KR101947785B1 - 섬유화 조직으로부터 정상 조직을 재생하기 위한 조성물 - Google Patents

섬유화 조직으로부터 정상 조직을 재생하기 위한 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 콜라겐-감소 물질을 포함하는 섬유화 조직으로부터 정상 조직 재생을 위한 약학적 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 섬유화 조직으로부터 정상조직의 치료적 재생을 가능하게 한다.

Description

섬유화 조직으로부터 정상 조직을 재생하기 위한 조성물{Composition for regenerating normal tissue from fibrotic tissue}
본 발명은 섬유화 조직으로부터 정상 조직을 재생하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
조직의 섬유화는 콜라겐을 중심으로 하는 세포 외 매트릭스가 조직에 과도하게 생산·축적되는 것으로 생긴다. 조직은 산화 스트레스, 저산소 상태, 염증, 세포사멸(apoptosis)등의 자극에 의해 손상을 받았을 경우, 손상 조직을 세포 외 매트릭스로 대체하여 회복을 도모하지만, 손상이 중증의 경우나 해당 자극이 만성화됐을 경우 등에는 세포 외 매트릭스의 축적이 과도하게 되어 조직이 그 기능을 충분히 완수할 수 없게 된다. 섬유화는 간, 췌장, 폐, 신장, 골수, 심장 등의 각종 장기에서 보여지며 근섬유모세포(myofibroblastic cell) 등의 콜라겐 생산 세포가 병태(病態)에 관여하고 있다고 생각되고 있다. 종래 섬유화는 불가역적인 현상이며, 일단 섬유화한 조직이 원래대로 돌아갈 수 없다고 생각되어 왔지만, 최근에는, 섬유화가 가역적인 것이며 상기 설명과 같은 섬유화 자극이 소실하면 조직에 축적한 세포 외 매트릭스가 감소하는 것을 시사하는 몇 개의 보고가 있다(비특허 문헌 1 내지 3 참조).
그렇지만, 병적인 세포 외 매트릭스의 축적이 감소한 후의 조직에서 구체적으로 무엇이 발생하는 지에 대한 상세한 보고는 없고, 해당 섬유화 조직으로 정상 조직의 재생이 일어나는 것도, 정상 조직의 재생을 일으킬 수 있는 것도 지금까지 전혀 알려지지 않았다.
　또한, 조직의 섬유화에는 바이러스 감염, 음주, 약물 등에 유래하는 섬유증 등 병인이 명확하고 그 제거가 가능한 것뿐만이 아니라, 직접적인 병인이 불명한 섬유증, 예를 들면, 특발성 간경변, 특발성 폐 섬유증, 특발성 골수 섬유증 등, 또는, 직접적인 병인은 알고 있지만, 그 병인의 원인이 불명한 것이나, 제거 곤란한 것, 예를 들면, 방사성 발전성 담즙성 간경변, 비알코올성 지방간염(NASH) 유래의 간 섬유증, 원발성 경화성 담관염 등도 포함된다. 이러한 병인의 제거가 곤란한 섬유화가 존재하는 조직은 끊임없이 섬유화 자극에 노출되어 있는 상태에 있지만, 해당 섬유화 조직에 대해 병적인 세포 외 매트릭스의 축적을 감소시킬 수 있는 것도, 더욱이 조직을 재생할 수 있는 것도 지금까지 전혀 알려지지 않았었다.
[비특허문헌 1] Issa et al., Gastroenterology. 2004;126(7):1795-808 [비특허문헌 2] Iredale, J Clin Invest. 2007;117(3):539-48 [비특허문헌 3] Sato et al., Nat Biotechnol. 2008;26(4):431-42
본 발명은 섬유화가 존재하는 조직에 대해 치료적으로 정상 조직을 재생하기 위한 조성물 및 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결할 수 있도록 열심히 연구를 계속하는 가운데, 섬유화 자극을 계속 받고 있는 섬유화 조직에서도 조직에 축적한 콜라겐을 감소시킬 수 있는 것과, 또한, 조직에 축적한 콜라겐을 제거하여 줄기세포가 증식·분화할 수 있는 공간을 확보하는 것으로 섬유화 조직으로부터 정상적인 조직을 재생할 수 있는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성시켰다.
상기와 같이, 섬유화 자극이 소실하면 조직에 축적한 세포 외 매트릭스가 감소할 수 있는 것은 알려져 있었지만, 섬유화 자극을 계속 받고 있는 섬유화 조직에 대해 조직에 축적한 콜라겐을 감소시킬 수 있는 것도, 조직에 축적한 콜라겐을 적극적으로 제거하는 것으로, 섬유화 조직으로부터 정상 조직을 재생할 수 있는 것도 지금까지 완전히 알려져 있지 않았고, 이것은 놀라운 결과이다.
따라서, 본 발명은 이하에 관한 것이다.
(1) 콜라겐 감소 물질을 포함하는 섬유화 조직으로부터 정상 조직을 재생하기 위한 약학적 조성물.
(2) 콜라겐 감소 물질은 콜라겐 생산 세포에 의한 콜라겐 생산을 억제하는 물질, 콜라겐의 분해를 촉진하는 물질 및 콜라겐 분해 저해 물질을 억제하는 물질로부터 구성되는 군으로부터 선택되는 상기(1)에 기재된 약학적 조성물.
(3) 섬유화 조직에서 콜라겐 생산 세포에 대한 표적화제를 더욱 포함하는 상기(1) 또는 (2)에 기재된 약학적 조성물.
(4) 표적화제가 레티노이드(retinoid)인 상기(3)에 기재된 약학적 조성물.
(5) 섬유화 조직이 섬유화 자극을 계속적으로 받고 있는 상기(1) 내지 (4)의 어느 하나에 기재된 약학적 조성물.
(6) 섬유화 조직에 축적된 콜라겐이 감소 되어 생성되는, 줄기세포의 증식·분화용의 공간에 있어, 섬유화 조직으로부터 정상 조직을 재생하기 위한 상기(1) 내지 (5)의 어느 하나에 기재된 약학적 조성물.
(7) 콜라겐 생산 세포에 의한 콜라겐 생산을 억제하는 물질은 TGF-β(Transforming growth factor beta) 저해 물질, HGF(Hepatocyte growth factor) 또는 이의 생산 촉진 물질, PPAR-γ(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma) 리간드, 안지오텐신(angiotensin) 저해 물질, PDGF(platelet-derived growth factor) 저해 물질, 릴렉신(relaxin) 또는 이의 생산 촉진 물질, 세포 외 매트릭스 성분의 생산·분비를 저해하는 물질, 세포 활성 억제 물질, 세포 증식 억제 물질 및 세포사멸(apoptosis) 유도 물질로부터 구성되는 군으로부터 선택되는 상기(2) 내지 (6)의 어느 하나에 기재된 약학적 조성물.
(8) 콜라겐의 분해를 촉진하는 물질은 콜라게나제(Collagenase) 또는 이의 생산 촉진 물질인 상기(2) 내지 (6)의 어느 하나에 기재된 약학적 조성물.
(9) 콜라겐 분해 저해 물질을 억제하는 물질은 TIMP(tissue inhibitor of metalloproteinases) 저해 물질인 상기(2) 내지 (6)의 어느 하나에 기재된 약학적 조성물.
본 발명에 의해 지금까지 정상 조직의 재생이 일어나지 않는다고 생각되고 있던 섬유화 조직으로부터 정상 조직을 재생할 수 있는 것을 확인하였다. 이것에 의해 섬유화 조직으로부터 정상 조직을 치료적으로 재생할 수 있게 되어 섬유화 질환의 새로운 재생 치료가 가능해진다.
또한, 본 발명에 의해 섬유화 자극에 계속적으로 노출되어 있는 섬유화 조직의 치료가 가능해지며 종래 유효한 치료법이 존재하지 않았던 섬유화 질환이나, 장기 이식밖에 치료법이 없었던 섬유화 질환을 포함한 모든 섬유화 질환의 내과적 치료가 실현되기 때문에 의료 및 수의학에 대한 지대한 공헌을 기대할 수 있다.
도 1은 피험 래트(rat)로부터 채취한 간의 전체 외관과 그 대표적 절편의 아잔 염색상을 나타낸 도이다.
도 2는 피험 래트로부터 채취한 간의 대표적 절편에서α-SMA의 위치를 나타낸 도이다.
도 3은 간의 줄기세포 이식 부위에서 DAPI 및 GFP의 분포를 나타낸 형광상이다.
도 4는 간의 줄기세포 이식 부위의 명시아상과 GFP 형광상이다.
도 5A는 VA-lip　siRNAgp46 투여군에서 DAPI, GFP의 형광상과 GFAP 항체에 의한 형광 염색상을 비교한 도이다(배율 200배).
도 5B는 VA-lip　siRNAgp46 투여군에서 DAPI, GFP의 형광상과 GFAP 항체에 의한 형광 염색상을 비교한 도이다(배율 400배).
도 6은 VA-lip　siRNAgp46 투여군에서 DAPI, GFP의 형광 사진과 α-SMA 항체에 의한 형광 염색상을 배율 200배로 비교한 도이다.
도 7은 VA-lip　siRNAgp46 투여군에서 DAPI, GFP의 형광 사진과 알부민 항체에 의한 형광 염색상을 배율 200배로 비교한 도이다.
도 8은 VA-lip　siRNAgp46 투여군에서 DAPI, GFP의 형광상과 CK19 항체에 의한 형광 염색상을 배율 200배로 비교한 도이다.
도 9A는 VA-lip　siRNAgp46 투여군에서 DAPI, GFP의 형광상과 ｖe-CAD 항체에 의한 형광 염색상을 비교한 도이다(배율 200배).
도 9B는 VA-lip　siRNAgp46 투여군에서 DAPI, GFP의 형광상과 ｖe-CAD 항체에 의한 형광 염색상을 비교한 도이다(배율 400배).
도 10은 VA-lip　siRNAgp46 투여군의 간의 줄기세포를 이식하지 않았던 부위에서 DAPI, GFP의 형광상과 알부민 항체에 의한 형광 염색상을 배율 200배로 비교한 도이다.
도 11은 래트 췌장세포에서 FAM 표지된 siRNA의 세포 내 분포(intracellular distribution)를 나타내는 형광상이다.
도 12는 래트 췌장세포에 편입된 siRNA에 관한 FACS 분석의 결과를 나타내는 그래프이다. 위로부터 순서대로 미처리군, Lip　siRNAgp46-FAM 처리군, VA-lip　siRNAgp46-FAM 처리군, VA-lip　siRNAgp46-FAM＋RBP 항체 처리군, Lip　siRNAgp46-FAM＋RBP 항체 처리군의 결과를 각각 나타낸다.
도 13은 siRNAgp46에 의한 래트 췌장세포에서 gp46의 발현 억제를 나타낸 웨스턴 플랏트 사진이다. A는 VA-lip　siRNAgp46의 농도에 의한 억제 효과의 차이를 나타내며 B는 억제 효과의 지속 시간을 나타낸다.
도 14는 미처리 세포 및 VA-lip　siRNAgp46 및 VA-lip　siRNArandom 각각으로 처리한 세포의 72시간 후의 콜라겐 생산량을 정량한 그래프이다.
도 15는 DBTC 처리 래트에서 췌장세포에의 VA-lip　siRNAgp46의 특이적 전달을 나타낸 도이다. A 및 B는 각각 VA-lip　siRNAgp46-FITC 및 Lip　siRNAgp46-FITC로 1일 간격으로 3회 처리한 래트의 췌장 절편의 항α-SMA 항체 및 항FITC 항체에 의한 면역 염색상이다. 우측의 a 내지 d의 염색사진은 좌측의 염색사진에서 대응하는 기호로 나타내지는 영역의 확대사진이다. C는 VA-lip　siRNAgp46-FITC로 1일 간격으로 3회 처리한 래트의 간 절편의 아잔-마로리 염색, 항α-SMA 항체 염색 또는 항-FITC 항체 염색에 의한 염색상이다. D 내지 F는 VA-lip siRNAgp46-FITC를 정맥 내 투여한 24시간 후의 래트의 폐, 비장 및 망막을 항CD68 항체 또는 항-FITC 항체로 염색한 염색상이다.
도 16은 DBTC 처리 후 14일째에, VA-lip　siRNAgp46(siRNA　0.75mg/kg)를 투여한 래트의 VA-lip　siRNAgp46 투여 후 0, 1, 2, 3 및 4일째의 췌장에서 gp46 단백질의 발현을 나타낸 도이다. A는 췌장 세포 파쇄물의 웨스턴 블랏팅의 결과를 나타내며 B는 β-엑틴으로 표준화한 정량적 농도 분석의 결과를 나타낸다.
도 17은 DBTC 유도성 췌장섬유증에서 VA-lip　siRNAgp46의 효과를 나타낸 도이다. A는 VA-lip　siRNAgp46, Lip　siRNAgp46 또는 PBS를 10회 투여한 DBTC 처리 래트의 췌장 절편의 아잔-마로리(Azan-Mallory) 염색 사진을 나타낸다. B는 A의 아잔-마로리 염색상에 있어서 양성을 나타낸 영역을 컴퓨터 이미지(image) 분석에 의해서 정량한 그래프이다. 데이터는 각 군 6마리의 래트로부터 무작위 추출한 6개 시야에서 계산하여 평균치±표준 편차로 나타내고 있다. C는 췌장에서 히드록시프롤린(hydroxyproline)의 함유량을 나타낸 그래프이다. 데이터는 평균치±표준 편차로 나타내고 있다.
도 18은 DBTC 유도성췌장섬유증에서 VA-lip　siRNAgp46의 효과를 나타낸 도이다. A는 VA-lip　siRNAgp46 처리 후의 DBTC 처리 래트의 췌장에서 α-SMA 염색상을 나타낸다. B는 A에서α-SMA 양성 영역을 컴퓨터 이미지(image) 해석에 의해서 정량화한 그래프이다. 데이터는 각 군 6마리의 래트로부터 무작위 추출한 6개 시야에서 계산하여 평균치±표준 편차로 나타내고 있다.
도 19는 VA-lip　siRNAgp46에 의한 섬유화 췌장조직으로부터의 정상 조직의 재생을 나타낸 그림이다. A는 DBTC 처리 래트에게 VA-lip　siRNAgp46(오른쪽) 및 Lip　siRNAgp46(왼쪽)를 10회 투여한 후의 췌장의 헤마토실린-에오신 염색상을 나타낸다. 상부 도면은 하부 도면의 각각 a 및 b 영역의 확대도이다. B는 DBTC 처리 래트의 췌장 중량을 나타낸 그래프이다.
도 20은 줄기세포 주위의 공간의 유무가 줄기세포의 분화에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다. 세로축은 알부민 양성 콜로니의 면적을 나타낸다.
도 21은 줄기세포 주위의 공간의 유무가 줄기세포의 증식에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다. 세로축은 줄기세포의 증식율의 지표를 나타낸다.
본 발명은 콜라겐(collagen) 감소 물질을 포함하는 섬유화 조직으로부터 정상 조직을 재생하기 위한 조성물에 관한 것이다.
　본 발명에 있어서「콜라겐 감소 물질」이란 조직에 축적한 콜라겐의 양을 감소할 수 있는 임의의 물질을 의미한다. 특정의 이론에 제한되는 것을 의도하는 것은 아니지만, 섬유화 조직에서 콜라겐 축적은 콜라겐의 생산과 분해의 밸런스가 생산 쪽에 치우치는 것이 한 요인이라고 생각되고 있기 때문에, 콜라겐 감소 물질은 콜라겐의 생산을 억제하는 물질뿐만이 아니라, 콜라겐의 분해를 촉진하는 물질이나 상기 물질을 저해하는 물질을 억제하는 물질도 포함할 수 있다. 따라서, 콜라겐 감소 물질을 한정하지 않고, 예를 들면, 콜라겐 생산 세포에 의한 콜라겐 생산을 억제하는 물질, 콜라겐의 분해를 촉진하는 물질 및 콜라겐 분해 저해 물질을 억제하는 물질 등을 들 수 있다. 본 발명에서 콜라겐은 특히 한정되지 않지만, 섬유화에 관여하는 콜라겐, 예를 들면, I, III, V형 콜라겐 등이 바람직하고, 섬유화 조직에 가장 다량으로 존재하는 I형 콜라겐이 특히 바람직하다.
본 발명에 있어서 콜라겐 생산 세포는 섬유화 조직에 있어서 콜라겐을 생산하는 임의의 세포를 의미하며, 한정되지 않고, 예를 들면, 활성화별세포, 근섬유모세포(myofibroblastic cell) 등을 포함한다. 활성화별세포 및 근섬유모세포(myofibroblastic cell)는 섬유화 조직에서 주요한 콜라겐 생산원이라고 생각되고 있고 있어 α-SMA(α-평활근 엑틴(alpha smooth muscle Actin))의 발현을 특징으로 하고 있다. 따라서, 본 발명에서 활성화별세포 및 근섬유모세포(myofibroblastic cell)는 검출 가능하게 표지된 항α-SMA 항체를 이용한 면역 염색 등에 의해서 동정(同定)되는 것이다.
콜라겐 생산 세포에 의한 콜라겐 생산을 억제하는 물질은 섬유화 조직에서 콜라겐 축적에 관계하는 동일 세포의 물리적, 화학적 및/또는 생리적인 작용 등을 직접 또는 간접에 억제하는 임의의 약물을 포함하며, 한정되지 않고, 예를 들면, TGF-β(Transforming growth factor-beta) 저해 물질, HGF(Hepatocyte growth factor) 또는 이의 생산 촉진 물질, PPAR-γ(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma) 리간드, 안지오텐신(Angiotensin) 저해 물질, PDGF(Platelet-derived growth factor) 저해 물질, 릴렉신(Relaxin) 또는 이의 생산 촉진 물질, 세포 외 매트릭스 성분의 생산·분비를 저해하는 물질, 세포 활성 억제 물질, 세포 증식 억제 물질, 세포사멸(apoptosis) 유도 물질 등을 포함한다.
TGF-β저해 물질을 한정하지 않고, 예를 들면, 절단형 TGF-βII형 수용체(Qi et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1999;96(5):2345-9), 가용성 TGF-βII형 수용체(George et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1999;96(22):12719-24), 항-TGF-β항체 등의 TGF-β활성 저해 물질이나, TGF-β에 대한 RNAi 분자, 리보자임(Ribozyme), 안티센스 핵산 등의 TGF-β 생산 저해 물질, 이들을 발현하는 벡터, 및 이들로 형질 전환된 세포 등을 들 수 있다. 본 발명의 한 형태에 있어서 TGF-β저해 물질은 TGF-β1의 활성 및/또는 생산을 저해한다.
HGF 또는 릴렉신(relaxin)의 생산 촉진 물질을 한정하지 않고, 예를 들면, HGF 또는 릴렉신을 코드 하는 핵산, 이것을 포함한 발현 구축물, 이것들을 포함한 발현 벡터 및 이것들로 형질 전환된 세포 등을 들 수 있다.
　PPAR-γ 리간드는, 한정하는 일 없이, 예를 들면, 15-데옥시-Δ12, 14-프로스타글란딘 J2(15-deoxy-delta12,14-prostaglandin J2), 니트로 리놀산(Nitrolinoleic acid), 산화 LDL(Low density lipoprotein), 장쇄지방산(long-chain fatty acid), 에이코사노이드(eicosanoid) 등의 내인성 리간드 또는, 트로그리타존(troglitazone), 피오그리타존(Pioglitazone), 로시그리타존(rosiglitazone), 바라그리타존(Balaglitazone), 리보그리타존(rivoglitazone) 등의 티아조리딘디온(thiazolidinedione;TZD)계 약제, 비스테로이드성 항염증약 등의 외인성 리간드 등을 들 수 있다.
안지오텐신 저해 물질을 한정하지 않고, 예를 들면, 테르미사르탄(telmisartan), 로사르탄(losartan), 바르사르탄(valsartan), 칸데사르탄 시렉세틸(candesartan cilexetil), 올메사탄메독소밀(Olmesartan medoxomil), 이르베사르탄(irbesartan) 등의 안지오텐신 수용체 대항 물질 등을 들 수 있다. 안지오텐신에는, 안지오텐신 I, II, III 및 IV가 포함된다. 또한, 안지오텐신 수용체는 한정하지 않고, 예를 들면, 안지오텐신 1형 수용체(AT1) 등을 들 수 있다.
PDGF 저해 물질은 한정하지 않고, 예를 들면, 항PDGF 항체 등의 PDGF 활성 저해 물질이나, PDGF에 대한 RNAi 분자, 리보자임, 안티센스 핵산 등의 PDGF 생산 저해 물질, 이들을 발현하는 벡터, 및 이들로 형질 전환된 세포 등을 들 수 있다.
세포 외 매트릭스 성분의 생산·분비를 저해하는 물질은 한정하지 않고, 예를 들면, 콜라겐(Collagen), 프로테오그리칸(Proteoglycan), 테나신(tenascin), 피브로넥틴(Fibronectin), 트롬보스폰딘(thrombospondin), 오스테오폰틴(Osteopontin), 오스테오넥틴(osteonectin), 엘라스틴(Elastin) 등의 세포 외 매트릭스 성분의 발현을 억제하는, RNAi 분자, 리보자임, 안티센스 핵산 등의 물질, 혹은 도미넌트 네가티브(Dominant negative) 변이체 등의 도미넌트 네가티브 효과를 가지는 물질, 이들을 발현하는 벡터, 및 이들로 형질 전환된 세포 등을 들 수 있다. 콜라겐의 생산·분비를 저해하는 약물은, 한정되지 않고, 예를 들면, 여러가지 타입의 콜라겐의 합성 과정에서 공통되는 세포 내 수송 및 분자 성숙화에 필수인 콜라겐 특이적 분자 샤페론(chaperone)인 HSP(Heat shock protein) 47의 저해 물질, 예를 들면, HSP47에 대한 RNAi 분자, 리보자임, 안티센스 핵산 등의 HSP47 발현 저해 물질, 혹은 HSP47의 도미넌트 네가티브 변이체 등의 도미넌트 네가티브 효과를 가지는 물질, 이들을 발현하는 벡터, 및 이들로 형질 전환된 세포 등을 들 수 있다.
세포 증식 억제 물질은, 한정하지 않고, 예를 들면, 알킬화제(예를 들면, 이포스파미드(ifosfamide), 니머스틴(nimustine), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 다카르바진(dacarbazine), 메르파란(melphalan), 라니머스틴(ranimustine) 등), 항종양성 항생 물질(예를 들면, 이다루비신(idarubicin), 에피루비신(epirubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 피라루비신(pirarubicin), 블레오마이신(bleomycin), 페플로마이신(peplomycin), 미토산트론(mitoxantrone), 마이토마이신 C(mitomycin C) 등), 대사 길항제(예를 들면, 겜시타빈(gemcitabine), 에노시타빈(enocitabine), 사이타라빈(cytarabine), 테가푸르-우라실(tegafururacil), 테가푸르-기메라실-오테라실 칼륨(tegafur-gimeracil-oteracil potassium) 배합제, 독시플루리딘(doxifluridine), 하이드록시카르바미드(hydroxycarbamide), 플루오르우라실(fluorouracil), 메도트렉세이트(methotrexate), 메르캅토퓨린(mercaptopurine) 등), 에토포사이드(etoposide), 이리노테칸(irinotecan), 비노렐빈(vinorelbine), 도세탁셀(docetaxel), 파클리탁셀(paclitaxel), 빈크리스틴(vincristine), 빈데신(vindesine), 빈블라스틴(vinblastine) 등의 알카로이드(alkaloid) 및 카보플라틴(carboplatin), 시스플라틴(cisplatin), 네다플라틴(nedaplatin) 등의 백금 착체, 로바스타틴(lovastatin), 심바스타틴(simvastatin) 등의 스타틴(statin) 등을 들 수 있다.
세포 활성 억제 물질은, 한정하는 일 없이, 예를 들면, 나트륨 채널 저해 물질 등을 들 수 있다.
세포사멸(apoptosis) 유도제는, 한정하지 않고, 예를 들면, compound 861(Cpd861), 글리오톡신(Gliotoxin), 아토르바스타틴(Atorbastatin) 등을 들 수 있다.
콜라겐의 분해를 촉진하는 물질은, 한정하지 않고, 예를 들면, 여러 가지의 콜라게나제(collagenase) 또는 이의 생산 촉진 물질 등을 들 수 있다. 콜라게나제의 예로서, 한정되지 않고 , 예를 들면, MMP(Matrix metalloproteinase) 1, 2, 3, 9, 13, 14등의 MMP 계열(family) 등을 들 수 있다. 콜라게나제의 생산 촉진 물질로서는, 한정하지 않고, 예를 들면, 콜라게나제를 코드 하는 핵산, 이것을 포함하는 발현 구축물, 이들을 포함한 발현 벡터 및 이들로 형질 전환된 세포 등을 들 수 있다.
콜라겐의 분해를 촉진하는 물질을 저해하는 물질은, 한정하지 않고, 예를 들면, TIMP(Tissue inhibitor of metalloproteinase, TIMP1 및 TIMP2등)를 들 수 있다. 따라서, 상기 물질을 저해하는 물질은, 한정하지 않고, 예를 들면, TIMP에 대한 항체 등의 TIMP 활성 저해 물질, TIMP에 대한 RNAi 분자, 리보자임, 안티센스 핵산등의 TIMP 생산 저해 물질, 이것들을 발현하는 벡터 및 이것들로 형질 전환된 세포 등을 들 수 있다.
본 발명에서 RNAi 분자에는 siRNA(small interfering RNA), miRNA(micro RNA), shRNA(short hairpin RNA), ddRNA(DNA-directed RNA), piRNA(Piwi-interacting RNA), rasiRNA(repeat associated siRNA)등의 RNA 및 이러한 개변체도 포함된다. 또한, 본 발명에서 핵산은 RNA, DNA, PNA, 또는 이들의 복합물을 포함한다.
본 발명에 대해 「섬유화 조직」이란 콜라겐을 중심으로 하는 세포 외 매트릭스가 정상보다 많이 축적된 조직을 의미한다. 세포 외 매트릭스로는 콜라겐 이외, 한정하지 않고, 예를 들면, 프로테오글리칸(Proteoglycan), 테나신(tenascin), 피브로넥틴(Fibronectin), 트롬보스폰딘(thrombospondin), 오스테오폰틴(Osteopontin), 오스테오넥틴(osteonectin), 엘라스틴(Elastin) 등을 들 수 있다. 조직에 축적한 콜라겐의 양은, 예를 들면, 조직중의 히드록시프롤린(hydroxyproline)의 양을 지표로 하거나 조직에 콜라겐 염색(예를 들면, 매슨·트리크롬 염색(Masson trichrome stain), 아잔 염색(Azan stain), 시리우스 레드 염색(Sirius red stian), 에라스티카 반 기에슨 염색(Elastica van Gieson stain;EVG) 등)을 실시하여 이미지 분석하는 것 등에 의해 정량화할 수 있다. 본 발명에서 섬유화 조직에서 세포 외 매트릭스의 양은 정상 조직에 비해, 5% 이상, 10% 이상, 25% 이상, 50% 이상, 100% 이상, 200% 이상, 300% 이상, 400% 이상 또는 500% 이상이어도 좋다. 조직의 섬유화에는 활성화별세포 및/또는 근섬유모세포(myofibroblastic cell)에 의한 콜라겐의 생산이 기여하고 있다고 생각되기 때문에, 본 발명에서 섬유화 조직은 전형적으로는 활성화별세포 및/또는 근섬유모세포(myofibroblastic cell)를 포함하고 있다. 섬유화 조직은 상기의 특징을 가지고 있으면, 체내의 어느 조직이어도 좋고, 한정되지 않고, 예를 들면, 간, 췌장, 폐, 신장, 골수, 성대, 후두, 구강, 심장, 비장, 종격, 후복막, 자궁, 피부, 유선, 장관 등을 포함한다.
따라서, 섬유화 조직은 여러 가지의 장기 섬유증의 환부여도 좋다. 장기 섬유증의 예는 한정하지 않고, 예를 들면, 간 섬유증, 간경변, 성대반흔형성, 성대 점막 섬유증, 후두의 섬유화, 폐 섬유증, 췌장 섬유증, 골수 섬유증, 심근경색, 심근경색 후의 심근의 섬유화, 심근 섬유증, 심내막심근 섬유증, 비장 섬유증, 종격 섬유증, 혀점막 아래 섬유증, 장관 섬유화(예를 들면, 염증성장질환을 수반하는 것 등), 후복막섬유증, 자궁 섬유증, 강피증, 유선 섬유증 등을 들 수 있다.
본 발명에서 간 섬유증 및 간경변은, B형 및 C형 간염 바이러스 등의 바이러스 감염, 음주, 지방간, 기생충 감염, 선천성 대사이상, 간독성 물질 등에 기인하는 것 뿐만이 아니라, 원인이 특정되어 있지 않은 것도 포함한다. 따라서, 본 발명에서 간경변은 한정되지 않고, 예를 들면, 샤르코트(Charcot) 간경변, 토드(Todd) 간경변, 원발성 담즙성 간경변, 단엽성 간경변, 속발성 담즙성 간경변, 폐색성 간경변, 담세관성 간경변, 담즙성 간경변, 위축성 간경변, 영양성 간경변, 괴사후성 간경변, 간염 후 간경변, 결절성 간경변, 혼합형 간경변, 소결절성 간경변, 대상성 간경변, 대결절성 간경변, 중격성 간경변, 특발성 간경변, 비대상성 간경변, 문맥 주위성 간경변, 문맥성 간경변, 알코올성 간경변 등을 포함한다.
본 발명에 있어 폐 섬유증은 협의의 폐 섬유증 뿐만 아니라, 간질성 폐렴과의 병존을 포함하는 광의의 폐 섬유증을 포함한다. 본 발명에서 폐 섬유증은 임의의 간질성 폐렴, 예를 들면, 바이러스성 폐렴, 진균성 폐렴, 마이코플라즈마 폐렴 등에 따른 감염성 간질성 폐렴, 관절 류머티즘, 전신성 강피증, 피부 근염, 다발성 근염, 혼합성 결합 조직병(MCTD,Mixed connective tissue disease)등의 교원병에 따른 간질성 폐렴, 방사선 노출에 따른 간질성 폐렴, 블레오마이신(bleomycin) 등의 항암제, 쇼사이코탕(小柴胡湯) 등의 한방약, 인터페론, 항생 물질, 파라코트(paraquat) 등에 의한 약제성 간질성 폐렴, 특발성 폐 섬유증, 비특이성 간질성 폐렴, 급성간질성 폐렴, 특발성 기질화 폐렴, 호흡세기관지염 관련성 간질성 폐질환, 박리성 간질성 폐렴, 임파구성 간질성 폐렴 등의 특발성 간질성 폐렴 등에 기인할 수 있어서, 이러한 간질성 폐렴이 만성화한 것을 포함한다.
본 발명에 대해 골수 섬유증은 원발성 골수 섬유증뿐만 아니라, 2차성 골수 섬유증도 포함한다. 2차성 골수 섬유증은 한정되지 않고, 급성 골수성 백혈병, 급성 임파성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 진성 적혈구 증가증, 원발성 혈소판혈증, 골수 이형성증후군, 다발성 골수종, 악성 임파종, 암종양, 전신성 에리테마토서스(systemic lupus erythematosus;SLE), 전신성 진행성 경화증 등의 질환이나, 방사선 조사 등에 의해 속발하는 것을 포함한다.
본 발명에서 신장 섬유증은 임의의 간질성 신장염, 예를 들면, 연쇄 구균 신장염, 포도상구균 신장염, 폐렴 구균 신장염, 수두, B형 간염, C형 간염, HIV 등에 의한 바이러스성 신장염, 말라리아 등의 기생충 감염에 의한 신장염, 진균성 신장염, 마이코플라즈마 신장염 등에 따른 감염성 간질성 신장염, 전신성 에리테마토서스(루프스 신장염), 전신성 강피증(신장 교원병), 쉐글렌 증후군 등의 교원병에 따른 간질성 신장염, 자반병성 신장염, 다발성 동맥염, 급속 진행성 사구체신염 등의 혈관의 면역 질환에 따른 신염, 방사선 노출에 따른 동안질성 신장염, 금 제재, NSAIDs, 페니실라민, 블레오마이신(bleomycin) 등의 항암제, 항생 물질, 파라코트 등에 의한 약제성 간질성 신장염, 곤충의 자상, 화분, 옻과의 식물 등에 의한 알레르기성 신장염, 아밀로이드시스(Amyloidosis) 신염, 당뇨병성 신증, 만성 사구체신염, 악성신장 경화증, 다발성 낭포신증 등에 수반하는 신장염, 요세관간질성 신장염, 임신 중독증이나 암에 수반하는 신장염, 막성 증식성 사구체신염, IgA 신증, 혼합형 저온형 글로블린혈증신장염(mixed cryoglobulinemia), 굿패스처-증후군(Goodpasture's syndrome;GPS) 신장염, 베게너 육아종증 신염, 급성간질성 신장염 등의 특발성 간질성 신장염 등에 기인할 수 있어서, 이러한 간질성 신장염이 만성화한 것을 포함한다.
본 발명의 한 형태에 있어서 섬유화 조직은 섬유화 자극을 계속적으로 받고 있는 것이다. 본 발명에 대해 섬유화 자극은 섬유화를 유도하는 임의의 자극을 의미하여, 한정하지 않으며, 예를 들면, 산화 스트레스, 저산소 상태, 염증, 세포사멸(apoptosis)등을 포함한다(Ghiassi-Nejad et al., Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 2008;2(6):803-16참조). 해당 조직으로는, 예를 들면, 만성 염증을 일으키고 있는 섬유화 조직이나, 세포 장해성 물질에 끊임없이 노출되어 있는 조직(예를 들면, 담관 질환등에 의해 담즙의 울체가 일어나고 있는 간조직)등을 들 수 있다. 또한, 해당 조직에는 직접적인 병인이 불명한 섬유증, 예를 들면, 특발성 간경변, 특발성 폐 섬유증, 특발성 골수 섬유증 등, 또는, 직접적인 병인은 알고 있지만, 그 병인의 원인이 불명한 것이나, 제거 곤란한 것, 예를 들면, 원발성 담즙성 간경변, 비알코올성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis;NASH) 유래의 간 섬유증, 원발성 경화성 담관염, 특발성 폐 섬유증, 특발성 간질성 폐렴 유래의 폐 섬유증, 원발성 골수 섬유증, 특발성 간질성 신장염 유래의 신장 섬유증, 염증성 장질환(예를 들면 만성 크론병, 궤양성 대장염 등), 전신성 강피증 등으로 이환한 조직 등도 포함된다.
본 발명에 있어 「섬유화 조직으로부터 정상 조직을 재생한다」는 섬유화에 의해서 변질한 조직을, 적어도 섬유화가 보다 경도인 상태로 회복시키는 것을 의미한다. 즉, 섬유화가 진행되는 것에 따라, 조직은 세포 외 매트릭스를 중심으로 한 섬유 조직으로 치환되어 가지만, 이 흐름을 역전시켜, 증식한 섬유 조직을 본래의 정상 조직으로 치환해 가는 것이 본 발명에서 섬유화 조직으로부터의 정상 조직의 재생이다. 따라서, 본 발명에서 섬유화 조직으로부터의 정상 조직의 재생은 섬유화 조직을 완전하게 원 상태로 회복시키는 것뿐만 아니라, 섬유화 조직을 부분적으로 원래 상태에 회복시키는 것도 포함한다. 정상 조직의 재생 정도는, 생검 시료 등의 조직학적 검사에 의해, 조직 구조의 정상화, 섬유 조직이 차지하는 영역의 축소, 정상 조직이 차지하는 영역의 확대 등에 기초를 두어 평가해도 좋고, 본 발명의 조성물에 의한 처리 전에 섬유화에 기인하는 생화학적 지표의 이상이 인정되고 있는 경우에는, 해당 지표의 개선 등에 의해서 평가해도 좋다.
본 발명의 한 형태에 있어서 정상 조직의 재생은 섬유화 조직에 축적된 콜라겐의 감소에 의해 생성된 스페이스에 있어, 줄기세포가 증식·분화하는 것으로 생기는 것이어도 좋다. 따라서, 본 발명의 한 형태는 섬유화 조직에 축적된 콜라겐이 감소 되어 생성되는, 줄기세포의 증식·분화용의 스페이스에 있어, 섬유화 조직으로부터 정상 조직을 재생하기 위한 상기 의약 조성물에 관한 것이다. 여기서, 줄기세포에는, 한정하지 않고, 예를 들면, 섬유화한 조직에 본래 존재하는 것(간 줄기세포, 췌장 줄기세포, 폐 줄기세포, 신장 줄기세포, 골수 줄기세포, 심장 줄기세포, 비장 줄기세포, 자궁 줄기세포, 피부 줄기세포, 유선 줄기세포, 장관 줄기세포, 간엽계 줄기세포 등)나, 체내의 다른 장소로부터 이동해 온 것, 또한, 치료적으로 투여한 것 등이 포함된다. 또한, 「스페이스」는 조직 내의 공극뿐만 아니라, 세포가 확대·증식 할 수 있는 여지가 있는 공간, 예를 들면, 세포 간의 압력이 감소된 공간이나, 유연성을 가지는 공간 등을 포함한다.
본 발명의 조성물은, 그 한 형태에 있어서, 섬유화 조직에서 콜라겐 생산 세포에 대한 표적화제를 한층 더 포함한다. 표적화제를 포함하는 것으로, 콜라겐 생산 세포를 표적으로 하는 콜라겐 감소 물질, 예를 들면, 한정되지 않고 , 세포 외 매트릭스 성분의 생산·분비를 저해하는 물질, HGF 또는 그 생산 촉진 물질, MMP 또는 그 생산 촉진 물질, TIMP 저해 물질, TGF-β생산 저해 물질, 릴렉신 또는 그 생산 촉진 물질등을, 표적 세포인 콜라겐 생산 세포에 특이적으로 전달하는 것이 가능해져, 사용하는 콜라겐 감소 물질의 효과를 높일 수 있다.
본 발명의 한 형태에 있어서, 콜라겐 생산 세포에 대한 표적화제는 레티노이드이다. 레티노이드에 의한 표적화 기구는 아직 완전하게 해명되어 있지 않지만, 예를 들면, RBP(Retinol binding protein)와 특이적으로 결합한 레티노이드가, 섬유화 조직에서 콜라겐 생산 세포의 세포 표면상에 위치하는 어떤 종류의 리셉터를 통하여 상기 세포에 편입되는 것을 생각할 수 있다. 레티노이드가 콜라겐 생산 세포의 표적화제로서 기능 할 수 있는 것은, WO 2006/068232, 특개 2009-221164, 특개 2010-59124등에 기재되어 있다.
레티노이드(retinoid)는 4개의 이소프레노이드(isoprenoid) 단위가 헤드-투-테일(head-to-tail)식으로 연결한 골격을 가지는 화합물 군의 일원이며(G. P. Moss, “Biochemical Nomenclature and Related Documents,” 2nd Ed. Portland Press, pp. 247-251 (1992)를 참조), 비타민 A는 레티놀(retinol)의 생물학적 활성을 정성적으로 보이는 레티노이드의 일반적인 기술자(記述子)이다. 본 발명에 있어 이용할 수 있는 레티노이드는 특히 한정되지 않고, 예를 들면 레티놀(올 트랜스 레티놀(all-trans-retinol)을 포함한다), 레티날(retinal), 레티노산(retinoic acid)(트레티노인(tretinoin)을 포함), 레티놀과 지방산과의 에스테르, 지방족알코올과 레치노산과의 에스테르, 에트레티네이트(etretinate), 이소트레티노인(isotretinoin), 아다팔렌(adapalene), 아시트레틴(acitretin), 타자로텐(tazarotene), 팔미틴산 레티놀(palmitate retinol)등의 레티노이드 유도체, 및 펜레티니드(fenretinide)(4-HPR), 벡사로텐(bexarotene)등의 비타민 A 아날로그를 들 수 있다.
이들 가운데, 레티놀, 레티날, 레티노산, 레티놀과 지방산과의 에스테르(예를 들면 레티닐 아세테이트(retinyl acetate), 레티닐 팔미테이트(retinyl palmitate), 레티닐 스테어레이트(retinyl stearate) 및 레티닐 라우레이트(retinyl laurate)등) 및 지방족알코올과 레티노산과의 에스테르(예를 들면 에틸 레티노에이트(ethyl retinoate)등)는 섬유화 조직에서 콜라겐 생산 세포로의 특이적인 물질의 전달 효율 면에서 바람직하다.
레티노이드의 시스-트랜스(cis-trans)를 포함한 이성체 모두는, 본 발명의 범위 내에 들어간다. 레티노이드는 또한, 1 또는 2 이상의 치환기로 치환되기도 한다. 본 발명에서 레티노이드는 단리 상태의 것은 물론, 이것을 용해 또는 보관 유지할 수 있는 매체에 용해 또는 혼합한 상태의 레티노이드도 포함한다.
본 발명의 조성물의 상기 형태는 유효 성분으로서의 콜라겐 생산 세포를 표적으로 한 콜라겐 감소 물질 및 표적화제로서의 레티노이드만으로 구성해도 좋고, 이것들과는 다른 담체 구성 성분을 포함해도 좋다. 본 형태에 있어서 담체 구성 성분으로서는, 특히 한정되지 않으며, 의약 및/또는 약학의 분야로 알려진 임의의 것을 이용할 수 있지만, 적어도 레티노이드를 포함할 수 있거나 이것과 결합 할 수 있는 것이 바람직하다.
이러한 성분으로는, 지질, 예를 들면, 글리세로인지질(glycerophospholipid) 등의 인지질, 스핑고미엘린(sphingomyelin) 등의 스핑고지질, 콜레스테롤(cholesterol)등의 스테롤, 콩기름, 양귀비유 등의 식물성유, 광유, 노른자 레시틴(lecithin) 등의 레시틴류, 폴리머 등을 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다. 이 중에서, 리포솜(liposome)을 구성할 수 있는 것, 예를 들면, 레시틴등의 천연 인지질, 디미리스토일포스파티딜콜린(dimyristoylphosphatidylcholine;DMPC), 디팔미토일포스파티딜콜린(dipalmitoylphosphatidylcholine;DPPC), 디스테아로일포스파티딜콜린(distearoylphosphatidylcholine;DSPC) 등의 반합성 인지질, 디올레오일포스파티딜에탄올라민(dioleoylphosphatidylethanolamine;DOPE), 디라우로일포스파티딜콜린(dilauroylphosphorylcholine;DLPC), 콜레스테롤 등이 바람직하다.
특히 바람직한 성분으로는, 세망 내피계에 의한 포착을 회피할 수 있는 성분, 예를 들면, N-(α-트리메틸암모니오아세틸)-디도데실-D-글루타메이트 클로라이드(N-(α-trimethylammonioacetyl)-didodecyl-D-glutamate chloride;TMAG), N, N', N'', N'''-테트라 메틸-N, N', N'', N'''-테트라팔미틸스페르민(N, N', N'', N'''-tetramethyl-N, N', N'', N'''-tetrapalmitylspermine;TMTPS), 2, 3-디올레옥시-N-2(에스피 에르미네카르복사미드) 에틸]-N, N-디메틸-1-프로판암모니움트리플루오르아세테이트(2,3-dioleyloxy-N-[2(sp erminecarboxamido)ethyl]-N, N-dimethyl-1-propanaminum trifluoroacetate:DOSPA), N-[1-(2, 3-디올레옥시)프로필]-N, N, N-트리메틸암모늄 클로라이드(N-[1-(2,3-Dioleyloxy)propyl]-N, N, N-trimethylammonium Chloride;DOTMA), 디메틸디옥타데실암모니움 클로라이드(Dimethyldioctadecylammoniumchloride;DODAC), 디도데실디메틸암모니움브로마이드(Didodecyldimethylammoniumbromide;DDAB), 1, 2-디올레일옥시-3-트리메틸암모니오프로판(1,2-dioleyloxy-3-trimethylammoniopropane;DOTAP), 3β-N-(N, N'-디메틸아미노 에탄) 카르바모일]콜레스테롤(3β-N-(N, N'-[dimethylaminoethan)carbamoyl]cholesterol;DC-Chol), 1, 2-디미리스토일옥시프로필-3-디메틸 하이드록시에틸암모늄브로미드(1,2-dimyristoyloxypropyl-3-dimethyhydroxyethylaminiumbromide;DMRIE), O, O'-디테트라데카노일-N-(α-트리메틸암모니오아세틸) 디에탄올아민클로라이드(ditetradecanoyl-N-(α- trimethylammonioacethyl)diethanolaminechloride;DC-6-14)등의 양이온성 지질을 들 수 있다.
상기 담체는 특정의 3 차원 구조를 가져도 좋다. 해당 구조로는, 한정되지 않고, 직쇄상 또는 분기상의 선상 구조, 필름상 구조, 구상 구조 등을 들 수 있다. 따라서, 담체는, 한정되지 않고, 미셀, 리포솜, 에멀젼, 미소구, 나노소구 등의 임의의 3 차원 형태를 가져도 좋다.
담체에 레티노이드 및/또는 유효 성분의 결합 또는 포함하는 것은 화학적 및/또는 물리적인 방법에 따라 레티노이드를 담체에 결합시키거나 포함시키는 것에 의해서도 가능하게 된다. 또한, 담체에 레티노이드 및/또는 유효 성분의 결합 또는 포함은 레티노이드 및/또는 유효 성분과 담체 구성 성분을 혼합하는 것에 의해서도 가능하게 된다. 본 발명의 조성물에서 레티노이드의 양은, 예를 들면, 0.01~1000 nmol/㎕, 바람직하게는 0.1~100 nmol/㎕로 하는 것이 가능하다. 또한, 본 발명의 조성물에서 유효 성분의 양은, 예를 들면, 1~10000 ng/㎕, 바람직하게는 10~1000 ng/㎕, 또는 1~1000000 ㎍/kg 체중, 바람직하게는 10~100000 ㎍/kg 체중으로 하는 것이 가능하다. 레티노이드나 유효 성분의 양은, 이러한 성분의 활성이나, 조성물의 투여 경로, 투여 빈도, 투여 대상 등에 따라서는 상기 범위 밖이 되는 경우도 있지만, 그 경우에서도 여전히 본 발명의 범위에 포함된다. 담체에 레티노이드 및/또는 유효 성분의 결합 또는 포함하는 것은 상기 담체에 유효 성분을 담지시키기 전에 가도 좋고, 담체 구성 성분, 레티노이드 및 유효 성분을 동시에 혼합하는 것 등에 의해서도 좋고, 또는, 유효 성분을 이미 담지한 상태의 담체와 레티노이드를 혼합하는 것 등에 의해 행하여도 좋다. 따라서, 본 발명은 또한, 기존의 임의의 약물 결합 담체나 약물 봉입 담체, 예를 들면, DaunoXome(R)( (daunorubicin citrate liposome injection)), Doxil(Doxorubicin HCl Liposome Injection), Caelyx(R)(pegylated liposomal doxorubicin hydrochloride), Myocet(R)(Nonpegylated Liposomal Doxorubicin) 등의 리포솜 제재에 레티노이드를 결합시키는 공정을 포함하는 섬유화 조직으로부터 정상 조직을 재생하기 위한 약학적 조성물의 제조 방법에 관한 것이기도 하다.
본 발명의 조성물의 형태는, 원하는 유효 성분을, 표적으로 하는 섬유화 조직에서 콜라겐 생산 세포에 운반할 수 있으면 어느 형태로도 좋고, 예를 들면, 한정되지 않고, 고분자 미셀, 리포솜, 에멀젼, 미소구, 나노소구 등의 어느 형태를 취할 수도 있다. 본 발명에 있어서 전달 효율의 높음, 전달할 수 있는 물질의 선택사항의 폭이나 제재의 용이성 등의 관점으로부터, 이 가운데 리포솜의 형태가 바람직하고, 이 가운데에서 양이온성 지질을 포함하는 양이온성 리포솜이 특히 바람직하다. 조성물이 리포솜의 형태인 경우, 레티노이드와 리포솜 구성 지질과의 몰비는, 레티노이드의 담체에 결합 또는 포함하는 것의 효율성을 고려하면, 바람직하게는 8：1 ~ 1：4, 보다 바람직하게는 4：1 ~ 1：2이다.
본 발명의 조성물은 유효 성분을 내부에 포함해도, 유효 성분을 외부에 부착하고 있어도, 또한, 유효 성분과 혼합되고 있어도 좋다. 따라서, 본 발명의 조성물은 리포솜과 유효 성분과의 복합체, 즉 리포플렉스(lipoplex)의 형태를 취해도 좋고, 투여 경로나 약물 방출 형태 등에 따라, 상기 조성물을, 적절한 재료, 예를 들면, 장용성의 코팅이나, 시한 붕괴성의 재료로 피복 해도 좋고, 또한, 적절한 약물 방출 시스템에 넣어도 좋다.
레티노이드를 표적화제로서 포함하는 경우, 이것은 본 발명의 조성물에 있어서, 표적화제로서 기능하는 모양으로 존재하고 있다. 여기서, 표적화제로서 기능한다는 것은 레티노이드를 포함한 조성물이, 이것을 포함하지 않는 조성물보다 신속하고/또는 대량으로, 표적 세포인 섬유화 조직에서 콜라겐 생산 세포에 도달하여, 한편/또는 편입되는 것을 의미하여, 이것은, 예를 들면, 표지를 교부한, 또는 표지를 포함한 조성물을 표적 세포의 배양물에 첨가하여 일정 시간 후에 표지의 존재 부위를 분석하는 것으로 용이하게 확인할 수 있다. 구조적으로는, 예를 들면, 레티노이드가 늦어도 표적 세포에 도달하기까지, 조성물의 외부에 적어도 부분적으로 노출하고 있으면, 상기 요건을 충족할 수 있다. 레티노이드가 조성물의 외부에 노출하고 있는지 아닌지는, 조성물을 레티노이드와 특이적으로 결합하는 물질, 예를 들면, 레티놀 결합 단백질(RBP) 등과 접촉시켜, 조성으로의 결합을 조사하는 것으로써 평가할 수 있다.
레티노이드를 늦어도 표적 세포에 도달하기까지, 조성물의 외부에 적어도 부분적으로 노출시키는 것은, 예를 들면, 레티노이드와 담체 구성 성분과의 배합 비율을 조절하는 것 등에 의해 달성할 수 있다. 또한, 담체로 리포솜 등의 지질 구조체를 이용하는 경우에는, 예를 들면, 지질 구조체와 레티노이드를 복합체화할 때에, 최초로 지질 구조체를 수성 용액 중에 희석하여 그 다음에 이것을, 레티노이드와 접촉, 혼합하는 등의 기술을 이용할 수 있다. 이 경우, 레티노이드는 용제, 예를 들면, DMSO 등의 유기용제에 용해한 상태여도 좋다. 여기서, 지질 구조체란, 임의의 3 차원 구조, 예를 들면, 선상, 필름상, 구상 등의 형상을 가지는, 지질을 구성 성분으로서 포함하는 구조체를 의미하여 한정되지 않고, 리포솜, 미셀, 지질 미소구, 지질 나노소구, 지질 에멀젼 등을 포함한다. 리포솜을 표적화한 것과 같은 표적화제를 다른 약물 담체에도 적용할 수 있는 것은, 예를 들면, Zhao and Lee, Adv Drug Deliv Rev. 2004;56(8):1193-204, Temming et al., Drug Resist Updat. 2005;8(6):381-402 등에 기재되어 있다.
본 발명의 조성물은 콜라겐 감소 물질 이외에, 섬유화 자극을 감소하는 물질을 유효 성분으로서 더 포함해도 좋고, 해당 물질과 병용해도 좋다. 섬유화 자극을 감소하는 물질로는 한정하는 일 없이, 예를 들면, 항산화제, 혈행 촉진제, 항염증제, 항바이러스제, 항생제, 항기생충제, 간비호제, 이담제, 세포사멸(apoptosis) 억제 물질 등을 들 수 있다. 이러한 물질은 대상이 되는 조직이나 병의 용태에 따라 적절히 선택할 수 있다.
본 발명의 조성물은 표지를 포함하고 있어도 좋다. 표지화에 의해, 표적 세포로의 전달의 성공 여부나, 표적 세포의 증감 등을 모니터링 하는 것이 가능해져, 시험·연구 레벨뿐만 아니라, 임상 레벨에 대해도 유용하다. 표지는 당업자에게 공지인 임의의 것, 예를 들면, 임의의 방사성 동위체, 자성체, 표지화물질에 결합하는 물질(예를 들면 항체), 형광 물질, 플루오르포어(Fluorophore), 화학 발광 물질, 및 효소 등에서 선택할 수 있다. 표지는 본 발명의 조성물의 구성 성분의 적어도 하나, 예를 들면, 레티노이드를 표적화제로서 포함하는 경우는, 유효 성분, 레티노이드 및 담체 구성 성분의 1 또는 2 이상으로 교부해도 괜찮고, 이것들과는 다른 성분으로서 조성물에 포함해도 좋다.
본 발명에 있어서 「섬유화 조직에서 콜라겐 생산 세포용」또는 「섬유화 조직에서 콜라겐 생산 세포 전달용」이란, 섬유화 조직에서 콜라겐 생산 세포를 표적 세포로서 사용하는데 적합한 것을 의미하며, 이것은 예를 들면, 상기 세포에, 다른 세포, 예를 들면 정상세포보다 신속, 고효율 또한/또는 대량으로 물질을 전달할 수 있는 것을 포함한다. 예를 들면, 섬유화 조직에서 콜라겐 생산 세포용의 담체 또는 섬유화 조직에서 콜라겐 생산 세포 전달용의 담체는 섬유화 조직에서 콜라겐 생산 세포에, 다른 세포에 비해 1.1배 이상, 1.2배 이상, 1.3배 이상, 1.5배 이상, 2배 이상, 또한, 3배 이상의 속도 및/또는 효율로 유효 성분을 전달할 수 있다. 본 발명의 조성물은, 섬유화 조직에서 콜라겐 생산 세포에 대한 표적화제를 포함하는 것으로, 섬유화 조직에서 콜라겐 생산 세포용 또는 섬유화 조직에서 콜라겐 생산 세포 전달용의 조성물로 할 수 있다.
본 발명의 조성물은 의약으로서 사용할 수 있어(즉 의약 조성물), 경구 및 비경구의 양쪽 모두를 포함하는 여러 가지의 경로, 예를 들면, 한정하는 일 없이, 경구, 경장, 정맥 내, 근육 내, 피하, 국소, 간 내, 담관 내, 폐 내, 기도 내, 기관 내, 기관지 내, 경비, 직장 내, 동맥 내, 문맥 내, 심실 내, 골수 내, 임파절 내, 임파관 내, 뇌 내, 뇌척수강 내, 뇌실 내, 경점막, 경피, 비 내, 복강 내 및 자궁 내 등의 경로에서 투여해도 좋고, 각 투여 경로에 적절한 제형으로 제재해도 좋다. 해당 제형 및 제재 방법은 임의의 공지의 것을 적절히 채용할 수 있다(예를 들면, 표준 약제학, 와타나베 요시테루등편, 난코우당도 2003년 등을 참조).
　예를 들면, 경구투여에 적절한 제형은, 한정하지 않고, 가루약, 과립제, 정제, 캅셀제, 물약, 현탁제, 유제, 겔제, 시럽제 등을 들 수 있고 또한, 비경구투여에 적절한 제형은, 용액성 주사제, 현탁성 주사제, 유탁성 주사제, 용시 조제형 주사제 등의 주사제를 들 수 있다. 비경구투여용 제재는, 수성 또는 비수성의 등 장성 무균 용액 또는 현탁액의 형태일 수 있다.
본 발명의 조성물은, 어느 형태로 공급되어도 괜찮지만, 보존 안정성의 관점으로부터, 용시 조제 가능한 형태, 예를 들면, 의료의 현장 혹은 그 근방에서, 의사 및/또는 약제사, 간호사, 혹은 그 외의 준의료활동(paramedical) 등에 의해서 조제될 수 있는 형태로 제공할 수 있다. 이 경우, 본 발명의 조성물은, 이들에 필수의 구성요소가 적어도 하나를 포함한 1개 또는 2개 이상의 용기로서 제공되어 사용 전, 예를 들면, 24시간 전 이내, 바람직하게는 3시간 전 이내, 그리고, 보다 바람직하게는 사용의 직전에 조제된다. 조제시에는, 조제하는 장소에 있어 통상 입수 가능한 시약, 용매, 조제 기구 등을 적당하게 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한, 유효 성분, 및/또는 임의로 표적화제나 담체 구성물질을, 단독으로 혹은 조합하여 포함하는 1개 또는 2개 이상의 용기를 포함하는 조성물의 조제 키트, 및, 그러한 키트의 형태로 제공되는 조성물의 필요 구성요소에 관한 것이기도 하다. 본 발명의 키트는, 상기외에, 본 발명의 조성물의 조제 방법이나 투여 방법 등에 관한 설명서나, CD, DVD등의 전자 기록 매체 등을 포함하고 있어도 좋다. 또한, 본 발명의 키트는, 본 발명의 조성물을 완성하기 위한 구성요소의 모두를 포함하고 있어도 좋지만, 반드시 모든 구성요소를 포함하지 않아도 좋다. 따라서, 본 발명의 키트는, 의료 현장이나, 실험 시설 등에서 통상 입수 가능한 시약이나 용매, 예를 들면, 무균수나, 생리 식염수, 포도당용액 등을 포함하지 않아도 좋다.
본 발명은 게다가 본 발명의 조성물 또는 콜라겐 감소 물질의 유효량을, 그것을 필요로 하는 대상에 투여하는 단계를 포함하는 섬유화 조직으로부터 정상 조직을 재생하기 위한 방법에 관한 것이다. 여기서, 유효량이란, 예를 들면, 섬유화 조직에서 콜라겐 등의 세포 외 매트릭스의 양의 증대를 억제하는 양, 바람직하게는, 세포 외 매트릭스의 양을 감소하는 양, 더 바람직하게는 섬유화 조직에 대해 정상 조직의 재생을 가져오는 양이다.
세포 외 매트릭스의 양은 여러 가지의 기술, 예를 들면, 한정되지 않고, 세포 외 매트릭스의 특수 염색상의 이미지(image) 해석이나, 세포 외 매트릭스 마커의 측정등에 의해 정량할 수 있다. 예를 들면, 콜라겐은 하이드록시프롤린(hydroxyproline) 등의 콜라겐 마커의 양을 측정하거나 조직에 콜라겐 염색(예를 들면, 매슨·트리크롬 염색(Masson trichrome stain), 아잔 염색(Azan stain), 시리우스 레드 염색(Sirius red stian), 에라스티카 반 기에슨 염색(Elastica van Gieson stain;EVG) 등)을 실시하여 이미지 분석하는 것 등에 의해 정량화할 수 있다. 섬유화 조직에서 세포 외 매트릭스의 감소율은, 본 발명의 조성물을 투여하지 않았던 경우에 비해, 예를 들면, 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 또한, 75% 이상이어도 좋다. 여기서, 본 발명의 조성물을 투여하지 않았던 경우에는, 투여 자체를 행하지 않았던 경우뿐만 아니라, 비히클(vehicle), 유효 성분을 포함하지 않는 이외에는 본 발명의 조성물에 상당하는 조성물, 본 발명의 조성물이 표적화제를 포함한 경우에는 표적화제를 포함하지 않는 이외는 본 발명의 조성물에 상당하는 조성물 등을 투여했을 경우(이른바 음성 대조)를 포함한다. 또한, 정상 조직의 재생은, 조직학적 소견이나, 표지 한 줄기세포를 섬유화 조직에 투여하여 이것을 추적 조사하는 것 등에 의해 평가할 수 있다.
상기 유효량은 투여에 의한 이익을 넘는 악영향이 생기지 않는 양이 바람직하다. 해당 양은 배양 세포 등을 이용한다. in vitro 시험이나, 마우스, 래트, 개 또는 돼지 등의 모델 동물에서 시험에 의해 적절히 결정할 수 있어 이러한 시험법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 또한, 본 발명의 방법으로 이용하는 약물의 용량은 당업자에게 공지 또는 상기의 시험 등에 의해 적절히 결정할 수 있다. 섬유화의 모델 동물로는, 사염화탄소(CCl4), 돼지 혈청, 디메틸니트로사민( dimethylnitrosamine;DMN), 메티오닌-코린 결핍식(methionin-and choline- deficient (MCD) diet;MCDD), 콘카나바린 A(concanavalin A;Con　A), 담관 결찰 등에 의한 간경변 모델, 블레오마이신(bleomycin;BLM) 등에 의한 폐 섬유증 모델, 이 염화 디부틸 주석(dibutyltin (DBT) dichloride) 등에 의한 췌장 섬유증모델, 트롬보포이에틴(Thrombopoietin;TPO) 트랜스제닉(transgenic) 마우스(Leukemia Research 29: 761-769, 2005)등의 골수 섬유증 모델 등의 여러 가지를 이용할 수 있다.
본 발명의 방법에 있어 투여하는 조성물 또는 콜라겐 감소 물질의 구체적인 용량은 처리를 필요로 하는 대상에 관한 여러 가지의 조건, 예를 들면, 증상의 정도, 대상의 일반 건강 상태, 연령, 체중, 대상의 성별, 식사, 투여의 시기 및 빈도, 병용하고 있는 의약, 치료에 대한 반응성 및 치료에 대한 컴플라이언스(compliance)등을 고려해 결정될 수 있다.
투여 경로로는, 경구 및 비경구의 양쪽 모두를 포함하는 여러 가지의 경로, 예를 들면, 경구, 경장, 정맥 내, 근육 내, 피하, 국소, 간 내, 담관 내, 폐 내, 기도 내, 기관 내, 기관지 내, 경비, 직장 내, 동맥 내, 문맥 내, 심실 내, 골수 내, 임파절 내, 임파관 내, 뇌 내, 뇌척수액강 내, 뇌실 내, 경점막, 경피, 비 내, 복강 내 및 자궁 내 등의 경로가 포함된다.
투여 빈도는, 이용하는 조성물의 성질과 상태나, 상기와 같은 대상의 조건에 따라서 다르지만, 예를 들면, 1일 여러번(즉 1일 2, 3, 4회 또는 5회 이상), 1일 1회, 몇일마다(즉 2, 3, 4, 5, 6, 7일 마다 등), 1주일에 몇차례(예를 들면, 1주일에 2, 3, 4회 등), 1주일마다, 수주일마다(즉 2, 3, 4주일마다 등)여도 좋다.
본 발명의 방법에 있어서, 용어 「대상」은 임의의 생물 개체를 의미하며 바람직하게는 동물, 더 바람직하게는 포유동물, 더욱 바람직하게는 사람이다. 본 발명에 있어서 대상은 건강하거나 어떠한 질환에 이환되어 좋지만, 전형적으로는 섬유화 조직을 가지거나 조직이 섬유화하는 리스크(risk)를 가지는 대상을 의미한다. 해당 대상으로서 예를 들면, 한정하지 않고, 상기의 장기 섬유증에 이환되어 있거나 이환한 리스크를 가지는 대상, 조직이 섬유화 자극을 받고 있거나 받는 리스크가 있는 대상 등을 들 수 있다.
더욱이, 본 발명은 섬유화 조직에서 콜라겐을 감소하는 단계 및/또는 섬유화 조직에 대해 세포 증식·분화용의 스페이스를 생성하는 단계를 포함하는 섬유화 조직으로부터 정상 조직을 재생하기 위한 방법에 관한 것이다.
본 방법에 있어서 섬유화 조직에서 콜라겐의 감소 및 세포 증식·분화용의 스페이스의 생성은 본 발명의 조성물 또는 상기에서 서술한 콜라겐 감소 물질을 섬유화 조직에 투여하는 것으로 실시할 수 있다.
< 실시예 >
본 발명을 이하의 예로 더 상세하게 설명하지만, 이것들은 예시에 지나지 않고, 본 발명을 결코 한정하는 것은 아니다. 이하의 실시예에 있어서, 데이터는 평균치(±표준 편차)로서 나타내었다. 컨트롤군 및 다른 군과의 복수 비교는 듀넷트(Dunnett) 검정에 의해서 수행하였다.
< 실시예 1> VA - lip 　 siRNA 의 제조
(1) siRNA 의 제조
콜라겐(I~IV형)의 공통 분자 샤페론인 사람 HSP47의 래트 호모 로그, gp46(GenBank Accession No. M69246)의 염기 배열을 표적으로 하는 siRNA(홋카이도 시스템·사이언스, Sapporo, Japan)의 센스 사슬 및 안티센스 사슬은 이하의 것을 이용했다.
A：GUUCCACCAUAAGAUGGUAGACAACAG(gp46의 염기 배열상의 제757 염기로부터 시작되는 센스 사슬 siRNA, 서열 번호 1)
B：GUUGUCUACCAUCUUAUGGUGGAACAU(안티센스 사슬 siRNA, 서열 번호 2)
siRNA random(siRNA scramble라고 칭하기도 한다)로서 이하의 것을 이용했다.
C：CGAUUCGCUAGACCGGCUUCAUUGCAG(센스 사슬 siRNA, 서열 번호 3)
D：GCAAUGAAGCCGGUCUAGCGAAUCGAU(안티센스 사슬 siRNA, 서열 번호 4)
몇개의 실험에 있어서, 6＇-카르복시플루오레세인(6-Carboxyfluorescein;6-FAM) 또는 플루오레세인이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate;FITC)가 5＇말단에 결합한 센스 사슬을 이용했다. 이러한 배열은 BLAST 검색에 있어서 알려진 다른 래트 mRNA와 상동성을 갖지 않는 것을 확인했다.
(2) VA - lip 　 siRNA 의 제조
양이온성 지질로서 O, O'-디테트라데카노일-N-(-트리메틸암모니오아세틸) 디에탄올아민클로라이드(ditetradecanoyl-N-(- trimethylammonioacethyl)diethanolaminechloride)(DC-6-14), 콜레스테롤(cholesterol) 및 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올라민(1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)(DOPE)을 4：3：3의 몰비로 포함하는 양이온성 리포솜(LipoTrust)을 홋카이도 시스템·사이언스(Sapporo, 일본)으로부터 구입했다. 리포솜은, 사용 전에, 동결건조 한 지질 혼합물에 교반 조건하에서 재증류수(DDW)를 첨가하는 것에 의해서, 1 mM(DC-6-14)의 농도로 제조했다. VA결합 리포솜을 조제하기 위해서, DMSO에 용해한 200 nmol의 비타민 A(레티놀, Sigma, USA)를 리포솜 현탁액(DC-6-14로 100 nmol)과 1.5 ㎖ 튜브에서 교반하면서 25℃로 혼합했다. siRNAgp46를 담지하는 VA결합 리포솜(VA-lip-siRNAgp46)을 조제하기 위해(때문에), siRNAgp46 용액(DDW중에 580 pmol/㎖)을 레티놀 결합 리포솜 용액에 교반하면서 실온하에서 첨가했다. siRNA와 DC-6-14와의 몰비는 1：11이었다. in vitro에서의 사용에 바람직한 용량을 얻기 위해서 VA-lip　siRNA를 인산완충 생리 식염수(PBS)로 재구성했다.
< 실시예 2> 간섬유화 모델 래트로 재생 치료 실험
(1) 간섬유화 모델 래트의 제작
간섬유화 모델 래트는 수컷 SD래트(체중 150~200 g)(Slc Japan, Shizuoka, 일본)에 대해서 총담관 결찰을 수행하여 제작하고 결찰 후 28일째의 개체를 본 실험에 제공했다. 본 모델 래트에 있어서, 총담관 결찰에 의해 담즙의 울체가 생겨 간조직이 섬유화 자극에 계속적으로 노출된 상태가 된다.
(2) GFP 표지 래트 간 줄기세포의 제조
GFP 표지 래트 간 줄기세포는 4주령의 GFP 유전자 도입 래트(Slc Japan)의 간에서 채취했다. 우선, GFP 유전자 도입 래트에게 EGTA 용액 및 콜라게나제 용액을 관류시킨 후, 간을 채취하여, 채취한 간을 세절 한 후, 셀 스트레이너-(구멍 지름 100μm)로 여과했다. 얻을 수 있던 세포 현탁액에 행크스 평형염액(HBSS)＋0.25%소 혈청알부민(BSA) 용액을 더하고, 4℃, 500 rpm으로 2분간 원심 했다. 상청을 채취하고, 4℃, 1300 rpm으로 5분간 원심을 실시했다. 상청을 제거한 후, 침전에 대해서 MACS(R)(Magnetic Activating Cell Sorting) 버퍼(Miltenyi Biotec, Auburn, CA, USA)를 더해 혼합했다. 세포수를 센 후, FITC 결합 마우스 항CD45 항체(BD Pharmingen), 래빗-폴리클로날(rabbit-polyclonal) 항CD133 항체(Abcam) 및 마우스 모노클로날(monoclonal) 항EpCAM 항체(Santa Cruz)를 이용해 MACS(R)(을)를 실시해, CD133 양성, EpCAM 양성, CD45 음성 세포를 채취하여, 래트 간 줄기세포로서 본 실험에 이용했다.
(3) 간섬유화 모델 래트의 처리
상기 (1)로 제작한 간섬유화 모델 래트에게, 상기 (2)로 제조한 GFP 표지 간 줄기세포를, 200 ㎕의 DME/F12 배지 속에 2×106개의 농도로 국소 이식했다.
　간 줄기세포의 이식 후 24시간째부터, 비타민 A결합 리포솜 내포 siRNAgp46(VA-lip　siRNAgp46) 또는 mock으로서 VA-lip　siRNA scramble를 1일 간격으로, 합계 12회 미정맥 투여했다. 투여한 siRNA의 농도는, 래트 체중에 대해서 0.75 mg/kg로 사용했다. 비타민 A 및 리포솜(LipoTrust, 홋카이도 시스템·사이언스, Sapporo, 일본) 및 siRNA의 몰비는 11.5：11.5：1으로 했다.
(4) 조직 염색
상기 (3)으로 12번째의 VA-lip　siRNAgp46 투여가 종료한 24시간 후(즉 총담관 결찰 후 52일째)에, GFP 발현간 줄기세포를 이식한 총담관 결찰 래트의 간을 채취했다. 채취한 간을 OCT 콤파운드(compound)를 이용해 봉매 한 후, 동결 절편을 제작했다. 간 절편을 4% 파라포름알데하이드(Paraformaldehyde;PFA)로 고정했다. 절편의 일부는, 상법(常法)에 의해, 아잔 염색을 사용했다. 절편의 다른 일부는 5% 염소 혈청을 넣은 PBS로 블로킹을 시행하여, PBS로 세정한 후, 마우스 모노클로날항α평활근 엑틴(α-SMA) 항체(Sigma), 마우스 모노클로날항 글리어 섬유성 산성 단백질(GFAP) 항체(Sigma), 래빗-폴리클로날항알부민 항체 (MP Biomedicals), 마우스 모노클로날 항CK19 항체(Novocastra) 혹은 마우스 모노클로날 항혈관내피 카드헤린(ｖe-CAD, Vascular Endothelial Cadherin) 항체(Santa cruz)를 이용하여 4℃에서 하룻밤 반응시켰다. PBS로 세정한 후, Alexa555표지 염소항마우스 IgG 항체 혹은 Alexa555표지 염소항토끼 IgG 항체(모두Invitrogen)를 실온으로 60분간 반응시켰다. PBS로 세정한 후,ProLong(R) Gold with DAPI(Invitrogen)를 이용해 봉입하고, 형광 현미경으로 관찰을 실시했다. 절편의 일부는,α-SMA 항체(Dako)와 반응시킨 후, 염소항토끼 항체와의 반응을 대신하여, 디아미노벤지진(DAB)으로 발색시켜, 한층 더 헤마토실린(hematoxylin)으로 핵염색을 실시했다.
결과
도 1은 피험 래트로부터 채취한 간의 외관과 그 그 대표적 절편의 아잔 염색상을 나타낸다. VA-lip　siRNA scramble를 투여한 군에서는, 간은 위축 하고, 표면이 불규칙하며, 조직중에 아잔 염색상에 있어서 청색으로 염색된 세포 외 매트릭스의 축적이 광범위하게 보여지고, 소엽 구조도 흐트러지고 있었다. 이것에 대해, VA-lip　siRNAgp46를 투여한 군에 대해서는, 외관적인 위축이 인정되지 않고, 표면은 매끈하고, 조직중에 세포 외 매트릭스의 축적은 거의 보이지 않고, VA-lip　siRNA scramble 투여군에 비해 섬유화 영역의 분명한 축소가 보였다. 또한, 중심 정맥으로부터 방사상으로 유동(sinusolid)이 주행하는 정상적인 소엽 구조가 회복하고 있는 것이 명확하게 보였다.
　도 2는 α-SMA 항체의 DAB 염색상이다. 청색의 부분은 헤마토실린(hematoxylin)으로 염색된 핵을 나타내고, 진한 갈색 부분이 α-SMA 양성 영역이다. α-SMA는 활성화별세포의 마커로서 알려져 있어 α-SMA 양성 영역에는 활성화별세포가 존재한다고 생각된다. VA-lip　siRNAgp46 투여군에 있어서, VA-lip　siRNA scramble과 비교해 현저한 활성화별세포의 감소를 보였다.
도 3은 GFP 표지 간 줄기세포 이식 부위에 있어서 DAPI 및 GFP의 형광상이다. VA-lip　siRNAgp46 투여군에 있어서 약 80%의 영역에서 GFP의 발색을 보였던 것에 비해, VA-lip　siRNA scramble 투여군에 있어서 거의 관찰되지 않았다.
도 4는 GFP 표지 간 줄기세포 이식 부위의 명시야상과 GFP 형광상이다. VA-lip siRNA scramble 투여군에서는 특히 혈관 주위 등에 있어 세포 외 매트릭스의 침착을 위해서 세포의 형상이 희미해져 유동(sinusolid)도 불규칙하게 주행하고 있는데 반해, VA-lip　siRNAgp46 투여군에서는, 뚜렷한 세포 형상과 중심 정맥으로부터 방사상으로 주행하는 유동구조가 보였다. 또한, VA-lip　siRNAscramble 투여군에서는 GFP의 발색을 볼 수 없었는데, VA-lip　siRNAgp46 투여군에서는, 조직 전체에 걸쳐 GFP의 발색을 볼 수 있었다.
도 5는 VA-lip　siRNAgp46 투여군에서 DAPI, GFP의 형광상과 GFAP 항체에 의한 형광 염색상을 비교한 것이다(도 5 A는 배율 200배, 도 5 B는 배율 400배). GFAP는 휴지 상태의 간성세포의 마커로서 알려져 있는 단백질이다. GFAP를 발현하고 있는 세포는, GFP를 발현하지 않았다.
도 6은 VA-lip　siRNAgp46 투여군에서 DAPI, GFP의 형광상과α-SMA 항체에 의한 형광 염색상을 배율 200배로 비교한 것이다. α-SMA를 발현하고 있는 세포는, GFP를 발현하지 않았다. 도 5 및 6의 결과는 간성세포가 간 줄기세포에 유래하는 것은 아닌 것을 시사하는 것이다.
도 7은 VA-lip　siRNAgp46 투여군에서 DAPI, GFP의 형광상과 알부민 항체에 의한 형광 염색상을 배율 200배로 비교한 것이다. 알부민은 간실질 세포의 마커이지만, GFP를 발현하고 있는 세포의 대부분이 알부민을 발현하고 있었다.
도 8은 VA-lip　siRNAgp46 투여군에서 DAPI, GFP의 형광상과 CK19 항체에 의한 형광 염색상을 배율 200배로 비교한 것이다. CK19는 담관 상피 세포의 마커이지만, 담관을 구성하는 CK19 양성 세포는, GFP를 발현하고 있었다.
도 9는 VA-lip　siRNAgp46 투여군에서 DAPI, GFP의 형광상과ｖe-CAD 항체에 의한 형광 염색상을 비교한 것이다(도 9 A는 배율 200배, 도 9 B는 배율 400배). ｖe-CAD는 혈관 내피 세포의 마커로서 알려져 있어 GFP를 발현하고 있는 세포의 일부에 있어, ｖe-CAD를 발현하는 세포가 관찰되었다.
도 10은 VA-lip　siRNAgp46 투여군의 세포 이식하지 않았던 부위에서 DAPI, GFP의 형광상과 알부민 항체에 의한 형광 염색상을 배율 200배로 비교한 것이다. 세포 이식하지 않았던 부위에 있어서는, GFP 발현 세포는 관찰되지 않았다.
고찰
GFP를 발현하는 세포는 이식한 간 줄기세포 유래의 세포이므로, VA-lip　siRNAgp46의 투여에 의해, 세포 이식 부위에 있어서, 섬유화 영역의 축소와 함께 간 줄기세포가 간실질 세포, 담관 상피 세포 및 혈관 내피 세포로 분화하는 것으로써, 정상적인 간 조직이 재생되는 것이 나타났다. 즉, VA-lip　siRNAgp46 투여에 의한 치료는, 간섬유증의 치유 뿐만 아니라, 간재생도 유발하는 것이 분명해졌다. 또한, VA-lip　siRNAscramble 투여군에서 간 줄기세포를 검출할 수 없었던 것(도 3)은, VA-lip　siRNAgp46에 의한 섬유화 영역의 축소가 간 줄기세포의 증식 및 분화에 깊게 관여하고 있는 것을 시사하고 있다.
< 실시예 3> VA 에 의한 별세포 특이적인 전달
(1) 래트 췌성세포( Pancreatic stellate cells ; PSC )의 단리
래트 췌성세포(Pancreatic stellate cells;PSC)를 기보(Apte et al.　Gut 1998;43:128-133)에 따라, 농도 구배 원심분리법을 이용하여 단리하였다. 순도는 현미경 관찰, 내재성 VA의 자기 형광 및 근 엑틴 (myo actin) 가교 단백질인 데스민(desmin)에 대한 단일 클론 항체(1：25,Dako)(을)를 이용한 면역 세포 화학법으로 분석했다. 세포의 생존능(viability)은 트리판 블루(trypan blue) 배출로 분석했다. 세포 순도 및 생존능은 모두 95%를 웃돌고 있었다. 상기 세포는 10%의 소 태아 혈청(FBS)을 첨가한 이스코브 변형 둘벡코스 배지(Iscove＇s modified Dulbecco＇s medium：IMDM) 안에, 37℃, 95% 대기/5% CO2의 가습 환경하에서 배양했다.
(2) VA - lip 　 siRNAgp46 - FAM 의 세포 내 분포 분석
래트 pPSC(초대췌성세포, primary PSC)를 Lab-Tek 챔버(chamber) 커버 유리에, 챔버(chamber) 당 1×104개가 되도록 파종했다. VA-lip　siRNAgp46-FAM 또는 Lip　siRNAgp46-FAM를, 최종 siRNA 농도가 50 nM가 되도록 세포에 첨가했다. 세포를, 10% FBS 함유 DMEM로 30분간 배양하여 배지를 신선한 배지로 교환했다. 처리 후 30분 및 2시간에 있어서 세포를 PBS로 3회 세정하여 4%의 파라포름알데히드로 25℃에서 15분간 처리하여 고정했다. 고정 후, 세포를 PBS로 3회 세정하여, ProLong(R) Gold with DAPI(Invitrogen)에 1분간 노출하여 핵을 염색했다. FAM 표지 siRNAgp46의 세포 내 위치를 형광 현미경(Keyence, BZ-8000)을 이용하여 분석했다.
(3) VA - lip 　 siRNAgp46 - FAM 의 FACS 분석
래트 pPSC(1×104개)를 10% FBS의 존재하에, VA-lip　siRNAgp46-FAM(50 nM의 siRNA)로 처리하여 30분간 배양했다. 블록킹(blocking) 분석을 위해서 VA-lip　siRNAgp46-FAM의 첨가 전에, 1×104개의 세포를 마우스 항RBP 항체(10 ㎍/㎖, BD Pharmingen) 또는 네가티브 컨트롤인 마우스 IgG1(10 ㎍/㎖, Dako)으로 30분간 처리했다. VA-lip　siRNAgp46-FAM 처리 세포의 평균 형광 강도(MFI)를 FACS calibur with CellQuest software(Becton Dickinson)를 이용해 분석했다.
(4) 웨스턴 블로팅
siRNAgp46의 넉다운 효과를 평가하기 위해서, 웨스턴 블로팅 실험을 실시했다. 구체적으로는, VA-lip　siRNAgp46(1 nM, 5 nM, 50 nM), VA-lip-siRNA random(50 nM) 및 Lip-siRNAgp46(50 nM)로 각각 30분 처리한 PSC의 단백질 추출물을 4/20　SDS-폴리아크릴아미드겔(polyacrylamides gel)로 분리하여, 니트로셀룰로오스막(Nitrocellulose mambrane) 위에 전사하여 HSP47(gp46)에 대한 항체(Stressgen) 또는 β-엑틴(beta-actin)에 대한 항체(Cell Signaling)로 프로브 한 후, 퍼옥시다제(peroxidase) 결합 항체(Oncogene Research Product, Boston, MA)(을)를 2차 항체로서 표지했다. 최종적으로, 세포를 ECL 웨스턴 블로팅 검출 시스템(Amersham Life Science, Arlington Heights, IL)으로 가시화했다.
또한, gp46의 발현 억제의 지속 시간을 확인하기 위해서, PSC를 VA-lip　siRNAgp46(50 nM)로 30분 처리 후, 24시간, 48시간, 72시간 및 96시간 배양한 후 단백질을 추출하여 VA-lip-siRNA random(50 nM)로 처리 후 30분의 것과 함께, 상기와 같이 웨스턴 블로팅 실험을 실시했다.
(5) 콜라겐 생산의 정량
래트 pPSC를 6 웰(well) 조직배양 플레이트에, 10% FBS 함유 DMEM 가운데 5×104개/웰의 밀도로 파종했다. 24시간의 배양 후, 래트 pPSC를 VA-lip　siRNAgp46(50 nM의 siRNA) 또는 VA-lip　siRNA random(50 nM의 siRNA)로 처리했다. 세포를 10% FBS 함유 DMEM 중에서 30분간 배양하고, 그 후 배지를 신선한 배지와 교환했다. 처리 72시간 후, 세포를 PBS로 3회 세정하고, 웰에 침착한 콜라겐을, 공지(Williams et al. Gut 2001;49:577-583)에 따라서 시리우스 레드(Biocolor, Belfast, UK)(으)로 염색했다. 결합하지 않은 염료를 세정해 제거하고 결합 복합체를 0.5%의 수산화 나트륨에 용해했다. 콜라겐을 540 nm의 흡광 광도 분석으로 정량 하여, 결과를 미처리 컨트롤에 대한 퍼센티지로 나타냈다.
결과
도 11은 FAM 표지 된 siRNA의 세포 세포 내 분포을 나타내는 형광상이다. 왼쪽의 2개는 VA-lip　siRNAgp46-FAM로 처리한 PSC의 형광상이며, 오른쪽의 2개는 Lip　siRNAgp46-FAM로 처리한 PSC의 형광상이다. 위의 2개는 각각 처리 후 30 분후의 상이며, 아래의 2개는 처리 후 2시간 후의 상이다. VA-lip　siRNAgp46-FAM에서는, 처리 후 30분에 세포질내에 희미한 과립장 패턴의 FAM의 녹색 형광이 관찰되어 처리 후 2시간에 보다 진한 과립장 패턴이 핵주변 영역에 관찰되었다. 그것에 비교하여 Lip　siRNAgp46-FAM 처리군에 있어서는, 처리 후 30분으로는 녹색 형광이 관찰되지 않고, 처리 후 2시간의 형광은 희미한 것이었다.
도 12는 FACS 분석의 결과를 나타내는 그래프이다. 위로부터 순서대로 미처리군, Lip　siRNAgp46-FAM 처리군, VA-lip　siRNAgp46-FAM 처리군, VA-lip　siRNAgp46-FAM＋RBP 항체 처리군, Lip　siRNAgp46-FAM＋RBP 항체 처리군의 결과를 각각 나타낸다. FACS 분석의 결과, VA-lip　siRNAgp46-FAM＋RBP 항체 처리군에서는, VA-lip　siRNAgp46-FAM 처리군과 비교하여, 형광 강도가 Lip　siRNAgp46-FAM 처리군과 동일 수준까지 억제되고 있어 이것은 VA-lip　siRNAgp46의 PSC로의 흡수, RBP 리셉터(receptor) 매개성인 것을 시사한다.
도 13 A는 억제 효과의 농도에 의한 차이를 나타내는 웨스턴 블로팅의 결과를 나타낸다. VA-lip　siRNAgp46 처리된 세포에서는 VA-lip　siRNAgp46의 농도 의존적으로 gp46의 발현 억제가 관찰되어 50 nM에 있어서는 거의 완전하게 발현이 억제된 것에 비하여, VA-lip　siRNA random 및 Lip　siRNAgp46에서는 발현 억제는 관찰되지 않았다.
도 13 B는 억제 효과의 지속 시간을 확인하는 웨스턴 블로팅의 결과를 나타낸다. VA-lip　siRNAgp46로 처리했을 경우, 처리 후 72시간 배양한 세포까지는 gp46의 현저한 억제가 관찰되었다. 따라서, 처리 후 적어도 72시간까지는, gp46의 발현 억제 효과가 지속되는 것을 확인할 수 있었다.
도 14는 미처리 세포, 및 VA-lip　siRNAgp46 및 VA-lip　siRNArandom 각각으로 처리한 세포의, 72시간 후의 콜라겐 생산량을 정량한 그래프이다. VA-lip　siRNAgp46으로 처리했을 경우에, 미처리 세포 및 VA-lip　siRNArandom으로 처리한 세포와 비교해서 현저한 콜라겐 생산 억제를 확인할 수 있었다.
고찰
상기의 결과로부터 in vitro에 있어서 VA-lip　siRNAgp46는 RBP 리셉터 매개성의 흡수에 의해서 PSC에 특이적으로 편입되어 gp46의 발현을 억제하여 그 결과 콜라겐의 생산을 현저하게 억제하는 것을 알 수 있다. 이것은, VA-lip　siRNAgp46가 췌장 섬유증에 걸린 췌장에 있어서, 콜라겐을 감소할 수 있는 것을 시사하는 것이다.
< 실시예 4> 췌장 섬유화 모델 래트에서의 재생 치료 실험
(1) 췌장 섬유화 모델 래트의 제작
체중이 150~200 g인 수컷 Lewis 래트(Charles River)를 이용했다. 공지(Inoue et al. Pancreas 2002;25:e64-70)에 따라서, 이염화 디부틸 주석(Dibutyltin dichloride;DBTC)을 1부의 에탄올에 녹인 후, 2부의 글리세롤 및 2부의 디메틸설폭사이드(Dimethyl sulfoxide;DMSO)와 혼합한 용액(DBTC 용액)을 제조하여 5 mg(DBTC)/kg(체중)에 상당하는 양을, 래트 우경동맥에 주사기를 이용해 투여했다.
(2) 래트 췌장 및 다른 조직에서 VA - lip 　 siRNAgp46 - FITC 의 in vivo 위치
DBTC 투여 개시부터 43일 후, 중증인 췌장의 섬유화가 관찰된 시점에서, DBTC 처리 래트에게 1 ㎕/g 체중의 VA-lip　siRNAgp46-FITC 또는 Lip　siRNAgp46-FITC를 미정맥으로 투여했다. 투여는 상압하에서 행해져 1회당 0.75 mg/kg의 siRNA를 1일 간격으로 3회 투여했다. 마지막 투여의 24시간 후, 래트를 생리 식염수의 관류를 통해 살처리하여 췌장 및 다른 장기(간, 폐, 비장 및 망막)를 채취했다. 장기 표본을 10%의 파라포름알데히드로 고정하고, 파라핀 포매 절편을 아잔-마로리 염색을 이용해 염색했다. 모노클로날 항α-SMA 항체(1：1000,Sigma), 항CD68 항체(1：500,Dako) 및 항-FITC(1：500,Abcam)를 각각 이용한 덱스트란 폴리머(dextran polymer)법 및 Envision Kit(Dako)에 의해서 면역 조직 염색을 실시하고, 계속해서 DAB(와코 순약공업,Osaka, Japan)에 의한 발색 및 헤마토실린(Haematoxylin)(와코 순약공업)에 의한 핵염색을 실시했다.
(3) 웨스턴 블로팅
in vivo에서 siRNAgp46에 의한 발현 억제의 지속 시간을 평가하기 위해(때문에), VA-lip　siRNAgp46의 정맥 내 투여 후 0, 1, 2, 3, 4일 후에 췌장으로부터 추출한 단백질 추출물에 대해서, 상기 <실시예 3>.(4)와 동일하게 웨스턴 블로팅을 실시했다.
(4) in vivo에서의 siRNAgp46 처리
3군의 래트(1군 당 n=6)를 조직학적 평가에 이용했다. DBTC 투여의 43일 후, 각 군을 각각 PBS, VA-lip　siRNArandom 및 VA-lip　siRNAgp46의 10회 투여(0.75 mg/kg의 siRNA, 1일 간격으로 3회 투여)로 처리했다. 모든 투여는 꼬리 정맥으로부터 상압하에서, 1 ㎕/g 체중의 양으로 실시했다. 췌장을 10%의 파라포름알데히드로 고정해, 파라핀 포매 후, 절편을 아잔-마로리 염색 및 헤마토실린(hematoxylin)-에오신 염색을 이용해 염색했다. 면역 조직 염색은, 모노클로날 항α-SMA 항체(1：1000,Sigma)를 이용한 덱스트란 폴리머(dextran polymer)법 및Envision Kit(Dako)에 의해서 실시하고, 계속해서 DAB(와코 순약공업, Osaka, Japan)에 의한 발색 및 헤마토실린(Haematoxylin)(와코 순약공업)에 의한 핵염색을 실시했다. 아잔-마로리, 헤마토실린(hematoxylin)-에오신 및 α-SMA에 의한 염색 영역의 정확한 정량을 위해, 각 래트의 췌장 절편마다 6개의 저배율 시야(×100)를 무작위로 선택해, 현미경(Axioplan 2; Carl Zeiss, Inc)으로 관찰했다. 디지털 이미지(image)를 디지털 TV 카메라 시스템(Axiocam High Resolution color, Carl Zeiss, Inc.)을 이용한 비디오 기록 시스템으로 촬영했다. 자동 소프트웨어 분석 프로그램(KS400, Carl Zeiss, Inc.)(을)를 이용하고, 디지털 현미경 사진에서 아잔-마로리 및 α-SMA에 의해 염색된 영역의 비율을 결정했다.
(5) 히드록시프롤린 ( Hydroxyproline )분석
히드록시플롤린(Hydroxyproline) 함유량은 공지(Weidenbach et al. Digestion 1997;58:50-57)에 따라, Weidenbach법에 따라서 결정했다. 간결하게는, 췌장의 세포파쇄물을 3000 rpm으로 15분간 원심하여, 펠렛(pellet)을 6N의 HCl에서 16시간, 96℃로 완전하게 가수분해하여 pH를 6.5~7.5에 조절한 후, 재차 원심(3000 rpm으로 15분간) 분리했다. 25 ㎕의 분취액(aliquot)을 60℃으로 건조시켜, 침전물을 1.2 ㎖의 50% 이소프로판올(Isopropanol)에 용해하여 200 ㎖의 0.56% 클로라민 T 수용액(chloramine T Solution)(Sigma)을 넣은 초산·구연산 완충액(pH6.0)에서 인큐베이트 했다. 25℃로 10분간 인큐베이트 한 후, 1 ㎖의 에를리히(Ehrlich) 시약을 더해 혼합물을 50℃으로 90분간 인큐베이트 했다. 냉각 후, 560 nm의 파장의 흡수를 계측했다.
(6) 췌장의 세포 파쇄물에서의 콜라게나제 활성
콜라게나제 활성의 계측은 공지(Iredale et al. J.Clin.Invest. 1998;102:538-549)의 변형법에 의해 실시하였다. 간결하게는, 야생형 래트 및 췌장 섬유화 모델 래트로부터 채취해, 액체 질소 냉동된 췌장을, 세린 및 티올-프로테아제(serine thiol-protease) 저해제(PMSF　0.1 mM, 로이페프틴(Leupeptin) 10μM, 페프스타틴 A(Pepstatin A)　10μM, 아프로티닌(Aprotinin) 25 ㎍/㎖, 요오드아세트아미드(Iodoacetamide) 0.1 mM를 포함한 샘플 버퍼(50 mM　Tris, pH7.6, 0.25% Triton　X-100, 0.15 M　NaCl, 10 mM　CaCl2) 안에서, 빙상으로 파쇄 했다. 세포파쇄물을 4℃, 14000 g로 30분간 원심하여 세포잔설 및 단백질 응집체를 없앴다. 췌장의 세포파쇄물중의 콜라게나제 활성을, EnzCheck Collagenase Assay Collagen Conjugate kit (Molecular Probes)를 이용하고, 취급 설명서에 따라서 결정했다. 동시에 적절한 네가티브 컨트롤 및 포지티브 컨트롤(세균성 콜라게나제)을 이용해 분석하고 결과를 단백질의 ㎎ 당 분해 콜라겐의 형광(혈청알부민 표준과 비교한 280 nm의 광학 농도에 의해서 결정)으로 나타냈다.
결과
췌장의 각 연속 섹션에 대해 활성화별세포 및 siRNAgp46-FITC를 면역 염색한 결과, VA-lip　siRNAgp46-FITC 투여군에 대해서는, 활성화별세포(α-SMA 양성의 세포)가 모여 있는 영역에 FITC 양성의 세포가 분류된 것에 비해, Lip　siRNAgp46-FITC 투여군에 대해서는, α-SMA 양성의 영역에 있어 분류된 FITC 양성 세포는 매우 적었다(도 15 A 및 B).
　α-SMA 양성 영역에서 FITC 양성 세포는, 간 표본에서도 관찰되었다(그림 15 C). 이 결과는 DBTC에 의해서 췌장 섬유화 뿐만 아니라 간경변도 유도된다고 하는 결과와 일치한다. 폐 및 비장을 포함한 래트의 다른 장기에 대해서는, 매크로파지(macrophage)가 침윤 영역(CD68 양성 세포)에서 FITC 염색된 세포는 적은 것으로부터(도 15 D 및 E), 매크로파지(macrophage)에 의한 siRNAgp46-FITC의 비특이적 혼합을 의미한다. 망막은 FITC 염색에 음성이고(도 15 F), 이것은 간경변에서 VA-lip　siRNAgp46-FAM를 이용한 결과와 일치한다. 아마, 혈액 망막 장벽의 투과성의 저하로 인해 안구는 독립 시스템을 구축하고 있기 때문이라고 생각된다.
웨스턴 플로팅의 결과, in vivo 에서도 siRNAgp46에 의한 gp46의 발현 억제의 효과가 적어도 3일간 지속하는 것이 확인되었다(도 16 A 및 B).
VA-lip　siRNAgp46의 10회 투여를 실시한 DBTC 처리 래트를 아잔-마로리 염색으로 평가했다(도 17 A). 컴퓨터 이미지(image) 분석에 의해서 결정된 섬유화 영역은, 컨트롤 표본에 대해서 VA-lip　siRNAgp46 투여군의 표본에 있어, 현저하게 감소하고 있었다(P＜0.01)(도 17 B). 이 결과는, VA-lip　siRNAgp46 투여군의 췌장에서 히드록시프롤린(hydroxyproline)의 분명한 억제를 나타내는 데이터(도 17 C) 와 합치한다.
VA-lip　siRNAgp46 처리 후의 래트 췌장에서 별세포의 변화를 평가하기 위해, VA-lip　siRNAgp46 처리 후 래트의 췌장 표본의 α-SMA 염색을 실시한 결과, Lip　siRNAgp46 처리 및 PBS 처리한 래트와 비교하여, α-SMA 양성의 세포수가 현저하게 감소하고 있었다(도 18 A 및 B).
VA-lip　siRNAgp46 투여에 의해서, PSC로부터 새로운 콜라겐의 분비를 억제하는 것에 이어지는 섬유화의 개선에는, 염증성 세포 및 PSC 자신에게 유래하는 콜라게나제가 관여하고 있는 것은 아닌지 그 추측에 근거하여 야생형 래트 및 VA-lip　siRNAgp46 처리한 DBTC 처리 래트의 췌장 세포파쇄물에서 콜라게나제 활성을 계측한 결과를 아래 표에 나타낸다.
Figure 112013016673292-pct00001
[표 1]에 나타낸 바와 같이, DBTC 처리 래트에서 콜라게나제 활성은, 야생형 래트의 것과 거의 동등했다.
VA-lip　siRNAgp46 처리 및 Lip　siRNAgp46 처리한 DBTC 처리 래트의 65일째에서 췌장 표본의 헤마토실린(hematoxylin)-에오신 염색상을 비교해 보면, VA-lip　siRNAgp46 처리 래트에 있어, 완전하지는 않지만 분명한 췌장 조직의 정상화가 관찰된 것에 비해, Lip　siRNAgp46 처리 래트에 있어서는 조직 정상화가 보이지 않았다(도 19 A). 이것은 VA-lip　siRNAgp46 처리한 DBTC 처리 래트의 췌장 중량이 정상화한 것(도 19 B)과도 일치한다.
고찰
상기의 결과에 비추어 보면, VA-lip　siRNAgp46에 의한 처리에 의해, siRNAgp46가 활성화췌장별세포(aPSC)에 특이적으로 받아들여져 gp46의 발현을 억제해, 그 결과 aPSC로부터 것인지 등의 콜라겐 분비를 억제하는 것으로 췌장 섬유화의 개선에 현저한 효과를 발휘하는 것을 알 수 있다. 게다가 콜라겐 분비의 감소에 기인하여 aPSC의 현저한 감소가 관찰되었다. 그리고 특별히, VA-lip　siRNAgp46에 의한 처리는 췌장 섬유화의 개선뿐만 아니라, 췌장 조직의 재생도 유도하는 것이 증명되었다. 상기 <실시예 2>의 결과와 종합해 생각하면, 이러한 결과는, 섬유화 조직에 대해 축적한 콜라겐을 감소시키는 것으로, 조직비특이적으로 섬유화 조직으로부터 정상 조직을 재생할 수 있는 것을 나타내는 것이다.
< 실시예 5> 줄기세포의 증식·분화용 스페이스의 중요성
활성화간별세포(aHSC)를, 여러 가지의 밀도의 간전구 세포와 공동 배양하여 간전구 세포의 분화에 세포 주위의 스페이스의 유무가 주는 영향을 검토했다. 간전구 세포로는 상기 <실시예 2>로 얻은 GFP 표지 래트 간 줄기세포를, aHSC로는 SD 래트로부터 채취한 HSC를 배양하여 1회 계대 한 것을 각각 이용했다. aHSC는 이하와 같이 채취·배양했다. 우선, SD 래트에게 EGTA 용액 및 콜라게나제 용액을 관 류한 후, 간을 채취하여, 채취한 간을 세절 한 후, 셀 스트레이너(Strainer)-(구멍 지름 100μm)로 여과했다. 상기 수득한 세포 현탁액에 HBSS＋0.25% BSA 용액을 더하고, 4℃, 500 rpm로 2분간 원심 했다. 상청을 채취하고, 4℃, 1300 rpm로 5분간 원심을 실시했다. 상청을 제거한 후, HBSS＋0.25%BSA 용액을 더해 Nycodenz의 농도가 13.2%가 되도록 28.7%　Nycodenz 용액(Axis Shield, Oslo, Norway)을 더해 혼합했다. HBSS＋0.25%BSA 용액을 중층 한 후, 4℃, 1400×g로 20분간 원심 했다. 원심 후, 중간층을 채취하고, Dulbecco＇s Modified Eagle's medium(DMEM)＋10%소 태아 혈청(FBS) 배지를 이용하여, 5일간 배양했다. 배양 5일째에 계대를 실시해, 상기 세포를 본 실험에 이용했다.
세포 배양 인서트(구멍 지름 0.4μm, BD Falcon, Franklin Lakes, 미국) 위에 aHSC를 5×104개/웰(well)의 밀도로 파종하여 인큐베이터내에서 37℃, 5% CO2에서, DMEM＋10% FBS를 이용해 48시간 배양했다. aHSC 파종의 2일 후에, 간전구 세포를 I형 콜라겐으로 코팅된 커버 유리(IWAKI, Tokyo, Japan)를 넣은 24 웰(well) 플레이트(BD Falcon)에 1×104개/웰(well)(저밀도) 또는 5×105개/웰(well)(컨플루언트(confluent))의 밀도로 파종했다. 그 다음에, aHSC를 포함한 상기 세포 배양 인서트를 24 웰(well) 플레이트의 웰(well)에 삽입하여 인큐베이터 내에서 37℃, 5% CO2에서 10일간 모두 배양했다(배지로는 DME/F12(Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient F-12 Ham)＋10% FBS＋ITS(10 ㎎/ℓ 인슐린, 5.5 ㎎/ℓ 트랜스페린(transferrin), 0.67 ㎍/ℓ 셀렌(Selenium))＋0.1 μM 덱사메타손(dexamethasone)＋10 mM 니코틴아미드(nicotinamide)＋50 ㎍/㎖ β-메르캅토 에탄올(beta-mercaptoethanol)＋2 mM　L-글루타민(glutamine)＋5 mM　Hepes를 사용).
공동 배양 10일째, 항알부민 항체(래빗-폴리클로날, MP Biomedicals)로 면역 염색을 실시하여 역상 현미경(Nikon)을 이용해 100배의 배율로 알부민 양성 콜로니를 촬영해서 수득한 이미지(image)를 기초로 알부민 양성 콜로니의 면적을 NIS-Elements software(Nikon, 일본)를 이용해 산출했다. 그 결과를 도 20에 나타낸다.
별도 실험에서는, 공동 배양 10일째에, Premix WST-1 Cell Proliferation Assay System(Takara, Tokyo, 일본)을 사용하고, 마이크로 플레이트 리더(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, 미국)를 이용해 세포 증식의 측정을 실시했다. 그 결과를 도 21에 나타냈다.
도 20에 나타내는 결과와 같이, aHSC를, 저밀도로 파종 한 간전구 세포와 공동 배양하면, 간전구 세포는 다수의 알부민 양성의 간실질 세포로 분화하지만, 간전구 세포가 컨플루언트(confluent)라면, 극히 소수 밖에 간실질 세포로 분화하지 않는 것이 분명해졌다. 또한, 간전구 세포를 단독 배양했을 경우에는, 알부민 양성의 간실질 세포로 분화하지 않았다.
또한, 도 21에 나타낸 바와 같이, 간전구 세포를 상기와 동일한 밀도로 파종했을 경우, 그 증식능은 저밀도 조건보다 컨플루언트(confluent) 조건이 낮아지는 것도 분명해졌다.
이상의 결과로부터, 활성화별세포가 줄기세포의 증식·분화를 유도하는 것, 및, 줄기세포의 증식·분화에 줄기세포 주위의 물리적 스페이스의 유무가 중요한 영향을 있음이 판명되었다. 이것은, 상기 각 예의 결과를 종합하여 생각하면, 콜라겐 감소 물질에 의해서 섬유화 조직에서 섬유 조직이 축소하여 줄기세포의 주위에 스페이스가 생긴 결과, 줄기세포가 증식·분화하여 정상 조직이 재생하는 것을 나타내는 것이다.
<110> NITTO DENKO CORPORATION <120> Composition for regenerating normal tissue from fibrotic tissue <130> 12FPI-12-10 <150> JP2210-175290 <151> 2010-08-05 <150> JP2010-230020 <151> 2010-10-12 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gp46 siRNA sense strand <400> 1 guuccaccau aagaugguag acaacag 27 <210> 2 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gp46 siRNA antisense strand <400> 2 guugucuacc aucuuauggu ggaacau 27 <210> 3 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNArandom sense strand <400> 3 cgauucgcua gaccggcuuc auugcag 27 <210> 4 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNArandom antisense strand <400> 4 gcaaugaagc cggucuagcg aaucgau 27

Claims (9)

  1. 섬유화 자극을 계속적으로 받고 있는 섬유화된 조직으로부터 정상 조직을 재생하는 방법에 사용하기 위한 약학적 조성물로써,
    상기 조성물은 콜라겐 감소 물질을 포함하며,
    상기 방법은 섬유화된 조직에 축적된 콜라겐이 감소되어 형성되는, 줄기세포의 증식 및 분화를 위한 공간(space)에 줄기세포를 이식하는 단계를 포함하는, 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 콜라겐 감소 물질은 콜라겐 생산 세포에 의한 콜라겐 생산을 억제하는 물질, 콜라겐의 분해를 촉진하는 물질, 및 콜라겐 분해 저해 물질을 억제하는 물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 섬유화 조직에서 콜라겐 생산 세포에 대한 표적화제를 추가적으로 더 포함하는 약학적 조성물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 레티노이드(retinoid)를 더 포함하는 약학적 조성물.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 줄기세포의 증식 및 분화를 위한 공간에서 섬유화된 조직으로부터 정상 조직으로의 재생이 이루어지는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  6. 제2항에 있어서, 상기 콜라겐 생산 세포에 의한 콜라겐 생산을 억제하는 물질은 TGF-β저해 물질, HGF 또는 이의 생산 촉진 물질, PPAR-γ리간드, 안지오텐신 저해 물질, PDGF 저해 물질, 릴렉신 또는 이의 생산 촉진 물질, 세포 외 매트릭스 성분의 생산·분비를 저해하는 물질, 세포 활성 억제 물질, 세포 증식 억제 물질, 및 세포사멸(apoptosis) 유도 물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  7. 제2항에 있어서, 상기 콜라겐의 분해를 촉진하는 물질은 콜라게나제(Collagenase) 또는 이의 생산 촉진 물질인 약학적 조성물.
  8. 제2항에 있어서, 상기 콜라겐 분해 저해 물질을 억제하는 물질은 TIMP(tissue inhibitor of metalloproteinases) 저해 물질인 약학적 조성물.
  9. 삭제
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