KR20190101147A - 자연살해세포 유래의 엑소좀 유사 베지클을 포함하는 암 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 자연살해세포 유래의 엑소좀 유사 베지클을 유효성분으로 포함하는 암 개선 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로 상기 베지클은 암세포를 표적화하여 증식을 효과적으로 억제할 수 있다.

Description

자연살해세포 유래의 엑소좀 유사 베지클을 포함하는 암 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for treating cancer comprising exosome like vesicle derived from natural killer cell}

본 발명은 자연살해세포 유래의 엑소좀 유사 베지클(exosome like vesicle)을 유효성분으로 포함하는 암 개선 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

자연살해세포(natural killer cell, NK cell)는 선천면역세포 중의 하나로 암세포에 대해 선택적인 세포독성을 보이는 세포이다. 자연살해세포는 다른 면역세포와 달리 암세포를 즉각적으로 감지하여 바로 제거할 수 있는데 이것은 자연살해세포 표면에 존재하는 다양한 면역수용체(immune receptor)를 통해 암세포와 정상세포를 구분할 수 있기 때문이다. 많은 암환자의 경우 자연살해세포의 수나 항암활성에 결함이 발견되고 있으며 자연살해세포의 기능 이상은 이러한 암의 발생과 밀접한 관련을 가지고 있다고 알려져 있다.

자연살해세포가 세포를 살해하는 과정은 퍼포린(perforin) 및 그랜자임(granzyme)을 포함하는 세포질 과립의 배출과 FasL 및 TRAIL을 포함하는 과정과 관련되어 있다. 자연살해세포는 IFN-γ, INF-α, GM-CSF 및 IL-10과 같은 다양한 사이토카인을 분비하고, 세포 표면에 여러 수용체를 발현하는데 이들 수용체는 세포 흡착, 세포 살해능력의 활성화, 또는 세포 살해능력의 억제에 관여한다.

한편, 엑소좀(exosome)은 세포 내에서 자연적으로 만들어지는 나노 크기의 소포체로서, 단백질 및 유전적 정보를 포함하고 있어 세포 밖으로 유전정보를 포함한 다양한 신호를 다른 세포에 전달하여 발달과정, 증식, 분화, 면역조절, 혈관생성, 다양한 질병의 진행 등에 관여하고 있다. 생체 나노소포체(nanovesicle)인 엑소좀의 경우 면역반응을 피할 수 있고, 인체 적합성이 뛰어나며, 약물탑재 기능, 특정세포로의 표적전달 효과, 혈액 내 안정성 등의 장점을 통해 최근 약물 전달체로 큰 관심을 받고 있다. 그러나 자연적으로 만들어지는 엑소좀은 그 양이 매우 적고, 분리 및 정제 과정이 복잡한 단점이 있다.

본 발명자들은 상기 엑소좀의 단점을 개선하기 위하여 연구한 결과, 엑소좀보다 생산이 용이하고, 항암 효과를 가지는 엑소좀 유래의 베지클을 제조하여 본 발명을 완성하였다.

1. 대한민국 등록특허 제10-1762833호

본 발명의 목적은 자연살해세포 유래의 엑소좀 유사 베지클(exosome like vesicle)을 유효성분으로 포함하는 암 개선 또는 치료용 약학적 조성물과 암 진단용 조영제를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 양상은 자연살해세포 유래의 엑소좀 유사 베지클(exosome like vesicle)을 유효성분으로 포함하는 암 개선 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 명세서에 사용된 용어, '엑소좀 유사 베지클(exosome like vesicle)'은 자연살해세포에서 분비되는 엑소좀과 유사한 기능을 수행하는 막 구조 소낭체를 의미하며, 막 구조로 인하여 내부와 외부가 구분되고, 자연살해세포의 세포막 지질과 막 단백질 및 세포질 성분을 포함한다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 엑소좀 유사 베지클은 자연살해세포로부터 유래하며, 자연살해세포에서 분비되는 엑소좀보다 현저하게 많은 양을 분리할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 엑소좀 유사 베지클은 50 내지 200 ㎚ 크기일 수 있으며, 구체적으로 80 내지 140 ㎚ 크기를 가질 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 엑소좀 유사 베지클은 암세포의 아폽토시스(apoptosis)를 유도하고, 종양의 성장을 억제하므로 암 개선 또는 치료용 약학적 조성물 용도로 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 유효성분으로 엑소좀 유사 베지클을 포함하는 이외에 약제의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화 하여 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘(calcium carbonate), 슈크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있으며, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 다른 양상은 자연살해세포 유래의 엑소좀 유사 베지클(exosome like vesicle)을 유효성분으로 포함하는 암 진단용 조영제를 제공한다.

본 명세서에 사용된 용어, '조영제'는 진단을 목적으로 하여 인위적으로 대조도의 차이를 만들어 영상으로 나타낼 수 있도록 하기 위해 사용하는 물질이다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 엑소좀 유사 베지클은 암세포에 흡수되므로 엑소좀 유사 베지클과 형광 프로브, 나노입자 등을 결합시켜 암의 발병 여부, 성장 여부를 확인하는 조영제로 유용하게 이용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양상은 ⒜ 자연살해세포 현탁액을 멤브레인 필터로 압출시키는 단계; ⒝ 상기 압출된 현탁액을 이오딕사놀(iodixanol) 밀도구배를 이용하여 초원심분리하는 단계; 및 ⒞ 원심분리된 펠렛을 재현탁시키는 단계를 포함하는 자연살해세포 유래의 엑소좀 유사 베지클을 분리하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 ⒜ 단계는 자연살해세포 현탁액을 0.5 ㎛ 내지 7 ㎛ 크기의 폴리카보네이트 멤브레인 필터(polycarbonate membrane filters)로 압출시켜 수행할 수 있다. 예를 들어, 자연살해세포 현탁액을 5 ㎛ 및 1 ㎛ 크기의 폴리카보네이트 멤브레인 필터에 순차적으로 8회 압출시킬 수 있다. 순차적인 압출에 의하여 자연살해세포는 점차 작은 크기의 베지클로 분할되며, 최종적으로 엑소좀 유래의 베지클을 수득할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 ⒝ 단계의 초원심분리는 100,000g 내지 160,000g에서 1시간 내지 6시간 동안 수행될 수 있으며, 구체적으로 132,000g에서 4시간 동안 수행할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른, 자연살해세포에서 유래한 엑소좀 유사 베지클은 암세포를 표적화하여 증식을 효과적으로 억제할 수 있으므로 암 개선 또는 치료 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 인간 교모세포종(glioblastoma) 세포주에 effluc 유전자를 도입한 D54/F 세포에서 effluc 유전자의 발현 여부를 확인한 결과를 보여준다.
도 2는 D54/F 세포에서 루시퍼라제의 활성을 측정한 결과를 보여준다.
도 3은 자연살해세포로부터 엑소좀(NK-Exo) 또는 엑소좀 유사체(NK-EM)을 분리하는 방법을 개략적으로 보여준다.
도 4는 엑소좀 및 엑소좀 유사체에서 발현되는 단백질을 비교한 결과를 보여준다.
도 5는 엑소좀 및 엑소좀 유사체에 포함된 단백질의 양과 생성된 입자의 수를 비교한 결과를 보여준다.
도 6은 엑소좀 및 엑소좀 유사체의 형태를 투사 전자 현미경과 나노입자 트랙킹으로 분석한 결과를 보여준다.
도 7은 D54/F 세포에 대한 엑소좀 및 엑소좀 유사체의 세포 독성 여부를 확인한 결과를 보여준다.
도 8은 effluc 유전자를 도입한 MDA-MB-231/F, HepG2/F 및 CAL-62/F 세포에서 엑소좀 및 엑소좀 유사체의 세포 독성 여부를 확인한 결과를 보여준다.
도 9는 D54/F 세포에서 처리 농도에 따른 엑소좀 유사체의 세포 독성 수준을 확인한 결과를 보여준다.
도 10은 MDA-MB-231/F, HepG2/F 및 CAL-62/F 세포에서 처리 농도에 따른 엑소좀 유사체의 세포 독성 수준을 확인한 결과를 보여준다.
도 11은 D54/F 세포에 의한 엑소좀 및 엑소좀 유사체의 흡수 정도를 확인한 결과를 보여준다.
도 12는 엑소좀 및 엑소좀 유사체에서 FasL(Fas ligand)과 퍼포린(perforin)의 발현 수준을 확인한 결과를 보여준다.
도 13은 D54/F 세포에 FasL 억제제를 처리한 후 엑소좀 유사체의 세포 독성 수준을 확인한 결과를 보여준다.
도 14는 D54/F 세포에 엑소좀 유사체를 처리한 후 아폽토시스에 관련된 단백질의 발현 수준을 확인한 결과를 보여준다.
도 15는 마우스에 D54/F 세포를 주입하여 종양 발생을 유도한 후 엑소좀 유사체를 투여하여 엑소좀 유사체의 생체내 분포 정도를 확인한 결과를 보여준다.
도 16은 종양 발생을 유도한 마우스에 엑소좀 유사체를 투여하고, 장기를 분리하여 엑소좀 유사체의 흡수 정도를 확인한 결과를 보여준다.
도 17은 종양 발생을 유도한 마우스에 엑소좀 유사체를 투여하고, 장기를 분리하여 엑소좀 유사체의 흡수 정도를 그래프로 표시한 결과를 보여준다.
도 18은 종양 발생을 유도한 마우스에 엑소좀 유사체를 투여한 후 시간 경과에 따른 종양의 생장 정도를 확인한 결과를 보여준다.
도 19는 종양 발생을 유도한 마우스에 엑소좀 유사체를 투여한 후 시간 경과에 따른 종양의 생장 정도를 그래프로 표시한 결과를 보여준다.
도 20은 종양 발생을 유도한 마우스에 엑소좀 유사체를 투여한 후 장기를 분리하여 엑소좀 유사체의 흡수 정도를 확인한 결과를 보여준다.
도 21은 종양 발생을 유도한 마우스에 엑소좀 유사체를 투여한 후 종양의 크기 및 무게를 초음파 영상으로 확인한 결과를 보여준다.

이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실험 방법

1. 세포 배양

인간 자연살해세포(natural killer cell, 이하 NK 세포로 기재함) 세포주인 NK92-MI는 ATCC(American Type CultureCollection, Rockville, MD, USA)에서 구입하였다. NK92-MI는 2% 엑소좀-결핍 인간 혈청(exosomes-depleted humanserum; 120,000g에서 18시간 동안 초원심분리) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(Hyclone, Logan, UT, USA)이 첨가된 줄기세포 배양 배지(Cellgro, Freiburg, Germany)로 37℃ 및 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 엑소좀-결핍 인간 혈청은 120,000xg에서 인간 혈청을 18시간 동안 초원심분리하여 제조하였다. 인간 교모세포종(glioblastoma) 세포주 D54, 유방암 세포주 MDA-MB-231, 미분화 갑상선암(anaplastic thyroid cancer) 세포주 CAL-62 및 간암 세포주 HepG2는 10% 소혈청 배지(fetal bovine serum, FBS; Gibco) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 첨가된 DMEM 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium; Hyclone, Logan, UT, USA)에서 배양하였다.

상기 D54, MDA-MB-231, CAL-62 및 HepG2 세포주는 플라스미드를 포함하는 재조합 레트로바이러스로 형질전환시켜 형질전환 세포주(stable cell line)로 제작하였다. 상기 플라스미드는 LTR 프로모터(long terminal repeat promoter)에 의하여 작동되는 effluc(enhanced firefly luciferase) 유전자 및 Thy1.1 유전자를 포함한다. Thy1.1 양성 세포를 자성세포 분류(Magnetic-activated cell sorting, MACS; Miltenyi Biotec, Auburn,CA, USA)로 선별하여 effluc 및 Thy1.1 유전자 모두를 발현하는 세포를 분리하였다. Effluc 및 Thy1.1 유전자에 대한 이중 양성 세포를 분리한 후 RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction) 및 웨스턴 블롯을 수행하여 mRNA 및 단백질 수준에서 effluc 유전자의 발현 여부를 명확히 확인하였다.

확인 결과, 도 1에 나타난 바와 같이 Effluc 및 Thy1.1 유전자를 도입한 D54 세포에서 effluc 유전자가 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 도 1에서 A는 웨스턴 블롯 결과이고, B는 RT-PCR 결과이다.

이하에서, 형질전환된 세포주는 D54/F와 같이 세포주 명칭/F로 기재한다.

또한, 루시퍼라제 활성을 확인하기 위하여 D54 및 D54/F를 흑색 또는 투명 바닥의 96-웰 플레이트에 다양한 밀도(0, 0.25 x10⁴, 0.5 x10⁴, 1 x10⁴ 및 2x10⁴)로 접종하여 배양하였다. 24시간 후, D-루시페린(D-luciferin; 3 ㎎/㎖) 3 ㎕를 각각의 웰에 참가하고, IVIS LuminaIII imaging system(Perkin-Elmer, Wellesley, MA, USA)으로 루시퍼라제의 활성을 측정하였다.

측정 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 세포 밀도에 비례하여 형광 신호가 증가하는 것을 알 수 있었으며, 이는 D54/F 세포에서 루시퍼라제가 정상적으로 작동함을 의미한다.

2. 엑소좀 ( exosome ) 및 엑소좀 유사체( exosome mimetics )의 분리

NK92-MI 세포(크기 7 ㎛) 현탁액을 미니 압출기(mini-extruder; Avanti Polar Lipids, Birmingham, AL)를 이용하여 5 ㎛ 및 1 ㎛ 크기의 폴리카보네이트 멤브레인 필터(polycarbonate membrane filters; Nuclepore, Whatman, Inc., Clifton, NJ)에 순차적으로 8회 압출시켰다(extrude). 초원심분리 튜브(ultracentrifuge tube;Beckman Coulter, Brea, CA, USA)의 바닥에 10% 및 60% 이오딕사놀(iodixanol; OptiPrep?, Sigma-Aldrich, USA)을 각각 2 ㎖씩 넣고, 압출된 세포 현탁액 샘플 1 ㎖을 튜브에 첨가한 후 4시간 동안 초원심분리(132,000g 및 4℃)하였다. 엑소좀 유사체는 10% 이오딕사놀과 60% 이오딕사놀 사이의 경계층에 위치하므로 이를 분리한 후 1시간 동안 추가로 원심분리(100,000xg 및 4℃)하여 엑소좀 유사체 펠렛을 수득하였다. 수득한 펠렛을 0.22 ㎛ 필터로 여과하고, PBS에 재현탁시킨 후 -80℃에 보관하면서 실험에 이용하였다. 또한, 당업계에 알려진 방법에 따라 NK 세포로부터 엑소좀을 분리하였다. 이하에서, 엑소좀 유사체는 NK-EM으로 기재하고, NK 세포로부터 유래된 엑소좀은 NK-Exo로 기재하며, NK-Exo는 인 비트로(in vitro) 실험시 대조군으로 이용하였다.

도 3에 NK 세포로부터 엑소좀(NK-Exo) 또는 엑소좀 유사체(NK-EM)을 분리하는 방법을 개략적으로 도시하였다.

3. 엑소좀 유사체 및 엑소좀 분석

엑소좀성 성분(Exosomal formulations)에 대한 입자의 크기, 분포 및 수는 405 ㎚ 레이저가 구비된 NanoSight LM10 system(Nanosight Ltd., Amesbury, U.K.)으로 25℃에서 분석하였다. 이를 위하여, NK-EM 및 NK-Exo는 0.01 ㎎/㎖ 농도로 준비하고, NTA(Nanoparticle tracking analysis) 2.0 분석 소프트웨어가 구비된 장치에서 분석하였다. 또한, NK-EM과 NK-Exo의 생성량을 비교하기 위하여, NK 세포 5x10⁶개를 준비하여 동시에 NK-EM 및 NK-Exo를 분리하고, 총 단백질과 나노입자의 수를 확인하였다. 모든 실험은 1:1000으로 희석하여 10x10⁷/㎖의 입자 농도가 유지되도록 진행하고, 3번씩 반복실험하였다.

4. 웨스턴 블롯팅 (Western blotting)

웨스턴 블롯팅은 당 업계에 알려진 하기 방법에 따라 수행하였다. 세포 용해물(whole cell lysates), NK-EM 및 NK-Exo는 RIPA 버퍼(Thermo Scientific)에 준비하고, 50 ㎍/웰 농도의 단백질을 10% SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamidegel electrophoresis)로 분리하였다. 이후 단백질을 PVDF 막 (polyvinylidene difluoride membrane; Millipore)으로 이동시키고, 일차 항체 및 HRP(horseradish peroxidase)가 연결된 2차 항체와 순차적으로 반응시켰다. 단백질 밴드는 enhanced chemiluminescence(ELC) detection system (GE healthcare, Milwaukee, WI, USA)으로 제조사의 프로토콜에 따라 확인하였다. 이용한 일차 항체는 하기와 같다: CD63, GM130, Alix, cytochrome-c(Abcam), 퍼포린(perforin) 및 β-actin(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). 또한, Mem-PER? Plus Membrane Protein Extraction Kit (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA)로 FasL을 분리한 후 웨스턴 블롯팅으로 확인하였다.

또한, NK-EM을 처리한 종양세포에서 세포 사멸 및 세포 신호 전달 경로에 관여하는 단백질의 발현 변화를 확인하였다. 사용한 일차 항체는 하기와 같다: 카스파아제-3(caspase-3), 절단된 카스파아제-3(cleaved caspase-3), 절단된 PARP(cleaved (Poly (ADP-ribose) polymerase), cleaved PARP), 사이토크롬-C(cytochrome-C), ERK(phosphorylated extracellular signal-regulated kinases), 인산화된 ERK(p-ERK), AKT (phosphorylated protein kinase B) 및 인산화된 AKT (p-AKT).

5. 투사 전자 현미경(Transmission Electron Microscopy, TEM ) 관찰

분리된 NK-EM 및 NK-Exo를 글로우-방전 탄소-코팅 구리 그리드(glow-discharged carbon-coated copper grids; Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA)에 접촉시킨 후, 실온의 건조한 환경에서 20분 동안 흡착시켰다. 그리드를 2% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde, PFA)로 10분 동안 고정하고, 탈이온수(deionized water)를 떨어뜨려 세척하였다. 네거티브 백그라운드(negative background)를 제거하기 위하여 그리드와 1% 글루타르알데하이드(glutaraldehyde)를 15분 동안 반응시켜 염색하였다. 전자현미경 사진(Electron micrograph)은 HT 7700 transmission electron microscope (Hitachi, Tokyo, Japan)로 기록하였다.

6. NK - Exo 및 NK - EM의 세포 독성(cell cytotoxicity ) 여부 확인

6-1. BLI (bioluminescence imaging)

D54/F 세포를 무혈청 배지를 이용하여 96-웰 블랙 플레이트에서 배양하고, NK-EM 또는 NK-Exo를 10, 20 및 30 ㎍ 농도로 처리한 후 서로 다른 시간(24, 48 및 72시간) 동안 배양하였다. 이후 마이크로플레이트 리더기로 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 상기와 동일한 방법으로 MDA-MB-231/F, CAL-62/F 및 HepG2 세포와 서로 다른 농도의 NK-EM 또는 NK-Exo를 72시간 동안 접촉시킨 후 BLI를 수행하였다.

6-2. CCK -8 assay

D54/F 세포를 96-웰 블랙 플레이트에서 배양하고, NK-EM 또는 NK-Exo를 10, 20 및 30 ㎍ 농도로 처리한 후 서로 다른 시간(24, 48 및 72시간) 동안 배양하였다. 이후, CCK-8(Dojindo Molecular Technologies, Tokyo, Japan) 용액 10 ㎕를 각 웰에 첨가하여 가습 배양기에서 2시간 동안 추가로 배양하였다. 마이크로플레이트 리더기로 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 또한, MDA-MB-231/F, CAL-62/F 및 HepG2 세포와 서로 다른 농도의 NK-EM 또는 NK-Exo를 72시간 동안 접촉시킨 후 상기와 동일한 방법으로 CCK-8을 수행하였다.

7. NK - Exo 및 NK - EM의 세포 흡수 실험(cellular uptake assay)

플레이트에 NK-EM 및 NK-Exo 현탁액을 분주하고, fluorescent lipophilic tracer 2-(5-(1,3-dihydro-3, 3-dimethyl-1-octadecyl-2H-indol-2-ylidene)-1, 3-pentadienyl)-3, 3-dimethyl-1-octadecyl-perchlorate (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA; 이하, DiD로 기재함)를 첨가하여 실온에서 20분 동안 반응시켰다. 이후 플레이트를 PBS로 3회 세척하고, 상등액을 제거한 후 DiD가 표지된 NK-EM과 DiD가 표지된 NK-Exo(이하, 각각 DiD-NK-EM 및 DiD-NK-Exo로 기재함)를 PBS에 재현탁시켰다. DiD-NK-EM 또는 DiD-NK-Exo 30 ㎍을 D54/F 세포와 37℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 3시간 후 D54/F 세포를 PBS로 5회 세척하고, 4% PFA로 20분 동안 고정시켰다. 고정된 세포에 DAPI(4′, 6-diamidino-2-phenylindol)를 포함하는 Vectashield Mounting 용액 (Vector Laboratories, Burlingame,CA, USA)을 올리고, 공초점 레이저 현미경(confocal laser microscopy; Zeiss, LSM 800 with Airyscan, Germany)으로 관찰하였다.

8. 종양 마우스 모델에서 NK - EM의 분포 및 종양 표적 정도 확인

실험 동물은 6주령의 암컷 SFP(Specific pathogen-free) BALB/c 누드 마우스(Hamamatsu, Shizuoka, Japan)를 이용하고, 이종 종양 마우스 모델은 기존에 알려진 방법(Theranostics. 2017; 7(10):2732-2745)으로 제작하였다.

간략하게, D54/F 세포 5x10⁶개를 마우스의 피하에 주사하여 28일 동안 종양의 생장을 유도하고, DiD-NK-EM(총 단백질량 100 ㎍) 또는 PBS(phosphated bufferedsaline)를 마우스의 꼬리 혈관에 주사하였다. DiD-NK-EM의 FLI(Fluorescence lifetime imaging)는 인 비보 이미징 시스템(in vivo imaging system, IVIS)으로 확인하였다. 자동-형광 백그라운드(Auto-fluorescence background)는 NK-EM을 주입하지 않은 이미징 대조군 마우스를 이용하여 제거하였다. 24시간 후, 마우스에서 장기(비장, 간, 신장, 폐 및 심장)와 종양 조직을 회수하여 엑스 비보(ex vivo) FLI를 수행하고, 이미지를 획득하여 정량하였다.

9. NK - EM의 생체 내 항종양 효과 확인

D54/F 세포를 마우스 피하에 주사하고, 주사 후 10일 차에 무작위로 실험군 및 대조군의 두 그룹(n=5마리/그룹)으로 나누었다. 실험군 및 대조군에 Did-NK-EM 30 ㎍ 또는 PBS를 종양 내(intratumorally)에 3일마다 총 3회 주입하였다. 종양의 BLI는 Did-NK-EM 현탁액 투여 후 0일, 4일, 9일, 14일 및 19일 및 24일차에 확인하고, ultrasound 3-D imaging (S-Sharp Corporation, New Taipei City, Taiwan)으로 종양의 부피를 측정하였다. Did-NK-EM 현탁액 투여 후 24일차에 마우스를 희생시켜 엑스 비보 BLI 및 종양의 BLI를 확인하고, 종양의 무게를 측정하였다.

10. 통계 분석

모든 실험 결과는 평균±표준편차로 기재하고, 그룹 간 차이(Inter-group differences)는 양측 꼬리 스튜던트 t-test(two-tailed Student's t-test)로 검정하였다. P 수치가 <0.05일 때 통계적 유의성이 있는 것으로 판단하였다.

실험 결과

1. NK - EM의 특성 분석

NK 세포로부터 분리한 NK-Exo 및 NK-EM에 대하여 웨스턴 블롯팅을 수행한 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 NK-EM에 CD63 및 ALIX[ALG-2 (apoptosis-linked gene 2)-interacting protein X]라는 두 종류의 단백질이 포함되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 또한, NK-Exo와 달리 NK-EM에는 GM-130(cis-Golgi matrix protein of 130 kD), 사이토크롬-C 및 베타-액틴(β-actin)과 같은 세포내 단백질(cellular protein)이 풍부하게 존재하는 것을 확인할 수 있었다.

NK 세포 5x10⁶개를 이용하여 동시에 NK-EM 및 NK-Exo를 분리한 결과, 도 5의 A에 나타난 바와 같이 NK-EM은 18.68 ㎍의 단백질을 포함하고, NK-Exo 1.36 ㎍의 단백질을 포함하는 것을 확인할 수 있었다. 생성된 입자의 수를 비교한 결과, 도 5의 B에 나타난 바와 같이 NK-EM은 9.59x10⁷개가 생성되고, NK-Exo 1.86x10⁶개가 생성되어 NK-EM이 약 50배 정도 많이 생성된 것을 확인할 수 있었다. 도 5에서 ***은 p<0.001을 나타낸다.

분리한 NK-Exo와 NK-EM을 TEM으로 확인한 결과, 도 6의 A에 나타난 바와 같이 NK-Exo 및 NK-EM 모두 완전한 막 구조를 가지는 100 내지 150 ㎚ 크기의 구형 입자인 것을 알 수 있었다. 또한, 나노입자 트랙킹 분석(Nanoparticle tracking analysis, NTA) 결과, 도 6의 B에 나타난 바와 같이 NK-EM은 99.2±21.5 ㎚ 범위의 크기이고, NK-Exo는 118±33.1 ㎚ 범위의 크기인 것을 확인할 수 있었다.

2. NK - EM의 세포 독성 여부 확인

D54/F, MDA-MB-231/F, CAL-62/F 및 HepG2/F 세포에 서로 다른 농도의 NK-EM 또는 NK-Exo를 처리하여 배양한 후 BLI 및 CCK-8 어세이를 수행하였다.

실험 결과, 도 7에 나타난 바와 같이 D54/F 세포의 경우 NK-EM의 처리 농도 및 처리 시간이 증가할수록 BLI 신호 강도가 감소하여 세포 생존율이 감소한 것을 확인할 수 있었다. 또한, NK-Exo과 비교하여 48시간 및 72시간 동안 NK-EM을 처리한 실험군에서 세포 생존율이 유의하게 낮은 것을 확인할 수 있었다. 도 7에서 *은 p<0.05, **은 p<0.01 및 ***은 p<0.001을 의미하고, ##은 p<0.01 및 ###은 p<0.001을 나타내며, 이하 도면에서도 동일하다.

또한, 도 8에 나타난 바와 같이 MDA-MB-231/F, HepG2/F 및 CAL-62/F 세포에서도 10, 20 및 30 ㎍의 NK-EM을 72시간 동안 처리한 경우 BLI 신호 강도가 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

CCK-8 어세이 결과 또한 유사한 경향을 나타내었다. 도 9에 나타난 바와 같이, D54/F 세포에 NK-EM을 처리하여 48시간 또는 72시간 동안 배양한 경우 처리 농도 의존적으로 세포 생존율이 유의하게 감소하였다. 또한, 도 10에 나타난 바와 같이 MDA-MB-231/F, HepG2/F 및 CAL-62/F 세포에서도 NK-EM 처리에 의하여 농도 의존적으로 세포 생존율이 유의하게 감소하였다.

상기 BLI 및 CCK-8 어세이 결과를 통하여 NK-EM이 종양 세포에 대하여 세포 독성이 있음을 알 수 있다.

3. 종양 세포의 NK - EM 흡수(uptake) 확인

종양 세포의 NK-EM 흡수 정도를 확인하기 위하여, D54/F 세포에 DiD-NK-EM 또는 DiD-NK-Exo를 3시간 동안 처리한 후 공초점 레이저 현미경으로 D54/F 세포에서 염색된 부분을 확인하였다.

확인 결과, 도 11에 나타난 바와 같이 붉게 염색된 부분이 확인되어 NK-EM 및 NK-Exo가 세포 내로 흡수된 것을 알 수 있었다.

4. NK - EM에서 FasL 및 퍼포린(perforin)의 발현 분석

NK 세포는 용해성 과립(lytic granules)을 포함하는 세포독성 물질(cytotoxic effectors)을 방출하여 세포 독성을 나타내고, 동시에 FasL(Fas ligand)과 같은 막투과성 단백질을 세포 표면에 노출시켜 세포독성 물질 및 표적 세포를 유도한다. 따라서, NK-EM에 FasL 및 퍼포린이 존재하는지 확인하였다.

확인 결과, 도 12에 나타난 바와 같이 NK-EM 및 NK-Exo 모두에 FasL과 퍼포린이 존재하는 것을 확인할 수 있었다. 정량 분석한 결과, NK-Exo와 비교하여 NK-EM에서 FasL과 퍼포린의 양이 유의하게 많은 것을 알 수 있었다(p<0.001).

또한, NK-EM의 세포 독성이 FasL에 의한 것인지 평가하기 위하여 FasL 억제제의 효과를 확인하였다. 확인 결과, 도 13에 나타난 바와 같이 FasL 억제제인 AF-016(Kamiya Biomedical Company, USA)을 처리한 실험군에서 BLI 신호 강도가 증가하여 세포 생존율이 상승하는 것을 확인할 수 있었다(p<0.001).

5. NK - EM의 항종양 효과 기작 확인

NK 세포의 세포 사멸 작용은 크게 두 기작으로 이루어진다: 표적 세포 사멸 수용체[FasL 또는 TRAIL(tumornecrosis factor-related apoptosis-inducing ligand)-연관 수용체]의 응집 및 퍼포린/그랜자임(granzymes). 퍼포린과 그랜자임의 결합(combination)은 내재성 아폽토시스 경로(intrinsic apoptosis pathway)를 유도한다. 동시에, 사이토크롬-C와 사멸 수용체-매개 아폽토시스 (death receptor-mediated apoptosis)는 외재성 아폽토시스 경로(extrinsic apoptosis pathway)를 유도하고, 결과적으로 카스파아제-8, -3 및 PARP(Poly (ADP-ribose) polymerase)가 활성화되어 세포가 사멸된다.

NK-EM에 의한 세포 사멸 기작을 확인하기 위하여, 아폽토시스-연관 단백질과 세포 증식(cell proliferation)과 연관 있는 MAPK(mitogen-activated protein kinase) 및 PI3K (phosphatidylinositol-3-kinases) 신호전달 경로에 관여하는 단백질의 발현 수준을 웨스턴 블롯으로 확인하였다.

확인 결과, 도 14에 나타난 바와 같이 NK-EM 처리 24시간 후에 절단된 카스파아제-3, 절단된 PARP, 및 사이토크롬-C의 수준이 증가한 것을 확인할 수 있었다. 상기 실험 결과는 NK-EM이 외재성 및 내재성 아폽토시스 경로를 통하여 암세포의 아폽토시스를 유도할 수 있음을 의미한다.

또한, NK-EM 처리 24시간 후에 인산화된 ERK(phosphorylated extracellular signal-regulated kinases, p-ERK) 및 인산화된 AKT (phosphorylated protein kinase B, p-AKT)의 수준이 감소하였다. 상기 실험 결과는 NK-EM이 종양의 증식을 억제할 수 있고, NK 세포와 유사한 항암 효과가 있음을 의미한다.

6. 종양 마우스 모델에서 NK - EM의 분포 확인

마우스에 D54/F 세포를 주입하여 28일 동안 종양 발생을 유도하고, DiD-NK-EM 투여 24시간 후에 NK-EM의 생체내 분포를 확인하였다.

확인 결과, 도 15의 A에 나타난 바와 같이 D54/F 세포를 주입한 마우스에서 종양이 발생한 것을 확인할 수 있었으며, 도 15의 B에 나타난 바와 같이 종양이 발생한 부위에서 형광 신호가 현저히 강한 것을 알 수 있었다. 반면 D54/F 세포를 주입하지 않은 대조군(No tumor)에서는 동일 부위에서 형광 신호를 관찰할 수 없었다.

마우스의 생체내 장기에 대한 엑스 비보(ex vivo) 이미지를 측정한 결과, 도 16 및 도 17에 나타난 바와 같이 비장, 간, 신장 및 폐에서 형광 신호를 확인하여 NK-EM이 흡수된 것을 알 수 있었다. 대조군(No tumor)과 비교하여, D54/F 세포를 주입한 마우스는 간 및 비장에서 더 약한 형광 신호가 나타났고(간: p<0.001, 비장: p<0.05), NK-EM이 종양 조직에 흡수된 것을 확인할 수 있었다(p<0.001). 상기 실험 결과를 통하여, NK-EM이 종양 세포로 이동할 수 있음을 확인할 수 있었다.

7. 종양 마우스 모델에서 NK - EM의 항종양 효과 확인

마우스에 D54/F 세포를 주사하고, 10일 후에 Did-NK-EM을 주입하여 종양의 생장 정도를 확인하였다.

확인 결과, 도 18에 나타난 바와 같이 PBS를 주입한 대조군(PBS)과 비교하여 NK-EM을 투여한 실험군(NK-EM)에서 종양 생장이 현저하게 억제된 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 19에 나타난 바와 같이 Did-NK-EM 투여 5일 차까지는 대조군과 실험군 사이에 BLI 신호에 유의한 차이가 나타내지 않았으나, 투여 9일 차부터 실험군의 BLI 신호 강도가 대조군에 비해 유의하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다(p<0.001).

엑스 비보 BLI는 인 비보 BLI와 유사한 결과를 나타냈으며, 도 20에 나타난 바와 같이 실험군보다 대조군에서 BLI 신호가 약 4배 정도 강한 것을 확인할 수 있었다.

또한, 실험군과 대조군의 초음파 영상(ultrasound imaging)을 3-D 패턴으로 구축하여 정량 분석하였다. 분석 결과, 도 21에 나타난 바와 같이 대조군과 비교하여 실험군에서 종양의 부피 및 무게 모두 유의하게 감소한 것을 확인할 수 있었다. 구체적으로 실험군의 평균 종양 부피는 38 ㎜³이고, 대조군의 평균 종양 부피는 170 ㎜³였다(p<0.001). 또한, 종양 무게를 측정한 결과, 실험군의 종양 크기는 마우스당 평균 0.122 g이고, 대조군의 종양 크기는 마우스당 평균 0.45 g인 것을 확인하여 대조군의 종양이 약 3.75배 큰 것을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (7)

1. 자연살해세포 유래의 엑소좀 유사 베지클(exosome like vesicle)을 유효성분으로 포함하는 암 개선 또는 치료용 약학적 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 엑소좀 유사 베지클은 50 내지 200 ㎚ 크기인 것인 암 개선 또는 치료용 약학적 조성물.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 엑소좀 유사 베지클은 암세포의 아폽토시스(apoptosis)를 유도하는 것인 암 개선 또는 치료용 약학적 조성물.
   
4. 자연살해세포 유래의 엑소좀 유사 베지클(exosome like vesicle)을 유효성분으로 포함하는 암 진단용 조영제.
   
5. ⒜ 자연살해세포 현탁액을 멤브레인 필터로 압출시키는 단계;
   ⒝ 상기 압출된 현탁액을 이오딕사놀(iodixanol) 밀도구배를 이용하여 초원심분리하는 단계; 및
   ⒞ 원심분리된 펠렛을 재현탁시키는 단계를 포함하는 자연살해세포 유래의 엑소좀 유사 베지클을 분리하는 방법.
   
6. 제5항에 있어서, 상기 ⒜ 단계는 자연살해세포 현탁액을 0.5 ㎛ 내지 7 ㎛ 크기의 폴리카보네이트 멤브레인 필터(polycarbonate membrane filters)로 압출시키는 것인 자연살해세포 유래의 엑소좀 유사 베지클을 분리하는 방법.
   
7. 제5항에 있어서, 상기 ⒝ 단계의 초원심분리는 100,000g 내지 160,000g에서 1시간 내지 6시간 동안 수행하는 것인 자연살해세포 유래의 엑소좀 유사 베지클을 분리하는 방법.

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