CN115197908A - 一种自然杀伤细胞来源外泌体的提取、修饰方法及其应用 - Google Patents
一种自然杀伤细胞来源外泌体的提取、修饰方法及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115197908A CN115197908A CN202210740612.9A CN202210740612A CN115197908A CN 115197908 A CN115197908 A CN 115197908A CN 202210740612 A CN202210740612 A CN 202210740612A CN 115197908 A CN115197908 A CN 115197908A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- supernatant
- cells
- exosomes
- exosome
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 title claims abstract description 82
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 61
- 238000000605 extraction Methods 0.000 title claims description 5
- 238000002715 modification method Methods 0.000 title claims description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 41
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 21
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims abstract description 12
- 210000002993 trophoblast Anatomy 0.000 claims abstract description 12
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims abstract description 10
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims abstract description 10
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 claims abstract description 10
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims abstract description 9
- MOFVSTNWEDAEEK-UHFFFAOYSA-M indocyanine green Chemical compound [Na+].[O-]S(=O)(=O)CCCCN1C2=CC=C3C=CC=CC3=C2C(C)(C)C1=CC=CC=CC=CC1=[N+](CCCCS([O-])(=O)=O)C2=CC=C(C=CC=C3)C3=C2C1(C)C MOFVSTNWEDAEEK-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 8
- 229960004657 indocyanine green Drugs 0.000 claims abstract description 8
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 17
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 10
- 102100031650 C-X-C chemokine receptor type 4 Human genes 0.000 claims description 7
- 101000922348 Homo sapiens C-X-C chemokine receptor type 4 Proteins 0.000 claims description 7
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 claims description 7
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 claims description 6
- 239000008188 pellet Substances 0.000 claims description 6
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 claims description 5
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims description 5
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 5
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 4
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000006051 NK cell activation Effects 0.000 claims description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 3
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 2
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 claims 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 230000007547 defect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 abstract 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 4
- 102100025222 CD63 antigen Human genes 0.000 description 2
- 102100027221 CD81 antigen Human genes 0.000 description 2
- 102100037904 CD9 antigen Human genes 0.000 description 2
- 101000934368 Homo sapiens CD63 antigen Proteins 0.000 description 2
- 101000914479 Homo sapiens CD81 antigen Proteins 0.000 description 2
- 101000738354 Homo sapiens CD9 antigen Proteins 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 238000002428 photodynamic therapy Methods 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 102100031151 C-C chemokine receptor type 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710149815 C-C chemokine receptor type 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100028990 C-X-C chemokine receptor type 3 Human genes 0.000 description 1
- 102000009410 Chemokine receptor Human genes 0.000 description 1
- 108050000299 Chemokine receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000002250 Hematologic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 101000916050 Homo sapiens C-X-C chemokine receptor type 3 Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 208000010378 Pulmonary Embolism Diseases 0.000 description 1
- 238000003917 TEM image Methods 0.000 description 1
- 206010053648 Vascular occlusion Diseases 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000006793 arrhythmia Effects 0.000 description 1
- 206010003119 arrhythmia Diseases 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000002308 calcification Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- SURLGNKAQXKNSP-DBLYXWCISA-N chlorin Chemical compound C\1=C/2\N/C(=C\C3=N/C(=C\C=4NC(/C=C\5/C=CC/1=N/5)=CC=4)/C=C3)/CC\2 SURLGNKAQXKNSP-DBLYXWCISA-N 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000003832 immune regulation Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000034217 membrane fusion Effects 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 230000011164 ossification Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003504 photosensitizing agent Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 208000021331 vascular occlusion disease Diseases 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0646—Natural killers cells [NK], NKT cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/16—Aptamers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/2321—Interleukin-21 (IL-21)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
- C12N2501/599—Cell markers; Cell surface determinants with CD designations not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
Abstract
本发明涉及一种自然杀伤细胞来源外泌体的提取、修饰方法及其应用，用含有自体血浆和IL‑2的MedGroTM免疫细胞培养基重悬PBMC，调整细胞密度为1‑2×106mL‑1，并加入相同数量的滋养层细胞，于CO2湿润培养箱中进行NK细胞的诱导培养，从培养后的上清液中提取外泌体。使用靶向CXCR4的RNA配体/吲哚菁绿对提取的NK外泌体进行工程化修饰。与现有技术相比，本发明克服了现有细胞来源外泌体制备技术存在的纯度低，产量低等不足，所提取的外泌体经工程化修饰后，解决了当前细胞来源外泌体靶向效率低、治疗效果差等问题。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种自然杀伤细胞来源外泌体的提取、修饰方法及其应用。
背景技术
外泌体(exosome)是由很多类型细胞分泌的30-150nm的“杯托状”磷脂双分子层囊泡，密度为1.13-1.19g/mL，携带多种蛋白质、脂质和核酸，功能复杂，参与免疫调节、调控细胞外基质重构、激活细胞的信号通路等。
在癌症研究中，以前的研究多数是探索癌细胞释放的外泌体，但很少了解免疫细胞释放的外泌体的功能。自然杀伤(NK)细胞对转移性及血液恶性肿瘤具有天然快速免疫作用，NK细胞的抗肿瘤特性已经在临床实验阶段。然而活细胞治疗会带来固有的风险：如微血管阻塞导致肺栓塞和死亡、移植细胞转化为不良的细胞类型或癌症、免疫排斥反应、心律失常、骨化和/或钙化等。用exosome替换细胞治疗可以避免这些问题，例如由于exosome的小尺寸可以避免血管闭塞和不良细胞类型的产生，目前有研究表明NK细胞外泌体对肿瘤细胞具有细胞毒性，但是对正常细胞无影响，值得进一步研究将其发展为癌症的治疗手段。
若要将NK细胞外泌体开发应用，NK细胞外泌体的高纯度大规模生产是不可回避的一环。虽然目前有报道大规模NK细胞外泌体的提纯方法(如：Jong A Y,et al.[J].Journalof Extracellular Vesicles,2017,6(1):1294368)。目前NK细胞外泌体的纯度、产量、治疗效果等问题并没有得到很好的解决，缺少一种能提取高纯度NK细胞外泌体并提高其靶向能力与治疗能力的稳定方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种自然杀伤细胞来源外泌体的提取、修饰方法及其应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种自然杀伤细胞来源外泌体的提取方法，用含有自体血浆和IL-2的MedGroTM免疫细胞培养基重悬PBMC，调整细胞密度为1-2×106mL-1，并加入相同数量的滋养层细胞，于CO2湿润培养箱中进行NK细胞的诱导培养，从培养后的上清液中提取外泌体。
优选地，所述的提取外泌体的过程包括：收集培养后的上清液，去除细胞沉淀后离心，留取上清液，弃沉淀；继续用超滤管离心，去除小分子杂质的同时浓缩细胞上清液；将浓缩上清液离心，弃上清液，留住沉淀，用磷酸盐缓冲液重悬后透析即可得到所述的外泌体。
进一步优选地，收集培养后的上清液，去除细胞沉淀后在4℃条件下以9000-12000rpm的转速离心15-100min，留取上清液，弃沉淀；继续用100kDa-150kDa超滤管以3000-4000rpm的速度离心5-30min，去除小分子杂质的同时浓缩细胞上清液，减少接下来的超速离心的工作量及成本；将浓缩上清液在4℃条件下以8000g-100,000g的转速离心60-90min，离心结束后，弃上清液，留住沉淀。
更进一步优选地，去除细胞沉淀后在4℃条件下以10000-12000rpm的转速离心90min。
进一步优选地，用磷酸盐缓冲液重悬沉淀后转移至透析袋中，透析6-8h即可得到大量高纯度的外泌体，损失率极低。
优选地，所述的NK细胞经过12天连续培养后，从培养后的上清液中提取外泌体。
优选地，在第0天，将30-35ml志愿者外周血抗凝稀释，用淋巴细胞分离液通过密度梯度离心分离外周血单个核细胞，获得2-3×107个PBMC，用含有5％自体血浆和IL-2(400UmL-1)的MedGroTM免疫细胞培养基重悬PBMC。
优选地，加入相同数量的滋养层细胞后，将细胞培养瓶放置于CO2湿润培养箱中进行NK细胞的诱导培养，滋养层细胞可分泌活化NK细胞所必须的IL-21和4-1BB因子，每隔1天，添加一定体积的新鲜完全培养基(含自体血浆和IL-2)以确保细胞密度在1-2×106mL-1之间，在第7天，再次加入相同数量的滋养层细胞以进行第二轮的NK细胞活化。在培养的第12天取适量细胞并通过流式细胞仪分析细胞表面标志物情况。
优选地，基于靶向CXCR4的RNA配体，对所述的外泌体进行工程化修饰。
进一步优选地，基于靶向CXCR4的RNA配体，将传统pRNA-3WJ结构扩展为箭头形结构，一侧为CXCR4 aptamer，另一侧为吲哚菁绿(ICG)与胆固醇，得到RNA配体结构，使用该RNA配体结构对提取的外泌体进行工程化修饰。其中，CXCR4 aptamer起到增强靶向的作用，吲哚菁绿起到成像示踪与光动力治疗的作用。CXCR4 aptamer可以用类似的趋化因子受体替换，如CXCR3、CCR2等。吲哚菁绿也可用类似的光动力药物替换，如二氢卟吩(Ce6)等光敏剂。经工程化修饰后的外泌体，可用0.22μm无菌过滤器滤菌后进行后续临床研究使用。
一种采用上述提取、修饰方法得到的自然杀伤细胞来源外泌体的应用，将所述的外泌体用于制备癌症的治疗药物。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1.本发明先获得高纯度的自然杀伤细胞，随后从上清液中提取外泌体，通过这种改进的方法获得的自然杀伤细胞外泌体性质均一；
2.本发明经12天连续培养后，获得高纯度的自然杀伤细胞，减少了由于细胞纯度不够导致的外泌体性质不均一的问题，得到高纯度自然杀伤细胞来源外泌体；
3.本发明得到自然杀伤细胞外泌体后，进一步进行工程化修饰，一方面提高了外泌体的靶向效率，一方面可以协同光动力治疗，更好的发挥NK细胞外泌体的治疗效能；
4.本发明通过对提取的高纯度自然杀伤细胞来源外泌体的膜表面进行工程化修饰，解决了当前细胞来源外泌体靶向效率低、治疗效果差等问题；
5.本发明方法克服了现有细胞来源外泌体制备技术存在的纯度低，产量低，表征蛋白表达量低等不足，所提取的外泌体经工程化修饰后，解决了当前细胞来源外泌体靶向效率低、治疗效果差等问题。
附图说明
图1为NK细胞表面标志物的流式检测结果图；
图2为NK细胞外泌体的TEM图；
图3为NK细胞外泌体的WB结果图；
图4为K细胞外泌体的NTA检测结果图；
图5为使用RNA配体工程化修饰NK细胞外泌体示意图；
图6为NK细胞外泌体改造前与改造后，CXCR4表达量流式检测结果(MFI平均图)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
第0天，抽取志愿者外周血35ml，经密度梯度离心后，得到2.5×107个PBMC。用含有5％自体血浆和IL-2(400U mL-1)的MedGroTM免疫细胞培养基重悬PBMC，调整细胞密度为2×106mL-1，并加入相同数量的滋养层细胞，然后将细胞培养瓶放置于CO2湿润培养箱中进行NK细胞的诱导培养。滋养层细胞可分泌活化NK细胞所必须的IL-21和4-1BB因子。每隔1天，添加一定体积的新鲜完全培养基(含自体血浆和IL-2)以确保细胞密度在1-2×106mL-1之间。在第7天，再次加入相同数量的滋养层细胞以进行第二轮的NK细胞活化。在培养的第12天取适量细胞并通过流式细胞仪分析细胞表面标志物情况。
从图1流式结果可以看出，经优化后的培养方法，可以得到纯度高达96.39％的NK细胞(CD3-CD56+细胞群体)。
收取12天的NK细胞培养上清液，采用4℃条件下使用磷酸盐缓冲液对收集的NK细胞培养上清液进行稀释，离心3000rpm，8min，沉淀为细胞，去除沉淀，留取上清。该上清液在4℃条件下以9000rpm的转速15min离心，留取上清液，弃沉淀；经磷酸盐缓冲液稀释后的上清液继续用110kDa超滤管以3500rpm的速度离心5min，去除小分子杂质的同时浓缩细胞上清液。将浓缩得到的上清液以4℃条件下100,000g的转速离心60min，离心结束后，弃上清，留住沉淀。将该沉淀用磷酸盐缓冲液重悬转移至透析袋中，透析8h即可得到目标高纯度大量的外泌体。使用透射电子显微镜(TEM)、蛋白质印迹法(Western Blot)、纳米颗粒跟踪分析(Nanoparticle Tracking Analysis)对获得的外泌体进行表征。
如图2所示，在其视野范围内，NK细胞外泌体清晰完整，这说明通过本发明方法获得NK细胞外泌体纯度高，且外泌体结构完整。
从图3中可以得知，NK细胞外泌体高表达外泌体标志蛋白CD9、CD81、CD63。
从图4中可以看出，NK细胞外泌体平均粒径为113nm±20nm，外泌体数量高达6*107。
如图5所示，基于靶向CXCR4的RNA配体，通过RNA序列合成，将传统pRNA-3WJ结构扩展为箭头形结构，一侧为CXCR4 aptamer，另一侧为吲哚菁绿(ICG)与胆固醇。使用该RNA配体结构对前述提取的自然杀伤细胞外泌体进行工程化修饰。将提取的高质量NK细胞外泌体进一步的进行工程化修饰。操作步骤为：将300ug NK细胞外泌体与1.68nM 3WJ纳米粒子在37℃条件下避光孵育45分钟进行膜融合，随后冰上1小时进行膜修复。
为去除多余的3WJ纳米粒子，先在12000g条件下离心70分钟，弃上清，用PBS重悬沉淀，使用0.025um规格的滤膜进行透析。所得的产物即为工程化修饰后的NK细胞外泌体。
从图6中可以看出，改造后的NK细胞外泌体高表达CXCR4，说明对提取的NK外泌体顺利进行了工程化修饰。
本发明通过优化的自然杀伤细胞培养方法获得大量高纯度的自然杀伤细胞，再通过优化的提取方法获得特征稳定的NK细胞来源外泌体，平均尺寸为30-150nm，粒径分布均匀，且表面携带标志性蛋白CD9、CD81、CD63。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种自然杀伤细胞来源外泌体的提取方法，其特征在于，用含有自体血浆和IL-2的MedGroTM免疫细胞培养基重悬PBMC，调整细胞密度为1-2×106mL-1，并加入相同数量的滋养层细胞，于CO2湿润培养箱中进行NK细胞的诱导培养，从培养后的上清液中提取外泌体。
2.根据权利要求1所述的自然杀伤细胞来源外泌体的提取方法，其特征在于，所述的提取外泌体的过程包括：收集培养后的上清液，去除细胞沉淀后离心，留取上清液，弃沉淀；继续用超滤管离心，去除小分子杂质的同时浓缩细胞上清液；将浓缩细胞上清液离心，弃上清液，留住沉淀，用磷酸盐缓冲液重悬后透析即可得到所述的外泌体。
3.根据权利要求2所述的自然杀伤细胞来源外泌体的提取方法，其特征在于，收集培养后的上清液，去除细胞沉淀后在4℃条件下以9000-12000rpm的转速离心15-100min，留取上清液，弃沉淀；继续用100kDa-150kDa超滤管以3000-4000rpm的速度离心5-30min，去除小分子杂质的同时浓缩细胞上清液；将浓缩细胞上清液在4℃条件下以8000g-100,000g的转速离心60-90min，离心结束后，弃上清液，留住沉淀。
4.根据权利要求2所述的自然杀伤细胞来源外泌体的提取方法，其特征在于，用磷酸盐缓冲液重悬沉淀后转移至透析袋中，透析6-8h，得到所述的外泌体。
5.根据权利要求1所述的自然杀伤细胞来源外泌体的提取方法，其特征在于，所述的NK细胞经过12天连续培养后，从培养后的上清液中提取外泌体。
6.根据权利要求1所述的自然杀伤细胞来源外泌体的提取方法，其特征在于，在第0天，通过密度梯度离心获得2-3×107个PBMC，用含有5％自体血浆和400U mL-1的IL-2的MedGroTM免疫细胞培养基重悬PBMC。
7.根据权利要求1所述的自然杀伤细胞来源外泌体的提取方法，其特征在于，加入相同数量的滋养层细胞后，将细胞培养瓶放置于CO2湿润培养箱中进行NK细胞的诱导培养，滋养层细胞分泌活化NK细胞所必须的IL-21和4-1BB因子，每隔1天，添加一定体积的新鲜完全培养基以确保细胞密度在1-2×106mL-1之间，在第7天，再次加入相同数量的滋养层细胞以进行第二轮的NK细胞活化；所述的完全培养基含自体血浆和IL-2。
8.一种自然杀伤细胞来源外泌体的修饰方法，其特征在于，基于靶向CXCR4的RNA配体，对采用如权利要求1～7任一项所述的提取方法得到的外泌体进行工程化修饰。
9.根据权利要求8所述的自然杀伤细胞来源外泌体的修饰方法，其特征在于，基于靶向CXCR4的RNA配体，将传统pRNA-3WJ结构扩展为箭头形结构，一侧为CXCR4 aptamer，另一侧为吲哚菁绿ICG与胆固醇，得到RNA配体结构，使用该RNA配体结构对提取的外泌体进行工程化修饰。
10.一种采用如权利要求8所述的修饰方法得到的外泌体的应用，其特征在于，将所述的外泌体用于制备癌症的治疗药物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210740612.9A CN115197908A (zh) | 2022-06-27 | 2022-06-27 | 一种自然杀伤细胞来源外泌体的提取、修饰方法及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210740612.9A CN115197908A (zh) | 2022-06-27 | 2022-06-27 | 一种自然杀伤细胞来源外泌体的提取、修饰方法及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115197908A true CN115197908A (zh) | 2022-10-18 |
Family
ID=83578592
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210740612.9A Pending CN115197908A (zh) | 2022-06-27 | 2022-06-27 | 一种自然杀伤细胞来源外泌体的提取、修饰方法及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115197908A (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115521914A (zh) * | 2022-10-12 | 2022-12-27 | 西北工业大学 | 一种人原代自然杀伤细胞体外扩增体系及方法 |
| CN116445404A (zh) * | 2022-12-29 | 2023-07-18 | 贵州医科大学 | 一种nk细胞来源的外泌体的制备及药物装载方法与应用 |
| CN116875547A (zh) * | 2023-09-04 | 2023-10-13 | 山东德升细胞治疗工程技术有限公司 | 一种利用细胞外泌体激活nk细胞的体外扩增培养方法 |
| CN117431210A (zh) * | 2023-12-20 | 2024-01-23 | 东莞再立健生物科技有限公司 | 一种促进nk细胞分泌外泌体的提取方法与应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108602849A (zh) * | 2016-04-06 | 2018-09-28 | 俄亥俄州国家创新基金会 | 用于通过rna纳米技术将治疗剂特异性递送至细胞的rna配体展示外来体 |
| CN109439625A (zh) * | 2018-10-31 | 2019-03-08 | 上海交通大学 | 一种NK细胞exosomes可控规模化的制备方法 |
| CN114540294A (zh) * | 2022-03-14 | 2022-05-27 | 上海交通大学 | 靶向肿瘤部位递送基因药物的干细胞外泌体的制备与应用 |
-
2022
- 2022-06-27 CN CN202210740612.9A patent/CN115197908A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108602849A (zh) * | 2016-04-06 | 2018-09-28 | 俄亥俄州国家创新基金会 | 用于通过rna纳米技术将治疗剂特异性递送至细胞的rna配体展示外来体 |
| CN109439625A (zh) * | 2018-10-31 | 2019-03-08 | 上海交通大学 | 一种NK细胞exosomes可控规模化的制备方法 |
| CN114540294A (zh) * | 2022-03-14 | 2022-05-27 | 上海交通大学 | 靶向肿瘤部位递送基因药物的干细胞外泌体的制备与应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| BIN LIU: "Human natural killer cells for targeting delivery of gold nanostars and bimodal imaging directed photothermal/photodynamic therapy and immunotherapy", CANCER BIOL MED, vol. 16, no. 4, pages 758 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115521914A (zh) * | 2022-10-12 | 2022-12-27 | 西北工业大学 | 一种人原代自然杀伤细胞体外扩增体系及方法 |
| CN115521914B (zh) * | 2022-10-12 | 2024-04-19 | 西北工业大学 | 一种人原代自然杀伤细胞体外扩增体系及方法 |
| CN116445404A (zh) * | 2022-12-29 | 2023-07-18 | 贵州医科大学 | 一种nk细胞来源的外泌体的制备及药物装载方法与应用 |
| CN116875547A (zh) * | 2023-09-04 | 2023-10-13 | 山东德升细胞治疗工程技术有限公司 | 一种利用细胞外泌体激活nk细胞的体外扩增培养方法 |
| CN117431210A (zh) * | 2023-12-20 | 2024-01-23 | 东莞再立健生物科技有限公司 | 一种促进nk细胞分泌外泌体的提取方法与应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN115197908A (zh) | 一种自然杀伤细胞来源外泌体的提取、修饰方法及其应用 | |
| JP7417301B2 (ja) | 細胞培養上清および生体液からの微小胞の単離および精製のための方法 | |
| JP7315243B2 (ja) | エクソソームの製造方法 | |
| CN114591905B (zh) | 一种人红细胞制备凋亡囊泡的方法与应用 | |
| CN113717944A (zh) | 一种miRNA13896过表达的工程化人脐带间质干细胞源外泌体及制备方法和应用 | |
| CN107648667B (zh) | 一种磁控蛋白复合细胞膜片的制备方法 | |
| CN114349845B (zh) | 一种促进t淋巴细胞的肿瘤浸润性的外泌体及其制备方法 | |
| CN109468275B (zh) | 一种树突状细胞诱导剂及其制备方法与应用 | |
| JP7360704B2 (ja) | 細胞外小胞を用いた全身移植片対宿主病を治療する方法 | |
| CN117089518A (zh) | 一种外泌体制备方法及其产品和应用 | |
| WO2023142219A1 (en) | A method for large-scale preparation of high-purity exosomes | |
| CN115814108A (zh) | 一种用于个性化肿瘤治疗的工程化巨噬细胞载药微颗粒制剂及其制备方法 | |
| CN113416693A (zh) | 一种间充质干细胞外泌体的制备方法 | |
| CN104894067B (zh) | 一种高质量外排体及其制备方法 | |
| CN113832103B (zh) | 弓形虫感染dc的外泌体制备及其应用 | |
| CN111494639A (zh) | 仿细胞结构纳米材料及其制备方法和应用 | |
| CN114480280B (zh) | 烟草花叶病毒在刺激巨噬细胞极化为m1型巨噬细胞中应用 | |
| Pi et al. | Method of Large-Scale Exosome Purification and Its Use for Pharmaceutical Applications | |
| KR20230091815A (ko) | αPD-1를 포함하는 수지상 세포 모방 기능성 나노구조체 및 이의 제조방법 | |
| KR20240016375A (ko) | αPD-1를 포함하는 수지상 세포 모방 기능성 나노구조체 및 이의 제조방법 | |
| CN113041358A (zh) | 一种超顺磁修饰中性粒细胞外泌体仿生囊泡药物递送生物制剂及其制备方法 | |
| KR20230091816A (ko) | αCTLA-4를 포함하는 수지상 세포 모방 기능성 나노구조체 및 이의 제조방법 | |
| CN116004724A (zh) | 过表达cd63基因的间充质干细胞及其制备方法、应用 | |
| CN116396923A (zh) | 一种小鼠睾丸组织外泌体的提取方法 | |
| CN115404241A (zh) | 一种基因工程化调节性t细胞来源的细胞外囊泡的制备方法及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |