CN116445404A - 一种nk细胞来源的外泌体的制备及药物装载方法与应用 - Google Patents

一种nk细胞来源的外泌体的制备及药物装载方法与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116445404A
CN116445404A CN202211713740.0A CN202211713740A CN116445404A CN 116445404 A CN116445404 A CN 116445404A CN 202211713740 A CN202211713740 A CN 202211713740A CN 116445404 A CN116445404 A CN 116445404A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
exosomes
ovarian cancer
cells
drug
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202211713740.0A
Other languages
English (en)
Inventor
赵星
张晶
罗和永
欧阳伟炜
林小金
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guizhou Medical University
Original Assignee
Guizhou Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guizhou Medical University filed Critical Guizhou Medical University
Priority to CN202211713740.0A priority Critical patent/CN116445404A/zh
Publication of CN116445404A publication Critical patent/CN116445404A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0646—Natural killers cells [NK], NKT cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A61K33/24—Heavy metals; Compounds thereof
    • A61K33/243—Platinum; Compounds thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/46—Ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. skin, bone, milk, cotton fibre, eggshell, oxgall or plant extracts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及肿瘤生物治疗技术领域，具体是一种NK细胞来源的外泌体的制备及药物装载方法与应用。本申请通过切向流技术联合超高速离心，从大体积细胞培养上清中分离NK细胞来源的外泌体，得到的NK细胞外泌体可直接用于卵巢癌等实体瘤治疗。解决了目前外泌体的常用制备技术难以实现从细胞培养上清中大量制备的问题。本申请将NK细胞外泌体通过电穿孔技术装载化疗药物如顺铂，用于治疗卵巢癌，特别是对化疗耐药的卵巢癌。NK细胞外泌体运载顺铂后可以提高顺铂耐药的卵巢癌细胞株对顺铂的敏感性。此外，NK细胞外泌体还可增强NK细胞，特别是功能降低的NK细胞的抗肿瘤作用。

Description

一种NK细胞来源的外泌体的制备及药物装载方法与应用
技术领域
本发明涉及肿瘤生物治疗技术领域，具体是一种NK细胞来源的外泌体的制备及药物装载方法与应用。
背景技术
外泌体(exosome,Exo)是一种由细胞主动分泌的具有脂质双分子层结构的纳米级囊泡，可携带蛋白质、核酸和脂质等多种生物活性物质在体液中循环，并将生物活性物质选择性地递送到受体细胞从而实现细胞间的物质交换和信息交流。近年来外泌体已在肿瘤精准治疗中展现出巨大的应用潜力，一方面可利用其良好的生物相容性、运输效率高及稳定性好等优势做为抗肿瘤药物的递送工具，另一方面某些外泌体自身就携带有抗肿瘤功能的生物活性物质，因而这类外泌体有望替代细胞治疗成为一种新型的“无细胞”抗肿瘤治疗手段。
自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)可通过释放穿孔素(perforin)和颗粒酶(Granzyme)等细胞毒性颗粒以及诱导靶细胞凋亡等途径来发挥对肿瘤细胞的直接杀伤作用。最新研究发现，NK细胞来源的外泌体(NK-EXO)上表达CD56及CD16等NK细胞的特征性标志蛋白，以及穿孔素及颗粒酶等细胞毒性物质，可对肿瘤细胞发挥直接杀伤作用。NK细胞来源的外泌体有着与NK细胞相似的功能且可能在临床应用中更有优势，如在肿瘤治疗中，NK细胞来源的外泌体比NK细胞在应用上具有安全性高、不受肿瘤微环境的影响、可作为运载工具递送抗肿瘤药物、且还具有储存及运输上的优势，因而在肿瘤治疗中有着巨大的应用价值。目前将NK细胞来源外泌体作为药物载体的研究已经涉及到多种实体瘤的治疗中。
要将NK细胞来源的外泌体应用于肿瘤治疗，外泌体的大规模制备将是急需解决的问题。然而，目前常用的制备和纯化技术无法满足外泌体大量提取及有效提纯的要求。外泌体的制备方法主要有差速离心分离法、尺寸排阻色谱、超滤法、磁珠法以及基于聚合物的沉淀技术等。其中，差速离心法是分离纯化外泌体的金标准，分离的外泌体纯度高，相对获得量大，但差速离心需要大型离心设备且耗时较长；尺寸排阻色谱耗时长，不适合大量样本处理；超滤法易使离心后的外泌体变形受损，难以恢复；磁珠法虽然分离的外泌体相对大小比较均一，但分离出来的外泌体多为磁珠与外泌体的混合物而限制了后续的应用；基于聚合物的沉淀技术可能会同时分离非囊泡污染物，而且聚合物材料的混杂可能影响下游分析。因此，寻找一种能够快速、大量制备高纯度外泌体的方法，是目前急需解决的问题。
顺铂(DDP)是一种细胞周期非特异性细胞毒药物,对多种恶性肿瘤(如膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、肺癌、头颈部癌、乳腺癌、卵巢癌、恶性淋巴瘤等)有治疗作用。但顺铂导致的毒副作用及耐药性使得其临床应用受到极大的限制，因而对顺铂新剂型的研究已成为热点。目前常用于包载顺铂的载体主要有脂质体及水凝胶等，但这些化学合成的药物载体在组织相容性及稳定性方面均存在着缺陷。因而，寻找一种毒副作用低，并且对耐药性的肿瘤仍具有良好效果的药物递送制剂，是目前急需解决的问题。
外泌体来源于细胞，具有良好的生物相容性，是实现药物递送的理想载体。目前外泌体的载药方式包括：1.物理共孵育，操作简单但载药效率低；2.超声处理，载药效率略有提高但容易造成外泌体聚集；3.电穿孔，载药效率高但条件不当时容易造成膜破损。专利申请号为201780082770.7的专利申请公开了负载治疗剂的乳外泌体，其中描述的方法是通过超声处理实现载药。因此，本领域急需一种能够提供高效负载同时减小对于外泌体膜损伤的载药方式。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供一种NK细胞来源外泌体的制备、药物装载方法与应用。
一种NK细胞来源外泌体的制备方法，包括如下步骤：
(1)切向流系统的组装：使用10-100KD孔径的过滤膜包，依次安装进液管、出液管、滤液管，进液管从蠕动泵中穿过；进液管和出液管均放置在同一个样品杯中，滤液管放置在滤液桶中；进液口在下，出液口在上，将压力指示器安装在膜包出液口；
(2)细胞上清的预处理：收集细胞培养上清，经过一次300×g，10min离心，取上清液，下层NK细胞可用于其他实验；上清再经过一次2000×g，10min离心，去除细胞碎片，收集上清液；
(3)细胞上清的浓缩：预处理后的细胞培养上清分次加入样品杯中；打开蠕动泵，缓慢增加压力，最终保持以2-4bar的压力进行浓缩，最终的浓缩倍数为50-160倍；在浓缩至15-25mL时收集样品杯中的样品至离心管中，再向样品杯添加PBS，以0.5-1.5bar的压力缓慢冲洗管道，提高回收率；
(4)超高速离心分离NK细胞来源的外泌体：将细胞上清浓缩液放置在灭菌后的超高速离心管中，10000×g离心30min并通过0.22μm的滤器，去除体积较大的囊泡；将上清进行100000×g离心70min，去除上清，使用PBS将下层外泌体沉淀块重悬并清洗一次；再次进行100000×g离心70min，去除上清，使用500μL的PBS重悬沉淀块得到外泌体悬液，保存在-80℃。
进一步的，所述步骤(4)，所有步骤在4℃下进行。
进一步的，所述步骤(4)，所有离心步骤使用Hitachi CPN100NX离心机进行离心。
一种NK细胞来源的外泌体的药物装载方法，其是采用电转染的方式对外泌体进行药物装载。
进一步的，所述电转染参数为400-450V，120ms。
进一步的，所述的基于NK细胞来源的外泌体的药物装载方法，具体步骤如下：
(1)将准备进行装载的药物使用生理盐水溶解，然后经过超声波破碎仪处理30s，促进溶解；
(2)在200μL的电转杯中以1:1:2的比例依次加入NK细胞来源的外泌体、装载药物与电转缓冲液混匀；
(3)设定电转条件进行导入：使用Celetrix电转仪参数设定为400-450V，120ms；
(4)电转完成后然后立刻将电转杯放置于冰上5-30min以促进膜的恢复。
(5)将其置于超速离心机，4℃，100000×g离心70min，使用PBS缓冲液将其重悬得到载药外泌体。
进一步的，所述进行装载的药物可以是：紫杉醇、顺铂、卡铂、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、亚叶酸、奥沙利铂、表柔比星、多柔比星、环磷酰胺、阿霉素、长春新碱、泼尼松龙等；以及siRNA、mRNA、溶瘤病毒(溶瘤腺病毒、呼肠孤病毒等)。优选的，所述药物是顺铂。
基于NK细胞来源的外泌体在制备肿瘤药物方面的应用，其可以应用于制备包括：前列腺癌、乳腺癌、肺癌和支气管癌、结肠癌和直肠癌、膀胱癌、甲状腺癌、肾癌和肾盂癌、子宫癌、口腔癌、卵巢癌、胃癌、胰腺癌在内的各种实体肿瘤的肿瘤药物。
进一步的，所述基于NK细胞来源的外泌体，是通过上述制备方法制备得到的外泌体。
进一步的，所述肿瘤药物，是卵巢癌药物，尤其是化疗耐药的卵巢癌。
进一步的，所述制备卵巢癌药物，是将化疗药物顺铂装载至该外泌体上进行制备。
NK细胞外泌体还可增强NK细胞，特别是功能降低的NK细胞的抗肿瘤作用。
与现有技术相比，本发明创造的技术效果体现在：
(1)本申请通过切向流技术联合超高速离心，从大体积细胞培养上清中分离NK细胞来源的外泌体，得到的NK细胞外泌体可直接用于卵巢癌治疗。解决了目前外泌体的常用制备技术为超高速离心，难以实现大量制备外泌体的问题。
(2)本申请将NK细胞来源的外泌体通过电穿孔技术装载化疗药物顺铂，用于治疗耐药性的卵巢癌。NK细胞来源的外泌体运载顺铂后作用于化疗耐药的卵巢癌细胞株可以提高顺铂耐药卵巢癌株对顺铂的敏感性。并且NK细胞外泌体对NK细胞，特别是功能抑制的NK细胞(如肿瘤微环境中的NK细胞)，能够增强其抗肿瘤作用。
(3)本申请使用了特定电转仪，加大电压后靠提高电转液的温度加上电泳作用，将药载入外泌体，并选择了400-450V，120ms的条件，解决了目前通过普通电转条件难以将药物加载到外泌体中的问题。
(4)与NK细胞疗法相比，NK细胞来源的外泌体有如下显著优势：①选择性杀伤作用，只攻击肿瘤细胞而不损害正常细胞；②更好的肿瘤靶向性，NK细胞的外泌体具有纳米级尺寸以及良好的组织渗透性，可穿过NK细胞难以跨越的血-肿瘤屏障及血-脑屏障等；③不被肿瘤微环境所抑制，NK来源外泌体在体外模拟的肿瘤抑制环境中仍保留其原有的抗肿瘤活性；④更好的保存条件，NK细胞制备完成后需在1-2天内使用，且保存及运输条件要求较高。而NK细胞来源的外泌体可通过-80℃下冷冻运输或者制备冻干粉的方式更简便的运输。
附图说明
图1切向流浓缩系统结构示意图，包括样品杯、100MWCO的膜包、管道及蠕动泵。以及纳米流式检测切向流系统截流效率结果图。样品从膜包中通过时，截留外泌体，滤除更小的杂质及液体达到浓缩的目的。
图2NK细胞外泌体的鉴定电镜图。
图3NK细胞外泌体的表面标志蛋白鉴定结果图。
图4卵巢癌细胞对NK细胞外泌体的摄取内化结果图。
图5NK细胞外泌体对卵巢癌细胞的杀伤作用。
图6NK-EXO-DDP的制备示意图。
图7NK-EXO-DDP对卵巢癌细胞的杀伤作用对比图。
图8NK-EXO-DDP引起卵巢癌细胞的凋亡结果对比图。
图9NK-EXO-DDP影响卵巢癌细胞增殖的对比图。
图10NK-EXO-DDP影响卵巢癌细胞周期的对比图。
图11NK细胞外泌体增强NK细胞、NK92细胞株、卵巢癌腹水处理后的NK细胞的抗肿瘤活性对比图。
具体实施方式
下面结合具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。
实施例1：NK细胞外泌体的分离及鉴定
1.NK细胞外泌体的分离
(1)切向流系统的组装：使用100KD孔径的过滤膜包，依次安装进液管、出液管、滤液管，进液管从蠕动泵中穿过。进液管和出液管均放置在同一个样品杯中，滤液管放置在滤液桶中。进液口在下，出液口在上，将压力指示器安装在膜包出液口。
(2)细胞上清的预处理：收集细胞培养上清，经过一次300×g，10min离心，下层NK细胞可用于其他实验。上清再经过一次2000×g，10min离心，去除细胞碎片。
(3)细胞上清的浓缩：预处理后的细胞培养上清分次加入样品杯中。打开蠕动泵，缓慢增加压力，最终保持以2-4bar的压力进行浓缩，最终的浓缩倍数能够达到50-160倍。在浓缩至15-25mL左右时收集样品杯中的样品至离心管中，再向样品杯添加5-15mLPBS，以0.5-1.5bar的压力缓慢冲洗管道，提高回收率(此体系单次可以浓缩500mL细胞培养上清。如果需要对大量的液体浓缩，我们可以通过多次向样品杯中添加样本或者同时添加多个样品杯的方式，扩大浓缩体积)。
(4)超高速离心分离NK细胞来源的外泌体：在4℃下进行以下所有步骤。将细胞上清浓缩液放置在灭菌后的超高速离心管中，使用Hitachi CPN100NX离心机，10000×g离心30min并通过0.22μm的滤器，去除体积较大的囊泡。将上清进行100000×g离心70min，去除上清，使用15-35mL PBS将下层外泌体沉淀块重悬并清洗一次。再次进行100000×g离心70min，去除上清，使用500μL的PBS重悬沉淀块得到外泌体悬液，保存在-80℃。
(5)通过纳米流式检测切向流滤出液中的粒子浓度及制备的外泌体粒子粒径及浓度，评价切向流的截留效率：将样品稀释以达到2000-12000/min的粒子计数范围，然后再1min内检测通过检测器的所有粒子。使用标准曲线，将流速和侧向散射强度转换为浓度和大小。具体结果见表1，纳米流式检测通过切向流系统浓缩后的浓缩液及滤出液中的粒子数目。表1展示了各个粒径范围内的粒子个数及粒子总数，并通过计算得出截留效率。通过切向流系统浓缩对NK细胞外泌体的截留效率能够达到94.4％(表1)。
表1比较滤出液与截留液中不同粒径范围内的粒子数目
2.NK细胞外泌体的表征
(1)将NK细胞外泌体(>109/mL)悬浮在PBS中。吸取10μL样品并滴加于铜网上，沉淀1min后使用滤纸吸去浮液。接着吸取10μL醋酸双氧铀滴加于铜网上沉淀1min，并用滤纸吸去浮液。常温干燥数分钟后，通过Hitachi HT-7700透射电子显微镜(100kV)进行观察。结果可见图2，通过实施例1获得的NK细胞外泌体在电镜下观察到外泌体典型的“茶托状”，呈现内部半透明、椭圆、大小不一的封闭膜结构。
(2)Western blot方法对NK细胞外泌体进行CD63、CD81及TSG101表达检测。在NK细胞外泌体中可检测到典型的外泌体标志CD63、CD81和TSG101，且检测不到代表细胞碎片污染的标志calnexin的表达。
实施例2：NK细胞外泌体装载化疗药物
1.特定电转条件下NK-EXO-DDP的制备：
将抗肿瘤药物顺铂(DDP)使用生理盐水溶解，然后经过超声波破碎仪处理30s，促进顺铂溶解；顺铂终浓度为5mg/mL。在200μL的电转杯中以1:1:2的比例依次加入NK细胞来源的外泌体、顺铂与电转缓冲液混匀(外泌体及顺铂浓度均为5mg/mL)。设定电转条件进行导入：使用Celetrix电转仪参数设定为400-450V，120ms。电转完成后然后立刻将电转杯放置于冰上5-30min促进膜的恢复。将其置于超速离心机，4℃，100000×g离心70min，使用PBS缓冲液将其重悬得到载药外泌体(NK-EXO-DDP)。
2.普通的电转条件为：
将抗肿瘤药物顺铂使用生理盐水溶解，然后经过超声波破碎仪处理30s，促进顺铂溶解；顺铂终浓度为5mg/mL。在200μL的电转杯中以1:1:2的比例依次加入NK细胞来源的外泌体、顺铂与电转缓冲液混匀(外泌体及顺铂浓度均为5mg/mL)。设定电转条件进行导入：使用Celetrix电转仪参数设定为400V，20ms。将其置于超速离心机，4℃，100000×g离心70min，使用PBS缓冲液将其重悬得到载药外泌体。
两种电转条件的效果对比见表2。两种电转条件分别制备的NK-EXO-DDP对于同一种细胞的细胞杀伤作用具有显著差异。以我们的特定电转条件制备的NK-EXO-DDP对SKOV3细胞的杀伤作用远高于普通电转条件下制备的NK-EXO-DDP。
表2.比较两种电转条件下不同的药物处理对于SKOV3细胞的杀伤率
实施例3：NK细胞外泌体直接或装载化疗药物的体外抗肿瘤作用
1.NK细胞外泌体的特征性蛋白检测
将NK细胞外泌体与APC anti-human CD16，FITC anti-human CD107a，PE anti-human CD56，PE anti-human CD69避光孵育30min后，经过70min，100000×g的超速离心去除游离染料，然后通过纳米流式仪进行检测。结果如图3所示，纳米流式结果显示可在NK细胞外泌体表面检测到典型的NK细胞标志CD56，以及脱颗粒标志物CD107a(左)。
用蛋白酶抑制剂在RIPA缓冲液中裂解NK细胞外泌体，然后采用Werstern blot方法对NK外泌体特有的穿孔素(perforin)和颗粒酶B(granzyme B)进行检测。WesternBlotting结果显示可在NK细胞外泌体中检测到CD56、细胞毒性物质穿孔素(perforin)及颗粒酶B(Granzyme B)的表达(图3右)。
2.卵巢癌细胞对NK细胞外泌体的摄取
将20μg PKH67标记的NK细胞外泌体与SKOV3细胞共孵育6小时，4％多聚甲醛固定SKOV3细胞，用10μg/mL的DAPI对细胞核进行染色，通过正置荧光显微镜进行图像采集。使用Image J 1.53a软件通过计数蓝色和绿色荧光阳性细胞来定量SKOV3细胞对NK细胞外泌体的摄取。如图4所示，能够观察到NK细胞外泌体进入SKOV3细胞，并且在6h时SKOV3细胞对NK细胞外泌体的摄取率能够达到60％左右。
3.NK细胞外泌体对卵巢癌细胞的杀伤作用
为了确定NK细胞外泌体是否对肿瘤细胞有细胞毒作用，我们选取卵巢癌细胞SKOV3、顺铂耐药株COC1/DDP作为检测对象。将实施例1获得的NK细胞外泌体按照不同浓度(10、25、50、100μg/mL)与上述几种细胞共同培养24h，通过CCK8法在450nm下测定光密度(OD)，从而量化细胞存活率。如图5所示，NK细胞外泌体对于卵巢癌细胞SKOV3及COC1/DDP均有显著的杀伤作用，并且杀伤率随着外泌体浓度的增加而显著增加。
4.NK-EXO-DDP对卵巢癌细胞的杀伤作用
为了确定本方案中电转条件的可行性，我们测定了电转制备的NK-EXO-DDP对于卵巢癌细胞的杀伤作用。选取卵巢癌细胞SKOV3、顺铂耐药株COC1/DDP、顺铂抵抗株OV-90作为检测对象。将实施例2获得的NK-EXO-DDP、NK细胞外泌体及DDP按照10μg/mL的浓度与上述几种卵巢癌细胞共同培养24h，通过CCK-8法在450nm下测定光密度(OD)，从而量化细胞存活率。
具体结果见表3及图7。与NK细胞外泌体及DDP单独作用组相比，NK-EXO-DDP组对3株卵巢癌细胞均有显著的杀伤作用，特别与DDP单独作用相比，NK-EXO-DDP可显著增强对顺铂耐药株COC1/DDP及顺铂抵抗株OV-90卵巢癌细胞的杀伤作用。
表3.特定电转条件下制备的NK-EXO-DDP处理对于几种卵巢癌细胞的杀伤率
5.流式检测NK-EXO-DDP对卵巢癌细胞凋亡的影响
将实施例2中获得的NK-EXO-DDP按10μg/mL的浓度处理卵巢癌细胞SKOV3及卵巢癌顺铂耐药株COC1/DDP 24h。在避光条件下用AnnexinⅤ-FITC及PI染色后通过流式细胞仪进行检测。如图8所示，NK细胞外泌体引起卵巢癌细胞的凋亡比例(早期凋亡+晚期凋亡)并不高，DDP能够引起卵巢癌细胞30％左右的凋亡，NK-EXO-DDP能够显著增高卵巢癌细胞的凋亡比例。
6.流式检测NK-EXO-DDP对卵巢癌细胞增殖的影响
为了检测NK-EXO-DDP对肿瘤细胞增殖的影响，使用CFSE荧光染料对SKOV3细胞膜进行着色，在充分去除游离染料后将CFSE染色的SKOV3细胞与10μg/mL实施例2中获得的NK-EXO-DDP避光共培养48h，通过流式细胞仪进行检测。
如图9所示，与空白组及单独的NK细胞外泌体相比，NK-EXO-DDP能够显著抑制肿瘤细胞的增殖。
7.流式检测NK-EXO-DDP对卵巢癌细胞周期的影响
为检测NK-EXO-DDP对卵巢癌细胞周期的影响，将SKOV3细胞与10μg/mL实施例2中获得的NK-EXO-DDP避光共培养24h，然后使用70％的乙醇在4℃下固定过夜。充分清洗去除残余固定液后，加入含有RNase的PI染液染色30min。收集细胞，通过流式细胞仪进行检测。
如图10所示，与单独应用DDP及NK细胞外泌体相比，NK-EXO-DDP能够显著诱导SKOV3细胞阻滞在G2/M期。
实施例4：NK细胞外泌体能够增强NK细胞功能
为了验证NK细胞外泌体对于NK细胞的免疫调节作用，选取NK细胞、NK92细胞株、卵巢癌腹水处理后的NK细胞(AS-t-NK)作为检测对象。首先，为了模拟处于肿瘤微环境中的NK细胞，我们使用含10％卵巢癌腹水的培养基处理NK细胞24h以制备AS-t-NK细胞。用80μg/mL的NK细胞外泌体分别处理NK细胞、NK92细胞及AS-t-NK细胞24h，然后按照1:1或2:1的效靶比将处理后的NK细胞与SKOV3共同孵育5h。使用CCK-8在450nm下检测OD值以量化NK细胞外泌体处理后的NK细胞的细胞毒性。
如图11所示，NK-EXO处理后的NK细胞、NK92细胞及AS-t-NK细胞均在2:1的效靶比下增强了对卵巢癌细胞SKOV3的杀伤作用，特别是显著增强了NK细胞及AS-t-NK细胞对肿瘤细胞的杀伤。
最后，应当指出，以上实施例仅是本发明较有代表性的例子。显然，本发明的技术方案并不限于上述实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种基于NK细胞来源的外泌体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)切向流系统的组装：使用10-100KD孔径的过滤膜包，依次安装进液管、出液管、滤液管，进液管从蠕动泵中穿过；进液管和出液管均放置在同一个样品杯中，滤液管放置在滤液桶中；进液口在下，出液口在上，将压力指示器安装在膜包出液口；
(2)细胞上清的预处理：收集细胞培养上清，经过一次300×g，10min离心，取上清液；上清再经过一次2000×g，10min离心，去除细胞碎片，收集上清液；
(3)细胞上清的浓缩：预处理后的细胞培养上清分次加入样品杯中；打开蠕动泵，缓慢增加压力，最终保持以2-4bar的压力进行浓缩，最终的浓缩倍数为50-160倍；在浓缩至15-25mL时收集样品杯中的样品至离心管中，再向样品杯添加PBS，以0.5-1.5bar的压力缓慢冲洗管道，提高回收率；
(4)超高速离心分离NK细胞来源的外泌体：将细胞上清浓缩液放置在灭菌后的超高速离心管中，10000×g离心30min并通过0.22μm的滤器；将上清进行100000×g离心70min，去除上清，使用PBS将下层外泌体沉淀块重悬并清洗一次；再次进行100000×g离心70min，去除上清，使用PBS重悬沉淀块得到外泌体悬液，保存在-80℃。
2.根据权利要求1所述的基于NK细胞来源的外泌体的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)，所有步骤在4℃下进行。
3.一种基于NK细胞来源的外泌体的药物装载方法，其特征在于，采用电转染的方式进行药物装载。
4.根据权利要求3所述的基于NK细胞来源的外泌体的药物装载方法，其特征在于，所述电转染参数为400-450V，120ms。
5.根据权利要求3所述的基于NK细胞来源的外泌体的药物装载方法，具体步骤如下：
(1)将准备进行装载的药物使用生理盐水溶解，然后经过超声波破碎仪处理30s，促进溶解；
(2)在200μL的电转杯中以1:1:2的比例依次加入NK细胞来源的外泌体、装载药物与电转缓冲液混匀；
(3)设定电转条件进行导入：使用Celetrix电转仪参数设定为400-450V，120ms；
(4)电转完成后然后立刻将电转杯放置于冰上5-30min。
(5)将其置于超速离心机，4℃，100000×g离心70min，使用PBS缓冲液将其重悬得到载药外泌体。
6.根据权利要求4所述的基于NK细胞来源的外泌体的药物装载方法，其特征在于，所述进行装载的药物是顺铂。
7.基于NK细胞来源的外泌体在制备肿瘤药物方面的应用。
8.权利要求7所述的基于NK细胞来源的外泌体在制备卵巢癌药物方面的应用，其特征在于，所述基于NK细胞来源的外泌体，是通过权利要求1-3任一项所述的制备方法制备得到的外泌体。
9.权利要求7所述的基于NK细胞来源的外泌体在制备卵巢癌药物方面的应用，其特征在于，所述肿瘤药物，是卵巢癌药物。
10.权利要求8所述的基于NK细胞来源的外泌体在制备卵巢癌药物方面的应用，其特征在于，所述卵巢癌，是化疗耐药的卵巢癌。
CN202211713740.0A 2022-12-29 2022-12-29 一种nk细胞来源的外泌体的制备及药物装载方法与应用 Pending CN116445404A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211713740.0A CN116445404A (zh) 2022-12-29 2022-12-29 一种nk细胞来源的外泌体的制备及药物装载方法与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211713740.0A CN116445404A (zh) 2022-12-29 2022-12-29 一种nk细胞来源的外泌体的制备及药物装载方法与应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116445404A true CN116445404A (zh) 2023-07-18

Family

ID=87122608

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211713740.0A Pending CN116445404A (zh) 2022-12-29 2022-12-29 一种nk细胞来源的外泌体的制备及药物装载方法与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116445404A (zh)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20190101147A (ko) * 2018-02-22 2019-08-30 경북대학교 산학협력단 자연살해세포 유래의 엑소좀 유사 베지클을 포함하는 암 치료용 약학적 조성물
CN210140594U (zh) * 2018-12-26 2020-03-13 浙江大学 一种用于外泌体分泌、分离和收集的生物反应器
CN113355290A (zh) * 2021-05-31 2021-09-07 北京理工大学 一种抗肿瘤的工程化外泌体、制备方法和应用
CN113388575A (zh) * 2021-06-11 2021-09-14 杭州露源生物科技有限公司 一种皮肤损伤修复用间充质干细胞外泌体的制备方法
CN114129734A (zh) * 2021-12-01 2022-03-04 姜海涛 一种胆组织靶向载药外泌体及其制备方法和应用
CN115197908A (zh) * 2022-06-27 2022-10-18 上海交通大学 一种自然杀伤细胞来源外泌体的提取、修饰方法及其应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20190101147A (ko) * 2018-02-22 2019-08-30 경북대학교 산학협력단 자연살해세포 유래의 엑소좀 유사 베지클을 포함하는 암 치료용 약학적 조성물
CN210140594U (zh) * 2018-12-26 2020-03-13 浙江大学 一种用于外泌体分泌、分离和收集的生物反应器
CN113355290A (zh) * 2021-05-31 2021-09-07 北京理工大学 一种抗肿瘤的工程化外泌体、制备方法和应用
CN113388575A (zh) * 2021-06-11 2021-09-14 杭州露源生物科技有限公司 一种皮肤损伤修复用间充质干细胞外泌体的制备方法
CN114129734A (zh) * 2021-12-01 2022-03-04 姜海涛 一种胆组织靶向载药外泌体及其制备方法和应用
CN115197908A (zh) * 2022-06-27 2022-10-18 上海交通大学 一种自然杀伤细胞来源外泌体的提取、修饰方法及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YANAN JIANG等: "Hypoxia enhances the production and antitumor effect of exosomes derived from natural killer cells", ANNALS OF TRANSLATIONAL MEDICINE, vol. 9, no. 6, pages 1 - 13 *
魏群: "生物工程技术实验指导", 高等教育出版社, pages: 79 *
鲍圣芳;李佳蕊;: "卵巢癌纳米靶向药物治疗的研究进展", 国际妇产科学杂志, no. 05, pages 586 - 570 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7315243B2 (ja) エクソソームの製造方法
CN111603454A (zh) 一种多重靶向的融合细胞膜修饰的仿生纳米递送系统及其制备方法与应用
CN109666695B (zh) 一种靶向整合素αvβ3的外泌体载体及其制备方法和应用
CN108042805B (zh) 一种肿瘤载药微颗粒制剂及其制备方法
US9844508B2 (en) Tumor vaccine and method for producing the same
Han et al. Natural killer cell-derived exosome-entrapped paclitaxel can enhance its anti-tumor effect.
CN113151251B (zh) 一种类囊体膜与nk细胞的融合细胞及其构建方法
Geng et al. Recent advancement and technical challenges in developing small extracellular vesicles for cancer drug delivery
CN111012924A (zh) 一种基于牛奶外泌体的靶向载药体系
CN113717944B (zh) 一种miRNA13896过表达的工程化人脐带间质干细胞源外泌体及制备方法和应用
Wang et al. Loading of metal isotope-containing intercalators for mass cytometry-based high-throughput quantitation of exosome uptake at the single-cell level
CN107875124B (zh) 一种从细胞悬液中提取和纯化包裹药物的细胞囊泡的方法
CN114404571A (zh) 一种装载化疗药物且tigit过表达的工程化载药细胞膜囊泡以及制备方法和应用
CN110699320A (zh) 一种人外周血中性粒细胞外泌体及其提取方法和应用
Panigrahi et al. Exosomes: Insights and therapeutic applications in cancer
Tian et al. Mesenchymal stem cell-derived exosomes: novel therapeutic approach for inflammatory bowel diseases
Wani et al. Exosomes harnessed as nanocarriers for cancer therapy-current status and potential for future clinical applications
CN110604813A (zh) 一种肿瘤细胞来源外泌体抗原在dc疫苗中的应用方法
Khan et al. Unique therapeutic potentialities of exosomes based nanodrug carriers to target tumor microenvironment in cancer therapy
Macedo-Pereira et al. Digging the intercellular crosstalkviaextracellular vesicles: May exosomes be the drug delivery solution for target glioblastoma?
CN109100504B (zh) 一种血小板-白细胞混合膜包被免疫磁珠及其制备方法与应用
CN116445404A (zh) 一种nk细胞来源的外泌体的制备及药物装载方法与应用
CN109651811A (zh) 磁性sf/pei纳米颗粒及其用途
CN113249321A (zh) 一种外周血nk细胞的培养方法
CN109012207B (zh) 一种循环肿瘤细胞富集的错流过滤系统

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination