JP7298929B2 - サイズ排除クロマトグラフィーを利用した細胞外小胞体の分析方法及びその用途 - Google Patents
サイズ排除クロマトグラフィーを利用した細胞外小胞体の分析方法及びその用途 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7298929B2 JP7298929B2 JP2020517365A JP2020517365A JP7298929B2 JP 7298929 B2 JP7298929 B2 JP 7298929B2 JP 2020517365 A JP2020517365 A JP 2020517365A JP 2020517365 A JP2020517365 A JP 2020517365A JP 7298929 B2 JP7298929 B2 JP 7298929B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- endoplasmic reticulum
- extracellular
- extracellular endoplasmic
- probe
- analyzing
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5076—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving cell organelles, e.g. Golgi complex, endoplasmic reticulum
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/34—Size selective separation, e.g. size exclusion chromatography, gel filtration, permeation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
- C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6486—Measuring fluorescence of biological material, e.g. DNA, RNA, cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/581—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with enzyme label (including co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or substrates)
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D2221/00—Applications of separation devices
- B01D2221/10—Separation devices for use in medical, pharmaceutical or laboratory applications, e.g. separating amalgam from dental treatment residues
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N2030/022—Column chromatography characterised by the kind of separation mechanism
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
- G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
- G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
[技術的課題]
本発明の目的は、(a)細胞外小胞体の構成成分と特異的に結合する結合部及び検出可能な信号部を含むプローブと、細胞外小胞体を含む試料とを混合して反応させる段階、(b)前記混合試料をサイズ排除クロマトグラフィーカラムに注入して展開させる段階、及び(c)前記展開された試料から細胞外小胞体-プローブ複合体及び遊離プローブを検出する段階を含む、細胞外小胞体の分析方法を提供することである。
本発明は、上述した問題点を解決するためのもので、細胞外小胞体の構成成分と特異的に結合する様々な物質をプローブとして使用して、試料と反応させることにより、細胞外小胞体-プローブ複合体を形成し、これをサイズ排除クロマトグラフィーで展開させた後、プローブを検出することにより、細胞外小胞体を分析する方法を提供する。
本発明による細胞外小胞体分析方法を図1に模式的に示した。
[発明の効果]
大腸癌細胞株SW480培養液を、500×gで10分、2000×gで20分間遠心分離して、沈殿物を除去した。上澄み液に存在する細胞外小胞体を1次精製及び沈殿するために、ポリエチレングリコール溶液(8.4%Polyethylene Glycol 6000、250mM NaCl、20mM HEPES、pH7.4)を添加して、16時間冷蔵保管した後、12000×gで30分間遠心分離して沈殿された細胞外小胞体を回収し、その後、HEPES緩衝溶液(HEPES-buffered saline、20mM HEPES、150mM NaCl、pH7.4)に沈殿物を溶かした。
サイズ排除クロマトグラフィーのサイズ別分画能と細胞外小胞体の構成成分を認識する様々なプローブの量を定量することにより、細胞外小胞体の構成成分の量を分析することができることを究明するために、下記のような実験を行った。
精製された標本細胞外小胞体と蛍光標識されたマウス抗体(normal mouse IgG)とを混合して、37℃で30分間反応させた後、セファクリルS500で満たされたカラムに注入して、HPLCシステムを利用して展開しながら、280nm吸光クロマトグラム(図3(a))と蛍光クロマトグラム(図3(b))を分析した。
前記精製された様々な量の標本細胞外小胞体と、細胞外小胞体の膜タンパク質(membrane surface protein)であるCD63を認識する蛍光標識された抗CD63抗体とを混合して、37℃で30分間反応させた後、セファクリルS500で満たされたカラムに注入して、HPLCシステムを利用して展開しながら、280nm吸光クロマトグラム(図4(a))と蛍光クロマトグラム(図4(b))を分析した。
前記において蛍光標識された抗CD63抗体が、標本細胞外小胞体に存在するCD63を特異的に認識して複合体を形成するとき、蛍光標識が特異的結合に影響を及ぼすか否かを確認するために、蛍光標識された抗CD63抗体と、標識のない抗CD63抗体とを混合して反応させた。具体的には、前記標本細胞外小胞体に蛍光標識された抗CD63抗体を混合した群と、標本細胞外小胞体に蛍光標識された抗CD63抗体と蛍光標識されていない抗CD63抗体とを1:10の割合で一緒に混合して反応させた群とにおいて、サイズ排除クロマトグラフィーを通じた蛍光クロマトグラムを比較した。
同量の相違する母細胞(SW480、HMEC1)から分泌された細胞外小胞体に、同量の蛍光標識された抗CD81抗体を混合して、各細胞外小胞体からCD81タンパク質の発現様相を前記サイズ排除クロマトグラフィーの方法を利用して、280nm吸光クロマトグラム(図7(a))と蛍光クロマトグラム(図7(b))で分析した。
本発明の方法を利用して、TNFaが、大腸癌細胞から分泌される細胞外小胞体の構成成分の変化に及ぼす影響を分析した。具体的には、大腸癌細胞培養時にTNFaを24時間処理した群(TNFa+)と、処理していない群(TNFa-)とに分けて、各培養液からの細胞外小胞体を従来の方法で精製した。各群で精製した細胞外小胞体に、蛍光(FITC)標識された抗CD81抗体と蛍光(PE)標識された抗ICAM1抗体を混合して反応させ、前記のサイズ排除クロマトグラフィーカラムに注入して展開しながら、280nm吸光クロマトグラム(図8(a))及び蛍光クロマトグラム(図8(b、c))を分析した。
3-1.蛍光標識された抗CD63 抗体
本発明の分析方法を利用して、細胞培養液から細胞外小胞体の量又は構成成分を分析するために、SW480大腸癌細胞をRPMI培養培地で24時間培養して細胞培養液を回収した。細胞を培養していないRPMI培養培地と蛍光標識された抗CD63抗体を混合した群、及び大腸癌細胞の培養液と蛍光標識された抗CD63抗体を混合した群のそれぞれを、37℃で30分間反応させ、TSK6000 HPLCカラムに注入した後、HPLCシステムを利用して展開しながら蛍光クロマトグラムを分析した。
前記3-1と同様に、前記大腸癌細胞の培養液と蛍光標識された抗CD81抗体を混合して、37℃で30分間反応させてセファクリルS500カラムに注入した後、HPLCシステムを利用して展開しながら、280nm吸光クロマトグラム(図10(a))及び蛍光クロマトグラム(図10(b))を分析した。
細胞が育つ間に分泌される細胞外小胞体の様相を分析するために、培養時間を異にした大腸癌細胞培養液に、それぞれ同量の蛍光標識された抗CD81抗体を混合して、37℃で30分間反応させ、セファクリルS500カラムに注入した後、HPLCシステムを利用して展開した。各細胞培養液に対して、ナノ粒子濃度分析(図11(a))、前記サイズ排除クロマトグラフィーを通じた280nm吸光クロマトグラム(図11(b))及び蛍光クロマトグラム(図11(c))を分析した。
本発明の方法において、細胞外小胞体の内部成分を認識するプローブ又は酵素を使用することにより、細胞外小胞体の構成成分の定量分析が可能であることを確認するために、細胞外小胞体の内部に存在する酵素の内の一つであるエステル分解酵素(esterase)の基質として、膜透過性があり、酵素活性によって蛍光物質に変換される物質であるVPD450を使用した。具体的には、前記精製された標本細胞外小胞体と蛍光標識された抗CD81抗体及び様々な濃度のVPD450を混合して、37℃で30分間反応させて、セファクリルS500カラムに注入した後、HPLCシステムを利用して展開しながら、280nm吸光クロマトグラム(図12(a))及び蛍光クロマトグラム(図12(b、c))を分析した。
前記実施例4で証明された細胞外小胞体の内部に存在する酵素に対する基質を利用して、細胞外小胞体を分析する方法が、生物学的試料において、細胞外小胞体の追加精製なしでも可能であることを証明するために、細胞培養液を利用して実験した。具体的には、SW480大腸癌細胞培養液を前記膜透過性VPD450と混合して、37℃で様々な時間の間反応させた後、セファクリルS500カラムに注入し、その後、HPLCシステムを利用して展開しながら280nm吸光クロマトグラム(図13(a))及び蛍光クロマトグラム(図13(b))を分析した。
6-1.標本細胞外小胞体蛍光VPD450複合体
前記膜透過性酵素基質を利用した細胞外小胞体の分析方法において、図14(a)に示した模式図の通り、細胞外小胞体と反応していない物質から、細胞外小胞体蛍光VPD450複合体を分離した後、分離された複合体を分析した。具体的には、標本細胞外小胞体と膜透過性基質であるVPD450を混合して反応させた後、スピン式セファクリルS500カラムにローディングし、遠心分離を通じて溶出液を回収した。前記溶出された細胞外小胞体蛍光VPD450複合体をセファクリルS500カラムに注入した後、HPLCシステムを利用して展開しながら280nm吸光クロマトグラム及び蛍光クロマトグラム(図14(b))を分析した。
図15(a)の模式図で示した通り、他のエステル分解酵素基質であるCFDA-SEを標本細胞外小胞体と混合した反応溶液を、前記6の方法に基づいて前処理した後、セファクリルS500カラムに注入してHPLCシステムを利用して展開しながら、280nm吸光クロマトグラム及び蛍光クロマトグラム(図15(b))を分析した。
サイズ排除クロマトグラフィー分析方法を利用して、細胞外小胞体の構成成分のうち、脂質二重層と結合するか、又は挿入(transmembrane)されるプローブの量を定量することにより、細胞外小胞体の総量を分析できることを究明するために、プローブとしてビオチンが標識されたコレステロール(Biotin-cholesterol)を使用した。
前記実施例7で、標本細胞外小胞体とビオチンコレステロールの混合反応物からスピン式サイズ排除クロマトグラフィー前処理を通じてビオチンコレステロール細胞外小胞体複合体のみを効果的に分離することができることを証明した。前記の方法を通じて、細胞外小胞体の精製なしに、細胞培養液内の細胞外小胞体の総量を分析することができるか否かを確認するために、SW480大腸癌細胞培養液とビオチンが標識されたコレステロール(Biotin-cholesterol)を使用した。具体的には、図17(a)に示した模式図の通り、互いに異なる濃度のSW480大腸癌細胞の培養液とビオチンコレステロールを混合して、37℃で30分間反応させた。次に、試料内の細胞外小胞体と結合していないビオチンコレステロールを除去するために、前記の各混合溶液をスピン式セファクリルS500カラムにローディングして700×g、5分間遠心分離して溶出液を回収した。対照群にビオチンコレステロール単一群又は大腸癌細胞培養液の単一群を、前記と同じ方法でカラムにローディングした後、スピンを通じて溶出液を回収した。前記溶出液内ビオチンの量を定量するために、溶出液を96ウェルプレート(microplate)に入れた後、試料内の物質をプレートに吸着させて固定した。この後、ストレプトアビジンペルオキシダーゼ(streptavidin-peroxidase)と反応させて洗浄した後、プレートに残存するペルオキシダーゼ酵素活性による化学発光(chemiluminescence)を測定した(図17(b))。
前記実施例8で確認した通り、細胞外小胞体の精製なしに、細胞培養液内の細胞外小胞体を分析することができ、前記の方法をヒトの体液に適用した。具体的には、図18(a)の模式図に示した通り、ヒトの尿又はヒトの血漿とビオチン標識されたコレステロール(Biotin-cholesterol)を混合して、各群を37℃で30分間反応させた後、試料内の細胞外小胞体と結合していないビオチンコレステロールを除去するために、前記の各混合溶液をスピン式セファクリルS500カラムにローディングして、700×g、5分間遠心分離して、溶出液を回収した。対照群にビオチンコレステロール単一群又は各生物学的試料の単一群を、前記と同じ方法でカラムにローディングした後、スピンを通じて溶出液を回収した。前記溶出液内のビオチンの量を定量するために、溶出液を96ウェルプレート(microplate)に入れた後、試料内の物質をプレートに吸着させて固定した。この後、ストレプトアビジンペルオキシダーゼ(streptavidin-peroxidase)と反応させて洗浄した後、プレートに残存するペルオキシダーゼ酵素活性による化学発光(chemiluminescence)を測定した(図18(b、c))。
細胞外小胞体の構成成分のうち、脂質二重層と結合するか、又は挿入されたプローブとして、コレステロールの代わりに蛍光標識された親油性DiIを使用して追加実験を実施した。具体的には、図19(a)に示した模式図の通り、蛍光標識された親油性DiI単一群又は標本細胞外小胞体と蛍光標識された親油性DiIを混合した群を、37℃で30分間反応させた後、細胞外小胞体と結合していない蛍光標識された親油性DiIを除去するために、前記の各混合溶液をスピン式セファクリルS500カラムにローディングして700×g、5分間遠心分離して溶出液を回収した。この後、前記溶出液をセファクリルS500カラムに注入し、HPLCシステムを利用して展開しながら280nm吸光クロマトグラム及び蛍光クロマトグラム(図19(b))を分析した。
前記実施例10と同じプローブを、大腸菌由来細胞外小胞体に適用して分析した。具体的には、図20(a)に示した模式図の通り、蛍光標識された親油性DiI単一群又は大腸菌由来の細胞外小胞体と蛍光標識された親油性DiIを混合した群を、37℃で30分間反応させた後、細胞外小胞体と結合していない蛍光標識された親油性DiIを除去するために、前記の各混合溶液をスピン式セファクリルS500カラムにローディングし、700×g、5分間遠心分離して溶出液を回収した。この後、前記溶出液をセファクリルS500カラムに注入し、HPLCシステムを利用して展開しながら280nm吸光クロマトグラム及び蛍光クロマトグラム(図20(b))を分析した。
Claims (13)
- (a)細胞外小胞体の構成成分と特異的に結合する結合部及び検出可能な信号部を含むプローブと、細胞外小胞体を含む試料とを混合して反応させる段階;
(b)前記混合試料をサイズ排除クロマトグラフィーカラムに注入して展開させる段階;及び
(c)前記展開された試料から細胞外小胞体-プローブ複合体及び遊離プローブを検出し、前記細胞外小胞体-プローブ複合体の量及び前記遊離プローブの量を定量することで、前記細胞外小胞体の構成成分の量を定量する段階を含む、細胞外小胞体の分析方法。 - (a)細胞外小胞体の構成成分と特異的に結合する結合部及び検出可能な信号部を含むプローブと、細胞外小胞体を含む試料とを混合して反応させる段階;
(b)前記混合試料をスピン式サイズ排除クロマトグラフィーカラムに注入して展開させる段階;及び
(c)前記サイズ排除クロマトグラフィーカラムから細胞外小胞体-プローブ複合体を分離する段階;及び
(d)前記分離された細胞外小胞体-プローブ複合体からプローブを検出する段階を含む、細胞外小胞体の分析方法であって、
前記プローブの結合部が、前記細胞外小胞体の膜表面成分、前記細胞外小胞体の膜成分及び前記細胞外小胞体の内部成分からなる群から選択される成分と特異的に結合する、
前記方法。 - 前記プローブは、
細胞外小胞体の構成成分と特異的に結合する結合部及び検出可能な信号部を含む単一物質;又は
細胞外小胞体の構成成分と特異的に結合する結合部を含む物質に、分析可能な一つ以上の信号部を含む物質が結合された複合物質である、請求項1又は2記載の細胞外小胞体の分析方法。 - 前記プローブの結合部は、細胞外小胞体の膜表面成分、細胞外小胞体の膜成分及び細胞外小胞体の内部成分からなる群から選択される一つ以上の成分と特異的に結合する、請求項1記載の細胞外小胞体の分析方法。
- 前記プローブは、タンパク質、抗体、抗体由来の物質、ペプチド、核酸、核酸アミノ酸複合体、酵素、酵素基質、化学的リガンド及びこれらの混合物からなる群から選択される一つ以上である、請求項1又は2記載の細胞外小胞体の分析方法。
- 前記プローブは、蛍光物質、酵素基質、酵素、タンパク質、ペプチド、核酸、ビオチン、金属及び放射性同位元素からなる群から選択される一つ以上の信号部を含む、請求項1又は2記載の細胞外小胞体の分析方法。
- 前記(c)段階は、特定の波長に対する吸光クロマトグラムを検出することにより、細胞外小胞体を定量する段階を含む、請求項1記載の細胞外小胞体の分析方法。
- 前記(d)段階は、特定の波長に対する吸光クロマトグラムを検出することにより、細胞外小胞体を定量する段階を含む、請求項2記載の細胞外小胞体の分析方法。
- 前記特定の波長は、200 nm~800 nmの範囲で選択される一つ以上の値である、請求項7又は8記載の細胞外小胞体の分析方法。
- 前記(c)段階は、プローブの信号部を検出してプローブを定量する段階を含む、請求項1記載の細胞外小胞体の分析方法。
- 前記(d)段階は、プローブの信号部を検出してプローブを定量する段階を含む、請求項2記載の細胞外小胞体の分析方法。
- 前記プローブの信号部を検出する段階は、分光学的分析、物理化学的分析、量子化学的分析、酵素学的分析、ビオチン分析及び核酸分析からなる群から選択される一つ以上の方法を含む、請求項10又は11記載の細胞外小胞体の分析方法。
- 前記試料は、哺乳動物細胞培養培地、バクテリア細胞培養培地、酵母培養培地、組織抽出物、癌組織、血清、血漿、唾液、涙、眼房水、汗、尿、糞、脳脊髄液(CSF、cerebrospinal fluid)、腹水(ascites)、羊水(amniotic fluid)、精液、乳(milk)、ほこり、淡水、海水、土壌及び発酵食品からなる群から選択される一つ以上であることを特徴とする、請求項1又は2記載の細胞外小胞体の分析方法。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR10-2017-0124856 | 2017-09-27 | ||
KR20170124856 | 2017-09-27 | ||
KR1020180115206A KR102243415B1 (ko) | 2017-09-27 | 2018-09-27 | 크기 배제 크로마토그래피를 이용한 세포밖 소포체의 분석 방법 및 이의 용도 |
PCT/KR2018/011443 WO2019066501A1 (ko) | 2017-09-27 | 2018-09-27 | 크기 배제 크로마토그래피를 이용한 세포밖 소포체의 분석 방법 및 이의 용도 |
KR10-2018-0115206 | 2018-09-27 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2020535416A JP2020535416A (ja) | 2020-12-03 |
JP2020535416A5 JP2020535416A5 (ja) | 2021-10-21 |
JP7298929B2 true JP7298929B2 (ja) | 2023-06-27 |
Family
ID=66105803
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2020517365A Active JP7298929B2 (ja) | 2017-09-27 | 2018-09-27 | サイズ排除クロマトグラフィーを利用した細胞外小胞体の分析方法及びその用途 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US11835502B2 (ja) |
EP (1) | EP3690434A4 (ja) |
JP (1) | JP7298929B2 (ja) |
KR (1) | KR102243415B1 (ja) |
CN (1) | CN111386458B (ja) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR102359540B1 (ko) * | 2019-12-06 | 2022-02-10 | 포항공과대학교 산학협력단 | 수용액 이상계 상분리 조성물을 이용한 질병 진단 방법 |
KR102329816B1 (ko) * | 2020-03-20 | 2021-11-19 | 인천대학교 산학협력단 | 고흡습성 수지를 이용한 세포 또는 이의 분비물의 분리 및 농축방법 |
CN112444479B (zh) * | 2021-02-01 | 2021-05-07 | 宁波大学 | 基于并行处理技术的单细胞质谱分析系统及方法 |
CN113092642B (zh) * | 2021-03-30 | 2022-11-01 | 苏州爱宝德生物科技有限公司 | 一种用于细胞外囊泡的快速提取装置 |
CN113189067B (zh) * | 2021-04-27 | 2023-04-25 | 浙江大学 | 一种细胞外囊泡的富集和检测方法及装置 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2014230521A (ja) | 2013-05-29 | 2014-12-11 | 国立大学法人 東京医科歯科大学 | 細胞のリプログラミングのための組成物 |
WO2016143904A1 (ja) | 2015-03-12 | 2016-09-15 | 三井化学株式会社 | エクソソームの破壊方法、エクソソームの破壊キットおよび正常細胞由来のエクソソームの分離方法 |
US20170143856A1 (en) | 2014-05-22 | 2017-05-25 | Snu R&Db Foundation | Method for labeling exosomes with radioactive substance and use thereof |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE69428763T2 (de) * | 1993-12-09 | 2002-08-01 | Ct De Inmunologia Molecular Ci | Monoklonale Antikörper gegen Ganglioside und deren Verwendung in der spezifischen, aktiven Immuntherapie gegen bösartige Tumoren |
EP3708682B1 (en) | 2008-02-01 | 2022-11-23 | The General Hospital Corporation | Use of microvesicles in diagnosis and prognosis of medical diseases and conditions |
AU2010324594B2 (en) | 2009-11-30 | 2016-09-15 | Caris Life Sciences Switzerland Holdings Gmbh | Methods and systems for isolating, storing, and analyzing vesicles |
EP2591359B1 (en) * | 2010-07-07 | 2017-03-01 | Aethlon Medical Inc | Methods for quantifying exosomes |
AU2012267884A1 (en) * | 2011-06-07 | 2014-01-23 | Caris Life Sciences Switzerland Holdings Gmbh | Circulating biomarkers for cancer |
EP2922861A4 (en) | 2012-11-26 | 2016-09-14 | Caris Life Sciences Switzerland Holdings Gmbh | BIOMARKER COMPOSITIONS AND METHODS |
US9086412B2 (en) | 2012-12-31 | 2015-07-21 | University Of Louisville Research Foundation, Inc. | Extracellular vesicle-associated protein markers of cancer |
US10054599B2 (en) * | 2013-03-12 | 2018-08-21 | Agency For Science, Technology And Research (A*Star) | Pre-eclampsia biomarkers |
CN105980615A (zh) * | 2013-08-28 | 2016-09-28 | 卡里斯生命科学瑞士控股有限公司 | 寡核苷酸探针及其用途 |
WO2015112382A1 (en) * | 2014-01-21 | 2015-07-30 | Morehouse School Of Medicine | Exosome-mediated detection of infections and diseases |
-
2018
- 2018-09-27 US US16/651,940 patent/US11835502B2/en active Active
- 2018-09-27 KR KR1020180115206A patent/KR102243415B1/ko active IP Right Grant
- 2018-09-27 JP JP2020517365A patent/JP7298929B2/ja active Active
- 2018-09-27 CN CN201880075753.5A patent/CN111386458B/zh active Active
- 2018-09-27 EP EP18860890.5A patent/EP3690434A4/en active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2014230521A (ja) | 2013-05-29 | 2014-12-11 | 国立大学法人 東京医科歯科大学 | 細胞のリプログラミングのための組成物 |
US20170143856A1 (en) | 2014-05-22 | 2017-05-25 | Snu R&Db Foundation | Method for labeling exosomes with radioactive substance and use thereof |
WO2016143904A1 (ja) | 2015-03-12 | 2016-09-15 | 三井化学株式会社 | エクソソームの破壊方法、エクソソームの破壊キットおよび正常細胞由来のエクソソームの分離方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Labeling Extracellular Vesicles for Nanoscale Flow Cytometry,Scientific Reports,2017年05月12日,Vol.7,P1-10 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN111386458A (zh) | 2020-07-07 |
KR20190036505A (ko) | 2019-04-04 |
US11835502B2 (en) | 2023-12-05 |
US20200284770A1 (en) | 2020-09-10 |
JP2020535416A (ja) | 2020-12-03 |
CN111386458B (zh) | 2023-04-14 |
EP3690434A4 (en) | 2021-05-26 |
EP3690434A1 (en) | 2020-08-05 |
KR102243415B1 (ko) | 2021-04-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7298929B2 (ja) | サイズ排除クロマトグラフィーを利用した細胞外小胞体の分析方法及びその用途 | |
Tang et al. | Advances in mesenchymal stem cell exosomes: a review | |
Lim et al. | Direct isolation and characterization of circulating exosomes from biological samples using magnetic nanowires | |
CN107446879B (zh) | 一种分离和纯化不同外泌体亚群的方法 | |
Phillips et al. | Understanding extracellular vesicle and nanoparticle heterogeneity: Novel methods and considerations | |
Coumans et al. | Bulk immunoassays for analysis of extracellular vesicles | |
Kang et al. | Extracellular vesicles on demand (EVOD) chip for screening and quantification of cancer-associated extracellular vesicles | |
Xu et al. | Recent progress of exosome isolation and peptide recognition-guided strategies for exosome research | |
EP2725359B1 (en) | Cell separation method using a release system for cell-antibody-substrate conjugates containing a polyethylene glycol spacer unit | |
CN111073846B (zh) | 一种分离组织特异来源细胞外囊泡的方法及其试剂盒 | |
Fang et al. | A magnetic bead-mediated selective adsorption strategy for extracellular vesicle separation and purification | |
Tamkovich et al. | Blood circulating exosomes contain distinguishable fractions of free and cell-surface-associated vesicles | |
Xu et al. | MicroRNAs in extracellular vesicles: Sorting mechanisms, diagnostic value, isolation, and detection technology | |
Bellotti et al. | High-grade extracellular vesicles preparation by combined size-exclusion and affinity chromatography | |
WO2016143904A1 (ja) | エクソソームの破壊方法、エクソソームの破壊キットおよび正常細胞由来のエクソソームの分離方法 | |
JP2023100770A (ja) | エクソソーム液体生検サンプルの製造装置、及びその製造方法 | |
Pallares-Rusiñol et al. | Advances in exosome analysis | |
Vinaiphat et al. | Advances in extracellular vesicles analysis | |
Zhao et al. | Comparative analysis of extracellular vesicles isolated from human mesenchymal stem cells by different isolation methods and visualisation of their uptake | |
TW201732040A (zh) | 結合於分子標靶醫藥之dna適體及使用其之分子標靶醫藥之檢測方法 | |
US20190324023A1 (en) | Detection of extracellular vesicles using nanoparticles | |
Malhotra et al. | Novel devices for isolation and detection of bacterial and mammalian extracellular vesicles | |
US9435790B2 (en) | Cell separation technique | |
KR20190036500A (ko) | 크기 배제 크로마토그래피를 이용한 세포밖 소포체의 순도 분석 방법 | |
RU2788198C1 (ru) | Способ выделения и анализа экзосом |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210913 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20210913 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20220726 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220809 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20221107 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20221223 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20230307 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230414 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20230509 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20230608 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7298929 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |