CN117147817A - 多能干细胞来源小细胞外囊泡的特征性标志物组合及其应用 - Google Patents

多能干细胞来源小细胞外囊泡的特征性标志物组合及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种多能干细胞来源小细胞外囊泡的特征性标志物组合及其应用。多能干细胞来源小细胞外囊泡的特征性标志物组合包括：跨膜蛋白PODXL及其糖基化表位Tra‑1‑60和Tra‑1‑81，和膜表面抗原SSEA‑4，以及标志物CD9，CD63以及CD81。与现有技术相比，本发明利用这些可靠的多能干细胞来源小细胞外囊泡的特征性标志物及其组合进行单囊泡水平的纳米流式分析，能够实现简便、快速地鉴定多能干细胞来源小细胞外囊泡。本发明对于多能干细胞来源小细胞外囊泡的产品质控和临床转化有实际意义。

Description

多能干细胞来源小细胞外囊泡的特征性标志物组合及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种多能干细胞来源小细胞外囊泡的特征性标志物组合及其应用。
背景技术
小细胞外囊泡(small extracellular vesicles，sEVs)是由活细胞分泌的直径小于200nm的具有磷脂双分子层膜结构的微小囊泡。sEVs的表面和内部含有蛋白质、核酸等多种生物活性物质。通过递送这些生物活性成分，sEVs能够充当细胞间通讯的媒介，影响邻近或远处细胞的生物学行为，发挥相关的生物学功能。其中，干细胞来源的sEVs能够发挥与其亲本干细胞相似的生物学功能，同时避免干细胞直接移植的成瘤和血管栓塞等潜在风险。另外，干细胞来源的sEVs还具有免疫原性低，能够穿过皮肤、黏膜、血脑屏障等特点，在组织修复与疾病治疗中极具潜力。在不同类型的干细胞来源的sEVs中，多能干细胞来源的小细胞外囊泡(pluripotent stem cell derived small extracellular vesicles，PSC-sEVs)具有独特的抗衰老功能。多能干细胞来源的小细胞外囊泡分为：胚胎干细胞来源的小细胞外囊泡(embryonic stem cell derived small extracellular vesicles，ESC-sEVs)和诱导多能干细胞来源的小细胞外囊泡(induced pluripotent stem cell derived smallextracellular vesicles，iPSC-sEVs)。PSC-sEVs在多种衰老相关的退行性疾病中显示出治疗效果，包括：心脑血管相关疾病、骨关节肌腱相关疾病、皮肤衰老相关疾病、卵巢早衰等。此外多能干细胞来源的sEVs还具有容易分离纯化，便于大量生产和储存等特点，在临床转化应用方面显示出独特优势。
目前，PSC-sEVs的科学研究及临床转化应用迅速发展，但由于sEVs有不同的生产和分离纯化方法，sEVs的表征方法和检测指标也同样复杂多样，目前的sEVs领域尚缺乏完备的质量控制标准。对于PSC-sEVs，目前的主要的质量控制指标包括：透射电镜下的直接形态观察，颗粒群体的尺寸分布，sEVs表面和内部标志物(CD9，CD63，CD81，TSG101等)的Western Blot鉴定，sEVs的颗粒蛋白比等。经过以上检测可以判定样品中的颗粒是否是sEVs，以及其中含有sEVs的数量和纯度，无法区分sEVs的细胞来源。不同细胞来源的sEVs在生物学功能上有着天壤之别，在实际应用中需要严格鉴定sEVs的细胞来源，并根据细胞来源匹配其特定的生物学功能。对于PSC-sEVs的临床转化应用，其独特的抗衰老功能是至关重要的，因此，对于PSC-sEVs的鉴定，不能仅有sEVs的通用性质分析，必须确认sEVs的细胞来源。遗憾的是，目前PSC-sEVs特异性的检测指标依然缺乏，难以通过对sEVs产品的直接鉴定来确认产品是PSC-sEVs。
因此，通过对PSC-sEVs进行成分解析，寻找特异性的标志物，为PSC-sEVs建立快速、简便的鉴定方法，对于PSC-sEVs的临床转化应用有实际意义。
发明内容
鉴于现有技术中多能干细胞来源小细胞外囊泡(PSC-sEVs)鉴定存在的技术缺陷，本发明提供一种多能干细胞来源小细胞外囊泡的特征性标志物组合及其应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明提供一种多能干细胞来源小细胞外囊泡的特征性标志物组合，所述特征性标志物组合包括跨膜蛋白Podocalyxin-like protein-1(PODXL)及其糖基化表位Tra-1-60和Tra-1-81，和膜表面抗原Stage-Specific Embryonic Antigen-4(SSEA-4)，以及标志物CD9，CD63以及CD81。
本发明还提供一种鉴定多能干细胞来源小细胞外囊泡的方法，基于所述多能干细胞来源小细胞外囊泡的特征性标志物组合来鉴定小细胞外囊泡是否为多能干细胞来源小细胞外囊泡；
基于多能干细胞来源小细胞外囊泡的特征性标志物组合，对待检测的小细胞外囊泡进行免疫荧光染色，
当PODXL/Tra-1-60/Tra-1-81阳性颗粒比例大于50％，且SSEA4阳性颗粒比例大于50％，且CD9阳性颗粒比例大于50％，且CD9/CD63/CD81阳性颗粒比例大于70％时，鉴定小细胞外囊泡为多能干细胞来源的小细胞外囊泡；
当PODXL/Tra-1-60/Tra-1-81阳性颗粒比例大于50％，SSEA4阳性颗粒比例大于50％，CD9阳性颗粒比例大于50％，CD9/CD63/CD81阳性颗粒比例大于70％这四个条件不同时达到时，鉴定小细胞外囊泡为非多能干细胞来源的小细胞外囊泡。
在本发明的一个实施方式中，检测PODXL/Tra-1-60/Tra-1-81阳性颗粒比例的方法为：
在免疫荧光染色时进行三种标志物PODXL/Tra-1-60/Tra-1-81的联合染色，即染色时同时加入三种标志物PODXL、Tra-1-60、Tra-1-81对应的荧光标记的适配体分子，然后孵育后，统计PODXL/Tra-1-60/Tra-1-81同时阳性的颗粒比例；
检测SSEA4阳性颗粒比例的方法为：
在免疫荧光染色时，加入SSEA4对应的荧光标记的适配体分子，然后孵育后，统计SSEA4阳性颗粒比例；
检测CD9阳性颗粒比例的方法为：
在免疫荧光染色时，加入CD9对应的荧光标记的适配体分子，然后孵育后，统计CD9阳性颗粒比例；
检测CD9/CD63/CD81阳性颗粒比例的方法为：
在免疫荧光染色时进行三种标志物CD9/CD63/CD81的联合染色，即染色时同时加入三种标志物CD9、CD63、CD81对应的荧光标记的适配体分子，然后孵育后，统计CD9/CD63/CD81同时阳性的颗粒比例。
在本发明的一个实施方式中，使用荧光标记的能够特异性识别PODXL，Tra-1-60，Tra-1-80，SSEA-4，CD9，CD63，CD81的适配体分子对样品进行免疫荧光染色。所述适配体分子包括但不限于特异性抗体和核酸适配体。
在本发明的一个实施方式中，荧光标记的能够特异性识别PODXL，Tra-1-60，Tra-1-80，SSEA-4，CD9，CD63，CD81的适配体分子分别为：AF488 anti-human PODXL Antibody、AF488 anti-human TRA-1-60-R Antibody、AF488 anti-human TRA-1-81Antibody、AF488anti-human SSEA-4Antibody、AF488 Mouse Anti-Human CD9、AF488 Mouse Anti-HumanCD63、FITC Mouse Anti-Human CD81。
在本发明的一个实施方式中，在进行免疫荧光染色前，计算颗粒蛋白比，颗粒蛋白比(小细胞外囊泡纯度指标)大于1*10^8particles/μg protein，且颗粒浓度在5*10^9particles/mL以上的样品可以进行后续免疫荧光染色以及鉴定；
若在进行免疫荧光染色前，待测样本的颗粒浓度过低，需要浓缩使得样本的颗粒蛋白比大于1*10^8particles/μg protein，且颗粒浓度在5*10^9particles/mL以上，再进行后续免疫荧光染色以及鉴定。
在本发明的一个实施方式中，使用荧光标记的能够特异性识别PODXL，Tra-1-60，Tra-1-80，SSEA-4，CD9，CD63，CD81的适配体分子对样品进行免疫荧光染色时，分别用荧光标记的适配体分子和样本在37℃孵育30min。
在本发明的一个实施方式中，进行免疫荧光染色后，去除免疫荧光染色后未结合的游离荧光标记的适配体分子，以降低游离荧光干扰，去除方法选自超速离心法、超滤法或尺寸排阻色谱法。
在本发明的一个实施方式中，进行免疫荧光染色，且去除免疫荧光染色后未结合的游离荧光标记的适配体分子后，进行单囊泡水平的纳米流式分析，获得PODXL/Tra-1-60/Tra-1-81阳性颗粒比例、SSEA4阳性颗粒比例、CD9阳性颗粒比例以及CD9/CD63/CD81阳性颗粒比例。
在本发明的一个实施方式中，鉴定多能干细胞来源小细胞外囊泡的方法，包括以下步骤：
(1)、样品质控：
在进行免疫荧光染色前，计算颗粒蛋白比，颗粒蛋白比大于1*10^8particles/μgprotein，且颗粒浓度在5*10^9particles/mL以上的样品可以进行后续免疫荧光染色以及鉴定；若在进行免疫荧光染色前，待测样本的颗粒浓度过低，需要浓缩使得样本的颗粒蛋白比大于1*10^8particles/μg protein，且颗粒浓度在5*10^9particles/mL以上，再进行后续免疫荧光染色以及鉴定；
(2)、免疫荧光染色：
将样本分装至低吸附管，分别按比例加入PODXL/Tra-1-60/Tra-1-81、SSEA4、CD9以及CD9/CD63/CD81对应的荧光标记的适配体分子，涡旋振荡后，在37℃孵育30min；
荧光标记的能够特异性识别PODXL，Tra-1-60，Tra-1-80，SSEA-4，CD9，CD63，CD81的适配体分子分别为：AF488 anti-human PODXL Antibody、AF488 anti-human TRA-1-60-R Antibody、AF488 anti-human TRA-1-81Antibody、AF488 anti-human SSEA-4Antibody、AF488 Mouse Anti-Human CD9、AF488 Mouse Anti-Human CD63、FITC Mouse Anti-HumanCD81；
(3)、去除免疫荧光染色后未结合的游离荧光标记的适配体分子：
孵育结束后，选自超速离心法、超滤法或尺寸排阻色谱法去除免疫荧光染色后未结合的游离荧光标记的适配体分子；
(4)、纳米流式检测仪检测：对于去除游离荧光标记的适配体分子后的样品，使用PBS稀释到最适检测浓度后，使用纳米流式检测仪进行单囊泡水平的纳米颗粒荧光分析，获得PODXL/Tra-1-60/Tra-1-81阳性颗粒比例、SSEA4阳性颗粒比例、CD9阳性颗粒比例以及CD9/CD63/CD81阳性颗粒比例；
(5)、鉴定：
当PODXL/Tra-1-60/Tra-1-81阳性颗粒比例大于50％，且SSEA4阳性颗粒比例大于50％，且CD9阳性颗粒比例大于50％，且CD9/CD63/CD81阳性颗粒比例大于70％时，鉴定小细胞外囊泡为多能干细胞来源的小细胞外囊泡；
当PODXL/Tra-1-60/Tra-1-81阳性颗粒比例大于50％，SSEA4阳性颗粒比例大于50％，CD9阳性颗粒比例大于50％，CD9/CD63/CD81阳性颗粒比例大于70％这四个条件不同时达到时，鉴定小细胞外囊泡为非多能干细胞来源的小细胞外囊泡。
在本发明的一个实施方式中，使用纳米流式检测仪对样本进行荧光分析时，样本的荧光背景信号与空白对照相比无明显升高，验证未结合的游离荧光标记的适配体分子已经除去。
在本发明的一个实施方式中，多能干细胞来源小细胞外囊泡的特征性标志物PODXL/Tra-1-60/Tra-1-81和SSEA-4还具有其他应用，包括但不限于：作为药物挂载位点用于PSC-sEV的载药，以及作为荧光蛋白等融合的基因位点用于PSC-sEV的示踪等。
本申请方案克服了现有技术中缺乏PSC-sEVs特异性鉴定指标的问题，提供PSC-sEVs的特异性标志物：跨膜蛋白Podocalyxin-like protein-1(PODXL)及其糖基化表位Tra-1-60和Tra-1-81，膜表面抗原Stage-Specific Embryonic Antigen-4(SSEA-4)，以及标志物CD9，CD63，CD81。本发明提供的PSC-sEVs鉴定方法：对PSC-sEVs的特异性标志物PODXL和SSEA4进行免疫荧光染色和单囊泡水平的纳米流式分析，验证样品中PODXL/Tra-1-60/Tra-1-81阳性颗粒比例大于50％，且SSEA4阳性颗粒比例大于50％，且CD9阳性颗粒比例大于50％，且CD9/CD63/CD81阳性颗粒比例大于70％，则可鉴定样品为PSC-sEVs。
与现有技术相比，本发明利用这些可靠的多能干细胞来源小细胞外囊泡的特征性标志物及其组合进行单囊泡水平的纳米流式分析，能够实现简便、快速地鉴定多能干细胞来源小细胞外囊泡。本发明对于多能干细胞来源小细胞外囊泡的产品质控和临床转化有实际意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单介绍。
图1为本发明鉴定PSC-sEVs的操作流程图。
图2为本发明中PSC-sEVs的性质表征结果图。
图3为本发明鉴定PSC-sEVs的特异性标志物PODXL/Tra-1-60/Tra-1-81和SSEA4，以及sEVs通用标志物CD9，CD63和CD81，以及CD9/CD63/CD81的单囊泡水平的纳米流式分析结果。
图4为本发明在多种不同细胞来源的sEVs样品中检测PODXL/Tra-1-60/Tra-1-81，SSEA4以及CD9，CD63和CD81的单囊泡水平的纳米流式分析结果(图4包括图4-1和图4-2)。
图5为本发明在PSC-sEV上检测其他常用PSC细胞鉴定marker的单囊泡水平的纳米流式分析结果。
图6为本发明中进行检测前样品质控不合格时的检测结果。
图7为本发明中免疫荧光染色后未结合的游离荧光抗体去除不完全(背景荧光水平过高)时的检测结果。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其他方式来实施，本领域技术任意可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，本发明不受下面的具体实施例的限制。
实施例一：多能干细胞来源小细胞外囊泡的鉴定方法
鉴定PSC-sEVs的操作流程参考图1。
1、样品准备：准备胚胎干细胞来源的小细胞外囊泡(embryonic stem cellderived small extracellular vesicles，ESC-sEVs)和诱导多能干细胞来源的小细胞外囊泡(induced pluripotent stem cell derived small extracellular vesicles，iPSC-sEVs)。
2、样品性质表征
形态：使用透射电镜观察样本中纳米颗粒的形貌。
浓度&粒径：使用纳米流式检测仪检测样本的颗粒浓度和粒径分布。
sEVs标志蛋白：使用western blot法分析sEVs表面标志物。
总蛋白含量：使用BCA法测定样品中的总蛋白浓度。
结果如图2所示，可以看出，ESC-sEVs和iPSC-sEVs均表现为典型的茶托状囊泡结构；粒径分布均在30至200nm之间；经western blot鉴定sEVs阳性标志物CD9、CD63、TSG101、Alix均表达，sEVs阴性标志物Calnexin、GM130均不表达。可以认定，所准备的ESC-sEVs和iPSC-sEVs样品均为典型的小细胞外囊泡。
3、样品质控：计算颗粒蛋白比，颗粒蛋白比大于1*10^8particles/μg protein的样品可以进行后续鉴定。鉴定前需确保样本的颗粒浓度在5*10^9particles/mL以上，若样本的颗粒浓度过低，需要浓缩。
4、免疫荧光染色：将样本按100μL分装至低吸附管，分别按比例加入CD9、CD63、CD81、以及SSEA4对应的荧光标记抗体，另有一管样本同时加入PODXL、Tra-1-60、Tra-1-81荧光抗体，还有一管样本中同时加入CD9、CD63、CD81荧光抗体。涡旋振荡后，本实施例中是在37℃下孵育30min。
抗体信息和使用比例如下：AF488 Mouse Anti-Human CD9(NanoFCM,NHA009-A488-50T,1:10-1:40)，AF488 Mouse Anti-Human CD63(NanoFCM,NHA063-A488-50T,1:10-1:40)，FITC Mouse Anti-Human CD81(NanoFCM,NHA-FITC-50T,1:10-1:40)，AF488 anti-human PODXL Antibody(Abcam,ab208254,1:50-1:200)，AF488 anti-human SSEA-4Antibody(BioLegend,330411,1:20-1:100)，AF488 anti-human TRA-1-60-R Antibody(BioLegend,330613,1:50-1:200)，AF488anti-human TRA-1-81Antibody(BioLegend,330709,1:50-1:200)。
5、去除游离抗体(本部分以超速离心法为例，超滤法或尺寸排阻法等其他方法任选一种去除游离抗体即可)：孵育结束后，将液体转移到1mL超速离心管中，向每支超速离心管中加入1mL的PBS稀释，于4℃下，100 000g，超速离心17min(Beckman Coulter MAX-XPcentrifuge,MLA-150rotor)。超速离心结束后，吸弃上清，加入1mL的PBS重悬，再次于4℃下，100 000g，超速离心17min。吸弃上清后，用200μL的PBS重悬。
6、纳米流式检测仪检测：对于去除游离抗体后的样品，使用PBS稀释到最适检测浓度后(本实施例中稀释10倍，不过基于实验条件的略微差异，在实审本发明的其他实施例中可以进行5-20倍稀释)，使用纳米流式检测仪(nFCM，厦门福流生物)进行单囊泡水平的纳米颗粒荧光分析。验证样品中PODXL/Tra-1-60/Tra-1-81阳性颗粒比例大于50％，SSEA4阳性颗粒比例大于50％，CD9阳性颗粒比例大于50％，CD9/CD63/CD81阳性颗粒比例大于70％，则鉴定样品为PSC-sEVs(如图3)。
图3中，Isotype表示同型对照(Isotype Control)，使用与一抗相同种属来源、相同亚型、相同剂量和相同的免疫球蛋白及亚型的免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色。CD9在ESC-sEVs中的含量为67.2％，CD9在iPSC-sEVs中的含量为71.4％，CD63在ESC-sEVs中的含量为49.0％，CD63在iPSC-sEVs中的含量为43.3％，CD81在ESC-sEVs中的含量为41.9％，CD81在iPSC-sEVs中的含量为44.6％，CD9/CD63/CD81阳性颗粒在ESC-sEVs中的含量为74.1％，CD9/CD63/CD81阳性颗粒在iPSC-sEVs中的含量为76.1％，PODXL阳性颗粒在ESC-sEVs中的含量为52.0％，PODXL阳性颗粒在iPSC-sEVs中的含量为53.8％，SSEA4阳性颗粒在ESC-sEVs中的含量为76.0％，SSEA4阳性颗粒在iPSC-sEVs中的含量为76.9％。
图3中特异性标志物PODXL/Tra-1-60/Tra-1-81的检测是指在免疫荧光染色时进行三种标志物PODXL/Tra-1-60/Tra-1-81的联合染色，即染色时同时加入三种标志物对应的抗体。CD9/CD63/CD81的检测是指在免疫荧光染色时进行三种标志物CD9/CD63/CD81的联合染色，即染色时同时加入三种标志物对应的抗体。PODXL/Tra-1-60/Tra-1-81阳性颗粒比例是指同时进行PODXL/Tra-1-60/Tra-1-81染色后，阳性颗粒的比例。
由于CD9、CD63、CD81均为通用型sEVs标志物，因此在本实施例中单独检测每个标志物的阳性率，以及CD9/CD63/CD81组合的阳性率。
图3所示的结果验证样品中PODXL/Tra-1-60/Tra-1-81阳性颗粒比例大于50％(具体PODXL/Tra-1-60/Tra-1-81阳性颗粒在ESC-sEVs中的含量为51.4％，PODXL/Tra-1-60/Tra-1-81阳性颗粒在iPSC-sEVs中的含量为59.7％)，SSEA4阳性颗粒比例大于50％，CD9阳性颗粒比例大于50％，CD9/CD63/CD81阳性颗粒比例大于70％，则鉴定样品为PSC-sEVs。
实施例二：其他细胞来源的小细胞外囊泡(非PSC-sEV)的鉴定
1、样品准备：准备人脐带间充质干细胞来源小细胞外囊泡(MSC-sEVs)，人成纤维细胞来源小细胞外囊泡(HFF1-sEVs)，人肾上皮细胞来源小细胞外囊泡(293T-sEVs)，人非小细胞肺癌细胞来源小细胞外囊泡(A549-sEVs)，人大细胞肺癌细胞来源小细胞外囊泡(H460-sEVs)，人乳腺癌细胞来源小细胞外囊泡(MCF7-sEVs)，人乳腺癌细胞来源小细胞外囊泡(MDA-MB-231-sEVs)。
2、按实施例一中步骤2-6，对样品进行质控、免疫荧光染色和游离荧光抗体去除后，使用纳米流式检测仪检测其通用标志物CD9，CD63，CD81阳性颗粒比例，以及PSC-sEVs特异性标志物PODXL/Tra-1-60/Tra-1-81和SSEA4阳性颗粒比例。
图4(包括图4-1和图4-2)中，Isotype表示同型对照(Isotype Control)，使用与一抗相同种属来源、相同亚型、相同剂量和相同的免疫球蛋白及亚型的免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色。CD9在293T-sEVs、HFF1-sEVs、MSC-sEVs、A549-sEVs、H460-sEVs、MCF7-sEVs、MDA-MB-231-sEVs中的含量分别为31.4、37.5、35.4、30.3、35.9、43.4、32.0％，CD63在293T-sEVs、HFF1-sEVs、MSC-sEVs、A549-sEVs、H460-sEVs、MCF7-sEVs、MDA-MB-231-sEVs中的含量分别为43.9、43.5、49.3、42.5、34.6、46.2、51.9％，CD81在293T-sEVs、HFF1-sEVs、MSC-sEVs、A549-sEVs、H460-sEVs、MCF7-sEVs、MDA-MB-231-sEVs中的含量分别为37.6、42.2、58.2、26.7、43.1、27.7、33.4％，CD9/CD63/CD81阳性颗粒在293T-sEVs、HFF1-sEVs、MSC-sEVs、A549-sEVs、H460-sEVs、MCF7-sEVs、MDA-MB-231-sEVs中的含量分别为62.0、63.8、75.5、52.0、57.0、65.9、65.0％，PODXL阳性颗粒在293T-sEVs、HFF1-sEVs、MSC-sEVs、A549-sEVs、H460-sEVs、MCF7-sEVs、MDA-MB-231-sEVs中的含量分别为1.1、1.4、3.0、9.5、7.6、8.7、20％，SSEA4阳性颗粒在293T-sEVs、HFF1-sEVs、MSC-sEVs、A549-sEVs、H460-sEVs、MCF7-sEVs、MDA-MB-231-sEVs中的含量分别为4.8、5.3、2.5、4.9、7.1、7.6、14.7％。
图4中特异性标志物PODXL/Tra-1-60/Tra-1-81的检测是指在免疫荧光染色时进行三种标志物PODXL/Tra-1-60/Tra-1-81的联合染色，即染色时同时加入三种标志物对应的抗体。CD9/CD63/CD81的检测是指在免疫荧光染色时进行三种标志物CD9/CD63/CD81的联合染色，即染色时同时加入三种标志物对应的抗体。PODXL/Tra-1-60/Tra-1-81阳性颗粒比例是指同时进行PODXL/Tra-1-60/Tra-1-81染色后，阳性颗粒的比例。
如图4可以看到，其他细胞来源的小细胞外囊泡(非PSC-sEV)无法同时具备以下四个特征：PODXL/Tra-1-60/Tra-1-81阳性颗粒比例大于50％，且SSEA4阳性颗粒比例大于50％，且CD9阳性颗粒比例大于50％，且CD9/CD63/CD81阳性颗粒比例大于70％，因此可鉴定样品不是PSC-sEVs。
由图4可以结论可以看出，鉴定PSC-sEVs需满足PODXL/Tra-1-60/Tra-1-81阳性颗粒比例大于50％，且SSEA4阳性颗粒比例大于50％，且CD9阳性颗粒比例大于50％，且CD9/CD63/CD81阳性颗粒比例大于70％，四个条件缺一不可，其他非PSC-sEVs无法同时满足四个条件。
实施例三、在PSC-sEV表面鉴定PSC常用标志物
1、PSC的常用标志物中选择亚细胞定位在膜上的SSEA4、Tra-1-60、Tra-1-81作为检测指标。
2、按实施例一中步骤2-5对样品进行质控，分别对SSEA4、Tra-1-60、Tra-1-81进行免疫荧光染色，然后去除游离荧光抗体，使用纳米流式检测仪，分别检测PSC-sEV样品中SSEA4、Tra-1-60、Tra-1-81阳性颗粒比例。
如图5可以看到PSC-sEV样品中SSEA4阳性颗粒占比大于50％(为76.0)，而Tra-1-60阳性颗粒占比小于20％(为6.4％)，Tra-1-81阳性颗粒占比小于20％(为9.8％)。此结果说明尽管Tra-1-60、Tra-1-81是PSC细胞的标志物，但不能单独作为PSC-sEVs的标志物，PSC的标志物并不都是PSC-sEV的标志物，必须以PODXL/Tra-1-60/Tra-1-81组合使用。
实施例四：多能干细胞来源小细胞外囊泡的鉴定方法(样品质控不合格)
1、样品准备：准备纯度较高(颗粒蛋白比为3*10^8particles/ug protein)的PSC-sEV样品，颗粒浓度正常(2*10^10particles/mL)；纯度较高(颗粒蛋白比为3*10^8particles/ug protein)的PSC-sEV样品，颗粒浓度偏低(1*10^9particles/mL)；纯度较差(颗粒蛋白比为6*10^7particles/ug protein)的PSC-sEV样品。
2、按实施例一中步骤4-5对样品进行免疫荧光染色和游离荧光抗体去除后，使用纳米流式检测仪检测其通用标志物CD9，CD9/CD63/CD81阳性颗粒比例。结果如图6所示。
图6中特异性标志物CD9/CD63/CD81的检测是指在免疫荧光染色时进行三种标志物CD9/CD63/CD81的联合染色，即染色时同时加入三种标志物对应的抗体。PODXL/Tra-1-60/Tra-1-81阳性颗粒比例是指同时进行PODXL/Tra-1-60/Tra-1-81染色后，阳性颗粒的比例。
图6的结果表明，对于颗粒蛋白比大于1*10^8particles/μg protein且颗粒浓度高于5*10^9particles/mL的合格PSC-sEV样品，CD9阳性颗粒比例大于50％(为70.3％)，CD9/CD63/CD81阳性颗粒比例大于70％(为72.0％)。对于颗粒蛋白比低于1*10^8particles/μg protein或者颗粒浓度低于5*10^9particles/mL的样品，CD9阳性颗粒比例低于50％(为28.8或45.4％)，CD9/CD63/CD81阳性颗粒比例低于70％(为66.2或54.7％)。总的来说，质控不合格(浓度和纯度不足)的样品，无法达到PSC-sEVs的鉴定要求，无法鉴定为PSC-sEVs。
实施例五：多能干细胞来源小细胞外囊泡的鉴定方法(游离抗体去除不完全)
1、按照实施例一中步骤2-4进行样本质控和免疫荧光染色。
2、按照实施例一中步骤5去除游离荧光抗体，另有一管样本免疫荧光染色结束后，将液体转移到1mL超速离心管中，向超速离心管中加入1mL的PBS稀释，于4℃下，100 000g，超速离心17min，超速离心结束后，吸弃上清，加入200uL的PBS重悬后直接用于检测(相比于实施例一中的去除游离荧光抗体的步骤，减少了一次超速离心过程，游离抗体去除不完全)。
3、使用纳米流式检测仪检测其通用标志物CD9，CD9/CD63/CD81，以及PSC-sEVs特异性标志物PODXL/Tra-1-60/Tra-1-81阳性颗粒比例。结果如图7所示，对于未结合的游离荧光抗体去除较好(背景荧光水平较低)的PSC-sEV样品，CD9阳性颗粒比例大于50％，CD9/CD63/CD81阳性颗粒比例大于70％，PODXL/Tra-1-60/Tra-1-81阳性颗粒比例大于50％。对于未结合的游离荧光抗体去除不完全(背景荧光水平过高)的PSC-sEV样品，CD9阳性颗粒比例低于20％，CD9/CD63/CD81阳性颗粒比例低于30％，PODXL/Tra-1-60/Tra-1-81阳性颗粒比例低于20％。总的来说，鉴定PSC-sEVs样品过程中，若游离抗体去除不完全，结果将无法达到PSC-sEVs的鉴定要求，无法鉴定为PSC-sEVs。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种多能干细胞来源小细胞外囊泡的特征性标志物组合，其特征在于，所述特征性标志物组合包括：跨膜蛋白PODXL及其糖基化表位Tra-1-60和Tra-1-81，膜表面抗原SSEA-4，以及标志物CD9，CD63以及CD81。
2.一种鉴定多能干细胞来源小细胞外囊泡的方法，其特征在于，基于权利要求1所述多能干细胞来源小细胞外囊泡的特征性标志物组合来鉴定小细胞外囊泡是否为多能干细胞来源小细胞外囊泡；
基于多能干细胞来源小细胞外囊泡的特征性标志物组合，对待检测的小细胞外囊泡进行免疫荧光染色，
当PODXL/Tra-1-60/Tra-1-81阳性颗粒比例大于50％，且SSEA4阳性颗粒比例大于50％，且CD9阳性颗粒比例大于50％，且CD9/CD63/CD81阳性颗粒比例大于70％时，鉴定小细胞外囊泡为多能干细胞来源的小细胞外囊泡；
当PODXL/Tra-1-60/Tra-1-81阳性颗粒比例大于50％，SSEA4阳性颗粒比例大于50％，CD9阳性颗粒比例大于50％，CD9/CD63/CD81阳性颗粒比例大于70％这四个条件不同时达到时，鉴定小细胞外囊泡为非多能干细胞来源的小细胞外囊泡。
3.根据权利要求2所述的一种鉴定多能干细胞来源小细胞外囊泡的方法，其特征在于，检测PODXL/Tra-1-60/Tra-1-81阳性颗粒比例的方法为：
在免疫荧光染色时进行三种标志物PODXL/Tra-1-60/Tra-1-81的联合染色，即染色时同时加入三种标志物PODXL、Tra-1-60、Tra-1-81对应的荧光标记的适配体分子，然后孵育后，统计PODXL/Tra-1-60/Tra-1-81同时阳性的颗粒比例；
检测SSEA4阳性颗粒比例的方法为：
在免疫荧光染色时，加入SSEA4对应的荧光标记的适配体分子，然后孵育后，统计SSEA4阳性颗粒比例；
检测CD9阳性颗粒比例的方法为：
在免疫荧光染色时，加入CD9对应的荧光标记的适配体分子，然后孵育后，统计CD9阳性颗粒比例；
检测CD9/CD63/CD81阳性颗粒比例的方法为：
在免疫荧光染色时进行三种标志物CD9/CD63/CD81的联合染色，即染色时同时加入三种标志物CD9、CD63、CD81对应的荧光标记的适配体分子，然后孵育后，统计CD9/CD63/CD81同时阳性的颗粒比例。
4.根据权利要求3所述的一种鉴定多能干细胞来源小细胞外囊泡的方法，其特征在于，使用荧光标记的能够特异性识别PODXL，Tra-1-60，Tra-1-80，SSEA-4，CD9，CD63，CD81的适配体分子对样品进行免疫荧光染色。
5.根据权利要求4所述的一种鉴定多能干细胞来源小细胞外囊泡的方法，其特征在于，荧光标记的能够特异性识别PODXL，Tra-1-60，Tra-1-80，SSEA-4，CD9，CD63，CD81的适配体分子分别为：AF488 anti-human PODXL Antibody、AF488 anti-human TRA-1-60-RAntibody、AF488 anti-human TRA-1-81Antibody、AF488 anti-human SSEA-4Antibody、AF488 Mouse Anti-Human CD9、AF488 Mouse Anti-Human CD63、FITC Mouse Anti-HumanCD81。
6.根据权利要求2所述的一种鉴定多能干细胞来源小细胞外囊泡的方法，其特征在于，在进行免疫荧光染色前，计算颗粒蛋白比，颗粒蛋白比大于1*10^8particles/μg protein，且颗粒浓度在5*10^9particles/mL以上的样品可以进行后续免疫荧光染色以及鉴定；
若在进行免疫荧光染色前，待测样本的颗粒浓度过低，需要浓缩使得样本的颗粒蛋白比大于1*10^8particles/μg protein，且颗粒浓度在5*10^9particles/mL以上，再进行后续免疫荧光染色以及鉴定。
7.根据权利要求2所述的一种鉴定多能干细胞来源小细胞外囊泡的方法，其特征在于，使用荧光标记的能够特异性识别PODXL，Tra-1-60，Tra-1-80，SSEA-4，CD9，CD63，CD81的适配体分子对样品进行免疫荧光染色时，分别用荧光标记的适配体分子和样本在37℃孵育30min。
8.根据权利要求2所述的一种鉴定多能干细胞来源小细胞外囊泡的方法，其特征在于，进行免疫荧光染色后，去除免疫荧光染色后未结合的游离的荧光标记的适配体分子，以降低游离荧光干扰，去除方法选自超速离心法、超滤法或尺寸排阻色谱法。
9.根据权利要求2所述的一种鉴定多能干细胞来源小细胞外囊泡的方法，其特征在于，进行免疫荧光染色，且去除免疫荧光染色后未结合的游离的荧光标记的适配体分子后，进行单囊泡水平的纳米流式分析，获得PODXL/Tra-1-60/Tra-1-81阳性颗粒比例、SSEA4阳性颗粒比例、CD9阳性颗粒比例以及CD9/CD63/CD81阳性颗粒比例。
10.根据权利要求2所述的一种鉴定多能干细胞来源小细胞外囊泡的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)、样品质控：
在进行免疫荧光染色前，计算颗粒蛋白比，颗粒蛋白比大于1*10^8particles/μgprotein，且颗粒浓度在5*10^9particles/mL以上的样品可以进行后续免疫荧光染色以及鉴定；若在进行免疫荧光染色前，待测样本的颗粒浓度过低，需要浓缩使得样本的颗粒蛋白比大于1*10^8particles/μg protein，且颗粒浓度在5*10^9particles/mL以上，再进行后续免疫荧光染色以及鉴定；
(2)、免疫荧光染色：
将样本分装至低吸附管，分别按比例加入PODXL/Tra-1-60/Tra-1-81、SSEA4、CD9以及CD9/CD63/CD81对应的荧光标记的适配体分子，涡旋振荡后，在37℃孵育30min；
荧光标记的能够特异性识别PODXL，Tra-1-60，Tra-1-80，SSEA-4，CD9，CD63，CD81的适配体分子分别为：AF488 anti-human PODXL Antibody、AF488 anti-human TRA-1-60-RAntibody、AF488 anti-human TRA-1-81Antibody、AF488 anti-human SSEA-4Antibody、AF488 Mouse Anti-Human CD9、AF488 Mouse Anti-Human CD63、FITC Mouse Anti-HumanCD81；
(3)、去除免疫荧光染色后未结合的游离荧光标记的适配体分子：
孵育结束后，选自超速离心法、超滤法或尺寸排阻色谱法去除免疫荧光染色后未结合的游离荧光标记的适配体分子；
(4)、纳米流式检测仪检测：对于去除游离荧光标记的适配体分子后的样品，使用PBS稀释到最适检测浓度后，使用纳米流式检测仪进行单囊泡水平的纳米颗粒荧光分析，获得PODXL/Tra-1-60/Tra-1-81阳性颗粒比例、SSEA4阳性颗粒比例、CD9阳性颗粒比例以及CD9/CD63/CD81阳性颗粒比例；
(5)、鉴定：
当PODXL/Tra-1-60/Tra-1-81阳性颗粒比例大于50％，且SSEA4阳性颗粒比例大于50％，且CD9阳性颗粒比例大于50％，且CD9/CD63/CD81阳性颗粒比例大于70％时，鉴定小细胞外囊泡为多能干细胞来源的小细胞外囊泡；
当PODXL/Tra-1-60/Tra-1-81阳性颗粒比例大于50％，SSEA4阳性颗粒比例大于50％，CD9阳性颗粒比例大于50％，CD9/CD63/CD81阳性颗粒比例大于70％这四个条件不同时达到时，鉴定小细胞外囊泡为非多能干细胞来源的小细胞外囊泡。
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