KR20230091816A - αCTLA-4를 포함하는 수지상 세포 모방 기능성 나노구조체 및 이의 제조방법 - Google Patents

αCTLA-4를 포함하는 수지상 세포 모방 기능성 나노구조체 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 나노입자 코어; 및 수지상 세포로부터 유래된 지질 분자의 세포막을 포함하는 쉘;을 포함하는 나노구조체로서, 상기 쉘은 αCTLA-4 단일클론 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역관문 억제용 수지상세포 모방 나노구조체 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 면역관문의 억제 활성을 통한 세포독성 T 세포의 강력한 활성화로 면역 반응을 증대시켜 우수한 면역항암치료 효과를 제공할 수 있다.

Description

αCTLA-4를 포함하는 수지상 세포 모방 기능성 나노구조체 및 이의 제조방법{Dendritic cell-mimicking functional nanostructures comprising CTLA-4 and a method for manufacturing the same}
본 발명은 αCTLA-4를 포함하는 수지상 세포 모방 기능성 나노구조체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
암은 우리나라 국민 사망원인 중 1위를 차지하고 있다. 대표적인 암치료방법은 암을 절제하는 외과적 수술, 방사선 치료, 화학약물 치료가 있을 수 있는데, 이들 치료방법은 예후가 불량하고 심각한 부작용이 뒤따른다는 문제점이 있다.
암 발생은 면역력 감소 또는 암세포의 면역회피 작용으로 인해 면역반응에 따라 제거되지 못한 암세포의 종양 형성을 주요 원인으로 들 수 있다. 따라서 환자 본인의 면역 반응을 증대시켜 암 치료를 도울 수 있는 면역항암치료제는 근본적인 암 치료법이 될 수 있다. 현재 개발된 면역항암치료제는 면역기능을 높이는 약물을 직접 주입하는 것이 대부분인데, 약물 주입술은 전달 효율이 매우 낮고, 추가 부작용이 존재할 수 있다는 점에서 여전히 한계가 존재한다. 이에 따라 암 치료 효율을 획기적으로 높이고, 재발율 및 부작용을 낮추면서 면역기능을 증대시킬 수 있는 치료제의 개발에 연구가 집중되고 있다.
한편, 나노기술을 바이오 의료 분야에 접목한 나노-바이오 융합기술에 대한 연구가 지속되어 오고 있다. 하지만 대부분의 나노재료는 합성을 통해 얻어지며, 나노재료를 이용한 표면 개질 시, 합성물이 첨가되는 과정이 수반되므로 체내 독성, 원치 않는 면역반응 유도, 암 유발 등의 부작용이 생길 수 있다. 그러므로 생체를 직접 모사하는 방식의 표면 개질 방법을 사용하여 부작용을 최소화하고, 생체특성에 따라 다양한 기능을 구현할 수 있도록 함으로써 기존 나노기술이 가진 한계점을 극복할 수 있다.
특히 나노입자-세포화 기술은 특정 세포의 전체 세포막을 코팅 재료로 활용하여 나노입자 표면을 물리적으로 클로킹(Cloaking)하는 기술로 단백질, 지질 및 탄수화물과 함께 세포막의 복합적 성질을 유지할 수 있어 나노입자 표면에 특정 세포의 특성을 그대로 구현할 수 있다.
2015년 University of California 의 Liangfang Zhang연구팀에서 처음으로 혈소판을 PLGA(poly(lactic-co-glycolic) acid) 입자 표면에 도입한 기술을 바탕으로, 현재까지 다양한 세포에 적용되고 있다.
PLGA 코어에 독소루비신(doxorubicin)을 담지한 후, 적혈구 막으로 코팅하여 면역적합성 나노캐리어를 제조해 고형 종양을 제거하거나, 적혈구 막과 암세포의 세포막을 멜라닌 나노입자에 동시에 코팅하여 하이브리드 세포막을 지닌 나노입자를 제조해 체내 순환시간을 증가시키고 종양 표적능을 증대시킨 연구가 보고되었다.
하지만 종래의 세포막 코팅 기술은 대부분 암세포, 혈액세포 위주로 진행되었고, 그 응용 역시 혈액 내 안정적 전달 등을 목표로 하는 연구들이 주를 이루었다. 또한 암세포막을 항원으로 직접 도입하여 체내에 전달하는 경우, 항원 내성으로 인한 면역반응 저하, 암세포 유래 물질에 대한 거부감 등의 단점이 존재한다. 따라서 직접적인 항원제시 면역세포의 기능을 가질 수 있는 면역치료제를 개발하여 중간 과정 없이 T 세포의 분화 및 증식을 유도하는 것이 매우 필요하다.
Hu, Che-Ming J., et al. Nature, 2015, 526(7571) 118-12 Brian T. Luk et al., Theranostics. 2016, 6(7), 1004-1101 Q. Jiang et al., Biomaterials 2019, 192, 292-308
본 개시는 종래기술의 재료적인 한계에서 벗어나 항원제시 기능을 가지는 세포를 사용하여 면역반응 증대에 따른 암 치료 효과를 보다 효과적으로 구현하고자 한다. 구체적으로, 수지상세포를 모방하는 나노구조체에 CTLA-4와 결합할 수 있는 단일클론 항체 αCTLA-4를 표면에 수식함으로써, 면역관문의 억제를 통해 세포독성 T 세포를 직접 활성화하여 암세포의 선택적 사멸을 유도하고, 면역 반응을 증대시켜 우수한 면역항암치료 효과를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 개시에 따른 면역관문 억제용 수지상세포 모방 나노구조체는 나노입자 코어; 및 수지상 세포로부터 유래된 지질 분자의 세포막을 포함하는 쉘;을 포함하는 나노구조체로서, 상기 쉘은 αCTLA-4 단일클론 항체를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 개시의 일 구현예에 있어서, 상기 αCTLA-4 단일클론 항체는 지질 분자와 컨쥬게이션된 것일 수 있다.
본 개시의 일 구현예에 있어서, 상기 나노구조체는 항원이 펄싱(pursing)된 것일 수 있다.
본 개시의 일 구현예에 있어서, 상기 항원은 종양 항원 유래 펩타이드 또는 단백질일 수 있다.
본 개시의 일 구현예에 있어서, 상기 나노구조체는 20㎚내지 50 ㎛의 평균입경을 가질 수 있고, 구체적으로, 20 ㎚내지 1000 ㎚의 평균입경을 가질 수 있다.
본 개시는 전술한 바와 같은 면역관문 억제용 수지상세포 모방 나노구조체를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
본 개시는 면역관문 억제용 수지상세포 모방 나노구조체의 제조방법을 제공하며, 상기 제조방법은 (S10) 수지상 세포로부터 세포막을 정제하는 단계; (S20) 상기 세포막에 에너지를 가하여 세포막 현탁액을 형성하는 단계; (S30) 상기 세포막 현탁액으로부터 리포좀을 수득하는 단계; (S40) 나노입자 및 상기 리포좀을 혼합한 후, 필터 압축하여 상기 세포막이 도입된 나노입자를 수득하는 단계; 및 (S50) 지질 분자와 컨쥬게이션된 αCTLA-4 단일클론 항체를 상기 세포막이 도입된 나노입자에 도입하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 개시의 일 구현예에 있어서, 상기 (S40) 단계 이후, 상기 세포막이 도입된 나노입자에 항원을 펄싱하는 단계;를 더 포함할 수 있다.
본 개시에 따른 수지상 세포 모방 나노구조체는 항원제시 기능을 나노입자 표면에 도입하여, 수지상세포의 항원제시 기능은 보존함과 동시에 사멸하지 않고 나노입자의 표적화 기능 및 광열효과 기능을 추가적으로 부여하여 강화된 기능의 면역항암치료 효과를 제공할 수 있다.
본 개시에 따른 수지상 세포 모방 나노구조체는 수지상 세포를 모방함으로써 장기간 체내에서 체류하며 항원 특이적 T 세포의 증식 및 분화를 지속적으로 유도함으로써 면역반응을 증대시키는 효과를 제공할 수 있다.
본 개시에 따른 수지상세포 모방 나노구조체는 CTLA-4와 결합할 수 있는 단일클론 항체 αCTLA-4를 표면에 포함함으로써 세포독성 T 세포 표면에 존재하는 CTLA-4와 결합을 유도할 수 있다. 이러한 결합을 통해 항원제시 세포에 존재하는 B7-1/2와 CTLA-4의 결합을 억제함으로써 면역관문의 억제를 유도하고, 세포독성 T 세포를 현저하게 활성화하여 암세포의 선택적 사멸을 유도하고, 면역 반응을 증대시켜 우수한 면역항암치료 효과를 제공할 수 있다.
도 1은 αCTLA-4 단일클론 항체가 도입된 면역관문 억제용 수지상세포 모방 나노구조체 (αCTLA-4-conjugated Nano DC)를 나타낸 모식도이다. 세포독성 T 세포의 CTLA-4 및 나노구조체의 αCTLA-4의 결합에 따라 B7-1/2 및 CTLA-4의 결합이 억제됨으로써 세포독성 T 세포가 활성화될 수 있음을 도시하고 있다.
도 2는 본 개시에 따른 면역관문 억제용 수지상세포 모방 나노구조체의 제조방법을 나타낸 모식도이다.
도 3은 본 개시에 따른 면역관문 억제용 수지상세포 모방 나노구조체에 항원을 펄싱하여 항원을 표면에 제시한 후, αCTLA-4가 컨쥬게이션된 인지질을 세포막에 삽입하여 최종적으로 αCTLA-4 단일클론 항체가 도입된 면역관문 억제용 수지상세포 모방 나노구조체가 제조되는 과정에 대한 모식도이다.
도 4는 본 개시에 따른 αCTLA-4가 컨쥬게이션된 인지질의 제조방법을 도시한 것이다.
도 5는 본 개시에 따른 αCTLA-4가 컨쥬게이션된 인지질이 성공적으로 합성되었음을 증명하는 FT-IR 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 개시에 따른 αCTLA-4가 컨쥬게이션된 인지질이 성공적으로 합성되었음을 증명하는 Raman Spectroscopy 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 개시에 따른 αCTLA-4가 컨쥬게이션된 인지질이 성공적으로 합성되었음을 증명하는 MALDITOF 질량 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 개시에 따른 αCTLA-4 단일클론 항체가 도입된 면역관문 억제용 수지상세포 모방 나노구조체가 T 세포와 결합하여 면역반응을 활성화시키는 원리를 나타내는 모식도이다.
도 9 내지 도 12는 αCTLA-4 단일클론 항체가 도입된 면역관문 억제용 수지상세포 모방 나노구조체의 입경 등의 분석 결과를 도시한 것이다.
도 13 내지 도 16은 본 개시 실험예 1 및 실험예 2에 따른 αCTLA-4 단일클론 항체가 도입된 면역관문 억제용 수지상세포 모방 나노구조체의 T 세포 증식 및 분화 유도 효과에 대한 in vitro 및 in vivo 실험결과를 도시한 것이다.
도 17 내지 도 20은 본 개시 실험예 3에 따른 αCTLA-4 단일클론 항체가 도입된 면역관문 억제용 수지상세포 모방 나노구조체의 대장암 성장 억제 및 마우스 생존률 효과에 대한 in vivo 실험과정 및 결과를 도시한 것이다.
도 21 내지 도 24는 본 개시 실험예 4에 따른 αCTLA-4 단일클론 항체가 도입된 면역관문 억제용 수지상세포 모방 나노구조체의 폐암 성장 억제 및 마우스 생존률 효과에 대한 in vivo 실험과정 및 결과를 도시한 것이다.
이하, 첨부된 도면 및 실시예들을 참조하여 본 발명에 따른 αCTLA-4를 포함하는 수지상 세포 모방 기능성 나노구조체 및 이의 제조방법에 대하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 다만, 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 여기에서 설명하는 구현예에 한정되지 않는다. 또한, 청구범위에 의하여 한정되는 보호범위를 제한하고자 하는 것도 아니다.
본 발명의 설명에 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.
본 명세서에서 사용되는 수치 범위는 하한치와 상한치와 그 범위 내에서의 모든 값, 정의되는 범위의 형태와 폭에서 논리적으로 유도되는 증분, 이중 한정된 모든 값 및 서로 다른 형태로 한정된 수치 범위의 상한 및 하한의 모든 가능한 조합을 포함한다. 본 발명의 명세서에서 특별한 정의가 없는 한 실험 오차 또는 값의 반올림으로 인해 발생할 가능성이 있는 수치범위 외의 값 역시 정의된 수치범위에 포함된다.
본 명세서에서 사용되는 단수 형태는 문맥에서 특별한 지시가 없는 한 복수 형태도 포함하는 것으로 의도할 수 있다.
본 명세서의 용어, "포함한다"는 "구비한다", "함유한다", "가진다" 또는 "특징으로 한다" 등의 표현과 등가의 의미를 가지는 개방형 기재이며, 추가로 열거되어 있지 않은 요소, 재료 또는 공정을 배제하지 않는다.
이하, 본 발명에 대해 구체적으로 설명한다.
본 개시에 따른 면역관문 억제용 수지상세포 모방 나노구조체는 CTLA-4와 결합할 수 있는 단일클론 항체 αCTLA-4를 표면에 포함함으로써 세포독성 T 세포 표면에 존재하는 CTLA-4와 결합을 유도하고, 항원제시 세포에 존재하는 B7-1/2와 CTLA-4의 결합을 억제함에 따라 면역관문의 억제를 유도함으로써, 세포독성 T 세포를 현저하게 활성화시키는 효과를 제공할 수 있다. 이는 나아가 암세포의 선택적 사멸을 유도하고, 면역 반응을 증대시켜 우수한 면역항암치료 효과를 발휘한다.
이를 위해 본 개시에 따른 면역관문 억제용 수지상세포 모방 나노구조체는 나노입자 코어; 및 수지상 세포로부터 유래된 지질 분자의 세포막을 포함하는 쉘;을 포함하고, 이때 상기 쉘은 αCTLA-4 단일클론 항체를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
CTLA-4는 활성화된 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 세포 표면에서 발현되며, T세포 기능의 중요한 음성 조절 인자로 알려져 있다. CTLA-4는 CD28과 유사한 구조를 가지며, 수지상세포 상의 리간드 CD80/CD86와 CD28 보다 고강도와 고친화로도 결합한다. 따라서 CD28과 상기 리간드와의 결합 가능성을 저하시킴으로써, 수지상세포에 의한 T세포 활성화를 감소시킨다.
본 개시에 따른 면역관문 억제용 수지상세포 모방 나노구조체는 CTLA-4에 의한 음성 조절의 억제 작용을 통해 T 세포 활성화를 보다 더 강화시킬 수 있다. αCTLA-4 항체는 당업계에 알려진 공지의 물질을 제한없이 사용할 수 있다.
상기 나노입자 코어는 1차원 또는 2차원 나노구조체일 수 있다. 상기 1차원 또는 2차원 나노구조체의 구체적인 예를 들면, 탄소 나노리본, 탄소 나노튜브, 그래핀, 산화그래핀, 환원된 산화그래핀, 맥신, 금속 나노로드, 금속 나노와이어 또는 금속 나노 판상체(platelet)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한 상기 나노입자 코어는 생체적합성을 가지는 유기 고분자 나노입자, 금속 유기골격체 나노입자, 금속 나노입자, 금속산화물 나노입자, 고체상 지질 나노입자(solid lipid nanoparticle), 자성 나노입자, 광열 변환 나노입자 및 핵산 함유 나노입자, 단백질 함유 나노입자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 또는 둘 이상일 수 있다. 구체적으로 나노물질 자체의 독성이 없으면서 광 감응성을 가지고 있어 광열치료에 적용이 가능한 것이면 더욱 바람직하다.
비한정적인 일 예에 있어서, 나노입자 코어는 금 나노입자일 수 있다.
이때 나노입자 코어는 5 내지 1000 nm, 또는 10 내지 500 nm의 평균 입경을 가질 수 있다. 나노입자 코어 및 쉘을 포함하는 나노구조체는 20 ㎚내지 50 ㎛의 평균 입경을 가질 수 있고, 구체적으로, 20 ㎚내지 10 ㎛, 보다 구체적으로 20 ㎚내지 1000 nm, 더욱 구체적으로 50 ㎚ 내지 500 ㎚의 평균 입경을 가질 수 있다.
본 개시의 일 예에 있어서, αCTLA-4 단일클론 항체는 지질 분자와 컨쥬게이션된 것일 수 있다. 지질 분자는 생체적합성을 가지는 지질 분자라면 제한없이 사용될 수 있으며, 구체적으로 인지질일 수 있고, 보다 구체적으로 포스파티딜에탄올아민계 인지질일 수 있다.
일 예시에 따르면 포스파티딜에탄올아민계 인지질과 αCTLA-4 단일클론 항체는 커플링제를 통해 공유결합될 수 있다. 인지질과 공유결합된 αCTLA-4 단일클론 항체는 인지질 및 세포막에 존재하는 지질 이중층과의 상호작용에 따라 자발적 세포막 삽입 현상을 이용하여 지질 분자의 세포막을 포함하는 쉘에 쉽게 삽입될 수 있으며, 이에 따라 안정적으로 나노구조체의 표면에 도입될 수 있다.
수지상세포는 강력한 항원 제시 세포로서, 세포막 표면에 주조직 적합성 복합체(major histocompatibility complex I/II: MHC I/II)와 CD80 및 CD86과 같은 보조자극인자(co-stimulatory molecules) 및 ICAM-1과 같은 세포부착 분자(cell adhesion molecules)가 고도로 발현되어 있고, T 세포 활성화와 관련된 인터페론, IL-12, IL-18 등의 다양한 사이토카인을 다량 분비함으로써, 강력한 항원제시 기능을 수행할 수 있다. 이에 따라 본 개시에 따른 나노구조체는 바람직하게 항원이 펄싱(pursing)된 것일 수 있다.
상기 항원은 암 치료의 용도를 위해 종양 항원 유래 펩타이드 또는 단백질일 수 있다. 구체적으로 예를 들면, 생쥐 암 모델에 있어서, 오브알부민(ovalbumin, OVA), LCMV(Lymphocytic choriomeningitis mammarenavirus) glycoprotein, retrovirus protein 유래의 단백질 또는 펩타이드일 수 있다. 보다 구체적으로 OVA257-264, GP33-41, p15E 모델의 암 항원 펩타이드 또는 단백질일 수 있다.
또한 인간 암 항원에 있어서, (1) HER2/Neu, tyrosinase, gp100, MART, HPV E6/E7, EBV EBNA-1, carcinoembryonic antigen, a-fetoprotein, GM2, GD2, testis antigen, prostate antigen, 및 CD20를 포함하는 종양 연관 항원 및 (2) 다양한 돌연변이에 의해 생성될 수 있는 신생항원(neoantigen)을 포함하는 종양 특이 항원으로부터 유래된 펩타이드 또는 단백질일 수 있다.
비제한적인 일 예로서, 종양 항원 유래 펩타이드로는 GP33-41일 수 있다.
본 개시에 따른 나노구조체의 쉘은 αCTLA-4 단일클론 항체 외에도 생리활성 고분자, 생리활성 성분 또는 단백질이 표지된 것일 수 있다.
구체적으로 상기 생리활성 성분은 세포 신호전달을 위한 사이토카인을 의미할 수 있다. 비제한적인 예로서, 케모카인, 인터페론, 인터루킨, 림포카인, 종양 괴사 인자, 모노카인 및 콜로니 자극 인자들을 포함할 수 있다. 보다 구체적으로 사이토카인은 BMP (Bone morphogenetic protein) 패밀리, CCL (Cheomkine ligands) 패밀리, CMTM (CKLF-like MARVEL transmembrane domain containing member) 패밀리, CXCL (C-X-C motif ligand ligand) 패밀리, GDF (Growth/differentiation factor) 패밀리, 성장 호르몬, IFN (Interferon) 패밀리, IL (Interleukin) 패밀리, TNF (Tumor necrosis factors) 패밀리, GPI(glycophosphatidylinositol), SLUPR-1(Secreted Ly-6/uPAR-Related Protein 1), SLUPR-2(Secreted Ly-6/uPAR-Related Protein 2) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 사이토카인은 T 세포의 분화에 필수적인 전사인자 또는 성장인자를 유도 또는 억제하며, 다른 면역세포의 성장 및 분화를 매개함으로써, 본 개시에 따른 수지상세포 모방 구조체의 면역항암 치료의 효과를 보다 강화할 수 있다.
구체적으로 상기 생리활성 성분은 αCTLA-4 단일클론 항체 외 αPD-1, αPD-L1와 같은 면역관문 억제제, 또는 이를 이용한 화학 요법 약물 등의 항암 약물이라면 제한되지 않는다.
본 개시는 전술한 바와 같은 면역관문 억제용 수지상세포 모방 나노구조체를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다. 도 17a 내지 도 24를 참조하면, αCTLA-4 단일클론 항체가 도입된 면역관문 억제용 수지상세포 모방 나노구조체는 종양 성장을 억제하는 효과가 매우 뛰어나 암 치료용 물질로 매우 현저한 효과를 나타내고 있음을 알 수 있다. 이에 따라 면역관문 억제용 수지상세포 모방 나노구조체를 포함하는 암 치료용 약학 조성물은 우수한 면역항암 치료 효과를 제공할 수 있다.
암은 침윤에 의해 국부적 및 전이를 통해 확장가능한 각종 악성 고형 종양 등을 총징하는 것으로서, 구체적인 예로는 B-세포 림프종, 비소세포 폐암, 소세포 폐암, 기저세포 암종, 피부 편평세포암종, 직장결장암, 흑색종, 두경부 편평암, 간세포암, 위암, 육종, 위식도암, 신세포 암종, 교모세포종, 췌장암, 방광암, 전립선암, 유방암, 피부 T-세포 림프종, 머켈세포 암종 또는 다발성 골수종일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
암 치료를 위한 약학적 조성물은 pH, 삼투도, 점도, 무균성, 투명도, 색상, 등장성, 냄새, 안정성, 용해 속도 또는 방출 속도, 흡착 또는 침투를 변형, 유지 또는 보존하기 위한 제형 물질을 포함할 수 있다. 상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다. 비경구의 예로는, 정맥내, 근육내, 피하, 안와내, 피막내, 복강내, 직장내, 수조내, 혈관내, 진피내를 포함하는 다양한 경로로 환자에게 투여될 수 있으며, 피부 패치 또는 경피 이온도입법을 각각 이용하여 피부를 통해서도 투여될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 항암제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 항암제와 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
아울러 본 개시에 따르면 상기 면역관문 억제용 수지상세포 모방 나노구조체 또는 이를 포함하는 약학적 조성물을 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체의 암 치료방법을 제공할 수 있다. 상기 약학적 조성물을 개체에 투여함으로써 개체에서 종양 특이적 면역 반응을 유도하거나 개체에서 암의 증상을 치료 및/또는 완화시킬 수 있다. 이때 상기 개체는 인간 또는 비인간 포유동물일 수 있다.
또한 본 개시는 면역관문 억제용 수지상세포 모방 나노구조체의 제조방법을 제공하며, 상기 제조방법은 (S10) 수지상 세포로부터 세포막을 정제하는 단계; (S20) 상기 세포막에 에너지를 가하여 세포막 현탁액을 형성하는 단계; (S30) 상기 세포막 현탁액으로부터 리포좀을 수득하는 단계; (S40) 나노입자 및 상기 리포좀을 혼합한 후, 필터 압축하여 상기 세포막이 도입된 나노입자를 수득하는 단계; 및 (S50) 지질 분자와 컨쥬게이션된 αCTLA-4 단일클론 항체를 상기 세포막이 도입된 나노입자에 도입하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
도 3을 참조하면, 수지상세포 모방 나노구조체 (anDC)에 항원을 펄싱하여 항원을 표면에 제시하고, αCTLA-4가 컨쥬게이션된 인지질을 세포막에 삽입하여 최종적으로 αCTLA-4 단일클론 항체가 도입된 면역관문 억제용 수지상세포 모방 나노구조체를 제조하는 과정이 도시되어 있다.
구체적으로, (S10) 수지상세포로부터 세포막을 정제하는 단계는 급속 냉동-해동 및 원심분리를 통하여 진행될 수 있다. (S20) 정제된 세포막에 에너지를 가하여 세포막 현탁액을 형성할 수 있다. 이때, 일 예로서, 초음파를 처리하면 수백 나노 또는 수 마이크로 단위의 세포막 현탁액이 얻어질 수 있다. 이후 (S30) 상기 세포막 현탁액을 멤브레인 필터를 통해 여과하면 원하는 크기의 세포막 리포좀을 수득할 수 있다. (S40) 세포막 리포좀 및 나노입자를 혼합하고, 필터압축하여 세포막이 도입된 나노입자를 수득할 수 있다. 수지상세포의 세포막이 상기 나노입자 표면에 코팅된 형태가 얻어진다.
상기 (S40) 단계 이후, 상기 세포막이 도입된 나노입자에 항원을 펄싱하는 단계;를 더 포함할 수 있다. 상기 항원은 암 치료의 용도를 위해 종양 항원 유래 펩타이드 또는 단백질일 수 있고, 전술한 바에 따라 다양한 종양 특이 항원을 활용할 수 있다. 본 개시에 있어서, 비제한적인 일 예로 GP33-41를 이용할 수 있다.
(S50) 단계에 있어서, 지질 분자는 생체적합성을 가지는 지질 분자라면 제한없이 사용될 수 있으며, 구체적으로 인지질일 수 있고, 보다 구체적으로 포스파티딜에탄올아민계 인지질일 수 있다. 포스파티딜에탄올아민계 인지질의 구체적인 예를 들면, 2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DSPE)일 수 있다. 도 4에 지질 분자에 컨쥬게이션된 αCTLA-4를 수득하는 과정이 도시되어 있다. DSPE의 친수성 기에 PEG의 일 말단이 컨쥬게이션되고, PEG의 타 말단은 αCTLA-4가 컨쥬게이션될 수 있다. PEG의 중량평균분자량은 200 내지 10,000 g/mol 또는 500 내지 5,000 g/mol일 수 있다.
인지질과 컨쥬게이션된 αCTLA-4는 수지상세포 나노구조체의 세포막의 지질-지질 상호작용에 따라 용이하게 삽입되어, 효과적으로 T 세포의 활성화를 유도하는 역할을 할 수 있다.
이상과 같이 본 발명에서는 특정된 사항들과 한정된 실시예에 의해 설명되었으나 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것일 뿐, 본 발명은 상기의 실시예에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이러한 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다.
따라서, 본 발명의 사상은 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 아니되며, 후술하는 특허청구범위뿐 아니라 이 특허청구범위와 균등하거나 등가적 변형이 있는 모든 것들은 본 발명 사상의 범주에 속한다고 할 것이다.
제조예 1. 수지상세포 모방 나노구조체 제조
6주~8주령 Na
Figure pat00001
ve B6 마우스(Orient Bio)의 대퇴골에서 분리된 골수세포로부터 분화된 수지상세포를 추출하여, 2,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 순수한 수지상세포를 수득하였다. 이후, Protease Inhibitor Tablet-PBS buffer를 처리하여 1~2×106 cells/㎖ 농도로 분산시켰다. 그리고 -70 ℃에서 급속 냉동, 상온에서의 해동 과정 및 원심분리를 거쳐 세포막만을 정제하였다. 이후 20%의 진폭으로, 3초 켜기/끄기 및 사이클간 2초의 냉각기를 갖는 3초 1회전을 총 60회 수행하는 초음파(VC505, Sonics & materials)를 처리하여, 마이크로 단위의 세포막 현탁액을 확보하였으며, 이를 나노 사이즈의 필터를 갖는 폴리카보네이트 막(기공크기 1㎛, 400 ㎚, 100 ㎚)으로 걸러내 각 기공 크기의 직경을 갖는 나노 리포좀을 생성하였다. 나노입자 표면 상에 코팅되는 세포막의 표면적을 고려하여, 나노입자 및 리포좀이 최적화된 혼합비율을 가지는 경우를 XDM=1로 전제하였다.
[식 1]
Mole fraction (XDM )=(세포막의 표면적)/(나노입자의 표면적)
상기 XDM = 1이 되도록 60 ㎚금 나노입자 5 ㎕ 및 리포좀 1 ㎖을 혼합한 후, 함께 필터압축 (filter extrusion)하여, 수지상세포 모방 나노구조체를 제조하였다. 상기 제조된 수지상세포 모방 나노구조체에 0.2 ㎍/㎖의 GP-33 항원을 약 30분간 37 ℃에서 처리함으로써 MHC class I, II 표면에 항원을 제시할 수 있도록 유도하여, 항원이 펄싱된 수지상세포 모방 나노구조체를 제조하였다.
실시예 1. αCTLA-4 단일클론 항체가 도입된 면역관문 억제용 수지상세포 모방 나노구조체 제조
도 4에 도시된 방법에 따라, 2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DSPE) 의 친수성 기에 PEG 말단이 컨쥬게이션 된 분자에 PEG의 타 말단에 αCTLA-4 단일클론 항체를 컨쥬게이션 시켜 준비하고, 상기 제조예 1에 따라 제조된 수지상세포 모방 나노구조체의 세포막에 인지질이 결합된 αCTLA-4 단일클론 항체를 자발적 세포막 삽입 현상을 이용하여 도입함으로써, 면역관문 억제용 수지상세포 모방 나노구조체를 제조하였다.
실험예 1. 면역관문 억제용 수지상세포 모방 나노구조체의 T 세포 증식 및 분화유도 효과 평가 (in vitro)
96 well U bottom plate에 실시예 1에 따라 제조된 면역관문 억제용 수지상세포 모방 나노구조체(αCTLA4-anDC), 항원 펄싱되지 않은 수지상세포 모방 나노구조체(anDC), 항원이 펄싱된 수지상세포 모방 나노구조체(anDC/GP33-41) 각각 4×104개에 대하여 P14 mouse로부터 분리한 CD8 T 세포 2×105개를 같은 well에 배양액 10% RPMI 200 ㎕을 통해 넣고, 37 ℃에서 3일간 공배양하였다. 3일 후, 해당 플레이트를 인큐베이터에서 회수하여 형광이 달린 항체를 통해 염색을 진행하고 유세포 분석기를 통하여 CD8 T 세포의 활성화 정도를 분석하였다. 그 결과는 도 13b 및 13c에 도시되었다.
도 13b는 FACS 데이터를 그래프화한 것으로서, 실시예 1에 따라 제조된 면역관문 억제용 수지상세포 모방 나노구조체(αCTLA4-anDC)의 경우 CD44, IFNγ, TNFα에 대해 모두 가장 높은 발현율을 나타냈다. 이는 본 개시에 따른 면역관문 억제용 수지상세포 모방 나노구조체의 T 세포의 증식 및 활성화 효과가 탁월하게 우수함을 확인할 수 있다.
실험예 2. 면역관문 억제용 수지상세포 모방 나노구조체의 T 세포 증식 및 분화유도 효과 평가 (in vivo)
congenic marker(Ly5.1)가 달린 P14 mouse에서 CD8 T 세포를 분리한 후 naive recipient mouse에 양자면역세포이입(adoptive transfer)를 해주고, 24시간 후 수지상세포 (BMDC), 수지상세포 모방 나노구조체 (anDC) 및 면역관문 억제용 수지상세포 모방 나노구조체 (αCTLA4 conjugated anDC, αPD-1 conjugated anDC) 를 각 그룹마다 다른 조건으로 양자면역세포이입을 진행하였다. 구체적인 조건은 도 14에 도시되었다. 그 후 48시간이 경과한 다음, 마우스의 비장에서 면역세포를 분리하여, 형광이 달린 항체를 통해 염색을 진행하고 유세포 분석기를 통하여 CD8 T 세포의 활성화 정도를 분석하였다. 그 결과는 도 15 및 도 16에 도시되었다.
도 15 및 도 16을 참조하면, GP-33을 처리하지 않은 Group 3의 경우, negative control인 Group 1과 마찬가지로 CD8 T 세포 활성화 지표들이 모두 나타나지 않은 것을 확인할 수 있다. Group 4 내지 6에서는 CTV를 통해 CD8 T 세포의 증식, CD44을 통한 활성화, 및 기능성 사이토카인인 IFNγ, TNFα 및 IL-2의 분비를 확인할 수 있다. in vivo 상에서도 본 개시에 따른 면역관문 억제용 수지상세포 모방 나노구조체의 T 세포의 증식 및 활성화 효과가 뛰어남을 확인할 수 있다.
실험예 3. 마우스 대장암 모델에서 αCTLA-4 단일클론 항체가 도입된 면역관문 억제용 수지상세포 모방 나노구조체의 항암 효능검증을 위한 암 성장 억제 및 마우스 생존률 평가
마우스 대장암 모델에서 나노구조체의 항암 효능 평가를 위한 생체내시험 조건은 도 17에 도시된 바와 같다. 마우스 대장암 세포주 MC38과 CT26세포주를 이용하여 5x105개의 세포를 6-8주령 C57BL/6 및 BALB/c 마우스 피하에 주사하여 종양을 유도하였다. 캘리퍼를 사용하여 0일차, 5일차, 8일차, 11일차, 14일차, 17일차, 20일차, 23일차에 종양 크기를 측정하였고 2000 ㎣ 보다 크기가 큰 종양은 죽은 것으로 간주하여 생존 그래프를 그렸다. 종양세포 주입 5일 후와 10일 후에 피하주사를 통해 anDC와 anDC/p15E, αCTLA4-anDC/p15E를 그룹별로 주입하였다. 그 결과를 도 19 및 도 20에 나타내었다. 도 19 및 도 20을 참조하면, 본 개시에 따른 αCTLA-4 단일클론 항체가 도입된 anDC 나노구조체를 1x106개 주입한 그룹에서 anDC 나노구조체만 주입한 그룹 대비 유의적인 종양 성장 감소가 확인되었고, 또한 마우스의 생존률을 유의적으로 대폭 증가시켰음을 확인할 수 있다.
실험예 4. 마우스 폐암 모델에서 αCTLA-4 단일클론 항체가 도입된 면역관문 억제용 수지상세포 모방 나노구조체의 항암 효능검증을 위한 암 성장속도 억제 평가
마우스 폐암 모델에서 나노구조체의 항암 효능 평가를 위한 생체내시험 조건은 도 21에 도시된 바와 같다. 면역관문저해제 저항성 세포주인 마우스 폐암 세포주 TC1 세포주에 luciferase를 합성한 TC1-luciferase 세포주를 이용하였다. 5x105개의 세포를 6-8주령 C57BL/6 마우스의 꼬리정맥에 주사하여 orthotopic하게 종양을 유도하였다. 6일 후에 IVIS spectrum(In Vivo Imaging System)을 통해 종양 생성을 확인하였다. 종양이 적절하게 생성된 6일차부터 5일 간격으로 꼬리 정맥주사를 통해 anDC와 anDC/E6,E7, αCTLA4-anDC/E6, E7을 그룹별로 세마리씩 주입하여 10일차, 14일차, 18일차에 IVIS 이미지를 확보하였다. 그 결과를 도 22 내지 도 24에 나타내었다.
도 22 내지 도 24를 참조하면, 본 개시에 따른 αCTLA-4 단일클론 항체가 도입된 면역관문 억제용 수지상세포 모방 나노구조체를 1x106개 주입한 그룹에서 가장 느린 종양 생성 속도를 나타냄을 확인할 수 있다.

Claims (10)

  1. 나노입자 코어; 및 수지상 세포로부터 유래된 지질 분자의 세포막을 포함하는 쉘;을 포함하는 나노구조체로서,
    상기 쉘은 αCTLA-4 단일클론 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역관문 억제용 수지상세포 모방 나노구조체.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 αCTLA-4 단일클론 항체는 지질 분자와 컨쥬게이션된 것인, 수지상세포 모방 나노구조체.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 나노구조체는 항원이 펄싱(pursing)된 것인, 수지상세포 모방 나노구조체.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 항원은 종양 항원 유래 펩타이드 또는 단백질인, 수지상세포 모방 나노구조체.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 나노구조체는 20㎚ 내지 50 ㎛의 평균입경을 가지는, 수지상세포 모방 나노구조체.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 나노구조체는 20 ㎚ 내지 1000 ㎚의 평균입경을 가지는, 수지상세포 모방 나노구조체.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 쉘의 표면은 생리활성 고분자, 생리활성 성분 또는 단백질이 표지된 것인, 수지상세포 모방 나노구조체.
  8. 제 1항에 따른 면역관문 억제용 수지상세포 모방 나노구조체를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물.
  9. (S10) 수지상세포로부터 세포막을 정제하는 단계;
    (S20) 상기 세포막에 에너지를 가하여 세포막 현탁액을 형성하는 단계;
    (S30) 상기 세포막 현탁액으로부터 리포좀을 수득하는 단계;
    (S40) 나노입자 및 상기 리포좀을 혼합한 후, 필터 압축하여 상기 세포막이 도입된 나노입자를 수득하는 단계; 및
    (S50) 지질 분자와 컨쥬게이션된 αCTLA-4 단일클론 항체를 상기 세포막이 도입된 나노입자에 도입하는 단계;
    를 포함하는 면역관문 억제용 수지상세포 모방 나노구조체의 제조방법.
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 (S40) 단계 이후, 상기 세포막이 도입된 나노입자에 항원을 펄싱하는 단계;를 더 포함하는, 면역관문 억제용 수지상세포 모방 나노구조체의 제조방법.
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