CN115925965B - 一种有核细胞处理试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种有核细胞处理试剂盒及其应用，所述试剂盒包括干细胞抗老化剂、纳米磁珠、洗脱液和磁珠清洗液。本发明提供了干细胞抗老化剂，包括抗氧化剂、mTOR抑制剂和糖类物质，能够抑制细胞老化，保持细胞干性，促进外泌体分泌，提高外泌体质量；提供了一种靶向抗CD9、CD81的多特异性抗原结合物，所述多特异性抗原结合物中靶向CD9和CD81的抗原结合片段具有2:1的比例，能够识别和获取表面具有特定抗原的干细胞外泌体，所述外泌体具有更强的促细胞增殖能力和损伤修复能力；提供了一种干细胞外泌体分离方法，将差速离心法与免疫磁珠法相结合，避免了对昂贵大型设备的依赖，提供筛选干细胞外泌体的质量和效率；采用所述试剂盒和方法获得的干细胞外泌体，可调节细胞因子分泌水平，促进血管新生，抑制疤痕形成。

Description

一种有核细胞处理试剂盒及其应用

技术领域：

本发明属于生物技术领域，具体提供了一种有核细胞处理试剂盒及其应用。

背景技术：

有核细胞是指具有细胞核的细胞，内部含有大量遗传物质，可以调节各种生命活动，是细胞治疗领域的基础材料；而干细胞具有多项分化能力，可修复多种组织损伤，因而受到细胞治疗领域研究人员的高度重视。然而，随着研究的不断深入，人们开始意识到直接使用干细胞存在培养和保存条件苛刻、制备成本高、存在移植抗宿主风险和伦理风险等多重限制，因此研究的重点逐渐转向了干细胞的衍生物，例如干细胞外泌体。

1983年，研究人员在绵羊网织红细胞中发现了外泌体，但它们最初被认为是细胞废物，长期未受到业界重视；直到2007年，学者们发现这种纳米级囊泡内含有蛋白质、脂质和RNA(包括mRNA和miRNA)，可以作为发挥生物学功能的信号分子传递给其他细胞，展现了生物学研究和临床应用价值。研究发现，外泌体是具有纳米级双层膜的细胞外囊泡，其表面为磷脂双层，外泌体具有良好的稳定性和渗透性，在它们进入靶细胞后，外泌体可以调节细胞的生理功能和信号传导；外泌体在显微镜下呈杯状结构，直径范围为30至200nm，密度约为1.13–1.19g/mL，外泌体可在-80℃环境中长期储存，与新鲜分离的外泌体相比，在不同条件下长期保存的外泌体会出现不同程度的直径增大，并且观察到上清液中外泌体有不同程度的蛋白质泄漏现象；外泌体的分布相当广泛，几乎存在于所有体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁。

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有自我更新和多向分化的潜力，常见MSCs源自脂肪(AMSCs)、骨髓(BMSCs)、脐带(UCMSCs)和牙龈，MSCs自1968年发现以来引起了广泛关注，并已用于临床前研究多年。各种类型的间充质干细胞可以在正常和病理条件下分泌外泌体，外泌体由细胞内溶酶体颗粒内陷形成，通过内吞作用与内体膜和细胞膜融合后，通过旁分泌信号释放到细胞外基质中。尽管不同来源的MSC衍生的外泌体具有不同的产量，例如骨髓间充质干细胞比脂肪来源的间充质干细胞释放更多的外泌体；人羊水间充质干细胞外泌体的产量显著高于人骨髓间充质干细胞，但是其生理功能类似，如研究表明来自源自人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，HUMSCs)的外泌体和源自骨髓的外泌体(human bone marrow mesenchymal stem cells，HBMSCs)的外泌体中60％的蛋白质是相同的，这些蛋白质与细胞生长和抗氧化应激有关，均可抑制肿瘤细胞的生长。

目前可用于有效分离外泌体的方法有以下几种：差速离心法、密度梯度离心法、沉淀法、冲洗分离法、超滤法、抗体亲和捕获法、微流体分离法和质谱法。

差速离心法，该方法的原理是根据外泌体的体积和物理特性分离外泌体与样品中存在的其他物质，将收集的样品以不同的速度离心以去除细胞、细胞碎片和大分子蛋白，然后以100000×g超速离心70分钟以获得上清液中的外泌体。差速离心是外泌体分离方法中的金标准，是从细胞生物液和培养上清液中提取外泌体最常用的方法，但尽管差速离心(包括超速离心)对于外泌体的分离是有效的，但对于研究实验室和临床环境来说，该技术耗时、劳动密集且严重依赖仪器，此外超速离心过程可能导致大量外泌体丢失，有降低产量的风险。此外，在分离效果上该方法也受到质疑，一方面该方法可能导致纯度不足，由于微泡和外泌体的鉴定没有统一的标准，这导致一些研究表明最终的离心产物是微泡而不是外泌体，因此其被认为不适合从少量血清样品中提取外泌体；另一方面，存在于外泌体上的蛋白质和RNA成分在超速离心过程中受到较大影响，不利于后期利用，因此该方法主要适用于细胞上清液和尿液等较大样本以及蛋白质研究。

密度梯度离心法，在密度梯度区域离心中，将样品加入惰性梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡，在一定的离心力作用下，样品的不同成分会沉降到它们的等密度区，从而实现外泌体与样品中其他成分的分离。该类方法中最常用的是蔗糖密度梯度离心法，将线性蔗糖梯度(0.25-2.0M蔗糖)构建到超速离心管中，然后将样品沉积在该线性蔗糖梯度的顶部，然后将梯度溶液在4℃下以210000g超速离心，获得外泌体。与传统的超速离心法相比，该方法的优点是，首先它具有更高的分离效率，从而产生更高纯度的外泌体；其次外泌体颗粒在分离过程中不易被压碎或变形，防止分离后的成分再次混合。该方法的缺点是离心时间较长，终产物收率不高。此外，需要在运行该方法之前准备惰性梯度介质溶液，而且准备工作和方法本身都复杂且耗时，密度梯度离心所需的仪器也很昂贵，并且在实验室中占用大量空间，这使许多实验室无法实施该方法。

沉淀法，该方法将溶剂添加到溶液中以改变某些组分的极性和溶解度，从而使它们沉淀到溶液中。与差速离心法相比，沉淀法可以有效改善生物体液的分离效率，目前已经开发出了Serum^TM、Exo-Q和Exo-Spin^TM血细胞纯化试剂盒、mi-RCURY外泌体分离试剂盒、ExoQuick-TC Exosome^TM沉淀溶液试剂盒、甲醇沉淀和总外泌体分离试剂盒等多种提取试剂盒。但这种方法由于使用沉淀试剂，使得外泌体的纯度受到影响。

冲洗分离法，该方法利用色谱分离原理，将样品添加到色谱柱的一端，使其吸附和溶解在固定相上，然后使用冲洗剂将样品从固定相上分离。这种方法具有时间和成本效益优势，大规模临床应用前景较好。但是，这种方法对于外泌体的吸附和冲洗分离难以完全，容易造成外泌体样品的浪费，不适用少量或痕量样本的分离和检测。

超滤法，利用超滤膜两侧的压力差作为驱动力，在一定压力下，原液流过膜表面，大体积颗粒被截留，而小体积颗粒可通过超滤膜，达到对原液的提纯、分离、浓缩。这种方法可以去除密度梯度离心难以去除的某些杂质，如非特异性AGO蛋白，但是超滤膜的分离孔易发生堵塞，使得处理效率逐渐降低，分离时间延长，不利于大量样品的处理。

免疫磁珠法，该方法中将特异性抗体固定于磁珠上，利用抗体-抗原特异性结合能力，筛选和分离外泌体。该方法可特异性筛选表达某一种或多种特异性抗原的外泌体，有研究表明抗体亲和捕获法分离外泌体比离心法或密度梯度法更有效(Popovic M，Mazzega E，Toffoletto B，de Marco A.Isolation of anti-extra-cellular vesicle single-domain antibodies by direct panning on vesicle-enriched fractions.Microb CellFactories.2018；17(1):6)，从而为特定疾病的诊断或治疗提供了解决方案。但是传统抗体结构复杂，生产成本高昂，限制了其应用范围。

微流控分离法，微流体技术是一种用于在微尺度水平上精确控制和操纵流体的方式，能够在微/纳米尺度空间中操纵流体，将反应、分离和检测扩展到几平方厘米大小的芯片上，其最大优势是在一个整体可控的微型平台上实现多单元技术的灵活组合和大规模集成。微流控技术利用立体致密体的物理和生化特性进行微尺度分离、检测和分析，除了利用成熟的分离方法/分离影响因素外，该技术还使用新的分选机制，例如声学、电泳和电磁操作。该技术速度快，仅需少量样品和少量试剂，但是微流体装置往往结构复杂且微小，难以大规模生产外泌体，目前主要用于实验室研究阶段。

质谱法，利用测试样品中的成分被电离以产生具有不同荷质比的离子，所述离子束在加速电场的作用下形成并进入质量返回分析仪，通过电场后，较慢的离子会偏转更多，而较快的离子会偏转较少；在磁场中，较慢的离子将偏转更多，而较快的离子将偏转较少，根据不同离子在电磁场中的运动特性不同，分别聚焦得到质谱图而进行分离。质谱数据质量高，可实现外泌体快速分离，但尽管质谱保留了蛋白质谱，但尚未建立质谱标准，该方法仍处于研究阶段。

除外泌体提取方法有待改进之外，干细胞的衰老问题也是困扰研究人员的难题之一，干细胞衰老是干细胞逐渐丧失自我更新或分化能力、衰老或凋亡并最终功能衰竭的过程，干细胞衰老的主要促进因素包括毒素代谢物的积累(如活性氧自由基ROS)、DNA损伤、蛋白质氧化、线粒体功能障碍等等，随着干细胞衰老过程的加速，相应分泌外泌体的质量和数量也受到不利影响。因此需要开发一种可抑制干细胞衰老的有效手段，进而有助于提取高质量的干细胞外泌体。

为了克服上述困难，本发明中提供了一种干细胞外泌体提取试剂盒，包括，干细胞抗老化剂、纳米磁珠、洗脱液和磁珠清洗液；所述纳米磁珠表面结合多特异性抗原结合物，可结合CD9、CD81抗原。采用该试剂盒可维持干细胞干性，改善外泌体分泌的数量和质量，并能够提取获得的干细胞外泌体具有更强的促细胞增殖能力，可促进血管形成和分化，抑制疤痕因子表达，促进皮肤损伤后修复。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明中提供了一种有核细胞处理试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括干细胞抗老化剂、纳米磁珠、洗脱液和磁珠清洗液；干细胞抗老化剂包括终浓度为10-100mg/L的维生素C、50-200nM雷帕霉素和100-150μM3’-唾液酸乳糖；所述纳米磁珠，用于从样品中捕获目标外泌体，所述纳米磁珠表面结合有多特异性抗原结合物；所述多特异性抗原结合物包括依次连接的抗CD9、CD81和CD9抗原结合片段；其中抗CD9抗原结合片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，抗CD81抗原结合片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述洗脱液，用于将所述特异性结合体分离，形成纯化的外泌体；所述磁珠清洗液，用于对外泌体进行洗涤。

随着干细胞的传代培养，细胞干性会逐渐消失，不再具有多向分化能力，称为干细胞的“老化”，相应的外泌体分泌能力、外泌体的质量和生物活性也受到较大影响。氧化应激是诱导干细胞衰老的重要途径，因此抗氧化试剂可有效延后或阻止干细胞衰老过程，常规的抗氧化途径包括：内源性抗氧化酶，如SOD、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶等；信号通路抑制剂，与氧化应激相关的分子信号通路包括Bcl-2、Bax、p53等途径；小分子抑制剂，如麦角硫因、维生素C、微量元素等(参见Feng Chen et al，Oxidative Stress in Stem CellAging，Cell Transplant，2017，26(9):1483-1495)。本发明中选用维生素C作为抗氧化试剂，该物质不仅价格低廉易于取得，而且相对于内源性抗氧化酶类易于保存，便于使用。

磷脂酰肌醇3-激酶/Akt途径也是诱导干细胞衰老的重要信号通路，有研究表明使用Akt/mTOR通路抑制剂，可以提供稳定生长环境，在长期培养扩增期间MSC维持在未成熟的未分化状态(参见Borzo Gharibi et al，Inhibition of Akt/mTOR attenuates age-related changes in mesenchymal stem cells，Stem Cells.2014，32(8):2256-2266)。本发明中使用雷帕霉素作为mTOR抑制剂，用于延缓干细胞衰老。

此外，还有研究表明，唾液酸寡糖也具有增强干细胞干性，增加干细胞因子表达、增强干细胞增殖能力，抑制干细胞的老化的功能(参见CN114555784A)。因此，本发明中选用3’-唾液酸乳糖作为促进剂，用于强化抗老化功能。在前期实验中，优化了维生素C、雷帕霉素和3’-唾液酸乳糖的适用比例，以便达到最优抗干细胞老化效果。

纳米磁珠是球形磁性颗粒，其包被有与目标物质特异性结合的单克隆抗体，在外加磁场的吸引下，可以诱导这些复合物的定向运动，从而将外泌体从样品中分离出来。这种方法具有目标特异性，并可确保提取的外泌体的完整性，还相对容易实施且不需要昂贵的仪器。本发明中抗原结合片段采用单域抗体结构，所谓单域抗体(Single DomainAntibody，SdAb)，又称为纳米抗体(Nanobody)或者VHH(Variable Domain of HeavyChain)抗体，是羊驼、骆驼等驼科动物外周血液中存在一种天然缺失轻链的抗体，该抗体只包含一个重链可变区(VHH)和两个常规的CH2与CH3区，但却不像人工改造的单链抗体片段(scFv)那样容易相互沾粘，甚至聚集成块，VHH结构具有与原重链抗体相当的结构稳定性以及与抗原的结合活性，是已知的可结合目标抗原的最小单位。这种抗体结构稳定，易于设计，并能标记特定的残基，大规模生产成本低，克隆稳定，还可以直接攻击可溶性抗原和细胞(参见Crepin R，Gentien D，Duche A，et al.Nanobodies against surface biomarkersenable the analysis of tumor genetic heterogeneity in uveal melanoma patient-derived xenografts.Pigment Cell Melanoma Res.2017；30:317–327)，因此选用该类抗体构建捕获磁珠，不仅制备方便，而能够有效结合目标抗原，实现高效分离。

进一步的，所述干细胞抗老化剂包括终浓度为50mg/L的维生素C、200nM雷帕霉素和100μM3’-唾液酸乳糖。

进一步的，所述多特异性抗原结合物的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

进一步的，纳米磁珠的制备方法包括：使用PBS溶液洗涤羧基磁珠，然后加入1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺溶液，室温下孵育30分钟；向磁珠溶液中加入所述多特异性抗原结合物，缓慢搅拌使其混合均匀，室温下反应3-4h；使用PBS溶液清洗3次，磁吸分离后重悬于PBS溶液中，获得所述纳米磁珠。

所述纳米磁珠包被有多特异性抗原结合物，能够提高外泌体筛选的特异性，且可通过外加磁场的往复运动，实现外泌体的快速分离，降低对大型设备的依赖程度，提高外泌体分离的质量和效率。

进一步的，所述洗脱液为含2％胰蛋白酶、20mMEDTA-Na2和10mMTris-HCl的水溶液。

进一步的，所述磁珠清洗液为pH7.4的PBS缓冲溶液。

提供了一种使用所述干细胞外泌体提取试剂盒提取外泌体的方法，包括如下步骤：原代培养间充质干细胞，细胞培养基中加入所述干细胞抗老化剂；使用差速离心法进行初步分离，收集所述间充质干细胞上清液，4℃300g离心10min；3000g离心15min；12000g离心45min；所得上清液，经0.22μm过滤膜过滤后进行浓缩得到粗分外泌体；免疫磁珠分离，将所述粗分外泌体与纳米磁珠按1:3比例混合，在室温下共孵育2-3h，使用磁场进行分离；分离后采用清洗液洗涤3-5次，再使用洗脱液进行洗脱得到外泌体。

该方法将差速离心法与免疫磁珠法相结合，避免了适用十万转以上的离心操作，降低了对离心设备的要求，从而使得生产成本降低，且易于操作，使得在普通生物实验室即可进行；同时利用抗原抗体的特异性反应，筛选并获得具有特定功能的干细胞外泌体，改善了后续外泌体的生物活性。

进一步的，所述间充质干细胞来自于脐带、骨髓或脂肪组织。

提供了一种所述干细胞外泌体提取试剂盒在提取干细胞外泌体中的应用。

进一步的，所述干细胞为脐带间充质干细胞。

有益效果

本发明提供了一种有核细胞处理试剂盒及其应用，具有以下优势：

(1)提供了干细胞抗老化剂，包括抗氧化剂、mTOR抑制剂和糖类物质，能够抑制细胞老化，保持细胞干性，促进外泌体分泌，提高外泌体质量；

(2)提供了一种靶向抗CD9、CD81的多特异性抗原结合物，所述多特异性抗原结合物中靶向CD9和CD81的抗原结合片段具有2:1的比例，能够识别和获取表面具有特定抗原的干细胞外泌体，所述外泌体具有更强的促细胞增殖能力和损伤修复能力；

(3)提供了一种干细胞外泌体分离方法，将差速离心法与免疫磁珠法相结合，避免了对昂贵大型设备的依赖，提供筛选干细胞外泌体的质量和效率；

(4)采用所述试剂盒和方法获得的干细胞外泌体，可调节细胞因子分泌水平，促进血管新生，抑制疤痕形成。

附图说明

图1：多特异性抗原结合物结构示意图；

图2：外泌体促HaCaT细胞增殖能力；

图3：外泌体促HUVEC细胞增殖能力；

图4：大鼠皮肤组织HE染色图；

图5：VEGF表达水平；

图6：TGF-β表达水平。

具体实施方式

以下非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何形式限制本发明。凡基于本发明上述内容所实现的技术均应当属于本申请要求保护的范围之中。

以下实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂生物材料、检测试剂盒，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1外泌体捕获抗体设计

抗CD9、CD63和CD81抗体常用于外泌体的捕获和筛选，但经过发明人早期研究表明，使用CD9和CD81抗原结合片段组合效果较好；并且，在本发明中发明人创造性的提出了将抗CD9和CD81抗原结合片段按照2:1的比例设置效果更好，可获得生物活性更强的干细胞外泌体。

本发明中使用单域抗体的重链可变区作为目标抗原的特异性捕获片段，具体的抗CD9、CD81抗原结合片段为发明人早期通过噬菌体文库筛选而得，其氨基酸序列分别如SEQID NO:1-2所示，表1中列出了相关抗原结合片段的氨基酸序列，所述抗体能够以较高亲和力与目标抗原片段结合。

表1 抗原结合片段

备注：下划线所述氨基酸为CDR区。

为降低后续制备和应用难度，本发明中的三特异性抗原结合物采用简化结构，利用柔性连接子连接不同抗原结合片段，其示意图如图1所示，多特异性抗原结合物的氨基酸序列如SEQ ID NO:3。本发明中以抗CD9和CD81抗原结合片段1:1比例的双特异性抗原结合物为对照，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4。实施例2间充质干细胞外泌体制备

2.1人脐带间充质干细胞原代培养

取健康胎儿脐带，置于含2％青霉素+2％链霉素的PBS溶液中保存。在超净台内，使用无菌PBS清洗脐带组织，除去组织表面的血凝块和其他杂质；用无菌手术剪剪开脐带，去除脐静脉、脐动脉及脐带外膜，分离出华通氏胶组织，使用无菌PBS清洗5次，将华通氏胶组织剪成2～3mm组织块均匀铺于60mm培养皿中，加入含10％胎牛血清和1％青霉素+1％链霉素的DMEM培养基，所述培养基中还包括干细胞抗老化剂，所述干细胞抗老化剂为终浓度50mg/L的维生素C、200nM雷帕霉素和100μM3’-唾液酸乳糖，作为对照组使用不含上述干细胞抗老化剂的培养基。于37℃、5％CO₂、饱和湿度培养箱中培养；每日观察细胞生长状况，并根据情况更换新鲜培养基；待细胞融合度达80％以上时，用0.25％胰蛋白酶进行消化传代，共传代3-5代，获得人脐带间充质干细胞(rhUC-MSCs)。

2.2差速离心提取外泌体

收集rhUC-MSCs细胞培养上清液，4℃300g离心10min；3000g离心15min；12000g离心45min；所得上清液，经0.22μm过滤膜过滤，置于洁净离心管中，4℃3000g离心20min，浓缩细胞上清液，使用无菌PBS重悬，置于4℃冰箱中备用。

将所述外泌体稀释后，使用纳米流式仪检测各组外泌体的颗粒浓度；使用电子显微镜检测外泌体的粒径分布；使用RIPA裂解缓冲液(购自Sigma公司)在冰上裂解外泌体，4℃12000g离心10min，取上清，使用BCA试剂盒测蛋白浓度(购自Sigma公司)。结果如表2所示，使用本发明所述抗老化剂培养后，使得外泌体的粒径分布更加集中，颗粒浓度和总蛋白浓度均有所提高，说明能够整体改善外泌体质量和数量。

表2外泌体表征

2.3免疫磁珠法分选外泌体

取100μg羧基磁珠(购自无锡百迈格生物科技有限公司)，使用pH7.4的无菌PBS溶液洗涤3-5次，然后加入500μL 0.26M1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)溶液，室温下孵育30分钟，激活磁珠表面的羧基；向磁珠溶液中加入200-500μg本发明中提供的抗CD9-CD81-CD9多特异性抗原结合物或CD9-CD81双特异性抗原结合物，缓慢搅拌使其混合均匀，室温下反应3-4h，通过氨基-羧基反应对磁珠进行抗体修饰。反应完成后，使用无菌PBS溶液清洗3次，去除未结合的抗原结合物，磁吸分离后重悬于PBS溶液中备用。

将步骤2.2中所获得的外泌体，与上述磁珠按1:3比例混合，在室温下共孵育2-3h，使用磁场进行分离；分离后以pH7.4的PBS溶液为清洗液洗涤3-5次，以含2％胰蛋白酶、20mMEDTA-Na2和10mM Tris-HCl的水溶液为洗脱液，洗脱得到纯化的外泌体，分别记为CD9-CD81-CD9-EXO和CD9-CD81-EXO。

实施例3间充质干细胞外泌体促进细胞增殖

外泌体对于多种细胞具有促增殖作用，已有研究证实，间充质干细胞外泌体可通过调控炎症反应、促进细胞增殖迁移、促进血管生成和调控基质重建促进创面愈合并抑制瘢痕形成(参见丛海燕，王娜等，间充质干细胞来源外泌体促进皮肤损伤创面修复的作用及机制研究进展，山东第一医科大学(山东省医学科学院)学报，2022，43(08)：620-625)。本实施例中选用人的永生化角质细胞(human immortalized keratinocyte,HaCaT)和永生化血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)两种细胞系作为研究对象，考察干细胞外泌体的促增殖作用。

将上述细胞接种于培养瓶，以含10％胎牛血清、1％青霉素+1％链霉素的DMEM培养基为培养液，在37℃、5％CO₂、饱和湿度培养箱中培养，每日观察细胞生长状况，当细胞融合度达到80％以上时进行细胞传代，共传3-5代。

取处于对数生长期的上述细胞，以1×10⁴个/孔接种至96孔板，培养过夜。设置EXO-1组(每孔加入100μg CD9-CD81-EXO)、EXO-2组(每孔加入100μg CD9-CD81-CD9-EXO)和对照组(加入等体积的细胞培养基)，使用相应药物处理24h。每孔加入10μLMTT，37℃孵育4h；弃去培养基，加入150μL DMSO振荡10min，采用酶标仪测定490nm处的吸光度(A)值，按照公式：细胞存活率＝A给药/A对照，计算细胞存活率。

如图2、3所示，间充质干细胞外泌体可促进HaCaT细胞和HUVEC细胞增殖，但是对于HaCaT细胞二者的作用类似，未见显著差异；对于HUVEC细胞，CD9-CD81-CD9-EXO展现出了更强的促增殖活性，说明该外泌体可能具有较强的促血管再生能力。

实施例4间充质干细胞外泌体促进皮肤创伤愈合

制备皮肤创伤动物模型：选取6-8周龄SD大鼠，正常饲喂1周适应环境，然后麻醉情况下从背部切下一块直径2cm的皮肤，将实验动物随机分为三组，然后使用无菌注射器沿创口周边多点注射药物，分别为EXO-1组(注射100100μg/kg CD9-CD81-EXO)、EXO-2组(每孔加入100μg/kg CD9-CD81-CD9-EXO)和对照组(加入等体积的生理盐水)。

治疗1周后，脱劲处死实验动物，取创口处皮肤进行HE染色，如图4所示，对照组中发现巨噬细胞、中性粒细胞、单核细胞、脱落溶解细胞核等大量的炎症和凋亡组织，未见明显新生血管；EXO治疗组中新生血管增多，纤维细胞和上皮细胞增多，这种改善在EXO-2组中更加明显，不仅血管组织增多，毛囊、汗腺等正常皮肤组织也开始恢复，皮肤创伤得到整体改善。

取创面及周边2mm的正常组织。按照1:9的比例加入冰预冷无菌PBS，电动研磨器于室温匀浆后制备成匀浆液。4℃，10000rpm离心10分钟，取上清液用ELISA的方法检测创面组织中VEGF、TGF-β的浓度。如图5所示，使用干细胞外泌体可显著促进VEGF表达，该因子可促进血管通透性增加、细胞外基质变性、血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成，有利于皮肤损伤后修复，CD9-CD81-CD9-EXO的促VEGF分泌能力更强，显著高于其他两组。如图6所示，皮肤损伤后，创面处TGF-β表达水平显著提高，该因子可促进疤痕形成，介导炎症反应，而施加干细胞外泌体可显著抑制TGF-β分泌，促进伤口愈合，防止疤痕形成。

Claims (10)

1.一种多特异性抗原结合物，其特征在于：所述多特异性抗原结合物包括依次连接的抗CD9、CD81和CD9抗原结合片段；其中抗CD9抗原结合片段的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示，抗CD81抗原结合片段的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。

2.根据权利要求1所述的一种多特异性抗原结合物，其特征在于：所述多特异性抗原结合物的氨基酸序列如SEQ ID NO: 3所示。

3.一种干细胞外泌体提取试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括干细胞抗老化剂、纳米磁珠、洗脱液和磁珠清洗液；干细胞抗老化剂包括终浓度为10-100mg/L的维生素C、50-200nM雷帕霉素和100-150μM 3’-唾液酸乳糖；所述纳米磁珠，用于从样品中捕获目标外泌体，所述纳米磁珠表面结合有权利要求1-2任一项所述的多特异性抗原结合物；所述洗脱液，用于将多特异性抗原结合物和外泌体所形成的结合体分离，形成纯化的外泌体；所述磁珠清洗液，用于对外泌体进行洗涤。

4.根据权利要求3所述的干细胞外泌体提取试剂盒，其特征在于：所述干细胞抗老化剂包括终浓度为50mg/L的维生素C、200nM雷帕霉素和100μM 3’-唾液酸乳糖。

5.根据权利要求3-4任一项所述的干细胞外泌体提取试剂盒，其特征在于：纳米磁珠的制备方法包括：使用PBS溶液洗涤羧基磁珠，然后加入1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺溶液，室温下孵育30分钟；向磁珠溶液中加入所述多特异性抗原结合物，缓慢搅拌使其混合均匀，室温下反应3-4h；使用PBS溶液清洗3次，磁吸分离后重悬于PBS溶液中，获得所述纳米磁珠。

6.根据权利要求3-4任一项所述的干细胞外泌体提取试剂盒，其特征在于：所述洗脱液为含2%胰蛋白酶、20mM EDTA-Na2和10mM Tris-HCl的水溶液。

7.根据权利要求3-4任一项所述的干细胞外泌体提取试剂盒，其特征在于：所述磁珠清洗液为pH7.4的PBS缓冲溶液。

8.一种使用权利要求3-7任一项所述干细胞外泌体提取试剂盒提取外泌体的方法，包括如下步骤：原代培养间充质干细胞，细胞培养基中加入所述干细胞抗老化剂；收集所述间充质干细胞上清液，4℃ 300g离心10min；3000g离心15 min； 12000g 离心45min；所得上清液，经0.22μm 过滤膜过滤后进行浓缩得到粗分外泌体；免疫磁珠分离，将所述粗分外泌体与纳米磁珠按1:3比例混合，在室温下共孵育2-3h，使用磁场进行分离；分离后采用清洗液洗涤3-5次，再使用洗脱液进行洗脱得到外泌体。

9.根据权利要求8所述的提取外泌体的方法，其特征在于：所述间充质干细胞来自于脐带、骨髓或脂肪组织。

10.一种如权利要求3-7任一项所述干细胞外泌体提取试剂盒在提取干细胞外泌体中的应用；所述干细胞为脐带间充质干细胞。

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