JP2020535416A - サイズ排除クロマトグラフィーを利用した細胞外小胞体の分析方法及びその用途 - Google Patents
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Abstract
Description
[技術的課題]
本発明の目的は、(a)細胞外小胞体の構成成分と特異的に結合する結合部及び検出可能な信号部を含むプローブと、細胞外小胞体を含む試料とを混合して反応させる段階、(b)前記混合試料をサイズ排除クロマトグラフィーカラムに注入して展開させる段階、及び(c)前記展開された試料から細胞外小胞体−プローブ複合体及び遊離プローブを検出する段階を含む、細胞外小胞体の分析方法を提供することである。
本発明は、上述した問題点を解決するためのもので、細胞外小胞体の構成成分と特異的に結合する様々な物質をプローブとして使用して、試料と反応させることにより、細胞外小胞体−プローブ複合体を形成し、これをサイズ排除クロマトグラフィーで展開させた後、プローブを検出することにより、細胞外小胞体を分析する方法を提供する。
本発明による細胞外小胞体分析方法を図1に模式的に示した。
[発明の効果]
大腸癌細胞株SW480培養液を、500×gで10分、2000×gで20分間遠心分離して、沈殿物を除去した。上澄み液に存在する細胞外小胞体を1次精製及び沈殿するために、ポリエチレングリコール溶液(8.4%Polyethylene Glycol 6000、250mM NaCl、20mM HEPES、pH7.4)を添加して、16時間冷蔵保管した後、12000×gで30分間遠心分離して沈殿された細胞外小胞体を回収し、その後、HEPES緩衝溶液(HEPES−buffered saline、20mM HEPES、150mM NaCl、pH7.4)に沈殿物を溶かした。
サイズ排除クロマトグラフィーのサイズ別分画能と細胞外小胞体の構成成分を認識する様々なプローブの量を定量することにより、細胞外小胞体の構成成分の量を分析することができることを究明するために、下記のような実験を行った。
精製された標本細胞外小胞体と蛍光標識されたマウス抗体(normal mouse IgG)とを混合して、37℃で30分間反応させた後、セファクリルS500で満たされたカラムに注入して、HPLCシステムを利用して展開しながら、280nm吸光クロマトグラム(図3(a))と蛍光クロマトグラム(図3(b))を分析した。
前記精製された様々な量の標本細胞外小胞体と、細胞外小胞体の膜タンパク質(membrane surface protein)であるCD63を認識する蛍光標識された抗CD63抗体とを混合して、37℃で30分間反応させた後、セファクリルS500で満たされたカラムに注入して、HPLCシステムを利用して展開しながら、280nm吸光クロマトグラム(図4(a))と蛍光クロマトグラム(図4(b))を分析した。
前記において蛍光標識された抗CD63抗体が、標本細胞外小胞体に存在するCD63を特異的に認識して複合体を形成するとき、蛍光標識が特異的結合に影響を及ぼすか否かを確認するために、蛍光標識された抗CD63抗体と、標識のない抗CD63抗体とを混合して反応させた。具体的には、前記標本細胞外小胞体に蛍光標識された抗CD63抗体を混合した群と、標本細胞外小胞体に蛍光標識された抗CD63抗体と蛍光標識されていない抗CD63抗体とを1:10の割合で一緒に混合して反応させた群とにおいて、サイズ排除クロマトグラフィーを通じた蛍光クロマトグラムを比較した。
同量の相違する母細胞(SW480、HMEC1)から分泌された細胞外小胞体に、同量の蛍光標識された抗CD81抗体を混合して、各細胞外小胞体からCD81タンパク質の発現様相を前記サイズ排除クロマトグラフィーの方法を利用して、280nm吸光クロマトグラム(図7(a))と蛍光クロマトグラム(図7(b))で分析した。
本発明の方法を利用して、TNFaが、大腸癌細胞から分泌される細胞外小胞体の構成成分の変化に及ぼす影響を分析した。具体的には、大腸癌細胞培養時にTNFaを24時間処理した群(TNFa+)と、処理していない群(TNFa−)とに分けて、各培養液からの細胞外小胞体を従来の方法で精製した。各群で精製した細胞外小胞体に、蛍光(FITC)標識された抗CD81抗体と蛍光(PE)標識された抗ICAM1抗体を混合して反応させ、前記のサイズ排除クロマトグラフィーカラムに注入して展開しながら、280nm吸光クロマトグラム(図8(a))及び蛍光クロマトグラム(図8(b、c))を分析した。
3−1.蛍光標識された抗CD63 抗体
本発明の分析方法を利用して、細胞培養液から細胞外小胞体の量又は構成成分を分析するために、SW480大腸癌細胞をRPMI培養培地で24時間培養して細胞培養液を回収した。細胞を培養していないRPMI培養培地と蛍光標識された抗CD63抗体を混合した群、及び大腸癌細胞の培養液と蛍光標識された抗CD63抗体を混合した群のそれぞれを、37℃で30分間反応させ、TSK6000 HPLCカラムに注入した後、HPLCシステムを利用して展開しながら蛍光クロマトグラムを分析した。
前記3−1と同様に、前記大腸癌細胞の培養液と蛍光標識された抗CD81抗体を混合して、37℃で30分間反応させてセファクリルS500カラムに注入した後、HPLCシステムを利用して展開しながら、280nm吸光クロマトグラム(図10(a))及び蛍光クロマトグラム(図10(b))を分析した。
細胞が育つ間に分泌される細胞外小胞体の様相を分析するために、培養時間を異にした大腸癌細胞培養液に、それぞれ同量の蛍光標識された抗CD81抗体を混合して、37℃で30分間反応させ、セファクリルS500カラムに注入した後、HPLCシステムを利用して展開した。各細胞培養液に対して、ナノ粒子濃度分析(図11(a))、前記サイズ排除クロマトグラフィーを通じた280nm吸光クロマトグラム(図11(b))及び蛍光クロマトグラム(図11(c))を分析した。
本発明の方法において、細胞外小胞体の内部成分を認識するプローブ又は酵素を使用することにより、細胞外小胞体の構成成分の定量分析が可能であることを確認するために、細胞外小胞体の内部に存在する酵素の内の一つであるエステル分解酵素(esterase)の基質として、膜透過性があり、酵素活性によって蛍光物質に変換される物質であるVPD450を使用した。具体的には、前記精製された標本細胞外小胞体と蛍光標識された抗CD81抗体及び様々な濃度のVPD450を混合して、37℃で30分間反応させて、セファクリルS500カラムに注入した後、HPLCシステムを利用して展開しながら、280nm吸光クロマトグラム(図12(a))及び蛍光クロマトグラム(図12(b、c))を分析した。
前記実施例4で証明された細胞外小胞体の内部に存在する酵素に対する基質を利用して、細胞外小胞体を分析する方法が、生物学的試料において、細胞外小胞体の追加精製なしでも可能であることを証明するために、細胞培養液を利用して実験した。具体的には、SW480大腸癌細胞培養液を前記膜透過性VPD450と混合して、37℃で様々な時間の間反応させた後、セファクリルS500カラムに注入し、その後、HPLCシステムを利用して展開しながら280nm吸光クロマトグラム(図13(a))及び蛍光クロマトグラム(図13(b))を分析した。
6−1.標本細胞外小胞体蛍光VPD450複合体
前記膜透過性酵素基質を利用した細胞外小胞体の分析方法において、図14(a)に示した模式図の通り、細胞外小胞体と反応していない物質から、細胞外小胞体蛍光VPD450複合体を分離した後、分離された複合体を分析した。具体的には、標本細胞外小胞体と膜透過性基質であるVPD450を混合して反応させた後、スピン式セファクリルS500カラムにローディングし、遠心分離を通じて溶出液を回収した。前記溶出された細胞外小胞体蛍光VPD450複合体をセファクリルS500カラムに注入した後、HPLCシステムを利用して展開しながら280nm吸光クロマトグラム及び蛍光クロマトグラム(図14(b))を分析した。
図15(a)の模式図で示した通り、他のエステル分解酵素基質であるCFDA-SEを標本細胞外小胞体と混合した反応溶液を、前記6の方法に基づいて前処理した後、セファクリルS500カラムに注入してHPLCシステムを利用して展開しながら、280nm吸光クロマトグラム及び蛍光クロマトグラム(図15(b))を分析した。
サイズ排除クロマトグラフィー分析方法を利用して、細胞外小胞体の構成成分のうち、脂質二重層と結合するか、又は挿入(transmembrane)されるプローブの量を定量することにより、細胞外小胞体の総量を分析できることを究明するために、プローブとしてビオチンが標識されたコレステロール(Biotin−cholesterol)を使用した。
前記実施例7で、標本細胞外小胞体とビオチンコレステロールの混合反応物からスピン式サイズ排除クロマトグラフィー前処理を通じてビオチンコレステロール細胞外小胞体複合体のみを効果的に分離することができることを証明した。前記の方法を通じて、細胞外小胞体の精製なしに、細胞培養液内の細胞外小胞体の総量を分析することができるか否かを確認するために、SW480大腸癌細胞培養液とビオチンが標識されたコレステロール(Biotin−cholesterol)を使用した。具体的には、図17(a)に示した模式図の通り、互いに異なる濃度のSW480大腸癌細胞の培養液とビオチンコレステロールを混合して、37℃で30分間反応させた。次に、試料内の細胞外小胞体と結合していないビオチンコレステロールを除去するために、前記の各混合溶液をスピン式セファクリルS500カラムにローディングして700×g、5分間遠心分離して溶出液を回収した。対照群にビオチンコレステロール単一群又は大腸癌細胞培養液の単一群を、前記と同じ方法でカラムにローディングした後、スピンを通じて溶出液を回収した。前記溶出液内ビオチンの量を定量するために、溶出液を96ウェルプレート(microplate)に入れた後、試料内の物質をプレートに吸着させて固定した。この後、ストレプトアビジンペルオキシダーゼ(streptavidin−peroxidase)と反応させて洗浄した後、プレートに残存するペルオキシダーゼ酵素活性による化学発光(chemiluminescence)を測定した(図17(b))。
前記実施例8で確認した通り、細胞外小胞体の精製なしに、細胞培養液内の細胞外小胞体を分析することができ、前記の方法をヒトの体液に適用した。具体的には、図18(a)の模式図に示した通り、ヒトの尿又はヒトの血清とビオチン標識されたコレステロール(Biotin−cholesterol)を混合して、各群を37℃で30分間反応させた後、試料内の細胞外小胞体と結合していないビオチンコレステロールを除去するために、前記の各混合溶液をスピン式セファクリルS500カラムにローディングして、700×g、5分間遠心分離して、溶出液を回収した。対照群にビオチンコレステロール単一群又は各生物学的試料の単一群を、前記と同じ方法でカラムにローディングした後、スピンを通じて溶出液を回収した。前記溶出液内のビオチンの量を定量するために、溶出液を96ウェルプレート(microplate)に入れた後、試料内の物質をプレートに吸着させて固定した。この後、ストレプトアビジンペルオキシダーゼ(streptavidin−peroxidase)と反応させて洗浄した後、プレートに残存するペルオキシダーゼ酵素活性による化学発光(chemiluminescence)を測定した(図18(b、c))。
細胞外小胞体の構成成分のうち、脂質二重層と結合するか、又は挿入されたプローブとして、コレステロールの代わりに蛍光標識された親油性DiIを使用して追加実験を実施した。具体的には、図19(a)に示した模式図の通り、蛍光標識された親油性DiI単一群又は標本細胞外小胞体と蛍光標識された親油性DiIを混合した群を、37℃で30分間反応させた後、細胞外小胞体と結合していない蛍光標識された親油性DiIを除去するために、前記の各混合溶液をスピン式セファクリルS500カラムにローディングして700×g、5分間遠心分離して溶出液を回収した。この後、前記溶出液をセファクリルS500カラムに注入し、HPLCシステムを利用して展開しながら280nm吸光クロマトグラム及び蛍光クロマトグラム(図19(b))を分析した。
前記実施例10と同じプローブを、大腸菌由来細胞外小胞体に適用して分析した。具体的には、図20(a)に示した模式図の通り、蛍光標識された親油性DiI単一群又は大腸菌由来の細胞外小胞体と蛍光標識された親油性DiIを混合した群を、37℃で30分間反応させた後、細胞外小胞体と結合していない蛍光標識された親油性DiIを除去するために、前記の各混合溶液をスピン式セファクリルS500カラムにローディングし、700×g、5分間遠心分離して溶出液を回収した。この後、前記溶出液をセファクリルS500カラムに注入し、HPLCシステムを利用して展開しながら280nm吸光クロマトグラム及び蛍光クロマトグラム(図20(b))を分析した。
Claims (20)
- (a)細胞外小胞体の構成成分と特異的に結合する結合部及び検出可能な信号部を含むプローブと、細胞外小胞体を含む試料とを混合して反応させる段階;
(b)前記混合試料をサイズ排除クロマトグラフィーカラムに注入して展開させる段階;及び
(c)前記展開された試料から細胞外小胞体−プローブ複合体及び遊離プローブを検出する段階を含む、細胞外小胞体の分析方法。 - 前記プローブは、
細胞外小胞体の構成成分と特異的に結合する結合部及び検出可能な信号部を含む単一物質;又は
細胞外小胞体の構成成分と特異的に結合する結合部を含む物質に、分析可能な一つ以上の信号部を含む物質が結合された複合物質である、請求項1記載の細胞外小胞体の分析方法。 - 前記プローブの結合部は、細胞外小胞体の膜表面成分、細胞外小胞体の膜成分及び細胞外小胞体の内部成分からなる群から選択される一つ以上の成分と特異的に結合する、請求項1記載の細胞外小胞体の分析方法。
- 前記プローブは、タンパク質、抗体、抗体由来の物質、ペプチド、核酸、核酸アミノ酸複合体、酵素、酵素基質、化学的リガンド及びこれらの化合物からなる群から選択される一つ以上である、請求項1記載の細胞外小胞体の分析方法。
- 前記プローブは、蛍光物質、酵素基質、酵素、タンパク質、ペプチド、核酸、ビオチン、金属及び放射性同位元素からなる群から選択される一つ以上の信号部を含む、請求項1記載の細胞外小胞体の分析方法。
- 前記検出段階は、特定の波長に対する吸光クロマトグラムを検出することにより、細胞外小胞体を定量する段階を含む、請求項1記載の細胞外小胞体の分析方法。
- 前記特定の波長は、200 nm〜800 nmの範囲で選択される一つ以上の値である、請求項6記載の細胞外小胞体の分析方法。
- 前記検出段階は、プローブの信号部を検出してプローブを定量する段階を含む、請求項1記載の細胞外小胞体の分析方法。
- 前記プローブの信号部を検出する段階は、分光学的分析、物理化学的分析、量子化学的分析、酵素学的分析、ビオチン分析及び核酸分析からなる群から選択される一つ以上の方法を含む、請求項8記載の細胞外小胞体の分析方法。
- 前記試料は、哺乳動物細胞培養培地、バクテリア細胞培養培地、酵母培養培地、組織抽出物、癌組織、血清、血漿、唾液、涙、眼房水、汗、尿、糞、脳脊髄液(CSF、cerebrospinal fluid)、腹水(ascites)、羊水(amniotic fluid)、精液、乳(milk)、ほこり、淡水、海水、土壌及び発酵食品からなる群から選択される一つ以上であることを特徴とする、請求項1記載の細胞外小胞体の分析方法。
- (a)細胞外小胞体の構成成分と特異的に結合する結合部及び検出可能な信号部を含むプローブと、細胞外小胞体を含む試料とを混合して反応させる段階;
(b)前記混合試料をサイズ排除クロマトグラフィーカラムに注入して展開させる段階;及び
(c)前記サイズ排除クロマトグラフィーカラムから細胞外小胞体−プローブ複合体を分離する段階;及び
(d)前記分離された細胞外小胞体−プローブ複合体からプローブを検出する段階を含む、細胞外小胞体の分析方法。 - 前記プローブは、
細胞外小胞体の構成成分と特異的に結合する結合部及び検出可能な信号部を含む単一物質;又は
細胞外小胞体の構成成分と特異的に結合する結合部を含む物質に、分析可能な信号部を含む物質が結合された複合物質である、請求項11記載の細胞外小胞体の分析方法。 - 前記プローブの結合部は、細胞外小胞体の膜表面成分、細胞外小胞体の膜成分及び細胞外小胞体の内部成分からなる群から選択される一つ以上の成分と特異的に結合する、請求項11記載の細胞外小胞体の分析方法。
- 前記プローブは、タンパク質、抗体、抗体由来の物質、ペプチド、核酸、核酸アミノ酸複合体、酵素、酵素基質、化学的リガンド及びこれらの化合物からなる群から選択される一つ以上である、請求項11記載の細胞外小胞体の分析方法。
- 前記プローブは、蛍光物質、酵素基質、酵素、タンパク質、ペプチド、核酸、ビオチン、金属及び放射性同位元素からなる群から選択される一つ以上の信号部を含む、請求項11記載の細胞外小胞体の分析方法。
- 前記検出段階は、特定の波長に対する吸光クロマトグラムを検出することにより、細胞外小胞体を定量する段階を含む、請求項11記載の細胞外小胞体の分析方法。
- 前記特定の波長は、200 nm〜800 nmの範囲で選択される一つ以上の値である、請求項16記載の細胞外小胞体の分析方法。
- 前記検出段階は、プローブの信号部を検出してプローブを定量する段階を含む、請求項11記載の細胞外小胞体の分析方法。
- 前記プローブの信号部を検出する段階は、分光学的分析、物理化学的分析、量子化学的分析、酵素学的分析、ビオチン分析、放射線分析及び核酸分析からなる群から選択される一つ以上の方法を含む、請求項18記載の細胞外小胞体の分析方法。
- 前記試料は、哺乳動物細胞培養培地、バクテリア細胞培養培地、酵母培養培地、組織抽出物、癌組織、血清、血漿、唾液、涙、眼房水、汗、尿、糞、脳脊髄液(CSF、cerebrospinal fluid)、腹水(ascites)、羊水(amniotic fluid)、精液、乳(milk)、ほこり、淡水、海水、土壌及び発酵食品からなる群から選択される一つ以上であることを特徴とする、請求項1記載の細胞外小胞体の分析方法。
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