CN113416693A - 一种间充质干细胞外泌体的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于细胞生物学技术领域，提供了一种间充质干细胞外泌体的制备方法：获得培养间充质干细胞的培养基，然后经过孔径为30kDa的切向流过滤系统进行浓缩，获得浓缩液；将浓缩液以差速离心进行纯化获得间充质干细胞外泌体。本发明还提供了一种上述方法获得的外泌体及其制剂。所述制剂可以为冻干粉或含有药学上可接受成分的液体制剂。该外泌体或制剂可应用于多种疾病的治疗，如组织损伤、神经变性疾病、组织纤维化、糖尿病等。本发明将中空纤维切向流过滤法和差速离心法相结合，在保证外泌体产量的同时，提高了外泌体的纯度。

Description

一种间充质干细胞外泌体的制备方法
技术领域
本发明属于细胞生物学领域，涉及一种间充质干细胞外泌体的浓缩和纯化方法。
背景技术
细胞外囊泡(extracellular vesicles，TVs)是由细胞分泌的具有磷脂双分子层结构的囊泡，能够通过其携带的生物大分子调节受体细胞的生物学特性，参与细胞的生理学和病理生理学过程。细胞外囊泡根据其发生途径不同可以分为外泌体、核外颗粒体、凋亡小体和癌小体。外泌体(exosome,EXO)是一类直径30-150nm的微小囊泡，可存在于细胞培养上清液、血浆、血清、唾液、尿液、羊水和恶性腹水以及其它生物体液中。1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现，1987年Johnstone将其命名为“exosome”。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体，其主要通过细胞内吞作用形成，质膜内陷，将一些细胞外成分和细胞膜蛋白包裹在一起，形成早期内涵体(ESEs)。ESEs可以与其他细胞器发生物质交换，或者不同ESEs之间融合形成晚期内涵体(LSEs)，进一步形成细胞内多膜体(MVBs)，其中会包含许多腔内囊泡(intraluminal vesicles，ILVs)。MVBs可能会通过与自噬体或溶酶体融合而被降解，也可能通过与质膜融合，释放其中的物质，包括ILVs，这些ILVs就是最终形成的外泌体。
外泌体的结构在电镜下有典型的“盘样”结构，呈扁平的球体形，具有脂质双层膜结构。含有丰富的mRNA,microRNA及蛋白质等成分，包括四跨膜蛋白家族成员(CD9，CD63，CD81，CD82)，主要组织相容性复合体(MHC)等。外泌体通过与靶细胞融合，将其中的内含物mRNA，micro RNA和蛋白质等成分注入到靶细胞中，从而交换遗传信息、重编程宿主细胞，进行细胞间通讯，调控靶细胞的增殖、迁移、凋亡。在作为新型的疾病诊断标志物、纳米药物载体、以及治疗试剂和药物作用靶标等方面具有巨大潜力，在化妆品、疾病的诊断以及治疗领域具有广阔的应用前景。
间充质干细胞是成体干细胞的一种，来源于多种组织，如：骨髓、脐带血/脐带、胎盘、脂肪组织和经血。具有多方向分化、组织修复及免疫调节等作用，在组织损伤修复、纤维化、免疫性疾病等领域中备受青睐。尽管MSCs被证明对多种难治疗的疾病有效，但是干细胞治疗普遍存在的伦理、安全和致瘤等问题在MSCs中也无法避免。有研究指出MSCs外泌体可以有效治疗多种疾病，如：组织损伤、神经变性疾病、组织纤维化、糖尿病。后续的研究也证明了之前被认为是MSCs参与了治疗的疾病，其实是由MSCs分泌的外泌体来实现的，如心肌梗塞、肝纤维化。还有研究证明MSCs来源的外泌体在心肌修复方面能发挥和MSCs一样，甚至有时候更佳的效果。较之MSCs本身，其分泌的外泌体性质更稳定、保存运输更方便，亦没有移植细胞带来的免疫排斥反应和肿瘤形成的风险，因而有望成为一种新的治疗策略。
如何分离得到大量且高纯度的外泌体是学术界及产业界亟待解决的问题。目前外泌体常见提取方法是差速离心法、密度梯度离心、体积排阻层析、超滤法、基于聚合物的沉淀法、免疫分离法等。差速离心法是最常用的外泌体纯化手段，采用低速离心、高速离心交替进行，可分离到大小相近的囊泡颗粒。但是这种方法制备的外泌体的产量低，不能满足外泌体应用的需要。超滤法利用不同截留相对分子质量(MWCO)的超滤膜对样品进行选择性分离，便可获得外泌体。该方法由于过滤膜的粘附，可能会导致外泌体的损失，并且过滤时的压力和剪切力，可能会使外泌体变形受损。
发明内容
针对现有技术中外泌体制备体量小、产量低、制备过程中外泌体易受损，本发明提供一种间充质干细胞外泌体的制备方法，将切向流过滤和差速离心的方法相结合，提高了外泌体的生产规模和收率；通过对过滤孔径大小的控制，获得纯度更高的外泌体。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种间充质干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：
(1)获得培养间充质干细胞的培养基，然后经过孔径为30kDa的切向流过滤系统进行浓缩，获得浓缩液；
(2)将浓缩液以差速离心进行纯化获得间充质干细胞外泌体。
所述间充质干细胞来源不限，包括但不限于脐血、脐带、胚胎、骨髓、脂肪。优选的，所述间充质干细胞为脐带来源的间充质干细胞。
所述培养基为无血清培养基；优选的，培养基为添加5％UltraGROTM细胞营养添加剂的
Figure BDA0003165952670000021
MSC-BM基础培养基。
优选的，所述上清液为培养第3代和/或第4代间充质干细胞获得。
优选的，所述浓缩倍数为20倍-100倍。
所述切向流过滤系统的参数设置为：流量Feed为400-600mL/min，Pf为12-14Psi。
所述差速离心的方法如下：
(i)将浓缩液1800g-2000g离心15-20min弃去沉淀，获得上清液I；
(ii)将上清液I以9000g-10000g离心20-30min弃去沉淀，获得上清液II；
(iii)将上清液II以110000g-120000g离心60-90min弃去上清液，获得沉淀I；
(iv)沉淀I以等渗溶液洗涤后110000g-120000g离心60-90min弃去上清液，获得沉淀即为外泌体。
优选的，步骤(iv)中洗涤和离心步骤重复1-3次。
本发明还提供了一种上述方法获得的外泌体及其制剂。所述制剂可以为冻干粉或含有药学上可接受成分的液体制剂。
上述外泌体或制剂可应用于多种疾病的治疗。所述疾病包括但不限于组织损伤、神经变性疾病、组织纤维化、糖尿病。
本发明具有以下优点：
本发明明确了外泌体的原液脐带间充质干细胞培养上清液的来源为细胞融合度达到80％时，第三代和第四代脐带间充质干细胞的培养上清液，最大限度的保证了外泌体来源的一致性，从而在源头上保证了外泌体的产品稳定性。
本发明将中空纤维切向流过滤法和差速离心法相结合，先用中空纤维切向流过滤法将脐带间充质干细胞培养上清液浓缩20倍-100倍，再用差速离心法将浓缩的脐带间充质干细胞培养上清液纯化为外泌体，在保证外泌体产量的同时，提高了外泌体的纯度。
本发明通过检测外泌体蛋白浓度、表面标志物、粒径、纯度、形态多个方面对外泌体进行鉴定，从而保证了外泌体的质量。
本发明的制备方法，通过将切向流过滤和差速离心的方法相结合，提高了外泌体的生产规模和收率；通过对过滤孔径大小的控制，获得纯度更高的外泌体。解决了外泌体制备过程中的数量和纯度的要求，为外泌体在临床上的应用提供更加有力的保障。
附图说明
图1是不同显微倍数的脐带间充质干细胞形态图；
图2是流式细胞仪检测脐带间充质干细胞表面标志物；
图3是透射电镜检测外泌体悬液1中外泌体形态；
图4是流式细胞仪检测外泌体悬液1中外泌体表面标志物；
图5是BCA蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白浓度的标准曲线；
图6是不同方法制备的外泌体悬液的粒径分布；
图7是不同方法制备的外泌体悬液的纯度；
图8是不同方法制备的外泌体悬液的CD9阳性颗粒数。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1脐带间充质干细胞(UC-MSC)外泌体的制备
1.脐带间充质干细胞(UC-MSC)的分离纯化
Figure BDA0003165952670000041
MSC-BM基础培养基中添加5％UltraGROTM细胞营养添加剂，获得完全培养液用于UC-MSC的分离培养。
(i)无菌条件下取健康来源的新生儿脐带约15-30cm，24h内剔除动脉、静脉、羊膜后获得华通氏胶，用生理盐水将其充分洗涤去红后剪碎至1-5mm3大小，再加入间充质干细胞完全培养基培养至第7天，然后全换液，待大部分组织中爬出细胞，P0细胞融合度达到80％时以1:1传代；
(ii)传代后细胞每3日全量换液，第3天按1传3传代一次，同样方法传至第三代时在倒置显微镜下拍照。如图1所示，倒置显微镜下观察UC-MSC细胞为贴壁生长，为形态相对均一的梭形细胞，呈平行排列生长或旋涡状生长，符合UC-MSC的细胞特征，并用流式细胞仪检测脐带间充质干细胞表面标志物。如图2所示，UC-MSC表达CD90，CD105，CD73，不表达CD34，CD45，符合UC-MSC的细胞特征。
2.外泌体的制备
(1)将实施例1中的第三代间充质干细胞以完全培养基培养3天，获得培养细胞后的培养基；同样方法获得第四代间充质干细胞的培养细胞后的培养基并合并；
(2)将步骤(1)中培养细胞后的培养基2L，经过孔径为30kDa中空纤维柱的切向流过滤系统的过滤，流量维持在500mL/min，Pf维持在12-14Psi，持续浓缩至液量为40mL，获得浓缩液；
(3)将步骤(2)的浓缩液以差速离心法进行外泌体的纯化：
(i)将浓缩液转入离心管以2000g离心20min弃去悬浮细胞等杂质沉淀，获得上清液I；
(ii)将上清液I以10000g离心30min弃去细胞碎片等杂质沉淀，获得上清液II；
(iii)将上清液II以120000g离心70min，弃去上清液，获得沉淀I；
(iv)沉淀I以pH7.2的PBS溶液洗涤后再次120000g离心70min，弃去上清液，获得沉淀即为外泌体；
(4)外泌体以2mL pH7.2的PBS溶液重悬后，获得外泌体悬液1，备用。
另取等量培养同一细胞后的培养基，同样的方法获得外泌体悬液2，不同在于切向流过滤采用孔径为50kDa中空纤维。
再取等量培养同一细胞后的培养基，同样的方法获得外泌体悬液3，不同在于步骤(2)中以30kDa超滤系统代替切向流过滤。
3.外泌体的验证
将上述方法获得的外泌体采用铀染色方式，透射式电子显微镜(型号FEI TalosF200C)在57000×条件下采集图像，结果如图3所示：颗粒具有明显的膜结构，部分具有典型的茶托状或红细胞单面凹的形态，符合外泌体的形态特征。
一般流式细胞仪的检测粒径范围在0.2μm-80μm，而外泌体的粒径刚好在200nm之下的检测盲区内，导致普通的流式细胞仪正常情况下无法检测外泌体，因此，外泌体需要结合磁珠包被来进行流式检测。将不同方法获得的外泌体采用SBI的CD9 Exo-flow Capturekit(EXOFLOW 100A-1)进行，将CD63、CD81或CD9捕获抗体分别包被在磁珠上，洗去未结合的抗体，将磁珠-CD63、CD81或CD9复合物与外泌体混合，可以特异性结合表面表达CD63、CD81或CD9抗原的外泌体，然后再分别用FITC anti-human CD63 Antibody、APC anti-humanCD81 Antibody、PE anti-human CD9 Antibody染色，BD FACS Canto II流式上机检测。如图4所示：UC-MSC外泌体能够表达CD63、CD81、CD9表面标志，符合外泌体的特征。
实施例2脐带间充质干细胞(UC-MSC)外泌体的性质测定
1.蛋白质含量
将实施例1中不同方法得到的外泌体悬液分别用BCA蛋白质检测试剂盒进行蛋白质含量检测，每个样本设置3个平行，测定562nm下的光吸收值。计算所得外泌体悬液中的蛋白总量和每毫升UC-MSC培养上清原液获得的外泌体的蛋白量。从图5可以看出，BCA检测的标准曲线R2为0.995，数据可靠。1mL UC-MSC培养上清原液经过30kDa孔径切向流浓缩和差速离心得到的外泌体(TFF-30KD)蛋白量为0.66μg，1mL UC-MSC培养上清原液经过50kDa孔径切向流浓缩和差速离心得到的外泌体(TFF-50KD)蛋白量为0.52μg，1mL UC-MSC培养上清原液经过30kDa超滤和差速离心得到的外泌体(UF-30KD)蛋白量为0.53μg。1mL UC-MSC培养上清原液经过30kDa孔径切向流浓缩和差速离心得到的外泌体蛋白量最高，通过单因素方差分析可知，显著高于50kDa切向流和差速离心、30kDa超滤和差速离心的含量(p<0.05)。
2.外泌体粒径分布、纯度和颗粒数
将实施例1中不同方法得到的外泌体用PE anti-human CD9 Antibody(Biolegend)染色，厦门福流纳米流式检测仪Flow NanoAnalyzer(型号：U30)上机检测。该纳米流式细胞仪的检测范围能够覆盖外泌体完整粒径(30-200nm)。如图6所示，30kDa孔径切向流浓缩和差速离心得到的外泌体(TFF-30KD)、50kDa孔径切向流浓缩和差速离心得到的外泌体(TFF-50KD)和30kDa孔径超滤浓缩和差速离心得到的外泌体(UF-30KD)在非荧光模式下和荧光模式下的颗粒分布无明显区别，颗粒大小分布较为均一，大多数集中在40-100nm之间，符合外泌体的大小特征。
各外泌体纯度如图7所示，经过30kDa切向流浓缩和差速离心纯化后得到的外泌体的纯度为67％，经过50kDa切向流浓缩和差速离心纯化后得到的外泌体的纯度为69％，经过30kDa超滤浓缩和差速离心纯化后得到的外泌体的纯度为66％，三种方式之间无统计学差异。
如图8所示，纳米流式细胞仪检测结果显示，1mL UC-MSC培养上清原液，经过30kDa切向流浓缩和差速离心纯化后得到的外泌体阳性颗粒数为3.79×107个，经过50kDa切向流浓缩和差速离心纯化后得到的外泌体阳性颗粒数为3.07×107个，经过30kDa超滤浓缩和差速离心纯化后得到的外泌体阳性颗粒数为3.01×107个。和经过30kDa切向流浓缩和差速离心纯化后得到的外泌体相比，另外两种方式得到的外泌体颗粒数少，且有统计学差异。
从以上结果看出，相对于50kDa切向流浓缩和差速离心纯化后得到的外泌体和30kDa超滤浓缩和差速离心纯化后得到的外泌体而言，30kDa切向流浓缩和差速离心纯化后得到的外泌体不会影响外泌体的纯度，但是提高了1mL UC-MSC培养上清原液能够得到的外泌体阳性颗粒数。

Claims (10)

1.一种间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）获得培养间充质干细胞的培养基，然后经过孔径为30kDa的切向流过滤系统进行浓缩，获得浓缩液；
（2）将浓缩液以差速离心进行纯化获得间充质干细胞外泌体。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述间充质干细胞来源不限，包括但不限于脐血、脐带、胚胎、骨髓、脂肪。
3. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述培养基为无血清培养基；优选的，培养基为添加5% UltraGROTM细胞营养添加剂的达优®MSC-BM基础培养基。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述上清液为培养第3代和/或第4代间充质干细胞获得。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述浓缩倍数为20倍-100倍；
所述切向流过滤系统的参数设置为：流量Feed为400-600mL/min，Pf为12-14Psi。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述差速离心的方法如下：
（i）将浓缩液1800g-2000g离心15-20min弃去沉淀，获得上清液I；
（ii）将上清液I以9000g-10000g离心20-30min弃去沉淀，获得上清液II；
（iii）将上清液II以110000g-120000g离心60-90min弃去上清液，获得沉淀I；
（iv）沉淀I以等渗溶液洗涤后110000g-120000g离心60-90min弃去上清液，获得沉淀即为外泌体。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤（iv）中洗涤和离心步骤重复1-3次。
8.一种权利要求1所述的制备方法获得的外泌体或包含权利要求1所述的制备方法获得的外泌体的制剂。
9.根据权利要求8所述的制剂，其特征在于，所述制剂可以为冻干粉或含有药学上可接受成分的液体制剂。
10.根据权利要求8所述的外泌体或制剂，其特征在于，外泌体或制剂应用于治疗组织损伤、神经变性疾病、组织纤维化或糖尿病。
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