および障害を特徴決定することができる。さらなる詳細に関しては、例えば、本明細書の「表現型」の項を参照すること。諸態様において、疾患または障害は増殖性または新生物性疾患または障害を含む。たとえば、疾患または障害は癌であることができる。いくつかの態様において、癌は、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、結腸直腸癌、黒色腫または脳癌を含む。
図16Bは、上記のような、試料の表現型を特徴決定するためのオリゴヌクレオチドプールの使用を示す模式図1610である。関心対象の標的に対するオリゴヌクレオチドのプールを提供する（1611）。たとえば、オリゴヌクレオチドのプールは、1種または複数種の微小胞に関して富化されることができる。プールのメンバーは、1種または複数種の微小胞上に存在する様々な標的（たとえば微小胞表面抗原）または同じ標的の様々なエピトープに結合し得る。プールを、特徴決定の対象となる試験試料と接触させる（1612）。たとえば、試験試料は、所与の疾患または障害を有する、または有することが疑われる個体由来の生物学的試料であり得る。混合物を洗浄して非結合オリゴヌクレオチドを除去する。残るオリゴヌクレオチドを試料から溶離させる、または他のやり方で分離させ、捕集する（1613）。捕集したオリゴヌクレオチドを、たとえば配列決定またはハイブリダイゼーションによって同定する（1614）。同定されたものの存在および/またはコピー数を使用して表現型を特徴決定する（1615）。たとえば、オリゴヌクレオチドのプールは、癌細胞から流出した微小胞を優先的に認識するオリゴヌクレオチドとして選択され得る。この方法を使用すると、試料が、癌関連微小胞に結合するオリゴヌクレオチドを保持するかどうかを検出し、それにより、試料を癌またはそうではないと特徴決定することができる。
図16Cは、図16Bの方法の具現化を示す模式図1620である。微小胞集団に結合するものと同定されたオリゴヌクレオチドのプールを提供する（1621）。投入試料は、微小胞を含む試験試料を含む（1622）。たとえば、試験試料は、所与の疾患または障害を有する、または有することが疑われる個体由来の生物学的試料であり得る。プールを、特徴決定の対象となる単離された微小胞と接触させる（1623）。微小胞集団は、接触1623の前または後に、本明細書に記載される様々な技術、たとえばクロマトグラフィー法、ろ過法、限外ろ過法、遠心分離法、超遠心分離法、フローサイトメトリー法、アフィニティー捕捉法（たとえば平面、カラムまたはビーズに対する）、ポリマー沈殿を用いて、および/またはマイクロ流体工学を使用して試料から単離することができる。混合物を洗浄して非結合オリゴヌクレオチドを除去し、残るオリゴヌクレオチドを試料から溶離させる、または他のやり方で分離させ、捕集する（1624）。捕集したオリゴヌクレオチドを同定し（1625）、保持されたオリゴヌクレオチドの存在および/またはコピー数を使用して、上記のように表現型を特徴決定する（1626）。
図16Cの態様に示されるように、オリゴヌクレオチドのプール1620を、微小胞を含む、または含むことが予想される生物学的試料と直接接触させる。その後、微小胞を試料から単離し、混合物を洗浄して非結合オリゴヌクレオチドを除去し、残るオリゴヌクレオチドを分離させ、捕集する（1624）。以後の工程は上記のように実施される。この代替構成の例として、生物学的試料、たとえば血液、血清または血漿試料をオリゴヌクレオチドのプールと直接接触させる。そして、非限定的に超遠心分離法、限外ろ過法、フローサイトメトリー法、アフィニティー単離法、ポリマー沈殿、クロマトグラフィー、それらの様々な組み合わせなどを含む、本明細書に開示される様々な技術によって微小胞を単離する。そして、残るオリゴヌクレオチドを、たとえば配列決定、ハイブリダイゼーションまたは増幅によって同定する。
関連の局面において、本発明は、表現型を特徴決定するためのオリゴヌクレオチドプールの使用を含む方法を実施するために使用することができる、複数のオリゴヌクレオチドを含む、組成物を提供する。複数のオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドのいずれかも含むことができる。
関連の局面において、本発明は、微小胞試料を用いて複数のオリゴヌクレオチドの、少なくとも1回の（i）ネガティブ選択または（ii）1回のポジティブ選択を実施する工程；オリゴヌクレオチドのセットを取得して、複数のオリゴヌクレオチドのネガティブ結合物質サブセットまたはポジティブ結合物質サブセットを提供する工程であって、複数のオリゴヌクレオチドのネガティブ結合物質サブセットが微小胞試料に結合せず、複数のオリゴヌクレオチドのポジティブ結合物質サブセットが微小胞試料に結合する、工程；ネガティブ結合物質サブセットまたはポジティブ結合物質サブセットを試験試料と接触させる工程；試験試料に結合したオリゴヌクレオチドを溶離させて、複数の溶離物オリゴヌクレオチドを提供する工程；および複数の溶離物オリゴヌクレオチドのハイスループット配列決定を実施して、複数の溶離物オリゴヌクレオチドのメンバーの配列および/またはコピー数を同定する工程を含む、ハイスループット配列決定を実施する方法を提供する。微小胞試料を使用する複数のオリゴヌクレオチドのネガティブ選択およびポジティブ選択は、本明細書に開示されるように実施することができる。複数の溶離物オリゴヌクレオチドのメンバーの配列および/またはコピー数によって明らかにされるオリゴヌクレオチドプロフィールは、本明細書に記載されるように試験試料の表現型を特徴決定するために使用することができる。
類似した局面において、本発明は、試験試料に特異的なオリゴヌクレオチドを同定する方法を提供する。方法は、（a）試料としての複数のオリゴヌクレオチドを富化して、標的試料と一緒に複合体を形成することが事前に確認されているオリゴヌクレオチドのセットを提供する工程；（b）オリゴヌクレオチドと試験試料との複合体の形成を可能にするために、（a）における複数を試験試料と接触させる工程；（c）（b）において複合体を形成したオリゴヌクレオチドを回収して、回収されたオリゴヌクレオチドのサブセットを提供する工程；および（d）回収されたオリゴヌクレオチドのサブセットをハイスループット配列決定またはハイブリダイゼーションによってプロファイリングし、それにより、試験試料に特異的なオリゴヌクレオチドを同定する工程を含む。試験試料は複数の微小胞を含み得る。オリゴヌクレオチドはRNA、DNAまたは両方を含み得る。いくつかの態様において、方法は、インフォマティクス解析を実施して、標的試料と一緒に複合体を形成することが事前に確認されているオリゴヌクレオチドと少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％または少なくとも99％の配列同一性を含むオリゴヌクレオチドのサブセットを同定する工程をさらに含む。
ある局面において、本発明は、SEQ ID NO: 10558に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同であるオリゴヌクレオチドを提供する。関連する局面において、本発明は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000、500000、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017または少なくとも1018個の異なるオリゴヌクレオチド配列を含み、各オリゴヌクレオチド配列またはその部分がSEQ ID NO: 10558に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である、複数のオリゴヌクレオチドを提供する。
もう一つの局面において、本発明は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000または500000個の異なるオリゴヌクレオチド配列を含み、各オリゴヌクレオチド配列またはその部分がSEQ ID NO: 10559〜510558から選択される配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である、複数のオリゴヌクレオチドを提供する。関連する局面において、本発明は、SEQ ID NO: 10559〜510558にリストされたオリゴヌクレオチドの少なくとも50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％または少なくとも99％を含む、オリゴヌクレオチドプローブライブラリーを提供する。
さらに別の局面において、本発明は、SEQ ID NO: 510559〜510578から選択される配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である核酸配列またはその部分を含む、オリゴヌクレオチドを提供する。関連する局面において、本発明は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個の異なるオリゴヌクレオチド配列を含み、各オリゴヌクレオチド配列またはその部分がSEQ ID NO: 510559〜510578に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である、複数のオリゴヌクレオチドを提供する。
さらに別の局面において、本発明は、SEQ ID NO: 510579〜510598から選択される配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である核酸配列またはその部分を含む、オリゴヌクレオチドを提供する。関連する局面において、本発明は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個の異なるオリゴヌクレオチド配列を含み、各オリゴヌクレオチド配列またはその部分がSEQ ID NO: 510579〜510598に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である、複数のオリゴヌクレオチドを提供する。
ある局面において、本発明は、SEQ ID NO: 510599〜510763から選択される配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である核酸配列またはその部分を含む、オリゴヌクレオチドを提供する。関連する局面において、本発明は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、125、130、140、150、160または165個の異なるオリゴヌクレオチド配列を含み、各オリゴヌクレオチド配列またはその部分がSEQ ID NO: 510599〜510763に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である、複数のオリゴヌクレオチドを提供する。さらに別の関連する局面において、本発明は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、125、130、140、150、160または165個の異なるオリゴヌクレオチド配列を含み、各オリゴヌクレオチド配列またはその部分が表16に列挙した配列番号に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である、複数のオリゴヌクレオチドを提供する。
ある局面において、本発明はまた、オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドを試料と接触させる工程および試料中の標的へのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドの結合の存在またはレベルを検出する工程を含み、オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが上記発明によって提供されるものであることができる方法を提供する。試料は、生物学的試料、有機試料、無機試料、組織、細胞培養物、体液、血液、血清、細胞、微小胞、タンパク質複合体、脂質複合体、糖質またはそれらの任意の組み合わせ、部分もしくは変種を含み得る。標的は、細胞、オルガネラ、タンパク質複合体、リポタンパク質、糖質、微小胞、膜断片、小分子、重金属、毒素または薬物を含み得る。
関連する局面において、本発明は、（a）微小胞を含む生物学的試料をオリゴヌクレオチドプローブライブラリーと接触させる工程であって、任意で、オリゴヌクレオチドプローブライブラリーが、上記発明によって提供されるオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドを含む、工程；（b）微小胞の少なくとも一部分に結合したオリゴヌクレオチドを同定する工程；および（c）同定されたオリゴヌクレオチドのプロファイルに基づいて試料を特徴決定する工程を含む、方法を提供する。
もう一つの局面において、本発明は、（a）溶解状態の混合物を形成するために、試料を、少なくとも106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017または少なくとも1018個の異なるオリゴヌクレオチド配列のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブライブラリーと接触させる工程であって、オリゴヌクレオチドが、試料中の複数の実体と結合して複合体を形成することができ、任意で、オリゴヌクレオチドプローブライブラリーが、上記発明によって提供されるオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドを含む、工程；（b）工程（a）で形成された複合体を混合物から分割する工程；および（c）試料に関するオリゴヌクレオチドプロファイルを同定するために、工程（b）で分割された複合体中に存在するオリゴヌクレオチドを検出する工程を含む、方法を提供する。ある態様において、検出する工程は、複合体中のすべてもしくはいくつかのオリゴヌクレオチドの配列決定、複合体中のすべてもしくはいくつかのオリゴヌクレオチドの増幅、および/または複合体中のすべてもしくはいくつかのオリゴヌクレオチドの、アレイへのハイブリダイゼーションを実施する工程を含む。アレイは、任意の有用なアレイ、たとえば平面または粒子ベースのアレイであることができる。
さらに別の局面において、本発明は、（a）第一のオリゴヌクレオチドライブラリーを生物学的試験試料および生物学的対照試料と接触させる工程であって、生物学的試料中に存在する生物学的実体と、第一のオリゴヌクレオチドライブラリー中に存在する複数のオリゴヌクレオチドとの間に複合体が形成される、工程；（b）生物学的試験試料および生物学的対照試料それぞれに関してオリゴヌクレオチドのサブセットを生成するために、工程（a）で形成された複合体を分割して、複合体中のオリゴヌクレオチドを単離する工程；（c）（b）におけるオリゴヌクレオチドのサブセットを生物学的試験試料および生物学的対照試料と接触させる工程であって、生物学的試料中に存在する生物学的実体と、オリゴヌクレオチドのサブセット中に存在する第二の複数のオリゴヌクレオチドとの間に複合体が形成されて、オリゴヌクレオチドの第二のサブセット群を生成する、工程；および（d）オリゴヌクレオチドのそれぞれ第三、第四、第五またはそれ以降のサブセット群を生成するために、任意で、工程（b）〜（c）を一回、二回、三回またはより多く繰り返して、それによって、富化されたオリゴヌクレオチドプローブライブラリーを生成する工程を含む、富化されたオリゴヌクレオチドプローブライブラリーを生成する方法を提供する。関連する局面において、本発明は、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000または500000個の異なるオリゴヌクレオチド配列を含む複数のオリゴヌクレオチドであって、該複数が本段落における方法から得られ、ライブラリーが第一の表現型を第二の表現型と区別することができる、複数のオリゴヌクレオチドを提供する。いくつかの態様において、第一の表現型は疾患もしくは障害を含み、第二の表現型は健康な状態を含む；または第一の表現型は疾患もしくは障害を含み、第二の表現型は異なる疾患もしくは障害を含む；または第一の表現型は疾患もしくは障害のある病期もしくは進行を含み、第二の表現型は同じ疾患もしくは障害の異なる病期もしくは進行を含む；または第一の表現型は治療に対する正の応答を含み、第二の表現型は同じ治療に対する負の応答を含む。
さらに別の関連する局面において、本発明は、（a）生物学的試験試料を、本発明によって提供されるオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドと接触させる工程；（b）工程（a）で本発明によって提供されるオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドと生物学的試験試料中の標的との間に形成された複合体の存在またはレベルを検出する工程；および（c）工程（b）で検出された存在またはレベルを、生物学的対照試料からの参照レベルと比較し、それによって疾患または障害を特徴決定する工程を含む、疾患または障害を特徴決定する方法を提供する。検出する工程は、複合体中のすべてもしくはいくつかのオリゴヌクレオチドの配列決定、複合体中のすべてもしくはいくつかのオリゴヌクレオチドの増幅、および/または複合体中のすべてもしくはいくつかのオリゴヌクレオチドの、アレイへのハイブリダイゼーションを実施する工程を含み得る。配列決定はハイスループットまたは次世代配列決定であり得る。
本発明の方法において、生物学的試験試料および生物学的対照試料は、それぞれ、組織試料、細胞培養物または生物学的流体を含み得る。いくつかの態様において、生物学的流体は体液を含む。本発明の方法の中で有用な体液は、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（CSF）、痰、唾液、骨髄、滑液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー腺液もしくは尿道球腺液、女性射精液、汗、糞便、体毛、涙液、嚢胞液、胸膜液および腹膜液、心膜液、リンパ液、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、月経分泌物、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌液、粘膜分泌液、水便、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液、胚盤胞腔液または臍帯血を含む。いくつかの好ましい態様において、体液は血液、血清または血漿を含む。生物学的流体は微小胞を含み得る。そのような場合、複合体は、オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドと少なくとも一つの微小胞との間で形成され得る。
生物学的試験試料および生物学的対照試料は、単離された微小胞をさらに含み得、任意で、微小胞は、クロマトグラフィー、ろ過、限外ろ過、遠心分離、超遠心分離、フローサイトメトリー、アフィニティー捕捉（たとえば平面、カラムまたはビーズへの）、ポリマー沈殿の少なくとも一つを使用し、かつマイクロ流体工学を使用して単離される。微小胞はまた、オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドとの接触の後で単離することもできる。
本発明の方法の様々な態様において、オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドはポリペプチドまたはその断片に結合する。ポリペプチドまたはその断片は可溶性または膜結合状態であることができ、任意で、膜は微小胞膜を含む。膜はまた、小胞の細胞または細胞の断片からの膜であることもできる。いくつかの態様において、ポリペプチドまたはその断片は表3または表4中のバイオマーカーを含む。たとえば、ポリペプチドまたはその断片は、表3におけるような一般的小胞マーカーまたは表4におけるような組織関連もしくは疾患関連のマーカーであることもできる。オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、生物学的試料中の微小胞表面抗原に結合し得る。たとえば、オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、微小胞に対してナイーブライブラリーから富化することができる。
本明細書に提供されるオリゴヌクレオチド、複数のオリゴヌクレオチドまたは方法によって検出される疾患または障害は、関心対象の任意の適切な疾患または障害、たとえば非限定的に、乳癌、アルツハイマー病、気管支喘息、膀胱移行上皮癌、巨細胞オステオブラストクラストーマ、脳腫瘍、結腸直腸腺癌、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、子宮頸部扁平上皮癌、急性心筋梗塞（AMI）/急性心不全、クローン病、II型糖尿病、食道癌、喉頭扁平上皮癌、急性および慢性骨髄白血病、肺癌、悪性リンパ腫、多発性硬化症、卵巣癌、パーキンソン病、前立腺腺癌、乾癬、関節リウマチ、腎細胞癌、皮膚有棘細胞癌、胃腺癌、甲状腺癌、精巣癌、潰瘍性大腸炎または子宮腺癌を含み得る。
いくつかの態様において、疾患または障害は、癌、前癌状態、炎症性疾患、免疫疾患、自己免疫疾患もしくは障害、心血管疾患もしくは障害、神経疾患もしくは障害、感染症または疼痛を含む。癌は、非限定的に、急性リンパ芽球性白血病；急性骨髄性白血病；副腎皮質癌；AIDS関連癌；AIDS関連リンパ腫；肛門癌；虫垂癌；星状細胞腫；非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍；基底細胞癌；膀胱癌；脳幹神経膠腫；脳腫瘍（脳幹神経膠腫、中枢神経系非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍、中枢神経系胚芽腫、星状細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣芽腫、上衣腫、髄芽腫、髄上皮腫、中間型松果体実質腫瘍、テント上原始神経外胚葉性腫瘍および松果体芽腫を含む）；乳癌；気管支腫瘍；バーキットリンパ腫；原発不明癌；カルチノイド腫瘍；原発不明癌腫；中枢神経系非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍；中枢神経系胚芽腫；子宮頸癌；小児癌；脊索腫；慢性リンパ球性白血病；慢性骨髄性白血病；慢性骨髄増殖性障害；結腸癌；結腸直腸癌；頭蓋咽頭腫；皮膚T細胞リンパ腫；内分泌膵島細胞腫瘍；子宮内膜癌；上衣芽腫；上衣腫；食道癌；鼻腔神経芽細胞腫；ユーイング肉腫；頭蓋外胚細胞腫瘍；性腺外胚細胞腫瘍；肝外胆管癌；胆嚢癌；胃癌；消化管カルチノイド腫瘍；消化管間質細胞腫瘍；消化管間質腫瘍（GIST）；妊娠性絨毛性腫瘍；神経膠腫；毛様細胞性白血病；頭頸部癌；心臓癌；ホジキンリンパ腫；下咽頭癌；眼内黒色腫；膵島腫瘍；カポジ肉腫；腎臓癌；ランゲルハンス細胞組織球症；喉頭癌；口唇癌；肝臓癌；肺癌；悪性線維性組織球腫；骨癌；髄芽腫；髄上皮腫；黒色腫；メルケル細胞癌；メルケル細胞皮膚癌；中皮腫；原発不明転移性扁平上皮性頸部癌；口腔癌；多発性内分泌腫瘍症候群；多発性骨髄腫；多発性骨髄腫/形質細胞腫瘍；菌状息肉腫；骨髄異形成症候群；骨髄増殖性腫瘍；鼻腔癌；鼻咽頭癌；神経芽細胞腫；非ホジキンリンパ腫；非黒色腫皮膚癌；非小細胞肺癌；口腔癌（oral cancer）；口腔癌（oral cavity cancer）；口腔咽頭癌；骨肉腫；他の脳および脊髄の腫瘍；卵巣癌；卵巣上皮癌；卵巣胚細胞腫瘍；卵巣低悪性度腫瘍；膵臓癌；乳頭腫症；副鼻腔癌；副甲状腺癌；骨盤癌；陰茎癌；咽頭癌；中間型松果体実質腫瘍；松果体芽腫；下垂体腫瘍；形質細胞腫瘍/多発性骨髄腫；胸膜肺芽腫；原発性中枢神経系（CNS）リンパ腫；原発性肝細胞肝癌；前立腺癌；直腸癌；腎臓癌；腎細胞（腎臓）癌；腎細胞癌；気道癌；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；唾液腺癌；セザリー症候群；小細胞肺癌；小腸癌；軟部組織肉腫；扁平上皮癌；頸部扁平上皮癌；胃癌；テント上原始神経外胚葉性腫瘍；T細胞リンパ腫；精巣癌；咽喉癌；胸腺癌；胸腺腫；甲状腺癌；移行上皮癌；腎盂尿管移行上皮癌；絨毛性腫瘍；尿管癌；尿道癌；子宮癌；子宮肉腫；膣癌；外陰癌；ワルデンシュトレームマクログロブリン血症；またはウィルムス腫瘍の一つを含むことができる。前癌状態は非限定的にバレット食道を含むことができる。自己免疫疾患は、非限定的に、炎症性腸疾患（IBD）、クローン病（CD）、潰瘍性大腸炎（UC）、骨盤炎症、血管炎、乾癬、糖尿病、自己免疫性肝炎、多発性硬化症、重症筋無力症、I型糖尿病、関節リウマチ、乾癬、全身性エリテマトーデス（SLE）、橋本甲状腺炎、グレーブス病、強直性脊椎炎、シェーグレン病、CREST症候群、強皮症、リウマチ性疾患、臓器拒絶反応、原発性硬化性胆管炎または敗血症の一つを含むことができる。心血管疾患は、非限定的に、アテローム性動脈硬化症、うっ血性心不全、不安定プラーク、脳卒中、虚血、高血圧症、狭窄症、血管閉塞または血栓性イベントの一つを含むことができる。神経疾患は、非限定的に、多発性硬化症（MS）、パーキンソン病（PD）、アルツハイマー病（AD）、統合失調症、双極性障害、うつ病、自閉症、プリオン病、ピック病、認知症、ハンチントン病（HD）、ダウン症候群、脳血管疾患、ラズムッセン脳炎、ウイルス性髄膜炎、神経精神全身性エリテマトーデス（NPSLE）、筋萎縮性側索硬化症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、伝達性海綿状脳症、虚血再灌流傷害（たとえば脳卒中）、脳損傷、微生物感染または慢性疲労症候群の一つを含むことができる。疼痛は、非限定的に、線維筋痛症、慢性神経因性疼痛または末梢神経因性疼痛の一つを含むことができる。感染症は、非限定的に、細菌感染、ウイルス感染、酵母菌感染、ウィップル病、プリオン病、肝硬変、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、HIV、HCV、肝炎、梅毒、髄膜炎、マラリア、結核またはインフルエンザの一つを含むことができる。当業者は、本発明のオリゴヌクレオチドもしくは複数のオリゴヌクレオチドまたは方法を使用して、任意の数のこれらまたは他の関連する疾患および障害を評価することができることを理解するであろう。
本発明のいくつかの態様において、オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドおよびその使用方法は、特定の疾患または疾患状態を特徴決定するのに有用である。所望により、様々な疾患を特徴決定するのに有用なオリゴヌクレオチドのプールをアセンブルしてマスタープールを創製し、それを、様々な疾患を特徴決定するのに有用なプローブとして使用することができる。たとえば、本明細書に提供されるSEQ ID NO: 510599〜510763の組み合わせがそのようなプールを構成する。当業者はまた、特定の疾患または障害を特徴決定するのに有用なオリゴヌクレオチドのプールを創製することもできることを理解するであろう。本明細書に提供される配列はまた、機能的局面（たとえば様々な標的への結合または表現型を特徴決定する能力）が維持される限り、所望により修飾されることができる。たとえば、オリゴヌクレオチドは、DNAまたはRNAを含み得る、様々な非天然ヌクレオチドを組み込み得る、他の化学的修飾を組み込み得る、または様々な欠失もしくは挿入を含み得る。そのような修飾は、合成、安定性、送達、標識などを容易にし得る、または実際にはほとんどまたは全く影響を及ぼし得ない。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドの機能的局面は維持されながら、そのオリゴヌクレオチド中のいくつかのヌクレオチドが置換されていてもよい。同様に、5'および3'隣接領域が置換されていてもよい。さらに他の場合において、オリゴヌクレオチドの一部分だけがその機能性を指示するように決定されて、他の部分は欠失または置換されることができるようにしてもよい。ヌクレオチドおよびポリヌクレオチドを合成し、修飾するための数多くの技術が、本明細書に開示されている、または当技術分野において公知である。
ある態様において、疾患または障害は乳癌を含み、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 510559〜510598のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30または少なくとも40個を含む。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの機能的局面が全体的または部分的に増強または維持される限り、様々な化学的修飾、付加、欠失、挿入、置換または他の修飾を組み込み得る。
もう一つの態様において、疾患または障害はアルツハイマー病を含み、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。関連する態様において、疾患または障害はアルツハイマー病を含み、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの機能的局面が全体的または部分的に増強または維持される限り、様々な化学的修飾、付加、欠失、挿入、置換または他の修飾を組み込み得る。
疾患または障害は気管支喘息を含み得、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。また、疾患または障害は気管支喘息を含み得、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの機能的局面が全体的または部分的に増強または維持される限り、様々な化学的修飾、付加、欠失、挿入、置換または他の修飾を組み込み得る。
いくつかの態様において、疾患または障害は膀胱移行上皮癌を含み、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの機能的局面が全体的または部分的に増強または維持される限り、様々な化学的修飾、付加、欠失、挿入、置換または他の修飾を組み込み得る。
もう一つの態様において、疾患または障害は巨細胞オステオブラストクラストーマを含み、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの機能的局面が全体的または部分的に増強または維持される限り、様々な化学的修飾、付加、欠失、挿入、置換または他の修飾を組み込み得る。
疾患または障害は脳腫瘍を含み得、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの機能的局面が全体的または部分的に増強または維持される限り、様々な化学的修飾、付加、欠失、挿入、置換または他の修飾を組み込み得る。
もう一つの態様において、疾患または障害は結腸直腸腺癌を含み、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの機能的局面が全体的または部分的に増強または維持される限り、様々な化学的修飾、付加、欠失、挿入、置換または他の修飾を組み込み得る。
さらに別の態様において、疾患または障害は慢性閉塞性肺疾患（COPD）を含み、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。関連する態様において、疾患または障害は慢性閉塞性肺疾患（COPD）を含み、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの機能的局面が全体的または部分的に増強または維持される限り、様々な化学的修飾、付加、欠失、挿入、置換または他の修飾を組み込み得る。
疾患または障害は子宮頸部扁平上皮癌であることができ、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの機能的局面が全体的または部分的に増強または維持される限り、様々な化学的修飾、付加、欠失、挿入、置換または他の修飾を組み込み得る。
疾患または障害は急性心筋梗塞（AMI）または急性心不全を含み得、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。関連する態様において、疾患または障害は急性心筋梗塞（AMI）または急性心不全を含み、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの機能的局面が全体的または部分的に増強または維持される限り、様々な化学的修飾、付加、欠失、挿入、置換または他の修飾を組み込み得る。
いくつかの態様において、疾患または障害はクローン病を含み、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。関連する態様において、疾患または障害はクローン病を含み、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの機能的局面が全体的または部分的に増強または維持される限り、様々な化学的修飾、付加、欠失、挿入、置換または他の修飾を組み込み得る。
疾患または障害はII型糖尿病を含み得、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。関連して、疾患または障害はII型糖尿病を含み得、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの機能的局面が全体的または部分的に増強または維持される限り、様々な化学的修飾、付加、欠失、挿入、置換または他の修飾を組み込み得る。
いくつかの態様において、疾患または障害は食道癌を含み、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの機能的局面が全体的または部分的に増強または維持される限り、様々な化学的修飾、付加、欠失、挿入、置換または他の修飾を組み込み得る。
もう一つの態様において、疾患または障害は喉頭扁平上皮癌を含み、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの機能的局面が全体的または部分的に増強または維持される限り、様々な化学的修飾、付加、欠失、挿入、置換または他の修飾を組み込み得る。
さらに別の態様において、疾患または障害は急性または慢性骨髄白血病を含み、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの機能的局面が全体的または部分的に増強または維持される限り、様々な化学的修飾、付加、欠失、挿入、置換または他の修飾を組み込み得る。
さらに別の態様において、疾患または障害は肺癌を含み、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの機能的局面が全体的または部分的に増強または維持される限り、様々な化学的修飾、付加、欠失、挿入、置換または他の修飾を組み込み得る。
疾患または障害は悪性リンパ腫を含み得、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの機能的局面が全体的または部分的に増強または維持される限り、様々な化学的修飾、付加、欠失、挿入、置換または他の修飾を組み込み得る。
疾患または障害はまた、多発性硬化症を含み得、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。関連して、疾患または障害は多発性硬化症を含み得、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの機能的局面が全体的または部分的に増強または維持される限り、様々な化学的修飾、付加、欠失、挿入、置換または他の修飾を組み込み得る。
ある態様において、疾患または障害は卵巣癌を含み、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの機能的局面が全体的または部分的に増強または維持される限り、様々な化学的修飾、付加、欠失、挿入、置換または他の修飾を組み込み得る。
もう一つの態様において、疾患または障害はパーキンソン病を含み、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。関連する態様において、疾患または障害はパーキンソン病を含み、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの機能的局面が全体的または部分的に増強または維持される限り、様々な化学的修飾、付加、欠失、挿入、置換または他の修飾を組み込み得る。
さらに別の態様において、疾患または障害は前立腺腺癌を含み、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの機能的局面が全体的または部分的に増強または維持される限り、様々な化学的修飾、付加、欠失、挿入、置換または他の修飾を組み込み得る。
さらに別の態様において、疾患または障害は乾癬を含み、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの機能的局面が全体的または部分的に増強または維持される限り、様々な化学的修飾、付加、欠失、挿入、置換または他の修飾を組み込み得る。
疾患または障害は乾癬であることができ、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの機能的局面が全体的または部分的に増強または維持される限り、様々な化学的修飾、付加、欠失、挿入、置換または他の修飾を組み込み得る。
疾患または障害はまた、関節リウマチであることができ、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの機能的局面が全体的または部分的に増強または維持される限り、様々な化学的修飾、付加、欠失、挿入、置換または他の修飾を組み込み得る。
いくつかの態様において、疾患または障害は関節リウマチを含み、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの機能的局面が全体的または部分的に増強または維持される限り、様々な化学的修飾、付加、欠失、挿入、置換または他の修飾を組み込み得る。
もう一つの態様において、疾患または障害は腎細胞癌を含み、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの機能的局面が全体的または部分的に増強または維持される限り、様々な化学的修飾、付加、欠失、挿入、置換または他の修飾を組み込み得る。
さらに別の態様において、疾患または障害は皮膚有棘細胞癌を含み、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの機能的局面が全体的または部分的に増強または維持される限り、様々な化学的修飾、付加、欠失、挿入、置換または他の修飾を組み込み得る。
様々な態様において、疾患または障害は胃腺癌を含み、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの機能的局面が全体的または部分的に増強または維持される限り、様々な化学的修飾、付加、欠失、挿入、置換または他の修飾を組み込み得る。
疾患または障害は甲状腺癌を含み得、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの機能的局面が全体的または部分的に増強または維持される限り、様々な化学的修飾、付加、欠失、挿入、置換または他の修飾を組み込み得る。
疾患または障害はまた、精巣癌を含み得、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの機能的局面が全体的または部分的に増強または維持される限り、様々な化学的修飾、付加、欠失、挿入、置換または他の修飾を組み込み得る。
疾患または障害は潰瘍性大腸炎であることができ、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。関連する態様において、疾患または障害は潰瘍性大腸炎を含み、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの機能的局面が全体的または部分的に増強または維持される限り、様々な化学的修飾、付加、欠失、挿入、置換または他の修飾を組み込み得る。
疾患または障害はまた、子宮腺癌であることができ、その特徴決定に有用なオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:
Figure 2016533752
のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの機能的局面が全体的または部分的に増強または維持される限り、様々な化学的修飾、付加、欠失、挿入、置換または他の修飾を組み込み得る。
ある局面において、本発明は、本明細書に提供される発明の方法を実施するための試薬を含むキットを提供する。類似の局面において、本発明は、本明細書に提供される発明の方法を実施するための試薬の使用を考慮する。諸態様において、試薬はオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、本明細書に提供されるものであることができる。試薬は、様々な他の有用な成分、たとえば非限定的に、（a）微小胞を単離するように構成された試薬（任意で、微小胞を単離するように構成された少なくとも一つの試薬は、微小胞抗原への結合物質、カラム、基体、ろ過ユニット、ポリマー、ポリエチレングリコール、PEG4000、PEG8000、粒子またはビーズを含む）；（b）オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドを増幅、配列決定、ハイブリダイズまたは検出するためにプライマーまたはプローブとして働くように構成された少なくとも一つのオリゴヌクレオチド；および（c）試料から1種または複数種の豊富なタンパク質を除去するように構成された試薬（任意で、1種または複数種の豊富なタンパク質は、アルブミン、免疫グロブリン、フィブリノーゲンおよびフィブリンのうち少なくとも1種を含む）の、一つまたは複数を含み得る。
最適化オリゴヌクレオチドライブラリー構築
本明細書に記載されるように、個々のアプタマーおよびオリゴヌクレオチドプローブライブラリーは、関心対象の一つまたは複数の標的に対して投入オリゴヌクレオチドライブラリーをスクリーニングまたは富化することによって生成される。投入ライブラリーは、出発またはナイーブなオリゴヌクレオチドライブラリーと呼ばれ得、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000、500000、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017または少なくとも1018個の異なるオリゴヌクレオチド配列を含み得る。ライブラリーは一般に、プライマー結合、プローブ結合、ハイブリダイゼーション、増幅、配列決定などを容易にするために5'および/または3'末端に公知の配列を含む。これらの隣接領域は、ライブラリー多様性を創製するランダムに生成された配列を含む部分を包囲し得る。本発明は、ライブラリー構築に使用される隣接領域および可変領域の両方を増強するオリゴヌクレオチド配列を提供する。このような構築物は、非限定的に合成、多様性および配列決定を含むスクリーニングおよび富化用途に使用するためのナイーブライブラリーの任意の所望の特性を増強し得る。本発明の増強された隣接領域および可変領域は、別々に使用されてもよいし、または一緒に使用されてもよい。実例に関して、本明細書の実施例19および23を参照すること。
ある局面において、本発明は、細胞のまたは細胞外の小胞試料を評価するための投入オリゴヌクレオチドライブラリーを含む組成物であって、投入オリゴヌクレオチドライブラリーを生成するための少なくとも二つのサブセットオリゴヌクレオチドライブラリーを含み、少なくとも二つのサブセットオリゴヌクレオチドライブラリーの少なくとも一つが、50％に等しくない全G+C含量を有するヌクレオチドの量で製造される、組成物を提供する。たとえば、全G+C含量は50％未満であることもできるし、または全G+C含量は50％超であることもできる。一つの態様において、少なくとも一つのサブセットライブラリーは、50％超の全G+C含量で製造され、もう一つのサブセットライブラリーは、50％未満の全G+C含量で製造される。ある態様において、少なくとも二つのサブセットライブラリーは、それぞれ25％、50％および75％のG+C含量で製造された三つのサブセットライブラリーを含む。少なくとも二つのサブセットライブラリーは、表13中の少なくとも二つの行に類似する、または等しい量のヌクレオチドで製造されることができる。ヌクレオチドは、所望により、天然のヌクレオチドまたは修飾された天然のヌクレオチドからなることができる。ヌクレオチドはまた、非天然のヌクレオチドを含むことができる。そのような投入オリゴヌクレオチドライブラリーは本明細書の中で「GC」ライブラリーと呼ばれ得る。GCライブラリーは、さらなるスクリーニングまたは富化目的のためにナイーブな投入ライブラリー中の可変領域として生成され得る。実施例19を参照すること。
関連する局面において、本発明は、投入オリゴヌクレオチドライブラリーを生成するために少なくとも二つのサブセットオリゴヌクレオチドライブラリーを接触させる工程を含む、本発明の投入オリゴヌクレオチドライブラリーを生成する方法を提供する。本明細書に記載される方法を使用して投入オリゴヌクレオチドライブラリーをスクリーニングまたは富化すると、様々なアプタマーまたはオリゴヌクレオチドプローブライブラリーを提供することができる。
ある局面において、本発明は、5'トランスポゾンアダプター領域と、トランスポゾンアダプター領域に対して5'に位置する0またはより多くのヌクレオチドを含むオフセット領域と、オフセット領域に対して5'に位置する可変領域と、可変領域に対して5'に位置する左プライマー領域とを含む配列を有するオリゴヌクレオチドを提供する。関連する局面において、本発明は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000、500000、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017または少なくとも1018個の異なるオリゴヌクレオチド配列を含み、各オリゴヌクレオチド配列が、5'トランスポゾンアダプター領域と、トランスポゾンアダプター領域に対して5'に位置する0またはより多くのヌクレオチドを含むオフセット領域と、オフセット領域に対して5'に位置する可変領域と、可変領域に対して5'に位置する左プライマー領域とを含む、複数のオリゴヌクレオチドを提供する。そのようなオリゴヌクレオチドは本明細書の中で「均衡」オリゴヌクレオチドと呼ばれ得る。実施例23を参照すること。
本発明の均衡オリゴヌクレオチドまたは複数の均衡オリゴヌクレオチドは、（a）トランスポゾンアダプター領域が20〜40ヌクレオチドを含む；（b）オフセット領域が0、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10ヌクレオチドを含む；（c）可変領域が20〜50ヌクレオチドを含む；および/または（d）左プライマー領域が20〜40ヌクレオチドを含むようなものであることができる。いくつかの態様において、均衡オリゴヌクレオチドは、（a）トランスポゾンアダプター領域が、配列
Figure 2016533752
に対して少なくとも約50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である核酸配列を含む；（b）オフセット領域が、以下の配列：5'-T（SEQ ID NO: 510765）、5'-CT（SEQ ID NO: 510766）および5'-ACT（SEQ ID NO: 510767）の少なくとも一つに対して少なくとも約50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である1、2、3、4、5、6、7、8、9または10ヌクレオチドを含む；（c）可変領域が10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50または50よりも多いヌクレオチドを含む；および/または（d）左プライマー領域が、SEQ ID NO: 510768および510769から選択される配列に対して少なくとも約50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である核酸配列を含む、ようなものである。可変領域は、本明細書に提供される「GC」ライブラリー配列を含み得る。
ある局面において、本発明は、均衡オリゴヌクレオチドまたは複数の均衡オリゴヌクレオチドをナイーブな投入ライブラリーとして使用して選択または富化プロセスを実施する工程を含む、アプタマーを同定する方法を提供する。そのような選択または富化プロセスは、非限定的にSELEXおよびその変形を含め、本明細書に記載または提供されている。ある態様において、選択プロセスは、関心対象の標的に対する少なくとも1ラウンドのポジティブ選択および任意で関心対象の標的以外の標的に対する少なくとも1ラウンドのネガティブ選択を含む。
もう一つの局面において、本発明は、均衡オリゴヌクレオチドまたは複数の均衡オリゴヌクレオチドを試料と接触させる工程および試料中の標的へのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドの結合の存在またはレベルを検出する工程を含む、方法を提供する。試料は、生物学的試料、たとえば有機試料、無機試料、組織、細胞培養物、体液、血液、血清、細胞、微小胞、タンパク質複合体、脂質複合体、糖質またはそれらの任意の組み合わせ、部分もしくは変種を含み得る。標的は、非限定的に細胞、オルガネラ、タンパク質複合体、リポタンパク質、糖質、微小胞、膜断片、小分子、重金属、毒素または薬物を含む任意の有用な標的であることができる。
関連する局面において、本発明は、（a）微小胞を含む生物学的試料をオリゴヌクレオチドプローブライブラリーと接触させる工程であって、オリゴヌクレオチドプローブライブラリーが均衡オリゴヌクレオチドまたは複数の均衡オリゴヌクレオチドを含む、工程；（b）微小胞の少なくとも一部分に結合したオリゴヌクレオチドを同定する工程；および（c）同定されたオリゴヌクレオチドのプロファイルに基づいて試料を特徴決定する工程を含む、方法を提供する。
もう一つの関連する局面において、本発明は、（a）溶解状態の混合物を形成するために、試料を、少なくとも106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017または少なくとも1018個の異なるオリゴヌクレオチド配列のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブライブラリーと接触させる工程であって、オリゴヌクレオチドが、試料中の複数の実体と結合して複合体を形成することができ、オリゴヌクレオチドプローブライブラリーが均衡オリゴヌクレオチドまたは複数の均衡オリゴヌクレオチドを含む、工程；（d）工程（a）で形成された複合体を混合物から分割する工程；および（c）試料に関するオリゴヌクレオチドプロファイルを同定するために、工程（b）で分割された複合体中に存在するオリゴヌクレオチドを検出する工程を含む、方法を提供する。関連する局面において、本発明は、（a）生物学的試験試料を均衡オリゴヌクレオチドまたは複数の均衡オリゴヌクレオチドと接触させる工程；（b）工程（a）で均衡オリゴヌクレオチドまたは複数の均衡オリゴヌクレオチドと生物学的試験試料中の標的との間に形成された複合体の存在またはレベルを検出する工程；および（c）工程（b）で検出された存在またはレベルを、生物学的対照試料からの参照レベルと比較し、それによって疾患または障害を特徴決定する工程を含む、疾患または障害を特徴決定する方法を提供する。検出する工程は、複合体中のすべてもしくはいくつかのオリゴヌクレオチドの配列決定、複合体中のすべてもしくはいくつかのオリゴヌクレオチドの増幅、および/または複合体中のすべてもしくはいくつかのオリゴヌクレオチドの、アレイへのハイブリダイゼーションを実施する工程を含み得る。いくつかの態様において、配列決定はハイスループット配列決定を含む。
均衡オリゴヌクレオチドまたは複数の均衡オリゴヌクレオチドの使用を含む本発明の方法において、生物学的試験試料および生物学的対照試料は、それぞれ、組織試料、細胞培養物または生物学的流体を含み得る。いくつかの態様において、生物学的流体は体液を含む。本発明の方法の中で有用な体液は、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（CSF）、痰、唾液、骨髄、滑液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー腺液もしくは尿道球腺液、女性射精液、汗、糞便、体毛、涙液、嚢胞液、胸膜液および腹膜液、心膜液、リンパ液、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、月経分泌物、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌液、粘膜分泌液、水便、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液、胚盤胞腔液または臍帯血を含む。いくつかの好ましい態様において、体液は血液、血清または血漿を含む。生物学的流体は微小胞を含み得る。そのような場合、複合体は、オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドと少なくとも一つの微小胞との間で形成され得る。生物学的試験試料および生物学的対照試料は、単離された微小胞をさらに含み得、任意で、微小胞は、クロマトグラフィー、ろ過、限外ろ過、遠心分離、超遠心分離、フローサイトメトリー、アフィニティー捕捉（たとえば平面、カラムまたはビーズへの）、ポリマー沈殿の少なくとも一つを使用し、かつマイクロ流体工学を使用して単離される。微小胞はまた、オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドとの接触の後で単離することもできる。
均衡オリゴヌクレオチドまたは複数の均衡オリゴヌクレオチドの使用を含む本発明の方法の様々な態様において、オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドはポリペプチドまたはその断片に結合する。ポリペプチドまたはその断片は可溶性または膜結合状態であることができ、任意で、膜は微小胞膜を含む。膜はまた、小胞の細胞または細胞の断片からの膜であることもできる。いくつかの態様において、ポリペプチドまたはその断片は表3または表4中のバイオマーカーを含む。たとえば、ポリペプチドまたはその断片は、表3におけるような一般的小胞マーカーまたは表4におけるような組織関連もしくは疾患関連のマーカーであることもできる。オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、生物学的試料中の微小胞表面抗原に結合し得る。たとえば、オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、微小胞に対してナイーブライブラリーから富化することができる。
均衡オリゴヌクレオチドまたは複数の均衡オリゴヌクレオチドの使用を含む、本明細書に提供されるオリゴヌクレオチド、複数のオリゴヌクレオチドまたは方法によって検出される疾患または障害は、関心対象の任意の適切な疾患または障害を含み得る。たとえば、疾患または障害は、癌、前癌状態、炎症性疾患、免疫疾患、自己免疫疾患もしくは障害、心血管疾患もしくは障害、神経疾患もしくは障害、感染症および/または疼痛を含み得る。たとえば本明細書の「表現型」の項を参照すること。疾患または障害は、非限定的に、乳癌、アルツハイマー病、気管支喘息、膀胱移行上皮癌、巨細胞オステオブラストクラストーマ、脳腫瘍、結腸直腸腺癌、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、子宮頸部扁平上皮癌、急性心筋梗塞（AMI）/急性心不全、クローン病、II型糖尿病、食道癌、喉頭扁平上皮癌、急性および慢性骨髄白血病、肺癌、悪性リンパ腫、多発性硬化症、卵巣癌、パーキンソン病、前立腺腺癌、乾癬、関節リウマチ、腎細胞癌、皮膚有棘細胞癌、胃腺癌、甲状腺癌、精巣癌、潰瘍性大腸炎または子宮腺癌を含み得る。
本発明はさらに、本明細書の方法を実施するための試薬を含むキットおよび本発明のGCライブラリーまたは均衡オリゴヌクレオチドに関連する方法を実施するための試薬の使用を提供する。たとえば、試薬は、GCライブラリーおよび/または均衡オリゴヌクレオチドライブラリーから導出された配列を有する一つまたは複数のオリゴヌクレオチドを含み得る。試薬は、本明細書に開示される他の有用な成分、たとえば非限定的に、（a）微小胞を単離するように構成された試薬（任意で、微小胞を単離するように構成された少なくとも一つの試薬は、微小胞抗原への結合物質、カラム、基体、ろ過ユニット、ポリマー、ポリエチレングリコール、PEG4000、PEG8000、粒子またはビーズを含む）；（b）オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドを増幅、配列決定、ハイブリダイズまたは検出するためにプライマーまたはプローブとして働くように構成された少なくとも一つのオリゴヌクレオチド；および（c）試料から1種または複数種の豊富なタンパク質を除去するように構成された試薬（任意で、1種または複数種の豊富なタンパク質は、アルブミン、免疫グロブリン、フィブリノーゲンおよびフィブリンのうち少なくとも1種を含む）の少なくとも一つをさらに含み得る。
キット
本発明はまた、本発明の方法を実施するための1種または複数種の試薬を含むキットを提供する。たとえば、1種または複数種の試薬は、1種または複数種のアプタマー、バッファ、ブロッカー、酵素またはそれらの組み合わせであることができる。1種または複数種の試薬は、非限定的にアプタマーライブラリー、基体、たとえばマイクロビーズまたは平面アレイもしくはウェル、（例えば、クロマトグラフィー、ろ過法、限外ろ過法、遠心分離、超遠心分離、フローサイトメトリー、アフィニティー捕捉法（例えば、平面、カラム、またはビーズに対する）、ポリマー沈殿による、および/またはマイクロ流体工学を用いる）バイオマーカーおよび/または微小胞単離のための試薬、特定の標的に対するアプタマー、バイオマーカー/微小胞集団の検出を容易にするアプタマープール、核酸配列決定または増幅のためのプライマーのような試薬、核酸ハイブリダイゼーションのためのアレイ、検出可能な標識、溶媒またはバッファなど、様々なリンカー、様々なアッセイ成分、ブロッカーなどを含む、主題の方法を実施するための任意の有用な試薬を含み得る。1種または複数種の試薬はまた、本発明によって提供される様々な組成物を含み得る。ある態様において、1種または複数種の試薬は本発明の1種または複数種のアプタマーを含む。1種または複数種の試薬は、基体、たとえば平面基体、カラムまたはビーズを含むことができる。キットは、1種または複数種の試薬を使用して様々なアッセイを実施するための取り扱い説明を含むことができる。
ある態様において、キットは、本明細書に提供されるアプタマーまたは組成物を含む。キットは、本明細書に提供される方法を実施するように構成されることができる。たとえば、キットは、本発明のアプタマー、基体または本発明のアプタマーおよび基体の両方を含むことができる。
ある態様において、キットは、アッセイを実施するように構成されている。たとえば、キットは、1種または複数種の試薬および生物学的試料中の生物学的実体の存在またはレベルを検出するための取り扱い説明を含むことができる。そのような場合、キットは、関心対象の生物学的実体への1種または複数種の結合物質を含むことができる。1種または複数種の結合物質は基体に結合していることができる。
ある態様において、キットは、生物学的試料の特定のアプタマープロフィールを提供するアプタマーのセットを含む。アプタマープロフィールは、非限定的に、特定の疾患または障害を特徴決定するために使用することができるプロフィールを含むことができる。たとえば、疾患または障害は、非限定的に癌を含む増殖性疾患または障害であることができる。疾患または障害は、表16における疾患または障害より選択することができる。
実施例1：標的に結合するDNAオリゴヌクレオチドの特定
標的を、スライドガラスまたは磁気ビーズなどの固体基体に付着させる。磁気ビーズの調製のためには、ビーズを、0.1〜1 mg/mlの範囲の濃度の標的タンパク質とインキュベーションする。特定のビーズ製造業者により提供される化学に従って、標的タンパク質をビーズに結合させる。典型的には、これは、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）官能基プロセスを介したカップリングを含む。占有されていないNHS基を、標的との結合後に不活性にする。
ある特定の長さ、例えば32塩基対の長さのランダムに生成されたオリゴヌクレオチド（オリゴ）を、安定化された標的を保持する容器に添加する。各オリゴは、5'末端または3'末端のいずれかに6個のチミンヌクレオチド（チミンテール）を、チミンテールが結合した単一分子のビオチンと共に含有する。ビオチンの追加的な分子を付加することができる。各オリゴはまた、PCR用の増幅プライマー（「プライマーテール」）に対応する、各末端上のヌクレオチドの短いストレッチ（5〜10塩基対の長さ）と共に製造される。配列は、チミンテールまたはプライマーテールがない状態で示す。
オリゴヌクレオチドを、特定の温度および時間で、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中で、摂氏37度で500マイクロリットルの反応容積において、標的とインキュベーションする。
結合していないオリゴを除去するために、標的/オリゴの組み合わせを、緩衝液で1〜10回洗浄する。洗浄の回数は、（以下で言及するように）プロセスの各々の反復と共に増大する。
標的に結合したオリゴを、7M尿素または1％ SDSなどのカオトロピック剤を含有する緩衝液を用いて溶出し、ビオチンタグを用いて収集する。オリゴのランダム化領域に付加された5'配列および3'配列に特異的なプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応を用いて、オリゴを増幅する。増幅されたオリゴを、別のラウンドの選択のために、再び標的に添加する。結合富化を観察するために、所望のとおりこのプロセスを繰り返す。
実施例2：競合アッセイ
抗体などの、標的に対する公知のリガンドを、結合したオリゴ種を溶出するために使用する（カオトロピック剤とは対照的に、またはカオトロピック剤に加えて）以外は、上記の実施例1におけるようにプロセスを行う。この場合は、Santa Cruz Biotechnology, Inc.由来の抗EpCAM抗体を、標的EpCAMからアプタマーを溶出するために使用した。
実施例3：スクリーニングおよび親和性解析
上述の結合アッセイから生成された全てのアプタマーを、Life Technologies由来のIon Torrentなどのハイスループット配列決定プラットフォームを用いて、配列決定する。
ライブラリーの調製 - 製造業者のプロトコルに従ってバーコードとアダプター配列とをライゲーションした後に（Life Technologies）、アプタマーをプールした。簡潔に言うと、アプタマーの等モルのプールを、以下の工程を用いて作製した：各ライブラリーのアリコートを、最終のライブラリー濃度に適切なように、Bioanalyzer（商標）機器およびAgilent DNA 1000 KitまたはAgilent High Sensitivity Kitで解析した。各アンプリコンライブラリーのモル濃度（nmol/L）を、市販されているソフトウェア（Agilent）を用いて測定した。
ライブラリーの等モルのプールを、可能な最高濃度で調製した。
プールされたライブラリーストックの合わせた濃度を算出した。
ライブラリープールの鋳型希釈係数を、以下の方程式を用いて決定した：鋳型希釈係数＝（ライブラリープール濃度 [pM]）/26 pM）。
鋳型の調製-新しく希釈されたライブラリーを用いて、上記で提供された結合アッセイに由来するアプタマープールを、従来の配列決定プロトコルを用いて配列決定した。所望のとおりに、ハイスループット（NextGen）配列決定法を使用することができる。
20個のアプタマーを、（上述のような）EpCAMへの結合を評価する直接アッセイまたは競合アッセイに基づいて選択した。
親和性の測定-これらの20個のアプタマーを、次に、インビトロの結合プラットフォームを用いて結合親和性について試験した。この工程については、以下のように、SPR、例えば、T200コントロールソフトウェアを用いたBiacore SPR機を使用することができる。
抗原を32 nMの濃度に希釈する。
32nMから開始して0.5nMまで抗原の2倍希釈液を調製し、速度論のために必要な希釈液を調製する。
Biacore 200コントロールソフトウェアを、以下の条件でプログラミングする：溶液：HBS-EP+緩衝液；サイクル数：3；接触時間：120秒；流速：30μl/分；解離時間：300秒；溶液：グリシン-HCl pH 2.5；接触時間：120秒；流速：20μl/分；安定化期間：0秒。これらのアプタマーの結合親和性を、次に、上記のSPRアッセイ、または望ましい機能についてアプタマーを評価する代わりのインビトロアッセイを用いて測定する。
図5は、アプタマーBTX176881（SEQ ID NO: 3）についてのSPRデータを示す。図は、示された濃度（nM）でのEpCAMタンパク質に対するビオチン化アプタマーの1:1フィッティングモデルの結合および解離のグラフを含む。表5は、図5に示されているSPR測定値から算出されたKd値を示す。さらに、表5は、BTX187269（SEQ ID NO: 6）およびアプタマー4（SEQ ID NO: 1）についてのSPRデータおよび算出されたKd値を示す。
（表５）SPR測定値から算出されたKD値
Figure 2016533752
＊単一参照法のためのグローバルフィッティングによるKd、R2およびChi2の値
実施例4：モチーフ解析
実施例3のプロセスに続いて、関心対象の標的に対する高親和性アプタマーを特定する。ひとたび高親和性アプタマーを特定すると、その配列を、次に、その二次元フォールディング構造を推定するためにソフトウェアプログラムを用いて解析する。周知の配列アラインメントプログラムおよびモチーフ特定のためのアルゴリズムを、配列モチーフを特定するため、および配列の一様な大きなデータセットの次元を低減させるために使用することができる。さらに、Viennaおよびmfoldなどのソフトウェアプログラムが、アプタマー選択の当業者に周知であり、二次構造モチーフ（共有される形状）に基づいてさらに配列をグループ化するために使用することができる。例となる構造予測については、図3Aおよび図3Bを参照されたい。共有される二次構造は、当然、同一の三次元構造を保証するものではない。従って、1セットのインシリコのツールではまだ、アプタマー候補のセットの中で最適なアプタマーを完全に予測することができないため、アプタマーの「ウェットラボ」評定が、依然として有用である。
実施例5：微小胞ベースのアプタマーサブトラクションアッセイ
循環微小胞を、以下の方法のうちの1つを用いて正常血漿（例えば、癌を有さない個体由来）から単離する：1）製造業者のプロトコルに従う、ExoQuick試薬を用いる単離；2）50,000〜150,000gでの1〜20時間のスピンを含み、その後沈殿物をPBSに再懸濁する、超遠心分離；3）製造業者のプロトコルに従う、Life Technologies由来のTEXIS試薬を用いた単離；ならびに4）濾過方法論。濾過法を、より詳細に以下に記載する。
7 ml 150K MWCOオープンカラム（Pierce concentrators, 150K MWCO（分子量カットオフ）7 ml。パート番号: 89922）上に、シリンジおよびフィルター（1.2μm Acrodisc Syringe Filter Versapor Membrane Non-Pyrogenic Ref: 4190, Pall Life Sciences）を置く。シリンジの開口端を、滅菌の分子グレードの水において調製した、5.2 mlの濾過した1×PBSで満たす。
患者の血漿（900〜1000μl）を、シリンジ中のPBSにピペットで移し、2回、ピペット操作で混合する。
血漿を、7 ml 150K MWCOカラム中に濾過する。
7 ml 150K MWCOカラムを、2000×g、20℃（16℃〜24℃）で1時間、遠心分離する。
1時間のスピン後、フロースルーを10％漂白剤中に注いで、廃棄する。
試料容積を、目視検証する。血漿濃縮物が、濃縮機チューブ上の8.5 mlの目盛より上の場合には、血漿濃縮物が8.0〜8.5 mlになるまで、10分刻みで、2000×g、20℃（16℃〜24℃）で血漿試料をスピンし続け、各スピン後に容積を確認する。
カラム上で最低6回、ゆっくりピペット操作で混合し、ピペットを調整して血漿濃縮物容積を測定する。容積が、100μlと標的容積の間である場合は、血漿濃縮物を、事前に標識したコポリマー1.5 mlチューブに移す。容積が依然として標的容積より多い場合は、上記の遠心分離工程を繰り返す。
次の工程における使用のために、滅菌の分子グレードの水において調製した、約45mlの濾過した1×PBSを、50 mlコニカルチューブ中に注ぐ。
適切な量の濾過した1×PBSを添加して、試料を標的容積に再構成する。
任意の単離法を用いて生成された微小胞は、小胞タイプの混合物を含み得、エキソソームサイズの粒子を単離するのに有利であり得る超遠心分離法は除くことができるが、種々のサイズであり得る。
ランダムに生成されたオリゴヌクレオチド（上記の実施例1に記載されているように生じた）を、単離された正常小胞とPBS中で一晩、室温でまたは摂氏4度でインキュベーションする。
これらの小胞に結合しないアプタマーを、50,000〜150,000×gで1〜20時間、小胞をスピンダウンし、上清を収集することにより単離する。
アプタマーオリゴヌクレオチドを、ストレプトアビジンコーティングビーズを含有するカラムに混合物を通すことにより、上清から回収する。これらのアプタマーを次に、（上記と同じ方法を用いて）罹患した患者から単離された小胞に添加し、一晩PBS中で、室温でまたは摂氏4度でインキュベーションする。
小胞をその後、50,000〜150,000×gで1〜20時間スピンし、上清を廃棄する。小胞をPBS中に再懸濁し、SDSまたはいくつかの類似した界面活性剤を用いて溶解する。
アプタマーをその後、ストレプトアビジンコーティングビーズのカラムに溶解混合物を通すことにより捕捉する。単離されたアプタマーを次に、1ラウンドのPCRに供して産物を増幅する。
プロセスをその後、設定の回数、例えば、5回繰り返す。残ったアプタマープールは、「正常」血漿において見出される微小胞を認識するアプタマーが枯渇している。従って、この方法は、癌小胞を認識するアプタマーにおいてプールを富化するために使用することができる。図4を参照されたい。
実施例6：抗EpCAMアプタマーを用いた微小胞の検出
アプタマーを、バイオマーカーを検出するための結合物質として使用することができる。本実施例においては、アプタマーを、微小胞と会合したEpCAMタンパク質を検出するための結合物質として使用する。
図6は、血漿試料中の微小胞集団を検出するための抗EpCAMアプタマー（アプタマー4；SEQ ID NO: 1）の使用を示す。血漿試料を、前立腺癌を有する3人の男性および前立腺癌を有さない3人の男性（対照または正常と呼ばれる）から取得した。以下の関心対象の微小胞表面タンパク質抗原に対する抗体を、マイクロビーズ（Luminex Corp, Austin, TX）に結合させた：図6A）EGFR（上皮成長因子受容体）；図6B）PBP（前立腺結合タンパク質；PEBP1（ホスファチジルエタノールアミン結合タンパク質1）としても知られる）；図6C）EpCAM（上皮細胞接着分子）；および図6D）KLK2（カリクレイン関連ペプチダーゼ2）。血漿試料中の微小胞を、ビーズ結合抗体を用いて捕捉した。蛍光標識されたアプタマー4を、マイクロビーズアッセイにおいて検出物質として使用した。図6は、ビーズで捕捉されかつアプタマー4で検出された微小胞について検出された平均中央蛍光値（MFI値）を示す。各プロットは、3種の癌試料（C1〜C3）および3種の正常試料（N1〜N3）を個々に示す。これらのデータは、平均して、前立腺癌試料が、正常よりも高いレベルの、標的タンパク質を含有する微小胞を有することを示す。
実施例7：アプタマーのネガティブ選択およびポジティブ選択
アプタマーは、結合物質に依拠する多数のタイプのアッセイを含む種々の生物学的アッセイにおいて使用することができる。例えば、アプタマーを、免疫ベースのアッセイにおいて抗体の代わりに使用することができる。本実施例は、アッセイ工程を通していかなる表面（基体、チューブ、フィルター、ビーズ、他の抗原など）にも結合せず、関心対象の抗原に特異的に結合するアプタマーを特定するアプタマースクリーニング法を提供する。アッセイは、最終的なアッセイの非標的抗原成分に結合するアプタマーを除去する、ネガティブ選択に依拠する。ネガティブ選択の後に、所望の抗原に結合するアプタマーを特定するポジティブ選択を行う。
予備的な実験を、各々1015個の配列を有する5種のDNAアプタマーライブラリーで行い、可変の長さ（60、65、70、75、80マー）を事前増幅して、鎖分離し、フォワード鎖（非ビオチン化）がアプタマーとして働くようにした。複数ラウンドのネガティブ選択およびポジティブ選択を行った。各ラウンドの前に、標準的な方法論を用い、回収されたアプタマー産物をPCR増幅して、鎖分離した。選択は、以下のように行った。
ネガティブ選択
1．ビーズのネガティブ選択ミックスを調製する：1200個の非磁気ビーズを、標準的なブロッキング剤と20分間インキュベーションする。
2．50μlのアプタマーライブラリー（全部で5ライブラリー）を、4.5μlの各ビーズ混合物と共にPCRストリップチューブに添加する。2時間37℃で、550 rpmで撹拌しながらインキュベーションする。
3．フィルタープレート（1.2μm, Millipore）をPBS-BN緩衝液であらかじめ湿らせる。150μlのPBS-BNを添加する。
4．試料をPCRストリップチューブからフィルタープレートに移し、1時間室温で、550 rpmで撹拌しながらインキュベーションする。
5．真空マニホールドを用いて、フロースルーをフィルタープレートから収集（NBS）プレート中へ収集する。
6．所望のとおりに過剰な材料を除去するために、試料を濃縮して清浄にする。
ネガティブ選択プロセスを、6〜7回まで繰り返す。
ポジティブ選択
開始前に、当技術分野において公知の条件を用いて、関心対象のタンパク質バイオマーカー（ここではSSX4、SSX2、PBP、KLK2、SPDEF）を望ましい非磁気マイクロビーズに結合させる。組み換え精製された出発材料には、以下が含まれた：Novus Biologicals (Littleton, CO, USA)、カタログ番号H00025803-P01のSPDEF組み換えタンパク質；Novus、カタログ番号H00003817-P02のKLK2組み換えタンパク質；Novus、カタログ番号H00006757-P01のSSX2組み換えタンパク質；Fitzgerald Industries International (Action, MA, USA)、カタログ番号30R-1382のPBP組み換えタンパク質；GenWay Biotech, Inc. (San Diego, CA, USA)、カタログ番号GWB-E219ACのSSX4組み換えタンパク質。
1．ビーズブロッキング：各々のビーズの望ましい数（8400×アプタマーライブラリーの数(5)×(1.2)の余剰係数）をstarting blockと共に20分間インキュベーションする。
2．50μlの各アプタマーライブラリー試料をPCRストリップチューブへ混合し、2.3μlの特定の抗原を有するビーズ試料を添加する。2時間37℃で、550 rpmで撹拌しながらインキュベーションする。
3．フィルタープレート（1.2μm, Millipore）をPBS-BN緩衝液であらかじめ湿らせる。150μlのPBS-BNを添加する。
4．試料をPCRストリップチューブからフィルタープレートに移し、1時間室温で、550 rpmで撹拌しながらインキュベーションする。
5．PBS-BNで3回洗浄し、50μlのPBSを添加し、試料をフィルターの上部から1.5 mlチューブに収集する。
ポジティブ選択を16回まで繰り返す。ある特定のラウンドのポジティブ選択は、以下のような、回収されたRNA（すなわち、残ったアプタマー候補）を処理する追加的な工程を有する。
ラウンド8のポジティブ選択を、以下のように改変した：
1．3回目の洗浄（PBS-BN）後に、25μlの試料をフィルターの上部から1.5 mlチューブ中に収集した。
2．フィルタープレートを、45℃で約10分間インキュベーションし、真空を用いて直ちに洗浄した。プレートを、PBS-BNでさらに3回洗浄した。
3．50μlのPBSをプレートに添加し、工程2を繰り返した。
4．最後の洗浄後に、25μlのPBSをウェルに添加した。試料を、十分に混合し、フィルターの上部から1.5 mlチューブ中に収集した。
ラウンド9のポジティブ選択を、以下のように改変した：
1．工程5）における最終的な洗浄後に、5μg/mlのストレプトアビジン-PEをアプタマー混合物に添加し、30分間室温で、550 rpmで撹拌しながらインキュベーションした。
2．フィルタープレート上の試料を、3回、PBS-BN（＋追加的な500 mM NaCl）で洗浄した。
3．正規のPBS-BNでの1回の追加的な洗浄を行った。
4．50μlのPBSを試料に添加し、その後、上記のように1.5 mlチューブ中に収集した。
5．試料を-20℃で保存した。
ラウンド14のポジティブ選択を、以下のように改変した：
このラウンドを開始する前に、関心対象の抗原（SSX4、SSX2、PBP、KLK2、SPDEF）を、当技術分野において公知である方法を用いて、カルボキシル化磁気ビーズに結合させた。
1．ビーズブロッキング：各々の非磁気ビーズの望ましい数（3000×アプタマーライブラリーの数(5)×1.2の余剰係数）を採り、starting block（3：1、1200ビーズ当たりのブロッキング）を添加し、4種の抗原の5個のミックスを作製して、磁気ビーズに結合させた異なる標的抗原を各々に補給し（示されている場合以外は抗原が非磁気ビーズに結合している、下記の表6を参照されたい）、20分インキュベーションする。
（表６）ビーズブロッキング混合物
Figure 2016533752
2．50μlのアプタマーライブラリーをPCRストリップチューブに添加し、磁気ビーズ上に標的抗原を有するビーズ混合物を、あらかじめ選択された対応するアプタマーライブラリーを有するチューブに添加し、2時間37℃で、550 rpmで撹拌しながらインキュベーションする。
3．フィルタープレートをPBS-BN緩衝液であらかじめ湿らせ、150μlのPBS-BNを添加する。
4．試料をPCRストリップチューブからフィルタープレートに移し、1時間室温で、550 rpmで撹拌しながらインキュベーションする。
5．最後の（標準的な）洗浄後に、5μg/mlのストレプトアビジン-PEを添加し、30分間室温で、550 rpmで撹拌しながらインキュベーションする。
6．PBS-BN（＋追加的な500 mM NaCl）で3回、洗浄する。
7．正規のPBS-BNで、1回の追加的な洗浄を行う。
8．50μlのPBSを試料に添加し、その後、上記のように1.5 mlチューブに収集した。
9．磁気スタンドを用いて磁気ビーズを除去し、新鮮なPBS緩衝液で置換する。
10．その後のDNA抽出および鎖分離のために、試料を-20℃で保存した。
ポジティブ選択の後期のラウンドにおいて実行される任意の工程は、アプタマー結合のストリンジェンシーを増大させることを意図される（例えば、熱または塩濃度の増大）。
実施例8：抗EpCAMアプタマーの発見および特徴決定
本実施例においては、上記の実施例における技術を用いて特定されたEpCAMに対するアプタマーを特徴決定する。上述のようなEpCAM結合アプタマーのプールについての選択後に、Ion Torrent標準プロトコル（Life Technologies, Carlsbad, CA）を用いてアプタマーライブラリーを配列決定した。リード候補を、（a）完全な期待される長さの産物でのすべての読み取り配列にわたる高存在量のモチーフおよび（b）強い二次構造、を有するものとして選択した（図7B）。
アプタマーを、SSX4、SSX2、PBP、KLK2、およびSPDEF組み換えタンパク質との競合において、MicroPlexビーズに結合させたEPCAMタンパク質について選択した。アプタマーの一部を、最初のラウンドにおいて、Fcタグに付加させたEpCAMに対して選択し、ラウンド8後に、選択を、ヒスチジンタグを有するEPCAMに切り換えた。アプタマーの別の一部は、最初のラウンドにおいて、ヒスチジンタグに付加させたEpCAMに対して選択し、ラウンド8後に、選択を、Fcタグを有するEPCAMに切り換えた。タンパク質の精製および捕捉のためにFcタグおよびヒスチジンタグを用いる方法は、当業者に公知である。
アプタマーの特徴決定
CAR003は、上記の方法論を用いて同定されるアプタマー候補である。RNAアプタマーとして、代替的なテール配列を伴うCAR003は、以下のRNA配列（SEQ ID NO: 5）を有する。
Figure 2016533752
CAR003を、さらに特徴決定した。EpCAMアプタマーCAR003を、5'末端への（CAR003.2_5'-B (SEQ ID NO: 4)）または3'末端への（CAR003.2_3'-B (SEQ ID NO: 7)）ビオチン部分の付加により、所望のとおりに修飾する。例えば、標識、捕捉、および/またはアンカリングのため、ビオチンを、ストレプトアビジン-ビオチンシステムを用いてアプタマーに結合するために使用することができる。図7Bは、-30.00 kcal/molの最小自由エネルギー（ΔG）を有するCAR003の最適二次構造を示す。説明の目的で、アプタマーを、CAR003 DNA配列（SEQ ID NO: 4、7）に対応するRNAアプタマー（SEQ ID NO: 5）として示す。
合成および精製
選択されたCAR003アプタマーを、AKTA OligoPilot 100 Synthesizer（GE Healthcare Life Sciences Corp., Piscataway, NJ）を用い、3'ビオチンおよび最終的な脱トリチルを伴って再合成した。産物を、FPLCにより陰イオン交換クロマトグラフィーで精製した。FPLC後のいくつかの画分を、図7Cに示されているプール1〜3として示されるように、組み合わせた。図は、すべての産物、および、ゲル上で品質を確認した後にプールに割り当てられた画分でのFPLCクロマトグラムを含む。図7Dは、合成後のCAR003アプタマーの異なるFPLC画分を有するSYBR GOLD染色ゲルを示す。異なる画分を、高から低への順序で（プール1−プール3）未完成の鎖の量に基づいて、プールにおいて組み合わせた。プール1〜3は、図7Cに示されているものに対応する。
CAR003アプタマーの特徴決定
精製されたCAR003アプタマーを、以下の内部で開発されたアッセイを用いて、ポリヒスチジンタグを有する（「Hisタグ付加された」）組み換えEPCAMタンパク質への結合について試験した。抗Hisタグ結合ビーズを、EPCAM-Hisタグ付加タンパク質と混合した。試験されるべきアプタマーを、ストレプトアビジン-フィコエリスリン（SA-PE）で標識した。EpCAM-ビーズとSA-PE標識アプタマーとを、混合した。結合を、本明細書に記載されているようなビーズアッセイにおいて中央蛍光値として測定した。MFI値（図7E〜図7F）は、組み換えEpCAMに対するSA-PE標識アプタマーの結合の増大と共に増大する。図7E〜図7Fは、PBS-BN（PBS、1％ BSA、0.05％アジド、pH 7.4）を含む25 mM HEPESにおける（図7E）、または1 mM MgCl2を含む25 mM HEPESにおける（図7F）、EPCAMタンパク質へのCAR003の結合を示す。EPCAMアプタマーであるアプタマー4（上記を参照されたい）を、比較のために使用した。図に示されるように、CAR003のプール3は、BSAの存在下（図7E）よりもMgCl2の存在下（図7F）でより効率的に、その標的に結合する。
その性能をさらに理解するために、CAR003の結合を、種々の緩衝液においてBSAおよびMgCl2の両方の存在下で試験した。図7Gは、ウシ血清アルブミン（BSA）の添加を伴うおよび伴わない、示された塩におけるEpCAMへのCAR003の結合を示す。再び、EpCAMへのCAR003の結合は、BSAが存在しない際により効率的である。追加的に、150 mM NaClを試験したが、MgCl2を超えてCAR003の性能を改善するようには見られなかった。
アプタマーの性能に影響を及ぼし得る別の要因は、異なる塩組成での変性である。図7Hは、EPCAMタンパク質へのCAR003の結合に対する変性の効果を示す。チャートから見られるように、アプタマーの変性は、MgCl2由来のCAR003に対する効果と類似した、EpCAMへのCAR003の結合に対する正の効果を有する。しかしながら、MgCl2の存在下での変性は、EpCAMへのCAR003の結合を相乗的には改善し得ない。興味深いことに、CAR003は、試験された条件において対照のアプタマー4と比較してより安定なようであった。
ビーズアッセイ環境におけるEpCAMへのCAR003の親和性を、抗原の一定の投入量にわたって滴定されたアプタマーで上記と同じアッセイにおいて評価した。図7Iは、EPCAM組み換えタンパク質（一定の投入量5μg）に対するアプタマーの滴定を示す。試験された条件下で、5μgのアプタマー投入量で開始する飽和レベルから示唆されるように、アプタマー4は、CAR003と比較してEPCAMタンパク質により高い親和性を有していた。
CAR003の特異性を評定するために、EPCAM組み換えタンパク質、ならびにウシ血清アルブミン（BSA）およびヒト血清アルブミン（HSA）を含む対照に対するウエスタンブロットを用いて試験した。図7Jは、EPCAM hisタグ付加タンパク質、BSA、およびHSA（各々5μg）に対するCAR003アプタマーでのウエスタンブロットを示す。ゲルを、0.5％のF127でブロッキングし、約50μg/mlのCAR003ビオチン化アプタマー、画分3をプローブとした。ブロットを、NeutrAvidin-HRP、それに続くSuperSignal West Femto Chemiluminescent Substrateで可視化した。CAR003アプタマーをプローブとしたウェスタンブロットは、アルブミンを上回る、EPCAMタンパク質に対するアプタマーの明らかな優先傾向を示した。
血漿試料でのCAR003試験
5人の前立腺癌対象および5人の正常対象由来の血漿試料を、CAR003で試験し、微小胞を捕捉するためのビーズ結合タンパク質、および小胞を検出するためのSA-PE標識アプタマーを用いて微小胞を検出した。SA-PE標識アプタマー4検出物質を、対照として用いた。正常を上回る癌の倍率変化（fold change）を、表7に示す。倍率変化を、正規化を伴わず（「未処理」）、または陰性対照に対する正規化を伴って示す。小胞を、示されるようなSSX4、PBP、SPDEF、EPCAM、KLK2、およびSSX2に対する、ビーズ結合抗体で捕捉した。
（表７）微小胞を検出するためのCAR003
Figure 2016533752
試験された条件下で、CAR003で検出された試料は、アプタマー4での検出と比較した際により低いMFI値を有したが、CAR003は、より良好なシグナル対ノイズ比を有し、かつ、SSX4、SPDEF、EPCAM、およびSSX2捕捉マーカーでの癌試料と正常試料との間のより良好な分離を示した。
対照アプタマー
アプタマーの特徴（サイズ、安定性、結合親和性、および特異性など）を、EpCAMまたは他の標的に特異的な対照アプタマーに対して比較することができる。例えば、アプタマーを、Kaur and Yung, 2012に記載されているような抗VEGFアプタマー：
Figure 2016533752
と比較する。
参照文献：
Figure 2016533752
実施例9：アプタマー標的の特定
本実施例においては、ミクロスフェアに結合させたアプタマーを、上述のようなライブラリースクリーニング法により特定された2個のアプタマーの標的を決定することを手助けするために用いる。全般的なアプローチを、図9に示す。アプローチを、EpCAMを認識するライブラリースクリーニングにより特定されたアプタマーであるCAR003の標的を検証するために使用する。CAR003については、上記の記載を参照されたい。本アプローチにおいては、CAR003の配列を、ミクロスフェアへの連結の前にランダムに再配列させる。ミクロスフェアを、意図される標的分子に類似しているが同一ではない標的に結合する対照として、使用する。
使用したプロトコルは以下である。
1）候補アプタマー（ここでは、CAR003）および陰性対照アプタマー（ここでは、ランダムに再配列させたCAR003）を、捕捉を可能にする修飾（ここでは、アプタマーをビオチン化する）および架橋を可能にする修飾（ここでは、光架橋を可能にするために、Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL由来のSulfo-SBED Biotin Label Transfer Reagent and Kit、カタログ番号33073を用いる）を伴って合成する。
2）アプタマーの各々を、関心対象の標的を有する微小胞（ここでは、BrCa細胞系微小胞）と個々に混合する。
3）アプタマーを標的に結合させるために、インキュベーション後に、アプタマーと微小胞標的との架橋を引き起こすように、紫外線を混合物に適用する。
4）微小胞を溶解させ、それにより架橋されたアプタマー-標的複合体を溶液中に放出する。
5）架橋されたアプタマー-標的複合体を、ストレプトアビジンコーティング基体を用いて溶液から捕捉する。
6）各アプタマーについて架橋されたアプタマー-標的複合体を、SDS-PAGEゲル電気泳動上で個々に流す。捕捉されたタンパク質標的を、クマシーブルー染色で可視化する。
7）架橋工程および結合工程は無差別の可能性があるため、意図される標的を含むが、ランダムなタンパク質もまた含む複数のバンドが、ゲルの各々上に現れるであろう。意図される標的は、候補アプタマー（ここでは、CAR003）を有するゲル上には現れるが、関連する陰性対照アプタマー（ここでは、ランダムに再配列させたCAR003）を有するゲル上には現れないバンド中に見出されるであろう。標的に対応するバンドを、ゲルから切り出す。
8）質量分析（MS）を用いて、切り出されたバンドからアプタマーの標的を特定する。
実施例10：乳癌（BrCa）由来の微小胞に対するアプタマー
本実施例においては、アプタマーライブラリーを、乳癌患者の血液中に循環している微小胞と、健康な対照個体（すなわち、乳癌を有していない）の血液中に循環している微小胞とを識別するアプタマーを特定するためにスクリーニングする。
微小胞を、60人の乳癌患者（BrCa+）のプールの血漿から単離した。微小胞をまた、60人の非癌試料（BrCa-）のプールからも単離した。微小胞は、超遠心分離（120,000×g）を用いて血漿から単離した。微小胞は、超遠心分離由来の沈殿物中に存在していた。超遠心分離由来の上清を、対照として使用するために取っておいた。両方の試料タイプ由来の微小胞を、MagPlexビーズ（Luminex Corp, Austin TX）に結合させた。任意で、単離された微小胞を、抗HSA/IgG/フィブリノゲンビーズと、これらの極めて豊富な血液タンパク質を除去するためにインキュベーションした。しかしながら、結合工程は、極めて豊富なタンパク質の除去がそれ程問題にはならないような微小胞の結合に好都合であるように、最適化することができる。
使用されたアプタマーライブラリーは、2'F SUL1 RNAアプタマーライブラリーからなった。配列は、
Figure 2016533752
である。アプタマーライブラリーは、3個のセクションからなる：フォワードプライマー- 15ヌクレオチド、可変領域- 40ヌクレオチド；リバースプライマー- 25ヌクレオチド。すべてのピリミジン（CおよびU）は、2'フルオロ修飾されていた。
アプタマーライブラリーを、癌または対照の微小胞結合ビーズのいずれかとインキュベーションした。微小胞に結合するアプタマーについて13ラウンドのポジティブ選択を、両方のタイプの試料について並行して行った。選択スキームについては、図11A「選択A」を参照されたい。ポジティブ選択工程の詳細のプロトコルについては、後述の実施例11を参照されたい。ネガティブ選択は、行わなかった。
上記のポジティブ選択から保持されたアプタマーを、Ion Torrent NGS（Life Technologies, Inc., Carlsbad, CA）からなる次世代配列決定技術を用いて配列決定した。MiSeqシステムがまた、使用されてもよい（Illumina, Inc., San Diego, CA）。配列を、癌試料において見出され、かつ対照試料において見出されない、およびその逆のアプタマーを特定するために比較する。そのようなアプタマーは、BrCa試料と非BrCa試料とを識別するために使用され得る候補を提供する。
これらの手順から得られた数々の代表的な配列を、表8に示す。表中の配列は、BrCa微小胞に対する選択由来のアプタマープールにおいて特定されたが、非癌試料に対して選択されたアプタマープールにおいては特定されなかった。表8においては、配列を、5'から3'を左から右へ示し、各々の完全な配列は、示された5'リーダー配列、それに続く示された可変配列、それに続く示された3'テール配列からなる。各配列は、間に可変配列を伴う、リーダーおよびテールを有するライブラリー（上述を参照されたい）に由来する。表8に開示されているヌクレオチド配列もまた、得られた修飾が開示配列に対して約50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、および99パーセントの相同性を有するアプタマーをもたらしかつ微小胞抗原またはその機能断片に対する結合機能を保持する程度まで改変され得ることが、理解される。
（表８）BrCa微小胞アプタマー候補配列
Figure 2016533752
表8中の各配列を、さらなる研究のために2種のバリアント：5'ビオチン化および3'ビオチン化において合成する。これは、所望のとおりに5'末端または3'末端で捕捉することができるアプタマーバリアントを提供する。各ピリミジン（CおよびU）が2'フルオロ修飾されたアプタマーを、さらに合成する。
表8中の各RNA配列に対応するDNA配列を、配列表において提供し、そこでは、DNA配列がその対応するRNA配列のすぐ後に続いている。例えば、SEQ ID NO: 9は、RNA配列SEQ ID NO: 8に対応するDNA配列である、などである。アプタマーのDNA形態を、さらなる特徴決定のために同様に合成する。
上記のアプタマーを、ミクロスフェアに結合させたBrCa微小胞および非BrCa微小胞を認識するアプタマーについてのポジティブ選択を用いて特定した。
実施例11：アプタマーライブラリー選択プロトコル
本実施例は、上記の実施例において行われたSUL1 RNAライブラリー選択についてのプロトコルを提供する。プロトコルは、所望のとおりに、他のアプタマーライブラリーおよび試料投入量に採り入れられ得る。
準備
作業空間を、作業前に80％ EtOHで清浄にする。
ビーズは、MagPlexビーズ（Luminex Corp., Austin, TX）である。所望のとおり、他のビーズが代替になり得る。
準備する緩衝液/試薬：
・MilliQ水
・100mM MgCl2
・5×転写緩衝液（200mMトリス pH 7.9）
・1×PBS
・3mM MgCl2を含む1×PBS
・10×PBS
・選択緩衝液（0.1％ BSAおよび3mM MgCl2を含む1×PBS）
選択を開始する前に、ビーズ保存緩衝液を除去し、3mM MgCl2を含む1×PBSでビーズを1回洗浄する（4チューブすべてにおいて全部で200uL）。選択あたり200,000ビーズを使用する。
微小胞コーティング磁気ビーズへの2'F SUL1 RNAプールの結合
略語：TK−転写；NTC−鋳型なし対照。
工程：
1．第1ラウンド：1nmolの精製された2'F SUL1 RNAを、20μlの再懸濁されたビーズ（微小胞と結合させたもの）と混合する。10uLの10×PBS＋1％ BSA、3μl 100 mM MgCl2、および47uL H20。これにより、1×PBS、0.1％ BSA、3mM MgCl2の終濃度になる。
1.1 この工程におけるMgCl2の添加により、3mM MgCl2の濃度になる。これは、プロセス全体のための結合濃度である。
1.2 その後のラウンド：20μlの転写産物（内部に15 mM MgCl2）を、20μlの洗浄された微小胞コーティングビーズ、加えて9uLの1％ BSAを含む10×PBS、51uL H2Oと混合する。希釈された転写産物（TK）中のMgCl2が3mM MgCl2の終濃度を提供するため、追加のMgCl2は必要とされない。
2．30分間37℃でインキュベーションし、1000rpmで振盪し、10分毎にピペットで混合する。
3．ビーズを洗浄する：
3.1 1回の洗浄サイクルは以下を含む：
3.1.1 ビーズを磁石から取り外す。
3.1.2 ビーズを磁石から外して、100μlの1×PBS＋3mM MgCl2に再懸濁する。
3.1.3 試料を磁石から外して、30秒間インキュベーションする。
3.1.4 試料を磁石上に戻して置き、ビーズが側面に寄るまで待つ。
3.1.5 上清を除去して廃棄する。
3.1.6 磁石から外して、100μlの1×PBS＋3mM MgCl2＋0.1％ BSAに再懸濁する。
3.1.7 試料を磁石から外して、3分間インキュベーションする。
3.1.8 試料を磁石上に戻して置き、ビーズが側面に寄るまで待つ。
3.1.9 上清を除去して廃棄する。
3.2 第1ラウンド：ビーズ混合物を磁石上に置き、上清を除去する。100μlの1×PBS＋3mM MgCl2＋0.1％ BSAで1回洗浄し（ビーズをピペットで混合することにより）、緩衝液を廃棄する。
3.3 その後のラウンド：洗浄工程を、1ラウンドおきに、1回多い洗浄工程により3回の洗浄工程まで増大させる。
4．55μlのMilliQ水をビーズ試料に添加する。
5．ビーズ試料を5分間80℃でインキュベーションすることにより、RNAを溶出する。
5.1 50μlあるかどうかを確認し、ない場合は、凝縮された水を上部から離してスピンダウンするために、試料をスピンする。
5.2 上清を新たなバイアルに移す。鎖がビーズに再結合することを回避するために素早く作業する。
5.2.1 その後のRT-PCRに50μlの溶出液を使用し、残りを-20℃で保存する。
回収されたアプタマー候補のRT-PCR
参考事項
・RT-PCR試料およびTK-PCR試料の残りは、-20℃で保存する。
・RNAは、4℃で約1時間保存することができる。
・RT-PCR産物は、一晩4℃で保存することができる。
・最適なRNA品質のために、転写後直ちに次の選択サイクルに進む。
・RNAをボルテックスすることは回避する。
・氷上で混合する。
・0.5ml PCRチューブを使用する。
・すべてのRT-PCRは、鋳型の代わりに水を含む鋳型なし対照（NTC）を有する。
・DTTを、1回より多くは凍結融解しない。
6．第1ラウンドの前にマスターミックスを調製し、それを0.5 pmol RNAで確認し、48μlのアリコートを使用まで-20℃で保存する。
（表９）RT-PCRマスターミックス
Figure 2016533752
7．陰性対照（NTC）としての50μl MilliQ水（これを最初にピペット操作する）または50μl選択溶出液を添加する。ピペットで混合する。
8．65℃で5分間、インキュベーションする。
9．4℃に冷却した後に、以下を添加する：
9.1 1μl Superscript II Reverse Transcriptase（Invitrogen、カタログ番号18064）（200 U/μl）
9.2 1μl GoTaqFlexi DNA polymerase（5単位/μl）Promegaカタログ番号M8305。
PCR-プログラム（SARTPCR）
a）10分、54℃
（この工程は、逆転写酵素のためだけであり、より多くのラウンドが必要とされる場合、工程Aは繰り返さない。）
b）1分、95℃
c）1分、60℃
d）1分、72℃
10．工程b〜dのサイクルを行う。
10.1 第1ラウンドはb〜dを4サイクル。5μLのPCR産物を4％アガロースゲル上で泳動する。
10.1.1 その後のラウンド：RNAの量は第1ラウンド後に減少し、必要とされるPCRサイクルの増大をもたらす。各々の時に必要とされるサイクルの回数を決定するために、前のラウンドの選択から、アガロースゲル由来のバンドの強度を確認する。その回数のサイクルを用いて、次のラウンドのRT-PCRを開始する。注意：常にアガロースゲル上の結果を確認する。
10.1.1.1 アガロースゲルの結果：産物のバンドが、標的の長さで見られるであろう。バンドの強度は、50bpラダーのバンドとほぼ同じであろう（同じでない場合は、少し強度が低い）。バンドが十分な強度ではない（かろうじて見える）場合は、適切な量より多くサイクルを行い、アガロースゲル上で再確認する。
転写
すべての混合を氷上で行う。転写マスターミックスを調製し、85.7μlのアリコートを使用まで-20℃で保存する。
11．使用前に、ストックの200 mMトリス pH 7.9のpHを検証する。経時的なpHの変化は、転写で問題を引き起こす可能性がある。
（表１０）SUL1ライブラリーのための転写（TK）マスターミックス
Figure 2016533752
12．10μlのRT-PCR産物を、マスターミックスに添加する。
13．1μlのRNasin（40単位/μl）を添加する。
13.1 Promega Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor カタログ番号N2515/N2511
14．4μlのT7 Y639F変異ポリメラーゼを添加する（25U/μl使用：反応当たり全部で100U）。
15．反応を30分間、37℃で行う。
16．転写産物を、次の選択ラウンドに直接使用する。次の工程が実行可能ではない場合は、転写産物を-20Cで凍結する。
その後のラウンド
ビーズのインキュベーション、RT-PCRおよび転写を、必要に応じてしばしば繰り返す。上述したように、すべてのラウンドにおいて試料について類似したバンド強度のRT-PCR産物を有するように努める。
結合アッセイ
癌で選択されたアプタマーの対照ビーズ（血漿超遠心分離由来の上清に結合させたもの、上記を参照されたい）への非特異的な結合を決定して評価するために、望ましいラウンドの選択後に結合アッセイを行い、同様に非癌対照試料についても行う。結合アッセイはまた、選択されたアプタマーの意図される標的微小胞に対する結合を評価するために行うこともできる。
チェレンコフプロトコル：32Pで放射性標識されたアプタマーライブラリーを用いて行う。
選択緩衝液の終濃度：1×PBS＋3mM MgCl2＋0.01％ BSA pH7.4
洗浄緩衝液：1×PBS＋3mM MgCl2 pH7.4
1．-80℃冷凍庫から微小胞試料を取り出して、融解する。
2．ビーズを磁石上に置き（試料実験当たり200,000個）、ビーズ保存緩衝液を除去する。
3．1×PBS、3mM MgCl2緩衝液で各々1分間、1×200μLで洗浄する。1チューブ中に200,000個になるようにビーズをプールする。
4．ビーズを70μLの選択緩衝液に再懸濁する。（試料当たり10μlの10×PBS、1％ BSA＋3μL 100mM MgCl2＋57μL H2O）。
5．30μLの放射性標識されたRNAアプタマーライブラリーを、それぞれの試料に添加する。
6．1000 rpmで振盪しながら、37℃で30分間インキュベーションする。
7．試料を磁石上に置く。
8．上清を除去して取っておく。
9．ビーズを、200μLの洗浄緩衝液1×PBS 3mM MgCl2 pH 7.4で、磁石から外して3分間インキュベーションし、洗浄する。
10．試料を磁石上に置き、洗浄溶液を除去して取っておく。
11．工程9、10を繰り返す。
12．100μLの水を試料に添加し、ピペットで混合する。
13．80℃で5分間、加熱する。
14．試料を磁石上に置き、上清を除去して取っておく。
15．ビーズを、100μLの水に再懸濁する。
16．シンチレーションカウンターを用いて、すべての画分の放射活性を測定する。
17．存在するバックグラウンド結合の量を解析する。
ネガティブ選択
所望のとおり、ネガティブ選択工程を、アプタマーライブラリーを標的微小胞に結合させたビーズとインキュベーションする前に追加する（すなわち、上記の「微小胞コーティング磁気ビーズへの2'F SUL1 RNAプールの結合」の手順）。ネガティブ選択は、微小胞を試料から濾過または遠沈させた後の上清または投入試料（例えば、血漿）に結合させたビーズ（「非微小胞コーティングビーズ」、「微小胞枯渇試料」、または類似して呼ばれる）を用いて行うことができる。工程は、以下である。
1）上述のような転写後の望ましいラウンド由来のアプタマーライブラリー産物で開始する。開始前にビーズを洗浄する：保存緩衝液を除去し、ビーズを200μLの洗浄緩衝液で洗浄し、その後、下記に述べるような緩衝液に置換する。
2）ネガティブ選択工程：20μlの新たに洗浄された非微小胞コーティングビーズを伴う転写産物（15 mM MgCl2）と、10μLの1％ BSAを含む10×PBS、70μL H2Oとを添加し、ピペットで混合する。希釈された転写産物（TK）中のMgCl2が3mM MgCl2の終濃度を提供するため、追加のMgCl2は必要とされない。
3）30分間37℃でインキュベーションし、1000rpmで振盪する。
4）上清を除去して、それを、洗浄された微小胞コーティングビーズであるポジティブ選択ビーズに（直接）添加する。
ポジティブ選択インキュベーションを継続する。工程2で開始する、上記の微小胞コーティング磁気ビーズへの2'F SUL1 RNAプールの結合を参照されたい。転写を通した追加的な工程は、上記で詳細に述べたようである。
実施例12：乳癌（BrCa）由来の微小胞に対する追加的なアプタマー
本実施例においては、アプタマーライブラリーを、乳癌患者の血液中に循環している微小胞と、健康な対照個体（すなわち、乳癌を有していない）の血液中に循環している微小胞とを識別するアプタマーを特定するためにスクリーニングする。この手順は、上記の実施例10におけるものと同じ試料およびアプタマーライブラリーを使用した。本実施例の手順は、ネガティブ選択を第3ラウンドのポジティブ選択後に開始して、各ポジティブ選択の前に行った点で異なる。
ネガティブ選択は、癌については可溶性で/豊富で/情報を与えずかつ一般的なタンパク質および非癌タンパク質に結合するアプタマーを除去するのに役立つ。ネガティブ選択は、以下のように、BrCa+微小胞に対して選択されたアプタマー候補についてネガティブ選択を行うことを含む：（i）BrCa+血漿の超遠心分離工程由来の上清（微小胞を含有しないはずである）に結合させたマイクロビーズを用いること；（ii）BrCa-血漿の超遠心分離工程由来の上清（微小胞を含有しないはずである）に結合させたマイクロビーズを用いること；（iii）BrCa-微小胞に結合させたマイクロビーズを用いること。ネガティブ選択はまた、以下のように、BrCa-微小胞に対して選択されたアプタマー候補について行うこともできる：（i）BrCa+血漿の超遠心分離工程由来の上清（微小胞を含有しないはずである）に結合させたマイクロビーズを用いること；（ii）BrCa-血漿の超遠心分離工程由来の上清（微小胞を含有しないはずである）に結合させたマイクロビーズを用いること；（iii）BrCa+微小胞に結合させたマイクロビーズを用いること。ネガティブ選択のラウンドは、本明細書に記載されているようなポジティブ選択のラウンド間に行う。
微小胞を、60人の乳癌患者のプールの血漿から単離した（BrCa+）。また微小胞を、60人の非癌試料のプールからも単離した（BrCa-）。微小胞は、超遠心分離（120,000×g）を用いて、血漿から単離した。微小胞は、超遠心分離由来の沈殿物中に存在していた。超遠心分離由来の上清を、対照として使用するために取っておいた。両方の試料タイプ由来の微小胞を、MagPlexビーズ（Luminex Corp, Austin TX）に結合させた。
使用されたアプタマーライブラリーは、2'F SUL1 RNAアプタマーライブラリーからなっていた。配列は、
Figure 2016533752
である。アプタマーライブラリーは、3個のセクションからなる：フォワードプライマー- 15ヌクレオチド、可変領域- 40ヌクレオチド；リバースプライマー- 25ヌクレオチド。すべてのピリミジン（CおよびU）は、2'フルオロ修飾されていた。
アプタマーライブラリーを、癌または対照の微小胞結合ビーズのいずれかとインキュベーションした。微小胞に結合するアプタマーについて9ラウンドのポジティブ選択を、両方のタイプの試料について並行して行った。ラウンド4〜9においてポジティブ選択の前に、超遠心分離後の投入血漿上清に結合させたビーズに対するネガティブ選択を行った。ポジティブ/ネガティブ選択スキームについては、図11A「選択B」および図11D〜11Eを参照されたい。ポジティブ選択工程およびネガティブ選択工程のプロトコルについては、上記の実施例11を参照されたい。
上記のポジティブ選択から保持されていたアプタマーを、Ion Torrent NGS（Life Technologies, Inc., Carlsbad, CA）からなる次世代配列決定技術を用いて配列決定した。MiSeqシステムもまた使用可能である（Illumina, Inc., San Diego, CA）。配列を、癌試料において見出され、かつ対照試料において見出されない、およびその逆のアプタマーを特定するために比較する。そのようなアプタマーは、BrCa試料と非BrCa試料とを識別するために使用され得る候補を提供する。
配列決定データを、以下の手順に従って解析した。
工程1：配列を、微小胞を枯渇させた癌血漿に結合させたビーズに対するネガティブ選択、それに続く癌微小胞に結合させたビーズに対するポジティブ選択後にラウンド9において回収されたアプタマープール全体における頻度に従って、ランク付けした。
工程2：倍率変化を、工程1に述べられている試料と：（i）微小胞を枯渇させた癌血漿に対する追加的なネガティブ選択後の同じ試料；（ii）非癌微小胞に対する追加的なネガティブ選択後の同じ試料；（iii）微小胞を枯渇させた非癌血漿に対する追加的なネガティブ選択後の同じ試料との間で算出した。
工程3：乳癌由来の微小胞について選択されたアプタマープールにおいて豊富であるかまたは欠損している配列を特定するために、配列を、工程2において算出された倍率変化に基づいてランク付けした。
工程4：可能性がある変異配列（例えば、PCRまたは他のエラーによる）を、圧密解析の結果に基づいて除去した。
工程5：すべての3種のバリアント（工程2におけるi、ii、およびiii）において、3より大きい倍率変化および最低頻度50を有する配列を特定した。
工程1〜5におけるものと同じ選択スキームを、非癌微小胞に結合させたビーズに対して選択されたアプタマーについて行った。
これらの手順から得られた数々の代表的な配列を、表11に示す。表中の配列は、BrCa微小胞に対する選択由来のアプタマープールにおいて特定されたが、非癌試料に対して選択されたアプタマープールにおいては特定されなかった。表11においては、配列を、5'から3'を左から右へ示し、各々の完全な配列は、示された5'リーダー配列、それに続く示された可変配列、それに続く示された3'テール配列からなる。各配列は、間に可変配列を伴う、リーダーおよびテールを有するライブラリー（上述を参照されたい）に由来する。表11に開示されているヌクレオチド配列もまた、得られた修飾が開示配列に対して約50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、および99パーセントの相同性を有するアプタマーをもたらしかつ微小胞抗原またはその機能断片に対する結合機能を保持する程度まで改変され得ることが、理解される。
（表１１）BrCa微小胞アプタマー候補配列
Figure 2016533752
Figure 2016533752
表11における各配列を、さらなる研究のために2種のバリアント：5'ビオチン化および3'ビオチン化において合成する。これは、所望のとおりに5'末端または3'末端で捕捉することができるアプタマーバリアントを提供する。各ピリミジン（CおよびU）が2'フルオロ修飾されたアプタマーを、さらに合成する。アプタマーはまた、表11における各RNA配列に対応するDNA配列として合成されてもよい。アプタマーライブラリーをまた、予測される二次配列、自由エネルギー、および本明細書に記載されているような他のパラメータに基づいて選別することもできる。
図10A〜図10Cは、種々の投入試料に結合させたマイクロビーズに対する、表11におけるアプタマーの結合を示す。アプタマーは、各プロットの上に示されており、各アプタマーのプロットは表１１のIDの列を意味している。表11を参照されたい。投入試料は、X軸上に左から右へ、以下のように示されている：1）癌エキソソーム：乳癌患者由来の血漿試料から単離された微小胞に結合させたマイクロビーズに対するアプタマー結合；2）癌非エキソソーム：超遠心分離による微小胞の除去後の乳癌患者由来の血漿試料に結合させたマイクロビーズに対するアプタマー結合；3）非癌エキソソーム：正常（すなわち、非乳癌）患者由来の血漿試料から単離された微小胞に結合させたマイクロビーズに対するアプタマー結合；4）非癌非エキソソーム：超遠心分離による微小胞の除去後の乳癌患者由来の血漿試料に結合させたマイクロビーズに対するアプタマー結合。図10A〜図10Cに示されるように、アプタマーは、各々、癌微小胞試料対上清対照試料および非癌微小胞を識別することができた。さらに、表11中のすべての配列が、癌由来の微小胞と比較した際に非癌由来の微小胞により豊富に結合すると観察されたBCE10およびBCE14を除いて、非癌由来の微小胞と比較した際に癌由来の微小胞により豊富に結合すると観察された。
SEQ ID NO: 44〜10527は、この実施例において、この実施例に記載される他の試料（たとえば、上清対照または非癌微小胞にコンジュゲートしたビーズ）よりも乳癌患者由来の血漿試料から単離された微小胞にコンジュゲートしたマイクロビーズに優先的に結合するものとして同定された配列のリストを含む。これらの配列は、上記工程2におけるように選択された配列（すなわち、乳癌患者由来の微小胞にコンジュゲートしたマイクロビーズに対して選択された配列ならびに（i）微小胞枯渇癌血漿に対するさらなるネガティブ選択後の配列；（ii）非癌微小胞に対するさらなるネガティブ選択後の配列；（iii）微小胞枯渇非癌血漿に対するさらなるネガティブ選択後の配列）の組み合わせを含む。SEQ ID NO: 44〜10527は、上記5'および3'テールを有する出発ライブラリーからの40ヌクレオチド可変領域を示す（たとえば、SEQ ID NO: 23および表11を参照）。これらのアプタマーを使用して、乳癌細胞由来の微小胞または非乳癌細胞由来の微小胞を検出することができる。本明細書に記載される様々な用途において、アプタマーは、癌の診断、予後判定またはセラノーシスのために使用することができる。
本実施例において行われた比較に基づいて、以下を含む、異なる出発投入物に結合するアプタマーが得られる：1）非癌由来の微小胞を上回って癌由来の微小胞に優先的に結合するアプタマー；2）癌由来の微小胞を上回って非癌由来の微小胞に優先的に結合するアプタマー；3）非癌由来の微小胞および癌由来の微小胞の両方に結合するアプタマー（例えば、「万能」結合物質）；ならびに4）微小胞を枯渇させている血漿成分に結合するアプタマー。
本実施例におけるアプタマーライブラリーを、4ラウンドの追加的なネガティブ選択およびポジティブ選択にさらに供する。ポジティブ/ネガティブ選択スキームについては、図11G「SELEX C」を参照されたい。ポジティブ選択は、本実施例に記載されているように行う。ネガティブ選択のラウンドは、癌微小胞に結合させたビーズに対するポジティブ選択により得られたアプタマーについて、ネガティブ選択として非癌微小胞に結合させたビーズを用いて行う。同様に、ネガティブ選択のラウンドを、非癌微小胞に結合させたビーズに対するポジティブ選択により得られたアプタマーについて、ネガティブ選択として癌微小胞に結合させたビーズを用いて行う。
実施例13：疾患の診断
本実施例は、増殖性疾患を診断するための本発明のアプタマーの使用を例証する。
実施例10または実施例12で同定されたものなどのBrCa由来の微小胞に結合する、適当な量のアプタマーを、当技術分野において公知である化学的手段を介して合成する。アプタマーを、当技術分野において公知である結合法を用いて、蛍光部分などの、検出に適した診断物質に結合させる。
組成物を、微小胞の過剰発現と関連する増殖性疾患、例えば乳癌を患う患者の試験コホートより採取された血液試料から単離された微小胞に適用する。組成物を、増殖性疾患を患っていない陰性対照コホートより採取された血液試料から単離された微小胞に、同様に適用する。
試験コホート試料に対する適切な検出技術（例えば、マイクロビーズアッセイまたはフローサイトメトリー）の使用により、疾患が存在することが示され、他方、対照コホート試料に適用された同じ技術により、疾患が存在しないことが示される。
結果により、本発明のアプタマーが増殖性疾患を診断するのに有用であることが示される。
実施例14：治療用アプタマー
本実施例は、マウスにおいて増殖性疾患を治療するための本発明のアプタマーの使用を例証する。
実施例10または実施例12で同定されたものなどのBrCa由来の微小胞に結合する、適当な量のアプタマーを、当技術分野において公知である化学的手段を介して合成する。アプタマーを、当技術分野において公知である結合法を用いて、化学療法剤、例えばDoxilに結合させる。結合体を、水性組成物において製剤化する。
組成物を、微小胞の過剰発現と関連する増殖性疾患、例えば乳癌を患うマウスモデルの試験コホートに、1つまたは複数の用量において、静脈内投与する。増殖性疾患を患っていない対照コホートに、対応する投薬レジメンに従って、同一組成物を静脈内投与する。
腫瘍試料の病理解析および/またはマウスの生存により、死亡率および/または罹患率が、対照コホートを上回って試験コホートにおいて改善されることが示される。
結果により、本発明のアプタマーが増殖性疾患を治療するのに有用であることが示される。
有用なアプタマーを、他の生物、例えばヒトにおいて乳癌を治療するために使用することができる。
実施例15：オリゴヌクレオチド-配列決定検出法
本実施例は、関心対象の表現型を示す微小胞を検出するためのオリゴヌクレオチドプールの使用を例証する。方法は、関心対象の表現型を示す関心対象の標的に対して富化されているオリゴヌクレオチドのプールを使用する。本実施例における方法により、標的実体を優先的に認識するためのオリゴヌクレオチドのライブラリーの効率的な使用が可能になる。
例証の目的で、方法を、体液試料由来の微小胞標的を用いて、実施例において記載する。当業者は、所望の投入試料に対するオリゴヌクレオチドライブラリーを富化することにより、方法を、他のタイプの標的実体（例えば、細胞、タンパク質、および種々の他の生物学的複合体）、試料（例えば、組織、細胞培養物、生検、および他の体液）、および他の表現型（他の癌、他の疾患など）に拡大できることを、理解するであろう。
全般的なワークフロー：
1）未知の医学的語源を有する患者の試料（血漿、血清、尿、または任意の他の生物学的試料）を取得し、関心対象の標的の利用可能性を確実にするために、それに応じて前処理する（下記を参照されたい）。関心対象の標的が微小胞集団である場合は、微小胞を単離することができ、任意で、マイクロビーズなどの固体支持体につなげることができる。
2）前処理した試料を、関心対象の標的に対してある特定の特異性を保有するオリゴヌクレオチドプールに曝露する。本明細書に記載されているように、関心対象の標的に対してある特定の特異性を保有するオリゴヌクレオチドプールは、種々の選択スキームを用いて、例えば、上述のようなネガティブ選択のための非癌微小胞およびポジティブ選択のための癌微小胞を用いて、富化することができる。DNAオリゴヌクレオチドまたはRNAオリゴヌクレオチドを、所望のとおりに使用することができる。
3）オリゴヌクレオチドライブラリーを試料と接触させる。
4）標的に結合した任意のオリゴヌクレオチドを溶出する。
5）溶出されたオリゴヌクレオチドを配列決定する。次世代配列決定法を使用することができる。
6）配列決定由来のオリゴヌクレオチドプロファイルを解析する。関心対象の標的に結合することが公知のオリゴヌクレオチドのプロファイルにより、投入試料内に標的が存在することが示される。プロファイルを、例えば、癌または非癌として、試料を特徴決定するために使用することができる。
プロトコルの変形：
様々な構成のアッセイが実施されうる。以下は、オリゴヌクレオチド-配列決定アッセイの目的を果たす4種の例示的プロトコルである。試料は、任意の生物学的試料であることができる。
プロトコル1：
微小胞を単離するための、沈殿の2回の洗浄を伴う、1〜5 mlの体液試料（例えば、血漿/血清/尿）の超遠心分離（120K×g、スクロースなし）。
単離された微小胞を含有する、回収された試料の全タンパク質濃度を測定する。
単離された微小胞を、磁気ビーズ（例えば、MagPlexビーズ（Luminex Corp. Austin TX））に結合させる。
結合させた微小胞を、関心対象のオリゴヌクレオチドプールとインキュベーションする。
磁石を用いてビーズを保持することにより、結合していないオリゴヌクレオチドを洗浄する。
微小胞に結合したオリゴヌクレオチドを溶出する。
溶出されたオリゴヌクレオチドを増幅および精製する。
オリゴヌクレオチド配列決定（例えば、次世代法；Ion Torrent：融合PCR、エマルジョンPCR、配列決定）。
オリゴヌクレオチドプロファイルを評価する。
プロトコル2：
この代替的なプロトコルは、微小胞単離工程、ビーズへの微小胞の結合、または分離した分配工程を含まない。これは、投入試料に対するオリゴヌクレオチドの非特異的結合を示す可能性がある。
体液試料から細胞/破片を除去し、試料を、MgCl2（2mM）を含有するPBSで希釈する。
上記で調製された試料を、オリゴヌクレオチドライブラリーとあらかじめ混合する。
オリゴヌクレオチド/試料混合物の超遠心分離（120K×g、スクロースなし）。沈殿した微小胞を洗浄する。
沈殿を回収して、微小胞に結合したオリゴヌクレオチドを溶出する。
溶出されたオリゴヌクレオチドを増幅および精製する。
オリゴヌクレオチド配列決定（例えば、次世代法；Ion Torrent：融合PCR、エマルジョンPCR、配列決定）。
オリゴヌクレオチドプロファイルを評価する。
プロトコル3：
このプロトコルは、超遠心分離の代わりに濾過を使用し、より少ない時間および試料容積を必要とするものである。
体液試料から細胞/破片を除去し、それを、MgCl2（2mM）を含有するPBSで希釈する。
上記で調製された試料を、オリゴヌクレオチドライブラリーとあらかじめ混合する。
試料をフィルター（すなわち、150Kもしくは300K MWCOフィルター、または、結合していないもしくは望ましくないオリゴヌクレオチドを排除することができる任意の他のもの）中にローディングする。試料を遠心分離して濃縮する。濃縮された試料は、微小胞を含有するはずである。
濃縮物を洗浄する。バリアント1：濃縮物を上記で特定された緩衝液で元の容積に希釈し、遠心分離を繰り返す。バリアント2：濃縮物を上記で特定された緩衝液で元の容積に希釈し、濃縮物を新たなフィルター単位に移して、遠心分離する。2回繰り返す。
濃縮物を回収して、微小胞に結合したオリゴヌクレオチドを溶出する。
溶出されたオリゴヌクレオチドを増幅および精製する。
オリゴヌクレオチド配列決定（例えば、次世代法；Ion Torrent：融合PCR、エマルジョンPCR、配列決定）。
オリゴヌクレオチドプロファイルを評価する。
プロトコル4：
微小胞を単離するための、沈殿の2回の洗浄を伴う、1〜5 mlの体液試料の超遠心分離（120K×g、スクロースなし）。
微小胞をオリゴヌクレオチドプールとあらかじめ混合する。
試料を300K MWCOフィルター単位中にローディングし、遠心分離（2000×g）する。濃縮率は、約3倍である。
濃縮物を洗浄する。バリアント1：濃縮物を上記で特定された緩衝液で元の容積に希釈し、遠心分離する。2回繰り返す。バリアント2：濃縮物を上記で特定された緩衝液で元の容積に希釈し、濃縮物を新たなフィルター単位に移して、遠心分離する。2回繰り返す。
濃縮物を回収して、微小胞に結合したオリゴヌクレオチドを溶出する。
溶出されたオリゴヌクレオチドを増幅および精製する。
オリゴヌクレオチド配列決定（例えば、次世代法；Ion Torrent：融合PCR、エマルジョンPCR、配列決定）。
オリゴヌクレオチドプロファイルを評価する。
上記プロトコルの代替法においては、患者試料から微小胞を単離するためにポリマー沈殿を用いる。例えば、オリゴヌクレオチドを試料に添加し、次にPEG4000またはPEG8000を4％または8％濃度で用いて沈殿させ、それによって微小胞を単離する。続けて、溶出、回収、および配列解析を上記の通り行う。
実施例16：オリゴヌクレオチド配列決定を用いた乳癌由来の微小胞の検出
上記の実施例15における方法を、乳癌細胞に由来する体液試料において微小胞を検出するために使用する。オリゴヌクレオチドライブラリーは、非癌個体に対して乳癌患者由来の微小胞に優先的に結合する、上記の実施例12に記載されているオリゴヌクレオチドのサブセットを含む。配列を、SEQ ID NO: 24〜10527として本明細書に列挙する。方法を、乳癌を示す微小胞の有無を検出するために使用する。
試験試料は、乳房生検を受ける予定の患者から収集された血漿試料を含む。試験試料は、本発明の方法による特徴決定の対象となる試料である。方法を、乳癌由来の微小胞の有無を判定するために行う。
実施例17：微小胞のためのアプタマー選択
古典的なアプタマー選択技術（すなわち、SELEX）は、典型的に、非標的分子（競合相手）での干渉が最小化されている「きれいな」条件において、特定の標的についてアプタマーを富化するために行われる。しかしながら、選択されたアプタマーについての種々の用途は、アプタマーが、多様な環境において、例えば豊富な潜在的干渉分子を伴う生物学的試料または組織培養培地において、その標的に結合するように働くことを必要としている。この場合には、選択プロセス中に存在しなかったそのような干渉分子が、より理想的な条件において選択されたアプタマーによる標的に認識を干渉する可能性がある。本実施例は、標的に対して非常に特異的なアプタマーを選択するためにアプタマーライブラリーをスクリーニングし、かつまた、潜在的干渉分子を含む生物学的試料において行うことができるアプタマー選択プロセスを提供する。
本実施例において、標的は、正常（非癌対照）微小胞と比較した際に癌由来の微小胞に結合するメンバーについてアプタマーライブラリーをスクリーニングするように、微小胞を含む。当業者は、方法を、他のタイプの標的実体（例えば、細胞、タンパク質、種々の他の生物学的複合体）に拡大できることを、理解するであろう。方法は、種々の試料タイプ（例えば、組織、細胞培養物、生検、および様々な体液）を使用することができ、かつ所望の投入試料に対してアプタマーライブラリーを富化することにより、種々の表現型（種々の癌、他の疾患など）を特徴決定するために使用され得る標的分子に方向づけることができる。さらに、癌試料および正常試料を、正常試料に優先的に結合するアプタマーについてスクリーニングするように切り換えることができる。
バリアント1：微小胞を枯渇させた血漿との競合における、微小胞ベースのアプタマー選択。ワークフロー：
→微小胞を、超遠心分離を用いて癌および正常の血漿試料から単離する。微小胞枯渇試料を構成する上清を、陰性対照試料として保存する。
→単離された微小胞を、磁気ビーズに捕捉/結合させる。
→上記由来の上清（すなわち、微小胞枯渇血漿）と混合された微小胞結合ビーズを用いて、アプタマースクリーニングおよび選択プロセスを開始する。上清にMgCl2を補給する。癌由来および正常（非癌由来）の微小胞についてのアプタマースクリーニングおよび選択を、並行して行うことができる。各ラウンドは、所望のとおりにネガティブ選択およびポジティブ選択からなる。
最初のアプタマーライブラリーを、微小胞標的および血漿由来の競合相手（可溶性タンパク質）に同時に曝露するため、微小胞/ビーズから回収されたアプタマーは、微小胞膜上の標的に対してより特異的であり得る。そのようなアプタマーは、標的結合/検出の前に標的の大規模な精製を必要とすることなく、生物学的試料において有効に機能し得る。
バリアント2：正常試料から単離された微小胞との競合における、癌由来の微小胞（例えば、癌細胞から流出）についてのアプタマー選択。ワークフロー：
→微小胞を、超遠心分離を用いて癌および正常の血漿試料から単離する。
→単離された癌由来の微小胞を、磁気ビーズに捕捉/結合させる。
→MgCl2を補給した正常微小胞（非結合）と混合された癌微小胞結合ビーズを用いて、アプタマースクリーニングおよび選択プロセスを開始する。アプタマースクリーニングおよび選択を、磁気ビーズで保持されているアプタマーのみを保持することにより、癌由来の微小胞のみについて行う。
アプタマーライブラリーを、両方のタイプの微小胞（癌および正常）に同時に曝露することになるため、方法は、非癌微小胞の存在下で癌由来の微小胞に優先的に結合するアプタマーを選択する。
バリアント3：正常血漿（微小胞を枯渇させていない）との競合における、癌由来の微小胞（例えば、癌細胞から流出）についてのアプタマー選択。ワークフロー：
→微小胞を、超遠心分離を用いて癌血漿試料から単離する。
→単離された癌由来の微小胞を、磁気ビーズに捕捉/結合させる。
→MgCl2を補給した正常血漿（非結合）と混合された癌微小胞結合ビーズを用いて、アプタマースクリーニングおよび選択プロセスを開始する。アプタマースクリーニングおよび選択を、磁気ビーズで保持されているアプタマーのみを保持することにより、癌微小胞のみについて行う。
このアプローチは、上記のバリアント1および2の利点を組み合わせる。各ラウンドは、正常血漿との競合を含む。アプタマーは、干渉する血漿タンパク質および他の生物学的実体の存在下では、標的に対してより選択的であろう。
バリアント4：混合されたビーズ上での並行の癌/正常アプタマー選択。ワークフロー：
→癌由来の微小胞を、磁気ビーズに捕捉/結合させる。
→正常（非癌）微小胞を、非磁気ビーズに捕捉/結合させる。
→両方のビーズセットを混合し、開始アプタマーライブラリーでアプタマースクリーニングおよび選択プロセスを行う。
→アプタマーライブラリーとのインキュベーション後に、磁気ビーズと非磁気ビーズとを分離する。磁石を用いて磁気ビーズを捕捉し、その後、遠心分離して非磁気ビーズを分離する。
→分離された磁気ビーズおよび非磁気ビーズを、別々に洗浄する。
→両方のタイプのビーズから別々に、アプタマーを溶出および再増幅する。
→ラウンド2：両方のタイプのビーズから増幅されたアプタマープールを混合し、混合されたビーズに添加する。
→上記を繰り返す。
バリアント4の潜在的な利点には、以下が含まれる：（i）癌微小胞および非癌微小胞の両方についてアプタマースクリーニングおよび選択プロセスを開始するために、同じアリコートのアプタマーライブラリーを使用すること；（ii）癌微小胞と非癌微小胞との間の競合を、各ラウンドにおいて1つの混合物中で直接使用すること；（iii）上清を、選択ストリンジェンシーを増大させるために追加的な競合相手として添加できること；（iv）正常のみまたは癌のみを特定するアプタマーをもたらすための競合における、癌特異的アプタマーおよび非癌特異的アプタマーについての並行富化（いずれか1つに結合する選択があるため）。
実施例18：乳癌（BrCa）由来微小胞へのアプタマーの同定
この実施例においては、アプタマーライブラリーをスクリーニングして、乳癌患者の血液中を循環する微小胞と、健康な対照個人（すなわち、乳癌ではない）の血液中を循環する微小胞とを区別するアプタマーを同定する。手順は、上記実施例12と類似した試料、出発アプタマーライブラリーならびにポジティブおよびネガティブ選択のラウンドを使用した。この実施例における手順は、以下に提示する分析論理およびワークフローにおいて異なる。
分析論理
実施例12におけるものに代わる配列決定データ分析のバリアントを、癌/非癌エキソソームおよび対応する微小胞枯渇血漿に対してプロービングされた10ラウンドのポジティブおよびネガティブ選択（R10）後の癌/非癌富化SUL1 RNAライブラリーからのデータに適用した（実施例12を参照）。この実施例に使用された配列決定データを分析するための具体的な変更は以下のとおりである。
-全回収率および再増幅によって影響されるおそれのある未処理の読み取りカウントではなく、特定のアプタマーの頻度を使用した。全カウント（正しいプライマーとの全アプタマー長）に対する特定のアプタマーの読み取りカウントの正規化は全集団中の特定のアプタマーの相対存在量を考慮し、それが、標的からの溶出と配列決定との間の全工程中の一貫性を高め得る。
-はじめにアプタマー選択のための基準として使用される特定のアプタマーの富化（標的から溶出したアプタマーの頻度/投入ライブラリー中の同じアプタマーの頻度）が、カウントを無視してすべてのアプタマーに関する結合能力の速やかな推定を可能にする。以前に適用されたすべてのアプタマー選択戦略は最高頻度のアプタマーのみを考慮するものであったことに留意すること。
-倍率変化を使用して、標的への結合と非標的への結合との差を計測する。ここで、倍率変化は、富化を示したアプタマーの頻度だけに適用される。
-RNA vs DNA。選択は、dsDNAとRNAとの混合物で実施されたため。いずれの形態のアプタマーも結合物質であり得る。これに対処するために、四つの試料をdsDNAアプタマーライブラリーでプロービングし（ラウンド10の選択への前駆体）、特定のRNAの頻度をDNA形態の同じアプタマーの頻度で割った。
分析ワークフロー
1）全読み取り数中の正しいプライマーとの各アプタマーの頻度を計算する。
2）癌微小胞と投入ライブラリーとの結合から回収された配列と、他の三つのタイプの試料（微小胞を枯渇させた癌小胞上清、非癌微小胞、微小胞を枯渇させた非癌上清）への結合から回収された配列と、dsDNA結合から回収された配列とを重ね合わせる。
3）投入ライブラリーと比較して、癌微小胞に結合したRNAライブラリー中の特定のアプタマーの「富化」を計算する。投入集団と結合集団との間のアプタマー頻度における差（投入物と比較して頻度が2〜5倍、5〜10倍および10倍超）に基づく三つのしきい値クラスを考慮する。
4）癌微微小胞に結合したRNAライブラリー中の特定のアプタマーを、微小胞を枯渇させた癌血漿、非癌微小胞および微小胞を枯渇させた非癌血漿に結合したライブラリー中の同じ配列と比較したときの「倍率変化」を計算する。2以上の倍率変化を考慮する。
5）癌微小胞上の特定のRNAアプタマーを、対応するDNAアプタマーの富化と比較したときの頻度の差を計算する。0.5〜1.5のRNA/dsDNA頻度比を有するアプタマーは、dsDNAおよびRNAの両形態中の微小胞に結合している場合がある。2以上のRNA/dsDNA頻度比を有するアプタマーは、RNAアプタマーとしてより効率的に結合し得る。
6）10よりも大きい「富化」に関してデータをフィルタリングする。三つの対照試料タイプ（微小胞を枯渇させた癌血漿上清、非癌微小胞、微小胞を枯渇させた非癌上清）の倍率変化は>＝2である。これが第一のアプタマーリストを提供する。5〜10および2〜5の範囲の「富化」に関してフィルタリングを繰り返すと、相応に、第二および第三のアプタマーリストが得られる。
7）どちらのアプタマー形態（すなわちDNAまたはRNA）がより効率的な結合を有し得るかを識別するために、最終のアプタマーリスト中のRNA/dsDNA比を考慮する。
これらの手順から得られたいくつかの代表的配列を表12に示す。表中の配列は、上記ワークフローを使用して、他の血漿成分または非癌血漿と比較して、BrCa血漿から単離された微小胞に選択的に結合するものとして同定された。表12中、配列は、左から右に5'〜3'で示され、各完全な配列は、表記5'リーダー配列、次いで表記可変配列、次いで表記3'テール配列からなる。各配列は、リーダーおよびテール（上記を参照）をそれらの間の可変配列と共に有するライブラリーから導出される。表12に開示されているヌクレオチド配列はまた、開示された配列に対して約50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98および99％の相同性を有するアプタマーを生み出し、かつ微小胞抗原またはその機能的断片への結合の機能性を保持する程度に修飾されることもできることが理解されよう。
（表１２）BrCa微小胞アプタマー候補配列
Figure 2016533752
Figure 2016533752
Figure 2016533752
表12中のアプタマーは、投入ライブラリーと比較して、非癌微小胞に対し、癌微小胞に対して選択されたアプタマー中で少なくとも10倍および少なくとも5倍有効である富化を有するものとして同定された。
表12中の各配列は、さらなる調査のために二つのバリアント：5'ビオチン化および3'ビオチン化で合成される。これは、所望により5'末端または3'末端で捕捉することができるアプタマーバリアントを提供する。アプタマーはさらに、各ピリミジン（CおよびU）が2'フルオロ修飾された状態で合成される。表12中の各RNA配列に対応するDNA配列が表に提供されており、表中、DNA配列はその対応するRNA配列の直後にある。たとえば、SEQ ID NO: 10529は、RNASEQ ID NO: 10528に対応するDNA配列である、などである。前記のように、さらなる特徴決定のために、両方の形態のアプタマーが合成される。
実施例19：アプタマーライブラリー生成
この実施例においては、一般的な等モル濃度ではなく様々な濃度のヌクレオチドを使用して、高い多様性を有するアプタマーライブラリーを生成する。図12を参照すること。そのような様々なヌクレオチド濃度を提供する中で、得られるランダム配列ライブラリーは、投入されるヌクレオチドの特定の濃度に依存して、A/TとG/Cとの間の様々な比を有するオリゴヌクレオチドを含む。さらには、得られるライブラリーは、オリゴヌクレオチド分子のより大きな化学的および構造的多様性を、複合投入試料中に存在するであろう複数の標的（たとえば組織または組織成分、細胞または細胞成分、細胞外小胞など）に対するより多くの潜在的結合パートナーを提供する利点と共に提供する。そのような非常に多様なランダムライブラリーは、投入試料中に存在する所望の標的に対して高いアフィニティーを有するオリゴヌクレオチドを富化するための投入物として使用される。予想外に、標準的な等モル濃度のヌクレオチドを使用する場合には不可能である、疾患試料と非疾患試料（たとえば癌と非癌）との間で示差的な結合を示すアプタマーが見いだされる。
本明細書に記載されるように、出発アプタマー投入ライブラリーは、たとえば配列決定により、いくつかのラウンドの選択を通して処理されて、示差的な読み出し情報を提供するサブセットライブラリーが富化される。出発投入ライブラリーそのものが複数のサブセットライブラリーを含んでもよく、各サブセットライブラリーは、高めまたは低めの最終GC含量の核酸を生成するために、異なる濃度のGおよびCヌクレオチドを使用して生成される。本発明のこの局面において、それぞれ25％を超える様々なヌクレオチド濃度（たとえば、単に一例として、各A/T 12.5％および各G/C 37.5％）は、G/Cヌクレオチドに対して増減する濃度のA/Tを含み得る。たとえば、全ヌクレオチド濃度の約5〜約95％（範囲5〜95の任意の単一測定単位を含む）であるGおよび/またはCヌクレオチド濃度を特定のライブラリーに使用して、一つまたは複数のランダム配列ライブラリーが生成される。例示的かつ非限定的なヌクレオチド濃度を表13に示す。
（表１３）アプタマーライブラリー生成のための例示的なヌクレオチド割合
Figure 2016533752
一つまたは一群のアプタマーの選択のための出発投入ライブラリーは、異なるヌクレオチド含量を有する少なくとも一つの（たとえば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはより多くの）サブセットライブラリーで構成され得る。各サブセットライブラリーは、たとえば、1012個の異なるオリゴヌクレオチドを含み得る（1.7pmolの80塩基ライブラリーの場合）。一つの非限定的な例において、投入ライブラリーは、それぞれ25％、50％および75％のGC含量を有する三つのサブセットライブラリーで構成される。本明細書における本出願人らの教示に基づくと、当業者には、サブセットライブラリーの数および各サブセットライブラリーのGC含量の両方を、本明細書に開示されるように変化させて、様々な投入ライブラリーを提供することができることが明らかであろう。投入ライブラリー中で使用されるサブセットライブラリーは、Gおよび/またはCが50％未満、50％、または50％超であるヌクレオチドを使用して生成することができる。
したがって、本発明は、高い多様性を有する出発オリゴヌクレオチドライブラリーを生成する方法を提供する。そのようなライブラリーは、二つの試料/状態を区別するための基礎としてアプタマーライブラリーを使用して、疾患または病状の評価における進歩を提供する。これは、特定の公知または未知の標的に特異的であるアプタマーを同定する従来の技術から明らかに区別可能である。様々な態様において、使用されるヌクレオチドは、天然ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、非天然ヌクレオチドの使用またはそれらの組み合わせであり得る。修飾または非天然ヌクレオチドのそのような種は公知である。
実施例20：オリゴヌクレオチドプローブライブラリー
この実施例においては、オリゴヌクレオチド検出法（たとえば上記実施例15を参照）を適用して、乳癌患者試料を正常な（すなわち、陰性生検によって確認された、乳癌ではない）生物学的試料と区別する。試料を検出および/または区別するために使用されるオリゴヌクレオチドライブラリーは本明細書の中で「オリゴヌクレオチドプローブライブラリー」または「オリゴヌクレオチドプロファイリングライブラリー」と呼ばれ得る。ランダム化オリゴヌクレオチドライブラリーを、乳癌患者血液由来の微小胞および正常な（非癌）個人由来の微小胞に対してトレーニングした。図13Dを参照して上述した手法を適用した。図14Aを参照すること。
ナイーブな投入オリゴヌクレオチドライブラリーは、以下の配列
Figure 2016533752
（ここで、nは、A、T、C、G、Uまたは他のヌクレオチドを含む）を有する3'リン酸化ssDNAオリゴヌクレオチドライブラリーからなるものであった。図示するように、各オリゴヌクレオチドは、18ヌクレオチドプライマー領域および中央の30ヌクレオチド可変領域を有する。唯一の修飾は一つの3'リン酸化ヌクレオチドである。乳癌患者由来の血漿試料をトレーニングされていない投入ライブラリーと接触させるポジティブ選択を実施した。試料中の微小胞を超遠心分離によって捕集し、微小胞と共に保持されたオリゴを溶出させ、捕集した。保持されたオリゴを次のラウンドの選択のための投入物として使用しながらこれらの工程を繰り返した。そして、部分的にトレーニングされたライブラリーを非癌患者血漿と接触させることによってネガティブ選択に供した。試料中の微小胞を超遠心分離によって捕集し、非癌微小胞に結合したオリゴを捨て、超遠心分離上清中に見られるオリゴ（すなわち、非癌微小胞に結合しなかったオリゴ）を保持した。癌患者由来の微小胞に対してポジティブ選択を繰り返し実施した。トレーニングされたライブラリーを処理してPCRおよび他の非特異アーチファクトを除去した。残るオリゴは、癌由来微小胞を優先的に認識するトレーニングされたオリゴヌクレオチドプローブライブラリーを含むものであった。この同じプロセスを逆に繰り返して、非癌由来微小胞を優先的に認識するトレーニングされたオリゴヌクレオチドプローブライブラリーを同定した（すなわち、非癌試料に対するポジティブ選択および癌試料に対するネガティブ選択）。各ライブラリーの重量単位の半分を混合することによって連合ライブラリーを創製した。このプロセスを使用し、次世代配列決定（Illumina HiSeqプラットフォーム）によってライブラリー構成を決定することにより、1,395,706の固有配列のオリゴヌクレオチドプールを創製した。このうち、843,729の配列が一回で検出された。最高から最低の出現率の順でランク付けした、オリゴヌクレオチドプール中でもっとも一般的に見られる500,000の配列をSEQ ID NO: 10559〜510558として本明細書に組み入れる。
オリゴヌクレオチドプローブライブラリーによって試料を試験するためのプロトコルは、以下、実施例21に記載されている。簡潔にいうと、血漿試料をトレーニングされたオリゴヌクレオチドプローブライブラリーと接触させた。超遠心分離を使用して、接触させた血漿試料から微小胞を単離した。微小胞と共に保持されたオリゴを溶出させ、次世代配列決定法を使用して配列決定した。微小胞に結合した保持されたオリゴの頻度を決定した。
上記手法を使用して開発されたオリゴヌクレオチドプローブライブラリーは、良好な回収率、S/Nおよび再現精度を示した。図14Bは、投入試料（すなわち血漿微小胞）に結合したオリゴヌクレオチドの数のプロットを示す。投入試料（「血漿」と標識）と結合オリゴヌクレオチドの数との間に直線関係（r2＝0.99）が認められた。対照的に、ヒト血清アルブミン（「HSA」と標識）または微小胞なしの血漿上清（「SN」と標識）を含む対照試料に結合したオリゴヌクレオチドはほとんどなかった。図14Cは、高い直線相関を示す複数の配列決定実験で方法が非常に高い再現精度を有したことを示す。この図において、一つの試料由来の微小胞を1×および2×の濃度でプロービングした。2×投入物に結合するオリゴが2倍である直線関係が認められた。この図は多くのそのような例の一つである。同じ試料または同じ血漿試料の異なる超遠心分離調製物に対する異なる配列決定実験を比較したときも、同様な直線関係が認められた。対照的に、異なる患者試料間で配列決定プロファイルを比較したとき、大きな開きが認められた。したがって、患者試料間の差は技術的変動のソースよりも有意に大きく、この方法が、基礎にある生物学的システムの差を計測することができることを示した。図14Dは、公知の実投入量と計測出力とを比較することによる標準曲線の形成を示す。各試料の標準曲線の包含は絶対的定量化および試料間の正規化を可能にする。
重要なことに、本発明者らは、方法の分散が配列決定深度の関数であり、したがって、実施される配列決定実験の回数によって制御することができることを認めた。図14Eはこの点を示す。投入試料に結合したプローブライブラリーの配列決定によって結果を得た。図は、検出された結合オリゴヌクレオチドの数に対してプロットされた変動係数（CV）を示す。明らかなように、配列決定されるオリゴヌクレオチドの数が大きければ大きいほど、より低いCVで配列を検出することができる。したがって、収集される配列決定データの量を増すことによって変動を制御することができるため、このアッセイ法は再現精度が高い。図14Fは、検出された高頻度オリゴヌクレオチドの分布を明らかにする。ボックス内のアプタマーは再現可能なオリゴのサブセットを示す（CV<0.2）。これらのオリゴは個々のマーカーとして潜在的用途を有する。
図14B〜14Fの結果に基づくと、乳癌試料および正常な試料に対してトレーニングされたオリゴヌクレオチドプローブライブラリーの検出は、再現精度が高く、ノイズが低いものであった。乳癌試料と正常な試料との最大の分離を示したオリゴヌクレオチドプローブライブラリーの個々のメンバーを同定した。図14Gは、血漿中の乳癌微小胞に関して富化されたオリゴヌクレオチドプローブライブラリーの配列決定プロファイル（カウントに対する頻度）のプロットを示す。プロット中に複数のマーカー亜集団が認められた。図14Hは、乳癌患者と生検陰性対照との差を示した4個オリゴヌクレオチドのプロットを示す。これらのオリゴヌクレオチドは、癌試料に優先的に結合するものとして同定された。複数個のオリゴヌクレオチドを組み合わせることもできる。図14Iは、癌試料に優先的に結合する20個のオリゴヌクレオチドの組み合わせのプロットを示す。プロット中に見られるように、乳癌患者と生検陰性対照との間で完全な分離が認められた。これら20個のオリゴヌクレオチドの配列を表14に示す。同様に、図14Jは、正常試料に優先的に結合した4個の代表的オリゴヌクレオチドによって得られた結果を示し、図14Kは、正常試料に優先的に結合した20個のオリゴヌクレオチドの組み合わせのプロットを示す。これら20個のオリゴヌクレオチドの配列を表14に示す。図14Iと同じく、乳癌患者と生検陰性対照との間で完全な分離が認められた。
（表１４）乳癌を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブライブラリーの使用
Figure 2016533752
任意の数の個々のオリゴヌクレオチドの結果を組み合わせることができる。たとえば、図14Lは、正常試料（NC1〜9）よりも癌試料（C1〜10）に優先的に結合した46個のオリゴヌクレオチドを組み合わせることによって得られた結果を示す。これら46のオリゴヌクレオチドは、癌と正常との間での2.2倍の頻度変化を示すものとして選択された。上記のように、これらの試料において認められた感度性および特異度はいずれも100％であった。
この実施例は、血漿試料および癌または非癌を区別するためのオリゴヌクレオチドプローブライブラリーの開発および使用を例示する。先に示したように、方法は試料間で100％の分離を提供した。当業者は、この方法を、他のタイプの生物学的実体（たとえば細胞、タンパク質複合体）および表現型（たとえば異なる癌、異なる疾患）を区別するために適用することができることを理解するであろう。
実施例21：複数の適応症のためのオリゴヌクレオチドプローブライブラリー
この実施例においては、先に実施例20に記載したオリゴヌクレオチドプローブライブラリーを、正常（すなわち無疾患）試料に対して複数のタイプの癌および他の疾患を区別するその能力に関して試験した。この実施例に関しては、試料の入手しやすさに基づき、血漿および血清を投入試料として使用した。
ライブラリー富化のためのおおよその手法は以下のとおりである。出発ナイーブライブラリーは、先に実施例20に記載したSEQ ID NO: 10558に基づくものであった。このライブラリーは約1012の固有の標本（たとえば一本鎖DNAオリゴヌクレオチド、ssDNA）を含む。いくつかのポジティブ富化（結合）およびカウンタ富化（減法）工程を実施した。特定の試料集団（たとえば、この実施例では乳癌患者）の微小胞に結合するオリゴヌクレオチドの富化の場合、出発ライブラリーを、患者試料から得られた血漿のプールと混合し、インキュベートした。遠心分離工程を実施して試料中の微小胞を単離する。超遠心分離またはポリマー沈殿（たとえばPEG4000、PEG8000）＋低速遠心分離をうまく使用した。微小胞に対して親和性および特異性を有するオリゴヌクレオチドは遠心分離中も結合したままであるが、一方で、非特異的結合は競合物質（たとえばサケ精子DNA、tRNA、S1、CM-D、それらの組み合わせなど）の添加によって抑制される。上清を捨てると、非結合オリゴヌクレオチドおよび非エキソソームタンパク質（たとえばHSA）への結合物質が除去される。再懸濁させた微小胞ペレットから結合オリゴヌクレオチドを回収する（溶出させる）。第二の試料集団（たとえば健康な対照、たとえば非癌患者）への結合物質をライブラリーから枯渇させるために、回収したオリゴプールを第二の試料集団からの試料のプールと混合し、遠心分離の結果として得られるペレットを捨てることにより、対照試料中の微小胞への結合物質を除去する。第二のポジティブ富化において、上清（これは、第一の試料集団には結合したが、第二の試料集団には結合しなかったオリゴを含む）を、第一の試料集団のもう一つのアリコートから単離された微小胞と混合し、結合物質を回収して、1ラウンド富化されたライブラリーとする。このスキームを複数回繰り返すと、ライブラリーをさらに富化し、その複雑性を減らし得る。最終工程で、ライブラリーをPCRによって増幅し、λエキソヌクレアーゼ消化によってssDNAに戻し、浄化する。同じ手順を、第一の（癌）集団とは逆に、第二の（対照）集団への結合物質を富化するように実施する。二つの富化されたライブラリーの組み合わせは、両試料集団に特徴的な標的への結合物質、たとえば上方制御および下方制御された癌マーカーへの結合物質を含む。そして、富化されたライブラリーの組み合わせをオリゴヌクレオチドプローブライブラリーとして使用する。富化の過程（ライブラリーに含まれるコピーおよび種の数）はqPCRおよびハイスループット配列決定によって追跡される。
富化されたオリゴヌクレオチドプローブライブラリーを、実施例20におけるように、個々の試料に対して試験した。プロトコルは、以下、実施例22に記載する。簡潔にいうと、血漿または血清試料をトレーニングされたオリゴヌクレオチドプローブライブラリーと接触させる。超遠心分離を使用して、接触させた試料から微小胞を単離した。微小胞と共に保持されたオリゴを溶出させ、次世代配列決定法を使用して配列決定した。微小胞に結合した保持されたオリゴの頻度を決定した。この方法を使用して、正常な血清または血漿を、表16に示すような多様な適応症からの血清または血漿と区別した。クラスター分析を使用してヒートマップを作成し、それが、図15A〜AN中の適応症に関して示されている。病状と正常試料との間でp<0.1を有するものとして、また、全試料中で少なくとも100回（信頼度の尺度として）出現するものとしてオリゴヌクレオチドを選択した。このフィルタリングののち、表15に示すような165の配列が残った。図15A〜ANのプロット中、個々のオリゴヌクレオチドがY軸上に示され、試料がX軸上に示されている（正常はその旨標記されている）。表15中の配列は、隣接する配列決定プライマー領域を有しない投入ライブラリーの可変領域である。表16は、様々な適応症に関して図15A〜AN中の対応するヒートマップに示されている、表15からの配列を示す。
（表１５）様々な病状を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブライブラリーのフィルタリング選択
Figure 2016533752
Figure 2016533752
Figure 2016533752
Figure 2016533752
（表１６）様々な病状を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブライブラリーの使用
Figure 2016533752
Figure 2016533752
Figure 2016533752
Figure 2016533752
Figure 2016533752
Figure 2016533752
図15A〜ANのデータは、オリゴヌクレオチドプローブライブラリーが疾患試料と正常試料とを区別することができたことを示す。これは、図中の疾患試料の密集によって見てとることができる。たとえば、図15A中、アルツハイマーの試料はプロット左側に密集したが、一方で、正常試料は右側に密集した。類似した結果が、結腸直腸癌の場合の図15H、心血管疾患の場合の図15Lおよび多発性硬化症の場合の図15Xに示されている。図15E中、膀胱癌試料の一つを除くすべてが中央のクラスター中に見られた。図15Kは、子宮頸癌に関して同様である。当業者は、複数の投入試料に対してトレーニングし、得られたオリゴヌクレオチドプールを合わせることにより、オリゴヌクレオチドプローブライブラリーの汎用性を増強することができることを理解するであろう。
この実施例において、乳癌設定においてトレーニングされたオリゴヌクレオチドプローブライブラリーを汎用プローブとして使用して、多様な疾患試料（たとえば癌、自己免疫、神経および心血管）に対して正常試料を区別した。予想外にも、ライブラリーは、疾患試料の大多数を正常試料から効率的に区別した。理論によって拘束されることなく、オリゴヌクレオチドライブラリーが多様な微小胞集団に対してトレーニングされたものであり、なおも多大な多様性を含むため、この手法は作用することが可能である。
実施例22：オリゴヌクレオチドプローブライブラリーを用いる体液プロービング
オリゴヌクレオチドプローブライブラリーを使用して、たとえば上記実施例15および20〜21におけるように血漿または血清試料のような体液をプロービングするために、以下のプロトコルが使用される。
投入オリゴヌクレオチドライブラリー：
1試料あたり2ngのオリゴヌクレオチドライブラリー投入物を使用する。
投入オリゴヌクレオチドライブラリーは、二つのライブラリー、すなわち癌富化ライブラリーおよび非癌富化ライブラリーの混合物であり、濃度は16.3ng/ulである。
アプタマーバッファー（1×PBS中3mM MgCl2）を使用して0.2ng/ul作業原液に希釈する。
作業原液から10ul（2ngライブラリーに等しい）を各Optiseal管に加える。
材料：
PBS、Hyclone SH30256.01, LN：AYG165629、ボトル#8237、使用期限7/2015
丸底遠心分離管、Beckman 326820, LN：P91207
OptiSeal遠心分離管および栓、ポリアロマーKonical、Beckman 361621、ロット#Z10804SCA
遠心分離ローター：50.4 TI
遠心分離ローター：50.4 TI、Beckman Caris ID#0478
プロトコル：
1 卓上遠心分離機、超遠心分離機、バケットおよびローターを4℃で予冷する。
2 血漿または血清試料を解凍する
3 試料1mlをアプタマーバッファー（1×PBS中3mM MgCl2）で1：2に希釈する
4 4℃で30分間、2000×gでスピン処理してデブリを除去する（卓上遠心分離機）
5 全試料の上清を丸底コニカルに移す
6 超遠心分離機中、4℃で45分間、12,000×gでスピン処理してさらなるデブリを除去する。
7 全試料の上清約1.8mlを新たなOptiSealベルトップ管（個別に印を付けた）に移す。
8 DNAプロービングライブラリー2ng（10ul中）を各Optiseal管に加える
9 全体で4.5mlになるまでアプタマーバッファを加える
10 OptiSealベルトップ管にキャップを固定する
11 漏れを防ぐためにキャップの周囲にパラフィルムを貼る
12 血漿およびオリゴヌクレオチドプローブライブラリーを室温で1時間、回転させながらインキュベートする
13 パラフィルムを剥がす（キャップは取らない）
14 栓をした各管の上に正しいスペーサーを配置する
15 管上のペレット区域をマークし、このマークが中心から外を向くことを確かめる。
16 管を4℃で2時間、120,000×gでスピン処理して（内列は33,400rpm）、微小胞をペレット化する。
17 マーキングがまだ中心から外を向いていることを確認する。
18 ペレットマーカーの両側から液体を捕集し、10mlシリンジバレルおよび21G2針を使用することにより、ペレットから上清を完全に除去する
19 上清を適切なバイオハザード廃棄容器に捨てる
20 1×PBSで希釈した3mM MgCl2 1mlを加える
21 1600rpmで5秒間やさしくボルテックスし、室温で5分間インキュベートする。
22 全体で約4.5mLになるまで1×PBSで希釈した3mM MgCl2を加える
23 OptiSealベルトップ管にキャップを固定する。
24 栓をした各管の上に正しいスペーサーを配置する。
25 管上のペレット区域をマークし、このマークが中心から外を向くことを確かめる。
26 管を4℃で70分間、120,000×gでスピン処理して（内列は33,400rpm）、微小胞をペレット化する
27 マーキングがまだ中心から外を向いていることを確認する。
28 ペレットマーカーの両側から液体を捕集し、10mlシリンジバレルおよび21G2針を使用することにより、ペレットから上清を完全に除去する
29 上清を適切なバイオハザード廃棄容器に捨てる
30 1×PBSで希釈した3mM MgCl2 1mlを加える
31 1600rpmで5秒間やさしくボルテックスし、室温で5分間インキュベートする。
32 全体で約4.5mLになるまで1×PBSで希釈した3mM MgCl2を加える
33 OptiSealベルトップ管にキャップを固定する。
34 栓をした各管の上に正しいスペーサーを配置する。
35 管上のペレット区域をマークし、このマークが中心から外を向くことを確かめる。
36 管を4℃で70分間、120,000×gでスピン処理して（内列は33,400rpm）、微小胞をペレット化する
37 マーキングがまだ中心から外を向いていることを確認する。
38 上清のアリコートを保存する（100ulを1.5ml管に）
39 ペレットマーカーの両側から液体を捕集し、10mlシリンジバレルおよび21G2針を使用することにより、ペレットから上清を完全に除去する
40 RNアーゼフリーの水50ulをペレットの側に加える
41 ベンチトップで15分間インキュベートする
42 清浄なはさみを使用して管を開封する。
43 ペレットを再懸濁させ、ピペットを用いてペレット側で上下に動かす
44 量を計測し、全試料を正規化するために量を記録する
45 オリゴヌクレオチドが結合した、計測し、再懸濁させ、溶出させた微小胞をRNアーゼフリーの1.5mlエッペンドルフ管に移す
46 全試料を100ulに正規化して、それを試料間および実験間で均一に維持する。
次世代配列決定試料調製：
I）H2O 100ul中に再懸濁させた、微小胞/オリゴ複合体を含有する上記からの試料50ulをトランスポゾンPCR、14サイクルにおける鋳型として使用する。
II）トランスポゾンPCR産物をAMPureで処理し、全回収物をインデックスPCR、10サイクルのために使用する。
III）インデックスPCR産物をゲル上で確認し、バンドが見えるならばAMPureを実施する。バンドが見えないならば、3サイクルを追加し、ゲル上で確認する。精製後、産物をQuBitで定量化し、HiSeqフローセル（Illumina Inc., San Diego, CA）に装填するために変性および希釈を実施する。
IV）1フローセルあたり五つの試料が多重化される。HiSeq1回で10試料。
データ分析（たとえば実施例21のような）：
両プライマー配列にマッチするHiSeq分析からのすべての配列読み取りを互いに比較する。各固有の配列読み取りのカウントを計算し、結合のためのシグナルとして使用する。試料ごとの配列読み取りの総数によって配列カウントを正規化する。固有の配列ごとの正規化カウントを比較して、疾患状態と正常対照との間で同じ試料タイプ、すなわち血清および血漿由来の試料への異なる結合レベルを示すオリゴヌクレオチドを同定する。全試料で100を超える平均カウントを有する配列だけを考慮する。示差的な結合を示すアプタマーからのオリゴヌクレオチドデータを階層クラスタリングによってクラスター化し、試料間の類似度をヒートマップおよびデンドログラムに示す。
実施例23：ハイスループット配列決定のための最適化アプタマーライブラリー設計
たとえばSELEXのような選択目的のための旧来のアプタマーライブラリー構造において、ライブラリーの各メンバーは、二つの保存された隣接配列の間に挿入された可変ヌクレオチド配列領域を含む。様々な用途の中で、保存領域は、選択ラウンド間の増幅、たとえばPCR増幅のためのプライミング部位として、配列決定のためのプライミング部位として、およびハイブリダイゼーションのために使用され得る。フォワードおよびリバースプライマーは本明細書の中で左（5'）および右（3'）末端プライマーと呼ばれ得る。アプタマーライブラリー配列の両端は同一であるため、ライブラリーは、配列決定目的に関して多様度が低いとみなされる。これは、増幅の偏りまたは他のそのような偏りの取り込みを生じさせ得る。いくつかのハイスループット配列決定法、たとえばIlluminaベースの次世代配列決定（NGS）の場合、最初の配列決定読み取りがクローン増幅後にフローセルの表面にクラスターを確立する。ライブラリーメンバーの始まりに同一塩基の領域を有することは、蛍光シグナルを区別すること、ひいては配列決定を進めることをより困難にする。Illuminaは、低多様度ライブラリーを配列決定する場合の様々な解決手段を提案している：（i）試料を含むライブラリーを50％のバクテリオファージPhiXゲノムと混合して多様性を導入する；（ii）対照試料を同じフローセルの異なるレーンに加える；および（iii）一つの試料内でライブラリーを互い違いに配列させる。オプション（i）および（ii）は配列決定総出力を半分に減らし、したがって、最適ではない。オプション（iii）は可変性の結果を示す：MiSeq NGS計器ではうまく使用されたが、HiSeq NGS計器ではそうはいかない。
この実施例は、ライブラリーそのものに多様性を導入することによってより効率的なアプタマーライブラリーの配列決定を可能にする代替アプタマーライブラリー設計を記載する。この実施例におけるアプタマーライブラリー設計は、以下：1）対照試料PhiXをスパイキングすることのないハイスループット配列決定計器におけるアプタマーライブラリーの配列決定；2）ハイスループット配列決定計器における最大能力でのアプタマーライブラリーの配列決定；および3）ハイスループット配列決定計器における最大信頼度でのアプタマーライブラリーの配列決定に対処する。実例として、この方法をこの実施例に適用して、HiSeq計器の、その最大能力での使用を容易にした。この実施例は例示目的でHiSeqプラットフォームを重点的に取り上げるが、この手法は、たとえばオリゴヌクレオチドライブラリー多様性が問題を呈し得る任意の適切な設定で使用することができる。
配列決定出発点が保存された外側領域（プライマー）から可変領域にシフトするようにナイーブなオリゴヌクレオチドライブラリー（すなわちアプタマー候補ライブラリー）を設計した。ライブラリーの左プライマーを、配列決定プライマーに相補的であるトランスポゾンアダプターで置き換えた。トランスポゾンアダプターと35ヌクレオチド可変領域との間には、ライブラリー設計中にオフセットを創製するように働く0、1、2または3ヌクレオチドが挿入される。図17Aは、可変領域に続くアプタマーライブラリーの右腕プライマー（すなわちSEQ ID NO: 510768）を示す。この手法を用いると、多様性を高めることに加えて、1ラウンドのPCRを使用するだけでNGSのための試料を調製することができる（たとえば、ハイブリダイゼーションのためのインデックスおよびアダプタをフローセルに加える）。これが、より効率的な試料調製をもたらし、PCRによって生成される潜在的突然変異体の数を減らし得る。
トランスポゾンアダプターおよびオフセットを組み込むためのライブラリー設計のこの変更は、配列決定されるライブラリーの可変領域における配列決定信頼度を改善した。以下さらに説明するように、図17C〜Dを比較すること。また、ライブラリーをさらに改善するために、左プライマーの配列は、たとえば、図中の一つの配列（SEQ ID NO: 510768）を使用する互い違い設計の中でヌクレオチドが重複する14の位置を示す図17Aのボックスによって示されるような潜在的な配列重複を減らすように設計されたものである。再設計された均衡設計のプライマー配列は、二つの塩基が重複する位置を五つしか含まない。図17B（SEQ ID NO: 510769を示す）を参照すること。
図17C〜17Fは、HiSeq SBS配列決定サイクル一つあたり％>Q30として反映される配列決定信頼度を示す。Q30は、1000回に1回の誤ベースコールの確率に等しい。図17Cは、ライブラリーの保存的（同一）部分から配列決定を開始した出発設計による、より低信頼度のオリゴヌクレオチドライブラリー配列決定の例を示す。配列決定実験にPhiX DNAは加えなかった。ライブラリーは互い違い設計を有するが、ベースコールソフトウェアは、これらの領域をベースコールするのに困難を要した。
図17Dは、トランスポゾンアダプターが右腕プライマーとしてライブラリーに組み込まれた標準的ライブラリーの配列決定信頼度の例を示す。この場合、配列決定は可変領域から直に出発し、大きく改善された配列決定信頼度を生じさせる。しかし、配列決定が左腕プライマーに達すると、信頼度は低下する。
図17Eは、図17Aの互い違い設計を挿入した後のライブラリーでの配列決定信頼度の例を示す。図に見てとれるように、配列決定信頼度は以前の非互い違い設計と比較して改善している。しかし、プライマー領域の中程のいくつかの塩基は潜在的にミスコールされる。
配列決定信頼度の最後のチューニングのために、左腕プライマーの配列を図17Bに示すように再均衡させた。図17Fは、図17EではQ30スコアが低めの塩基の大多数に関して、信頼度が約50％改善したことを示す。この設計は、プライマー配列のベースコールを改善し、出発アプタマーライブラリーパターンへのもっとも効率的なマッチを可能にした。
図17Cのグラフ（オリジナル）と図17Fのグラフ（最適化設計）との比較が、アプタマーライブラリー設計の改善および相応に配列決定信頼度/出力の改善を実証する。
改善されたアプタマーライブラリー設計のさらなる利点が、関心対象の生物学的標的に対するアプタマー配列の富化の効能によって、およびハイスループット配列決定の現在の能力でライブラリーを効果的に管理する可能性によって実証される。図17G〜Hは、乳癌血漿エキソソームに対する富化ののち、旧来のアプタマーライブラリー設計（「NP1m-30n」；図17G）と新規な一工程均衡ライブラリー設計（「F-TRin-35n-B」；図17H）とを比較して示す。これらの図に示すように、改良された設計は、（i）異なる読み取りカウントの間で種の数の正規分布を示す別個の集団の存在；（ii）最も可能性が高い、PCR偏りによってまたはHiSeq SBS工程中に創製されるような配列を分析から除外することを可能にする、ライブラリーの残りからの低カウントの種の改善された分離；（iii）配列決定スループットの増大を可能にする、2000〜3000コピーの範囲の富化集団中の1種あたり平均読み取りカウント；および（iv）生物学的標本をプロービングするときの最小化された技術的ばらつき、によって実証されるように、より効率的な富化を可能にする。
得られたアプタマーライブラリーは、本明細書に記載されるように個々のアプタマーまたはオリゴヌクレオチドプローブライブラリーを開発する、たとえば診断アッセイ法を開発するために使用することができる。
本発明の好ましい態様が、本明細書において示されかつ記載されてきたが、そのような態様は例としてのみ提供されていることが、当業者に明らかであろう。本発明から逸脱することなく、多数の変形、変化、および置換が、今や当業者の心に浮かぶであろう。本明細書に記載されている本発明の態様についての種々の代替物が、本発明を実施する上で使用されてもよいことが、理解されるべきである。添付の特許請求の範囲が本発明の範囲を規定すること、ならびに、添付の特許請求の範囲内の方法および構造ならびにそれらの等価物がそれによりカバーされることが、意図される。

Claims (199)

  1. SEQ ID NO: 10558に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同であるオリゴヌクレオチド。
  2. 少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000、500000、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017または少なくとも1018個の異なるオリゴヌクレオチド配列を含み、各オリゴヌクレオチド配列またはその部分がSEQ ID NO: 10558に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である、複数のオリゴヌクレオチド。
  3. 少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000または500000個の異なるオリゴヌクレオチド配列を含み、各オリゴヌクレオチド配列またはその部分がSEQ ID NO: 10559〜510558から選択される配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である、複数のオリゴヌクレオチド。
  4. SEQ ID NO: 10559〜510558にリストされたオリゴヌクレオチドの少なくとも50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％または少なくとも99％を含む、オリゴヌクレオチドプローブライブラリー。
  5. SEQ ID NO: 510559〜510578から選択される配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である核酸配列またはその部分を含む、オリゴヌクレオチド。
  6. 少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個の異なるオリゴヌクレオチド配列を含み、各オリゴヌクレオチド配列またはその部分がSEQ ID NO: 510559〜510578に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である、複数のオリゴヌクレオチド。
  7. SEQ ID NO: 510579〜510598から選択される配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である核酸配列またはその部分を含む、オリゴヌクレオチド。
  8. 少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個の異なるオリゴヌクレオチド配列を含み、各オリゴヌクレオチド配列またはその部分がSEQ ID NO: 510579〜510598に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である、複数のオリゴヌクレオチド。
  9. SEQ ID NO: 510599〜510763から選択される配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である核酸配列またはその部分を含む、オリゴヌクレオチド。
  10. 少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、125、130、140、150、160または165個の異なるオリゴヌクレオチド配列を含み、各オリゴヌクレオチド配列またはその部分がSEQ ID NO: 510599〜510763に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である、複数のオリゴヌクレオチド。
  11. 少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、125、130、140、150、160または165個の異なるオリゴヌクレオチド配列を含み、各オリゴヌクレオチド配列またはその部分が表16中の行中の配列番号に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である、複数のオリゴヌクレオチド。
  12. DNA、RNA、非天然のヌクレオチド、欠失、挿入、付加、および化学的修飾からなる群より選択される少なくとも一つの機能的修飾を含む、請求項1〜12のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチド。
  13. オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドを試料と接触させる工程および試料中の標的へのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドの結合の存在またはレベルを検出する工程を含み、任意で、オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが請求項1〜12のいずれか一項記載のものである、方法。
  14. 試料が、生物学的試料、有機試料、無機試料、組織、細胞培養物、体液、血液、血清、細胞、微小胞、タンパク質複合体、脂質複合体、糖質またはそれらの任意の組み合わせ、部分もしくは変種を含む、請求項13記載の方法。
  15. 標的が、細胞、オルガネラ、タンパク質複合体、リポタンパク質、糖質、微小胞、膜断片、小分子、重金属、毒素または薬物を含む、請求項13記載の方法。
  16. （a）微小胞を含む生物学的試料をオリゴヌクレオチドプローブライブラリーと接触させる工程であって、任意で、オリゴヌクレオチドプローブライブラリーが、請求項1〜12のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドを含む、工程；
    （b）微小胞の少なくとも一部分に結合したオリゴヌクレオチドを同定する工程；および
    （c）同定されたオリゴヌクレオチドのプロファイルに基づいて試料を特徴決定する工程
    を含む、方法。
  17. （a）溶解状態の混合物を形成するために、試料を、少なくとも106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017または少なくとも1018個の異なるオリゴヌクレオチド配列のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブライブラリーと接触させる工程であって、オリゴヌクレオチドが、試料中の複数の実体に結合して複合体を形成することができ、任意で、オリゴヌクレオチドプローブライブラリーが、請求項1〜12のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドを含む、工程；
    （b）工程（a）で形成された複合体を混合物から分割する工程；および
    （c）試料に関するオリゴヌクレオチドプロファイルを同定するために、工程（b）で分割された複合体中に存在するオリゴヌクレオチドを検出する工程
    を含む、方法。
  18. 検出する工程が、複合体中のすべてもしくはいくつかのオリゴヌクレオチドの配列決定、複合体中のすべてもしくはいくつかのオリゴヌクレオチドの増幅、および/または、複合体中のすべてもしくはいくつかのオリゴヌクレオチドの、アレイへのハイブリダイゼーションを実施する工程を含む、請求項17記載の方法。
  19. （a）第一のオリゴヌクレオチドライブラリーを生物学的試験試料および生物学的対照試料と接触させる工程であって、生物学的試料中に存在する生物学的実体と、第一のオリゴヌクレオチドライブラリー中に存在する複数のオリゴヌクレオチドとの間に複合体が形成される、工程；
    （b）生物学的試験試料および生物学的対照試料それぞれに関してオリゴヌクレオチドのサブセットを生成するために、工程（a）で形成された複合体を分割して、複合体中のオリゴヌクレオチドを単離する工程；
    （c）（b）におけるオリゴヌクレオチドのサブセットを生物学的試験試料および生物学的対照試料と接触させる工程であって、生物学的試料中に存在する生物学的実体と、オリゴヌクレオチドのサブセット中に存在する第二の複数のオリゴヌクレオチドとの間に複合体が形成されて、オリゴヌクレオチドの第二のサブセット群を生成する、工程；ならびに
    （d）オリゴヌクレオチドのそれぞれ第三、第四、第五またはそれ以降のサブセット群を生成するために、任意で、工程（b）〜（c）を一回、二回、三回またはより多く繰り返して、それによって、富化されたオリゴヌクレオチドプローブライブラリーを生成する工程
    を含む、富化されたオリゴヌクレオチドプローブライブラリーを生成する方法。
  20. 少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000または500000個の異なるオリゴヌクレオチド配列を含む複数のオリゴヌクレオチドであって、該複数が、請求項19記載の方法から得られ、ライブラリーが第一の表現型を第二の表現型と区別することができる、複数のオリゴヌクレオチド。
  21. 第一の表現型が疾患もしくは障害を含み、第二の表現型が健康な状態を含む；または第一の表現型が疾患もしくは障害を含み、第二の表現型が異なる疾患もしくは障害を含む；または第一の表現型が疾患もしくは障害のある病期もしくは進行を含み、第二の表現型が同じ疾患もしくは障害の異なる病期もしくは進行を含む；または第一の表現型が治療に対する正の応答を含み、第二の表現型が同じ治療に対する負の応答を含む、請求項20記載の複数。
  22. （a）生物学的試験試料を請求項1〜12のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドと接触させる工程；
    （b）工程（a）で請求項1〜12のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドと生物学的試験試料中の標的との間に形成された複合体の存在またはレベルを検出する工程；および
    （c）工程（b）で検出された存在またはレベルを、生物学的対照試料からの参照レベルと比較し、それによって疾患または障害を特徴決定する工程
    を含む、疾患または障害を特徴決定する方法。
  23. 検出する工程が、複合体中のすべてもしくはいくつかのオリゴヌクレオチドの配列決定、複合体中のすべてもしくはいくつかのオリゴヌクレオチドの増幅、および/または複合体中のすべてもしくはいくつかのオリゴヌクレオチドの、アレイへのハイブリダイゼーションを実施する工程を含み得る、請求項22記載の方法。
  24. 配列決定がハイスループット配列決定を含む、請求項23記載の方法。
  25. 生物学的試験試料および生物学的対照試料がそれぞれ、組織試料、細胞培養物、または生物学的流体を含む、請求項19または22〜24のいずれか一項記載の方法。
  26. 生物学的流体が体液を含む、請求項25記載の方法。
  27. 体液が、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（CSF）、痰、唾液、骨髄、滑液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー腺液もしくは尿道球腺液、女性射精液、汗、糞便、体毛、涙液、嚢胞液、胸膜液および腹膜液、心膜液、リンパ液、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、月経分泌物、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌液、粘膜分泌液、水便、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液、胚盤胞腔液、または臍帯血を含む、請求項26記載の方法。
  28. 体液が、血液、血清、または血漿を含む、請求項26記載の方法。
  29. 生物学的流体が微小胞を含む、請求項25記載の方法。
  30. 複合体が、オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドと少なくとも一つの微小胞との間で形成される、請求項29記載の方法。
  31. 生物学的試験試料および生物学的対照試料が、単離された微小胞を含み、任意で、微小胞が、クロマトグラフィー、ろ過、限外ろ過、遠心分離、超遠心分離、フローサイトメトリー、アフィニティー捕捉（たとえば平面、カラムまたはビーズへの）、ポリマー沈殿の少なくとも一つを使用しかつマイクロ流体工学を使用して単離される、請求項19または22〜30のいずれか一項記載の方法。
  32. オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドがポリペプチドまたはその断片に結合する、請求項22〜31のいずれか一項記載の方法。
  33. ポリペプチドまたはその断片が可溶性または膜結合状態であり、任意で、膜が微小胞膜を含む、請求項32記載の方法。
  34. ポリペプチドまたはその断片が表3または表4中のバイオマーカーを含む、請求項33記載の方法。
  35. オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが、生物学的試料中の微小胞表面抗原に結合する、請求項22〜34のいずれか一項記載の方法。
  36. 疾患または障害が、乳癌、アルツハイマー病、気管支喘息、膀胱移行上皮癌、巨細胞オステオブラストクラストーマ、脳腫瘍、結腸直腸腺癌、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、子宮頸部扁平上皮癌、急性心筋梗塞（AMI）/急性心不全、クローン病、II型糖尿病、食道癌、喉頭扁平上皮癌、急性および慢性骨髄白血病、肺癌、悪性リンパ腫、多発性硬化症、卵巣癌、パーキンソン病、前立腺腺癌、乾癬、関節リウマチ、腎細胞癌、皮膚有棘細胞癌、胃腺癌、甲状腺癌、精巣癌、潰瘍性大腸炎または子宮腺癌を含む、請求項22〜35のいずれか一項記載の方法。
  37. 疾患または障害が、癌、前癌状態、炎症性疾患、免疫疾患、自己免疫疾患もしくは障害、心血管疾患もしくは障害、神経疾患もしくは障害、感染症、または疼痛を含む、請求項22〜35のいずれか一項記載の方法。
  38. 癌が、急性リンパ芽球性白血病；急性骨髄性白血病；副腎皮質癌；AIDS関連癌；AIDS関連リンパ腫；肛門癌；虫垂癌；星状細胞腫；非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍；基底細胞癌；膀胱癌；脳幹神経膠腫；脳腫瘍（脳幹神経膠腫、中枢神経系非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍、中枢神経系胚芽腫、星状細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣芽腫、上衣腫、髄芽腫、髄上皮種、中間型松果体実質腫瘍、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、および松果体芽腫を含む）；乳癌；気管支腫瘍；バーキットリンパ腫；原発不明癌；カルチノイド腫瘍；原発不明癌腫；中枢神経系非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍；中枢神経系胚芽腫；子宮頸癌；小児癌；脊索腫；慢性リンパ球性白血病；慢性骨髄性白血病；慢性骨髄増殖性障害；結腸癌；結腸直腸癌；頭蓋咽頭腫；皮膚T細胞リンパ腫；内分泌膵島細胞腫瘍；子宮内膜癌；上衣芽腫；上衣腫；食道癌；鼻腔神経芽細胞腫；ユーイング肉腫；頭蓋外胚細胞腫瘍；性腺外胚細胞腫瘍；肝外胆管癌；胆嚢癌；胃癌；消化管カルチノイド腫瘍；消化管間質細胞腫瘍；消化管間質腫瘍（GIST）；妊娠性絨毛性腫瘍；神経膠腫；毛様細胞性白血病；頭頸部癌；心臓癌；ホジキンリンパ腫；下咽頭癌；眼内黒色腫；膵島腫瘍；カポジ肉腫；腎臓癌；ランゲルハンス細胞組織球症；喉頭癌；口唇癌；肝臓癌；肺癌；悪性線維性組織球腫；骨癌；髄芽腫；髄上皮種；黒色腫；メルケル細胞癌；メルケル細胞皮膚癌；中皮腫；原発不明転移性扁平上皮性頸部癌；口腔癌；多発性内分泌腫瘍症候群；多発性骨髄腫；多発性骨髄腫/形質細胞腫瘍；菌状息肉腫；骨髄異形成症候群；骨髄増殖性腫瘍；鼻腔癌；鼻咽頭癌；神経芽細胞腫；非ホジキンリンパ腫；非黒色腫皮膚癌；非小細胞肺癌；口腔癌；口腔癌；口腔咽頭癌；骨肉腫；その他の脳および脊髄の腫瘍；卵巣癌；卵巣上皮癌；卵巣胚細胞腫瘍；卵巣低悪性度腫瘍；膵臓癌；乳頭腫症；副鼻腔癌；副甲状腺癌；骨盤癌；陰茎癌；咽頭癌；中間型松果体実質腫瘍；松果体芽腫；下垂体腫瘍；形質細胞腫瘍/多発性骨髄腫；胸膜肺芽腫；原発性中枢神経系（CNS）リンパ腫；原発性肝細胞肝癌；前立腺癌；直腸癌；腎臓癌；腎細胞（腎臓）癌；腎細胞癌；気道癌；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；唾液腺癌；セザリー症候群；小細胞肺癌；小腸癌；軟部組織肉腫；扁平上皮癌；扁平上皮性頸部癌；胃癌；テント上原始神経外胚葉性腫瘍；T細胞リンパ腫；精巣癌；咽喉癌；胸腺癌；胸腺腫；甲状腺癌；移行上皮癌；腎盂尿管移行上皮癌；絨毛性腫瘍；尿管癌；尿道癌；子宮癌；子宮肉腫；膣癌；外陰癌；ワルデンシュトレームマクログロブリン血症；またはウィルムス腫瘍を含む、請求項37記載の方法。
  39. 前癌状態がバレット食道を含む、請求項37記載の方法。
  40. 自己免疫疾患が、炎症性腸疾患（IBD）、クローン病（CD）、潰瘍性大腸炎（UC）、骨盤炎症、血管炎、乾癬、糖尿病、自己免疫性肝炎、多発性硬化症、重症筋無力症、I型糖尿病、関節リウマチ、乾癬、全身性エリテマトーデス（SLE）、橋本甲状腺炎、グレーブス病、強直性脊椎炎、シェーグレン病、CREST症候群、強皮症、リウマチ性疾患、臓器拒絶反応、原発性硬化性胆管炎、または敗血症を含む、請求項37記載の方法。
  41. 心血管疾患が、アテローム性動脈硬化症、うっ血性心不全、不安定プラーク、脳卒中、虚血、高血圧症、狭窄症、血管閉塞、または血栓性イベントを含む、請求項37記載の方法。
  42. 神経疾患が、多発性硬化症（MS）、パーキンソン病（PD）、アルツハイマー病（AD）、統合失調症、双極性障害、うつ病、自閉症、プリオン病、ピック病、認知症、ハンチントン病（HD）、ダウン症候群、脳血管疾患、ラズムッセン脳炎、ウイルス性髄膜炎、神経精神全身性エリテマトーデス（NPSLE）、筋萎縮性側索硬化症、クロイツフェルト-ヤコブ病、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、伝達性海綿状脳症、虚血再灌流傷害（例えば脳卒中）、脳損傷、微生物感染、または慢性疲労症候群を含む、請求項37記載の方法。
  43. 疼痛が、線維筋痛症、慢性神経因性疼痛、または末梢性神経因性疼痛を含む、請求項37記載の方法。
  44. 感染症が、細菌感染、ウイルス感染、酵母菌感染、ウィップル病、プリオン病、肝硬変、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、HIV、HCV、肝炎、梅毒、髄膜炎、マラリア、結核、インフルエンザを含む、請求項37記載の方法。
  45. 疾患または障害が乳癌を含み、オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO: 510559〜510598のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30または少なくとも40個を含む、請求項22〜35のいずれか一項記載の方法。
  46. 疾患または障害がアルツハイマー病を含み、オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO:
    Figure 2016533752
    のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む、請求項22〜35のいずれか一項記載の方法。
  47. 疾患または障害がアルツハイマー病を含み、オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO:
    Figure 2016533752
    のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む、請求項22〜35のいずれか一項記載の方法。
  48. 疾患または障害が気管支喘息を含み、オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO:
    Figure 2016533752
    のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む、請求項22〜35のいずれか一項記載の方法。
  49. 疾患または障害が気管支喘息を含み、オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO:
    Figure 2016533752
    のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む、請求項22〜35のいずれか一項記載の方法。
  50. 疾患または障害が膀胱移行上皮癌を含み、オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO:
    Figure 2016533752
    のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む、請求項22〜35のいずれか一項記載の方法。
  51. 疾患または障害が巨細胞オステオブラストクラストーマを含み、オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO:
    Figure 2016533752
    のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む、請求項22〜35のいずれか一項記載の方法。
  52. 疾患または障害が脳腫瘍を含み、オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO:
    Figure 2016533752
    のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む、請求項22〜35のいずれか一項記載の方法。
  53. 疾患または障害が結腸直腸腺癌を含み、オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO:
    Figure 2016533752
    のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む、請求項22〜35のいずれか一項記載の方法。
  54. 疾患または障害が慢性閉塞性肺疾患（COPD）を含み、オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO:
    Figure 2016533752
    のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む、請求項22〜35のいずれか一項記載の方法。
  55. 疾患または障害が慢性閉塞性肺疾患（COPD）を含み、オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO:
    Figure 2016533752
    のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む、請求項22〜35のいずれか一項記載の方法。
  56. 疾患または障害が子宮頸部扁平上皮癌を含み、オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO:
    Figure 2016533752
    のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む、請求項22〜35のいずれか一項記載の方法。
  57. 疾患または障害が急性心筋梗塞（AMI）または急性心不全を含み、オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO:
    Figure 2016533752
    のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む、請求項22〜35のいずれか一項記載の方法。
  58. 疾患または障害が急性心筋梗塞（AMI）または急性心不全を含み、オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO:
    Figure 2016533752
    のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む、請求項22〜35のいずれか一項記載の方法。
  59. 疾患または障害がクローン病を含み、オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO:
    Figure 2016533752
    のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む、請求項22〜35のいずれか一項記載の方法。
  60. 疾患または障害がクローン病を含み、オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO:
    Figure 2016533752
    のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む、請求項22〜35のいずれか一項記載の方法。
  61. 疾患または障害がII型糖尿病を含み、オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO:
    Figure 2016533752
    のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む、請求項22〜35のいずれか一項記載の方法。
  62. 疾患または障害がII型糖尿病を含み、オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO:
    Figure 2016533752
    のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む、請求項22〜35のいずれか一項記載の方法。
  63. 疾患または障害が食道癌を含み、オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO:
    Figure 2016533752
    のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む、請求項22〜35のいずれか一項記載の方法。
  64. 疾患または障害が喉頭扁平上皮癌を含み、オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO:
    Figure 2016533752
    のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む、請求項22〜35のいずれか一項記載の方法。
  65. 疾患または障害が急性または慢性骨髄白血病を含み、オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO:
    Figure 2016533752
    のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む、請求項22〜35のいずれか一項記載の方法。
  66. 疾患または障害が肺癌を含み、オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO:
    Figure 2016533752
    のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む、請求項22〜35のいずれか一項記載の方法。
  67. 疾患または障害が悪性リンパ腫を含み、オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO:
    Figure 2016533752
    のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む、請求項22〜35のいずれか一項記載の方法。
  68. 疾患または障害が多発性硬化症を含み、オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO:
    Figure 2016533752
    のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む、請求項22〜35のいずれか一項記載の方法。
  69. 疾患または障害が多発性硬化症を含み、オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO:
    Figure 2016533752
    のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む、請求項22〜35のいずれか一項記載の方法。
  70. 疾患または障害が卵巣癌を含み、オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO:
    Figure 2016533752
    のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む、請求項22〜35のいずれか一項記載の方法。
  71. 疾患または障害がパーキンソン病を含み、オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO:
    Figure 2016533752
    のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む、請求項22〜35のいずれか一項記載の方法。
  72. 疾患または障害がパーキンソン病を含み、オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO:
    Figure 2016533752
    のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む、請求項22〜35のいずれか一項記載の方法。
  73. 疾患または障害が前立腺腺癌を含み、オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO:
    Figure 2016533752
    のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む、請求項22〜35のいずれか一項記載の方法。
  74. 疾患または障害が乾癬を含み、オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO:
    Figure 2016533752
    のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む、請求項22〜35のいずれか一項記載の方法。
  75. 疾患または障害が乾癬を含み、オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO:
    Figure 2016533752
    のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む、請求項22〜35のいずれか一項記載の方法。
  76. 疾患または障害が関節リウマチを含み、オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO:
    Figure 2016533752
    のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む、請求項22〜35のいずれか一項記載の方法。
  77. 疾患または障害が関節リウマチを含み、オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO:
    Figure 2016533752
    のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む、請求項22〜35のいずれか一項記載の方法。
  78. 疾患または障害が腎細胞癌を含み、オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO:
    Figure 2016533752
    のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む、請求項22〜35のいずれか一項記載の方法。
  79. 疾患または障害が皮膚有棘細胞癌を含み、オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO:
    Figure 2016533752
    のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む、請求項22〜35のいずれか一項記載の方法。
  80. 疾患または障害が胃腺癌を含み、オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO:
    Figure 2016533752
    のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む、請求項22〜35のいずれか一項記載の方法。
  81. 疾患または障害が甲状腺癌を含み、オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO:
    Figure 2016533752
    のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む、請求項22〜35のいずれか一項記載の方法。
  82. 疾患または障害が精巣癌を含み、オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO:
    Figure 2016533752
    のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む、請求項22〜35のいずれか一項記載の方法。
  83. 疾患または障害が潰瘍性大腸炎を含み、オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO:
    Figure 2016533752
    のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む、請求項22〜35のいずれか一項記載の方法。
  84. 疾患または障害が潰瘍性大腸炎を含み、オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO:
    Figure 2016533752
    のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む、請求項22〜35のいずれか一項記載の方法。
  85. 疾患または障害が子宮腺癌を含み、オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO:
    Figure 2016533752
    のうち少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50個またはすべてを含む、請求項22〜35のいずれか一項記載の方法。
  86. オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも一つが、DNA、RNA、非天然のヌクレオチド、欠失、挿入、付加、および化学的修飾からなる群より選択される少なくとも一つの機能的修飾を含む、請求項45〜85のいずれか一項記載の方法。
  87. 請求項13〜19または22〜86のいずれか一項記載の方法を実施するための試薬を含むキット。
  88. 請求項13〜19または22〜86のいずれか一項記載の方法を実施するための試薬の使用。
  89. 試薬がオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドを含む、請求項87記載のキットまたは請求項88記載の使用。
  90. オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが請求項1〜12のいずれか一項記載のものである、請求項89記載のキットまたは使用。
  91. 試薬が、
    （a）微小胞を単離するように構成された試薬であって、任意で、微小胞を単離するように構成された少なくとも一つの該試薬が、微小胞抗原への結合物質、カラム、基体、ろ過ユニット、ポリマー、ポリエチレングリコール、PEG4000、PEG8000、粒子またはビーズを含む、該試薬；
    （b）オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドを増幅、配列決定、ハイブリダイズまたは検出するためにプライマーまたはプローブとして働くように構成された少なくとも一つのオリゴヌクレオチド；ならびに
    （c）試料から1種または複数種の豊富なタンパク質を除去するように構成された試薬であって、任意で、1種または複数種の豊富なタンパク質が、アルブミン、免疫グロブリン、フィブリノーゲンおよびフィブリンのうち少なくとも1種を含む、該試薬
    のうちの少なくとも一つをさらに含む、請求項89または90記載のキットまたは使用。
  92. （a）表8に記載される、SEQ ID NO: 8〜21もしくはそれらの可変配列；
    （b）表11に記載される、SEQ ID NO: 24〜43もしくはそれらの可変配列；
    （c）SEQ ID NO: 44〜10527；
    （d）表12に記載される、SEQ ID NO: 10528〜10557もしくはそれらの可変配列；または
    （e）任意の上記配列の機能的断片
    のいずれかと、少なくとも約50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、または100パーセント相同である核酸配列を含むアプタマー。
  93. 少なくとも一つの化学修飾を含むようにさらに改変されている、請求項92記載のアプタマー。
  94. 前記修飾が、核酸の、糖位置での化学的置換；リン酸位置での化学的置換；および塩基位置での化学的置換からなる群より選択される、請求項93記載のアプタマー。
  95. 前記修飾が、ビオチン化、蛍光標識の取り込み、修飾ヌクレオチドの取り込み、3'キャッピング、アミンリンカーへの結合、非免疫原性の高分子量化合物への結合、親油性化合物への結合、薬物への結合、細胞傷害性部分への結合、および放射性同位体を用いた標識からなる群より選択される、請求項93記載のアプタマー。
  96. ビオチン化、蛍光標識、または細胞傷害性部分が、前記アプタマーの5'末端に結合している、請求項95記載のアプタマー。
  97. ビオチン化、蛍光標識、または細胞傷害性部分が、前記アプタマーの3'末端に結合している、請求項95記載のアプタマー。
  98. 細胞傷害性部分がナノ粒子中に封入されている、請求項95記載のアプタマー。
  99. ナノ粒子が、リポソーム、デンドリマー、および櫛形ポリマーからなる群より選択される、請求項98記載のアプタマー。
  100. 細胞傷害性部分が小分子の細胞傷害性部分を含む、請求項95記載のアプタマー。
  101. 小分子の細胞傷害性部分が、ビンブラスチンヒドラジド、カリチアマイシン、ビンカアルカロイド、クリプトフィシン、ツブリシン、ドラスタチン-10、ドラスタチン-15、アウリスタチンE、リゾキシン、エポチロンB、エポチロンD、タキソイド、メイタンシノイド、ならびにそれらの任意のバリアントおよび誘導体からなる群より選択される、請求項100記載のアプタマー。
  102. 放射性同位体が、イットリウム-90、インジウム-111、ヨウ素-131、ルテチウム-177、銅-67、レニウム-186、レニウム-188、ビスマス-212、ビスマス-213、アスタチン-211、およびアクチニウム-225からなる群より選択される、請求項95記載のアプタマー。
  103. 細胞傷害性部分がタンパク毒素である、請求項95記載のアプタマー。
  104. タンパク毒素が、ジフテリア毒素、リシン、アブリン、ゲロニン、およびシュードモナス外毒素Aからなる群より選択される、請求項103記載のアプタマー。
  105. 非免疫原性の高分子量化合物がポリアルキレングリコールである、請求項95記載のアプタマー。
  106. ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコールである、請求項105記載のアプタマー。
  107. γ線放出放射性同位体によって標識されている、請求項92記載のアプタマー。
  108. 活性物質が前記アプタマーに結合している、請求項92記載のアプタマー。
  109. 活性物質が治療物質または診断物質を含む、請求項108記載のアプタマー。
  110. 治療物質または診断物質が、チロシンキナーゼ阻害剤、キナーゼ阻害剤、生物学的活性物質、生物学的分子、放射性核種、アドリアマイシン、アンサマイシン系抗生物質、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、ブスルファン、シスプラチン、カルボプラチン、カルムスチン、カペシタビン、クロラムブチル、シタラビン、シクロホスファミド、カンプトセシン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デクスラゾキサン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エトポシド、エポチロン、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルカプトプリン、メルファラン、メトトレキサート、ラパマイシン（シロリムス）、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニトロソ尿素、パクリタクセル、パミドロナート、ペントスタチン、プリカマイシン、プロカルバジン、リツキシマブ、ストレプトゾシン、テニポシド、チオグアニン、チオテパ、タキサン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、タキソール、コンブレタスタチン、ディスコデルモリド、トランスプラチナ（transplatinum）、抗血管内皮成長因子化合物（「抗VEGF」）、抗上皮細胞成長因子受容体化合物（「抗EGFR」）、5-フルオロウラシルおよび誘導体、放射性核種、ポリペプチド毒素、アポトーシス誘導物質、治療増感物質、酵素またはその活性断片、ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される治療物質である、請求項108〜109のいずれか一項記載のアプタマー。
  111. 治療的有効量の請求項92〜110のいずれか一項記載のアプタマーまたはその塩、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む、薬学的組成物。
  112. それを必要とする対象に請求項111記載の組成物を投与する工程を含む、疾患または障害を治療するかまたは寛解させる方法。
  113. 対象に治療的有効量の前記組成物を投与する工程が以下をもたらす、請求項112記載の方法：
    （a）活性物質単独の送達と比較した、疾患部位への活性物質の送達の増大；または（b）微小胞クリアランスの増大による、アプタマーの標的となる微小胞の血中濃度の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、もしくは90%の低下；または（c）該アプタマーの標的となる微小胞の生物学的活性の、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、もしくは90%の低下。
  114. 微小胞の生物学的活性が、免疫抑制または遺伝情報の伝達を含む、請求項113記載の方法。
  115. 疾患または障害が、新生物性の、増殖性の、または炎症性の疾患または障害を含む、請求項112〜114のいずれか一項記載の方法。
  116. 治療的有効量の請求項103記載のアプタマーまたはその塩、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む、薬学的組成物。
  117. 請求項92〜110のいずれか一項記載のアプタマーまたはその薬学的組成物を含む、キット。
  118. 請求項92〜110のいずれか一項記載のアプタマーを生物学的試料と接触させる工程および該生物学的試料中の微小胞に対する該アプタマーの結合の有無を検出する工程を含む、方法。
  119. 生物学的試料が血液または血液成分を含む、請求項118記載の方法。
  120. アプタマーが、生物学的試料と接触させる工程の前に基体に結合している、請求項118記載の方法。
  121. 基体がビーズを含む、請求項120記載の方法。
  122. アプタマーが、検出可能な標識に結合している、請求項118記載の方法。
  123. 微小胞集団を含有することが疑われる生物学的試料中の該微小胞集団の存在またはレベルを検出する方法であって、該生物学的試料を、該微小胞集団に特異的な1種または複数種の結合物質および請求項92〜110のいずれか一項記載の1種または複数種のアプタマーと接触させる工程、ならびに、該1種または複数種の結合物質および該1種または複数種のアプタマーの両方によって認識された微小胞を検出し、それによって、該生物学的試料中の該微小胞集団の存在またはレベルを検出する工程を含む、方法。
  124. 1種または複数種の結合物質が、表3および表4から選択される微小胞表面抗原ならびにそれらの組み合わせに対する抗体またはアプタマーを含む、請求項123記載の方法。
  125. 1種または複数種の結合物質が、生物学的試料と接触させる工程の前に基体に結合している、請求項123記載の方法。
  126. 1種または複数種の結合物質が、検出可能な標識に結合している、請求項123記載の方法。
  127. 1種または複数種のアプタマーが、生物学的試料と接触させる工程の前に基体に結合している、請求項123記載の方法。
  128. 1種または複数種のアプタマーが、検出可能な標識に結合している、請求項123記載の方法。
  129. 1種または複数種のアプタマーが、生物学的試料と接触させる工程の前に基体に結合している、請求項126記載の方法。
  130. 1種または複数種のアプタマーが、検出可能な標識に結合している、請求項125記載の方法。
  131. 生物学的試料中の微小胞集団の存在またはレベルを検出する工程が、疾患の診断、予後判定、またはセラノーシス（theranosis）を提供する、請求項123〜130のいずれか一項記載の方法。
  132. 疾患が癌を含む、請求項131記載の方法。
  133. 癌が乳癌を含む、請求項132記載の方法。
  134. （a）生物学的試験試料を、請求項92〜110のいずれか一項記載の1種または複数種のアプタマーと接触させる工程；
    （b）工程（a）で形成された、該生物学的試験試料における1種または複数種のアプタマーと該1種または複数種のアプタマーに結合された標的との間の複合体の存在またはレベルを検出する工程；
    （c）生物学的対照試料を、1種または複数種のアプタマーと接触させる工程；
    （d）工程（c）で形成された、該生物学的対照試料における1種または複数種のアプタマーと該1種または複数種のアプタマーに結合された標的との間の複合体の存在またはレベルを検出する工程；ならびに
    （e）工程（b）および（d）で検出された存在またはレベルを比較し、それによって、疾患または障害を特徴決定する工程
    を含む、疾患または障害を特徴決定する方法。
  135. 生物学的試験試料および生物学的対照試料がそれぞれ、組織試料、細胞培養物、または生物学的流体を含む、請求項134記載の方法。
  136. 生物学的流体が体液を含む、請求項135記載の方法。
  137. 体液が、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（CSF）、痰、唾液、骨髄、滑液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー腺液もしくは尿道球腺液、女性射精液、汗、糞便、体毛、涙液、嚢胞液、胸膜液および腹膜液、心膜液、リンパ液、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、月経分泌物、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌液、粘膜分泌液、水便、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液、胚盤胞腔液、または臍帯血を含む、請求項136記載の方法。
  138. 体液が、血液、血清、または血漿を含む、請求項136記載の方法。
  139. 生物学的流体が微小胞を含む、請求項135記載の方法。
  140. 1種または複数種のアプタマーがポリペプチドまたはその断片に結合する、請求項134記載の方法。
  141. ポリペプチドまたはその断片が可溶性であるか膜結合性である、請求項134記載の方法。
  142. ポリペプチドまたはその断片が表3または表4のバイオマーカーを含む、請求項134記載の方法。
  143. 1種または複数種のアプタマーが、生物学的試料中の微小胞表面抗原に結合する、請求項134または139記載の方法。
  144. 特徴決定する工程が、疾患または障害の診断、予後判定、またはセラノーシスを含む、請求項134〜143のいずれか一項記載の方法。
  145. 疾患または障害が癌を含む、請求項144記載の方法。
  146. 癌が乳癌を含む、請求項145記載の方法。
  147. 請求項118〜146のいずれか一項記載の方法を実施するための試薬を含むキット。
  148. 請求項118〜146のいずれか一項記載の方法を実施するための試薬の使用。
  149. 試薬が請求項92〜110のいずれか一項記載のアプタマーを含む、請求項147記載のキットまたは請求項148記載の使用。
  150. 試薬が、
    （a）微小胞を単離するように構成された試薬であって、任意で、微小胞を単離するように構成された少なくとも一つの該試薬が、微小胞抗原への結合物質、カラム、基体、ろ過ユニット、ポリマー、ポリエチレングリコール、PEG4000、PEG8000、粒子またはビーズを含む、該試薬；
    （b）オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドを増幅、配列決定、ハイブリダイズまたは検出するためにプライマーまたはプローブとして働くように構成された少なくとも一つのオリゴヌクレオチド；ならびに
    （c）試料から1種または複数種の豊富なタンパク質を除去するように構成された試薬であって、任意で、1種または複数種の豊富なタンパク質が、アルブミン、免疫グロブリン、フィブリノーゲンおよびフィブリンのうち少なくとも1種を含む、該試薬
    のうちの少なくとも一つをさらに含む、請求項149記載のキットまたは使用。
  151. 細胞のまたは細胞外の小胞試料を評価するための投入オリゴヌクレオチドライブラリーを含む組成物であって、投入オリゴヌクレオチドライブラリーを生成するための少なくとも二つのサブセットオリゴヌクレオチドライブラリーを含み、少なくとも二つのサブセットオリゴヌクレオチドライブラリーの少なくとも一つが、50％に等しくない全G+C含量（total G and C content）を有するヌクレオチドの量で製造される、組成物。
  152. 全G+C含量が50％未満である、請求項151記載の組成物。
  153. 全G+C含量が50％超である、請求項151記載の組成物。
  154. 少なくとも一つのサブセットライブラリーが、50％超の全G+C含量で製造され、もう一つのサブセットライブラリーが、50％未満の全G+C含量で製造される、請求項151記載の組成物。
  155. 少なくとも二つのサブセットライブラリーが、それぞれ25％、50％および75％のG+C含量で製造された三つのサブセットライブラリーを含む、請求項151記載の組成物。
  156. 少なくとも二つのサブセットライブラリーが、表13中の少なくとも二つの行に類似する、または等しい量のヌクレオチドで製造される、請求項151記載の組成物。
  157. ヌクレオチドが、天然のヌクレオチドからなる、請求項151記載の組成物。
  158. ヌクレオチドが、修飾された天然のヌクレオチドを含む、請求項151記載の組成物。
  159. ヌクレオチドが、非天然のヌクレオチドを含む、請求項151記載の組成物。
  160. 投入ライブラリーを生成するために少なくとも二つのサブセットライブラリーを接触させる工程を含む、請求項151〜159のいずれか一項記載の投入ライブラリーを生成する方法。
  161. 5'トランスポゾンアダプター領域と、トランスポゾンアダプター領域に対して5'に位置する0またはより多くのヌクレオチドを含むオフセット領域と、オフセット領域に対して5'に位置する可変領域と、可変領域に対して5'に位置する左プライマー領域とを含む配列を有するオリゴヌクレオチド。
  162. 少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000、500000、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017または少なくとも1018個の異なるオリゴヌクレオチド配列を含み、各オリゴヌクレオチド配列が、5'トランスポゾンアダプター領域と、トランスポゾンアダプター領域に対して5'に位置する0またはより多くのヌクレオチドを含むオフセット領域と、オフセット領域に対して5'に位置する可変領域と、可変領域に対して5'に位置する左プライマー領域とを含む、複数のオリゴヌクレオチド。
  163. （a）トランスポゾンアダプター領域が20〜40ヌクレオチドを含み；
    （b）オフセット領域が0、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10ヌクレオチドを含み；
    （c）可変領域が20〜50ヌクレオチドを含み；かつ/または
    （d）左プライマー領域が20〜40ヌクレオチドを含む
    、請求項161〜162のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチド。
  164. （a）トランスポゾンアダプター領域が、配列
    Figure 2016533752
    に対して少なくとも約50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である核酸配列を含み；
    （b）オフセット領域が、以下の配列：5'-T（SEQ ID NO: 510765）、5'-CT（SEQ ID NO: 510766）および5'-ACT（SEQ ID NO: 510767）の少なくとも一つに対して少なくとも約50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である1、2、3、4、5、6、7、8、9または10ヌクレオチドを含み；
    （c）可変領域が15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49または50ヌクレオチドを含み；
    （d）可変領域が請求項151〜159のいずれか一項記載の投入オリゴヌクレオチドライブラリーを含み；かつ/または
    （e）左プライマー領域が、SEQ ID NO: 510768および510769から選択される配列に対して少なくとも約50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である核酸配列を含む
    、請求項161〜163のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチド。
  165. 請求項161〜164のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドを使用してSELEX選択プロセスを実施する工程を含む、アプタマーを同定する方法。
  166. 選択プロセスが、関心対象の標的に対する少なくとも1ラウンドのポジティブ選択および任意で関心対象の標的以外の標的に対する少なくとも1ラウンドのネガティブ選択を含む、請求項165記載の方法。
  167. オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドを試料と接触させる工程、および試料中の標的へのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドの結合の存在またはレベルを検出する工程を含み、任意で、オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが請求項161〜164のいずれか一項記載のものである、方法。
  168. 試料が、生物学的試料、有機試料、無機試料、組織、細胞培養物、体液、血液、血清、細胞、微小胞、タンパク質複合体、脂質複合体、糖質またはそれらの任意の組み合わせ、部分もしくは変種を含む、請求項167記載の方法。
  169. 標的が、細胞、オルガネラ、タンパク質複合体、リポタンパク質、糖質、微小胞、膜断片、小分子、重金属、毒素または薬物を含む、請求項167記載の方法。
  170. （a）微小胞を含む生物学的試料をオリゴヌクレオチドプローブライブラリーと接触させる工程であって、オリゴヌクレオチドプローブライブラリーが請求項161〜164のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドを含む、工程；
    （b）微小胞の少なくとも一部分に結合したオリゴヌクレオチドを同定する工程；および
    （c）同定されたオリゴヌクレオチドのプロファイルに基づいて試料を特徴決定する工程
    を含む、方法。
  171. （a）溶解状態の混合物を形成するために、試料を、少なくとも106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017または少なくとも1018個の異なるオリゴヌクレオチド配列のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブライブラリーと接触させる工程であって、オリゴヌクレオチドが、試料中の複数の実体に結合して複合体を形成することができ、オリゴヌクレオチドプローブライブラリーが請求項161〜164のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドを含む、工程；
    （b）工程（a）で形成された複合体を混合物から分割する工程；および
    （c）試料に関するオリゴヌクレオチドプロファイルを同定するために、工程（b）で分割された複合体中に存在するオリゴヌクレオチドを検出する工程
    を含む、方法。
  172. 検出する工程が、複合体中のすべてもしくはいくつかのオリゴヌクレオチドの配列決定、複合体中のすべてもしくはいくつかのオリゴヌクレオチドの増幅、および/または複合体中のすべてもしくはいくつかのオリゴヌクレオチドの、アレイへのハイブリダイゼーションを実施する工程を含む、請求項171記載の方法。
  173. （a）生物学的試験試料を請求項161〜164のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドと接触させる工程；
    （b）工程（a）で請求項161〜164のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドと生物学的試験試料中の標的との間に形成された複合体の存在またはレベルを検出する工程；および
    （c）工程（b）で検出された存在またはレベルを、生物学的対照試料からの参照レベルと比較し、それによって疾患または障害を特徴決定する工程
    を含む、疾患または障害を特徴決定する方法。
  174. 検出する工程が、複合体中のすべてもしくはいくつかのオリゴヌクレオチドの配列決定、複合体中のすべてもしくはいくつかのオリゴヌクレオチドの増幅、および/または複合体中のすべてもしくはいくつかのオリゴヌクレオチドの、アレイへのハイブリダイゼーションを実施する工程を含み得る、請求項173記載の方法。
  175. 配列決定がハイスループット配列決定を含む、請求項174記載の方法。
  176. 生物学的試験試料および生物学的対照試料がそれぞれ、組織試料、細胞培養物、または生物学的流体を含む、請求項173記載の方法。
  177. 生物学的流体が体液を含む、請求項176記載の方法。
  178. 体液が、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（CSF）、痰、唾液、骨髄、滑液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー腺液もしくは尿道球腺液、女性射精液、汗、糞便、体毛、涙液、嚢胞液、胸膜液および腹膜液、心膜液、リンパ液、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、月経分泌物、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌液、粘膜分泌液、水便、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液、胚盤胞腔液、または臍帯血を含む、請求項177記載の方法。
  179. 体液が、血液、血清、または血漿を含む、請求項177記載の方法。
  180. 生物学的流体が微小胞を含む、請求項176記載の方法。
  181. 複合体が、オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドと少なくとも一つの微小胞との間で形成される、請求項180記載の方法。
  182. 生物学的試験試料および生物学的対照試料が、単離された微小胞を含み、任意で、微小胞が、クロマトグラフィー、ろ過、限外ろ過、遠心分離、超遠心分離、フローサイトメトリー、アフィニティー捕捉（たとえば平面、カラムまたはビーズへの）、ポリマー沈殿の少なくとも一つを使用しかつマイクロ流体工学を使用して単離される、請求項173記載の方法。
  183. オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドがポリペプチドまたはその断片に結合する、請求項173記載の方法。
  184. ポリペプチドまたはその断片が可溶性または膜結合状態であり、任意で、膜が微小胞膜を含む、請求項183記載の方法。
  185. ポリペプチドまたはその断片が表3または表4中のバイオマーカーを含む、請求項184記載の方法。
  186. オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが、生物学的試料中の微小胞表面抗原に結合する、請求項173記載の方法。
  187. 疾患または障害が、乳癌、アルツハイマー病、気管支喘息、膀胱移行上皮癌、巨細胞オステオブラストクラストーマ、脳腫瘍、結腸直腸腺癌、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、子宮頸部扁平上皮癌、急性心筋梗塞（AMI）/急性心不全、クローン病、II型糖尿病、食道癌、喉頭扁平上皮癌、急性および慢性骨髄白血病、肺癌、悪性リンパ腫、多発性硬化症、卵巣癌、パーキンソン病、前立腺腺癌、乾癬、関節リウマチ、腎細胞癌、皮膚有棘細胞癌、胃腺癌、甲状腺癌、精巣癌、潰瘍性大腸炎または子宮腺癌を含む、請求項173記載の方法。
  188. 疾患または障害が、癌、前癌状態、炎症性疾患、免疫疾患、自己免疫疾患もしくは障害、心血管疾患もしくは障害、神経疾患もしくは障害、感染症、または疼痛を含む、請求項173記載の方法。
  189. 癌が、急性リンパ芽球性白血病；急性骨髄性白血病；副腎皮質癌；AIDS関連癌；AIDS関連リンパ腫；肛門癌；虫垂癌；星状細胞腫；非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍；基底細胞癌；膀胱癌；脳幹神経膠腫；脳腫瘍（脳幹神経膠腫、中枢神経系非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍、中枢神経系胚芽腫、星状細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣芽腫、上衣腫、髄芽腫、髄上皮種、中間型松果体実質腫瘍、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、および松果体芽腫を含む）；乳癌；気管支腫瘍；バーキットリンパ腫；原発不明癌；カルチノイド腫瘍；原発不明癌腫；中枢神経系非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍；中枢神経系胚芽腫；子宮頸癌；小児癌；脊索腫；慢性リンパ球性白血病；慢性骨髄性白血病；慢性骨髄増殖性障害；結腸癌；結腸直腸癌；頭蓋咽頭腫；皮膚T細胞リンパ腫；内分泌膵島細胞腫瘍；子宮内膜癌；上衣芽腫；上衣腫；食道癌；鼻腔神経芽細胞腫；ユーイング肉腫；頭蓋外胚細胞腫瘍；性腺外胚細胞腫瘍；肝外胆管癌；胆嚢癌；胃癌；消化管カルチノイド腫瘍；消化管間質細胞腫瘍；消化管間質腫瘍（GIST）；妊娠性絨毛性腫瘍；神経膠腫；毛様細胞性白血病；頭頸部癌；心臓癌；ホジキンリンパ腫；下咽頭癌；眼内黒色腫；膵島腫瘍；カポジ肉腫；腎臓癌；ランゲルハンス細胞組織球症；喉頭癌；口唇癌；肝臓癌；肺癌；悪性線維性組織球腫；骨癌；髄芽腫；髄上皮種；黒色腫；メルケル細胞癌；メルケル細胞皮膚癌；中皮腫；原発不明転移性扁平上皮性頸部癌；口腔癌；多発性内分泌腫瘍症候群；多発性骨髄腫；多発性骨髄腫/形質細胞腫瘍；菌状息肉腫；骨髄異形成症候群；骨髄増殖性腫瘍；鼻腔癌；鼻咽頭癌；神経芽細胞腫；非ホジキンリンパ腫；非黒色腫皮膚癌；非小細胞肺癌；口腔癌；口腔癌；口腔咽頭癌；骨肉腫；その他の脳および脊髄の腫瘍；卵巣癌；卵巣上皮癌；卵巣胚細胞腫瘍；卵巣低悪性度腫瘍；膵臓癌；乳頭腫症；副鼻腔癌；副甲状腺癌；骨盤癌；陰茎癌；咽頭癌；中間型松果体実質腫瘍；松果体芽腫；下垂体腫瘍；形質細胞腫瘍/多発性骨髄腫；胸膜肺芽腫；原発性中枢神経系（CNS）リンパ腫；原発性肝細胞肝癌；前立腺癌；直腸癌；腎臓癌；腎細胞（腎臓）癌；腎細胞癌；気道癌；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；唾液腺癌；セザリー症候群；小細胞肺癌；小腸癌；軟部組織肉腫；扁平上皮癌；扁平上皮性頸部癌；胃癌；テント上原始神経外胚葉性腫瘍；T細胞リンパ腫；精巣癌；咽喉癌；胸腺癌；胸腺腫；甲状腺癌；移行上皮癌；腎盂尿管移行上皮癌；絨毛性腫瘍；尿管癌；尿道癌；子宮癌；子宮肉腫；膣癌；外陰癌；ワルデンシュトレームマクログロブリン血症；またはウィルムス腫瘍を含む、請求項188記載の方法。
  190. 前癌状態がバレット食道を含む、請求項188記載の方法。
  191. 自己免疫疾患が、炎症性腸疾患（IBD）、クローン病（CD）、潰瘍性大腸炎（UC）、骨盤炎症、血管炎、乾癬、糖尿病、自己免疫性肝炎、多発性硬化症、重症筋無力症、I型糖尿病、関節リウマチ、乾癬、全身性エリテマトーデス（SLE）、橋本甲状腺炎、グレーブス病、強直性脊椎炎、シェーグレン病、CREST症候群、強皮症、リウマチ性疾患、臓器拒絶反応、原発性硬化性胆管炎、または敗血症を含む、請求項188記載の方法。
  192. 心血管疾患が、アテローム性動脈硬化症、うっ血性心不全、不安定プラーク、脳卒中、虚血、高血圧症、狭窄症、血管閉塞、または血栓性イベントを含む、請求項188記載の方法。
  193. 神経疾患が、多発性硬化症（MS）、パーキンソン病（PD）、アルツハイマー病（AD）、統合失調症、双極性障害、うつ病、自閉症、プリオン病、ピック病、認知症、ハンチントン病（HD）、ダウン症候群、脳血管疾患、ラズムッセン脳炎、ウイルス性髄膜炎、神経精神全身性エリテマトーデス（NPSLE）、筋萎縮性側索硬化症、クロイツフェルト-ヤコブ病、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、伝達性海綿状脳症、虚血再灌流傷害（例えば脳卒中）、脳損傷、微生物感染、または慢性疲労症候群を含む、請求項188記載の方法。
  194. 疼痛が、線維筋痛症、慢性神経因性疼痛、または末梢性神経因性疼痛を含む、請求項188記載の方法。
  195. 感染症が、細菌感染、ウイルス感染、酵母菌感染、ウィップル病、プリオン病、肝硬変、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、HIV、HCV、肝炎、梅毒、髄膜炎、マラリア、結核、インフルエンザを含む、請求項188記載の方法。
  196. 請求項165〜195のいずれか一項記載の方法を実施するための試薬を含むキット。
  197. 請求項165〜195のいずれか一項記載の方法を実施するための試薬の使用。
  198. 試薬がオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドを含む、請求項196記載のキットまたは請求項197記載の使用。
  199. オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが、請求項151〜159または161〜164のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチドまたはライブラリーに由来するオリゴヌクレオチドの少なくとも一つを含む、請求項198記載のキットまたは使用。
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