KR101786905B1 - 아포토시스 유도제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 GST-π 및 그 저해제의 신규 용도 및 GST-π을 억제하는 약물과 오토파지를 억제하는 약물을 활성 성분으로서 포함하는, 아포토시스를 유도하기 위한 제, 이것을 포함하는 의약 조성물, 이것을 이용한 아포토시스의 이상에 따른 질환의 처치 방법 등에 관한 것이다.

Description

아포토시스 유도제 {APOPTOSIS-INDUCING AGENT}
본 발명은 GST-π 및 그 저해제의 신규 용도, 신규 아포토시스 유도제, 그 아포토시스 유도제를 포함하는 의약 조성물 및 아포토시스의 이상으로 수반하는 질환의 새로운 치료 방법에 관한 것이다.
암은 인류가 직면하고 있는 가장 중요하고 까다로운 질환 중 하나이며, 그 치료를 위해 엄청난 연구 노력이 이루어지고 있다. 암은 유전자의 돌연변이와 후성적(epigenetic, 後成的)인 이상 등에 의해 세포가 제어되지 않고 증식하는 질환이다. 암의 유전자 이상으로 이미 많은 것이 보고되고 있으며 (예 Futreal et al., Nat Rev Cancer 2004; 4 (3) :177-83 등), 그 대부분이 세포 증식, 분화, 생존에 관한 신호 전달에 어떠한 관련이 있다고 생각되어 진다. 또한, 이러한 유전자 이상에 의해 정상적인 분자로 구성된 세포 내 신호 전달이 이상을 가져오고, 이것이 특정 신호 캐스케이드의 활성화와 비활성화를 초래하고 궁극적으로 세포의 이상 증식을 일으키는 원인이 될 수도 있다. 초기 암 치료는 세포 증식 자체를 억제하는데 주안점을 두고 있었지만, 이러한 치료는 생리적으로 정상으로 증식하는 세포의 증식도 억제해 버리기 때문에, 탈모, 소화 장애, 골수 억제 등의 부작용을 동반하고 있었다. 그래서 이러한 부작용을 줄이기 위해 암 특유의 유전자 이상이나 신호 전달의 이상을 표적으로 한 분자 표적 약 등의 새로운 발상에 근거한 암 치료제의 개발이 진행되고 있다.
암 특유의 유전자 이상으로, KRAS(V-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog)이상이 잘 알려져 있다. KRAS는 EGFR, PDGFR등의 티로신 키나아제형 수용체의 하류에 위치하는 저 분자량 GTP결합 단백질(저 분자량 G단백질이라고도 함)이며, 이들 수용체로부터의 증식과 분화에 관한 신호를 하류의 MAPK 캐스케이드에 전달하는 역할을 맡고 있다. 정상적인 KRAS는, 리간드의 결합에 의해 활성화된 수용체의 티로신 키나아제 활성에 의해 Grb2 및 SOS를 통해 활성화되어, Raf 등의 MAPK를 인산화하고 MAPK 캐스케이드를 구동시키지만, 변이형 KRAS는 수용체로부터의 자극이 없어도 항상 활성화되어 증식 신호를 전달한다. 이 때문에, 비정상인 세포 증식이 생긴다고 생각되고 있다.
한편, 글루타티온 포함을 촉매하는 효소의 하나인 글루타티온-S-전이 효소 (GST), 특히 GST-π (glutathione S-transferase pi, GSTP1이라고도 함)의 발현이 각종 암세포에서 증대해 있으며, 이것이 일부 항암제에 대한 내성의 한 요인이 되고 있을 가능성이 지적되고 있다. 실제로 GST-π를 과잉 발현하고 약물 내성을 나타내는 암 세포주에, GST-π 대한 안티센스 DNA와 GST-π 저해제를 작용시키면 약제 내성이 억제되는 것으로 알려져 있다(Takahashi and Niitsu, Gan To Kagaku Ryoho 1994; 21 (7) :945-51, Ban et al., Cancer Res 1996; 56 (15) :3577-82, Nakajima et al., J Pharmacol Exp Ther 2003; 306 (3) :861-9). 또한 최근 보고에서는 GST-π를 과잉 발현하는 안드로겐 비 의존성 전립선 암 세포계에 GST-π에 대한 siRNA를 작용시키면 그 증식이 억제되고, 세포 사멸이 증가하는 것으로 보고되고 있다(Hokaiwado et al., Carcinogenesis 2008; 29 (6) :1134-8). 또한 인간 대장 암에서, KRAS의 변이가 AP-1의 활성화를 통해 GST-π의 과잉 발현을 유도하는 것으로 생각되는 것도 시사되어 있다(Miyanishi et al., Gastroenterology 2001; 121 (4) :865-74).
그러나, GST-π와 세포 증식이나 세포 사멸과의 관계, GST-π의 분자 메커니즘, 다양한 세포 내 신호 전달에 있어서 GST-π의 역할 등에 대해서는 아직 대부분 밝혀져 있지 않다. 세포 내 신호 전달은 매우 복잡하고 하나의 분자가 여러 분자의 작용에 영향을 주거나, 반대로 하나의 분자가 여러 분자의 영향을 받거나 할 수 있는 데다, 분자의 작용을 억제해도 다른 신호 캐스케이드가 활성화되고 예상대로의 효과를 얻을 수 없는 경우가 종종 있다. 따라서 더 나은 분자 표적 약의 개발에는 복잡하게 얽힌 세포의 신호 전달 메커니즘의 해명이 필요하지만, 오랜 연구에 의해 그 일부가 해명되어 있는 데 지나지 않고, 추가 연구 노력이 요구되고 있다.
Futreal et al., Nat Rev Cancer 2004; 4 (3) :177-83 Takahashi and Niitsu, Gan To Kagaku Ryoho 1994; 21 (7) :945-51, Ban et al., Cancer Res 1996; 56 (15) :3577-82, Nakajima et al., J Pharmacol Exp Ther 2003; 306 (3) :861-9 Hokaiwado et al., Carcinogenesis 2008; 29 (6) :1134-8 Miyanishi et al., Gastroenterology 2001; 121 ( 4) :865-74
본 발명은 GST-π 또는 저해제의 새로운 용도, 및 세포에서 효과적으로 세포 사멸을 유도하는 조성물 및 그것을 이용하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 GST-π의 분자 메커니즘을 해명하기 위해 예의 연구를 계속하는 중에, GST-π의 발현을 억제하면 Raf-1, MEK와 ERK의 활성화가 저해되는 것과, 마찬가지로 G 단백질 공역형 수용체와 티로신키나아제 수용체의 활성화에 의해 활성화되는 PI3K (Phosphoinositide 3-kinase) 신호 캐스케이드에서도 신호 전달의 억제가 일어나는 것을 발견함과 동시에, GST-π의 발현 억제에 의해 아포토시스가 발생하지만 이보다 더 빠르게 오토파지(autophagy, 자식작용)가 유도되는 것도 밝혔다. 그리고 추가 연구를 계속 한 결과, GST-π를 억제하는 동시에 오토파지를 억제함으로써 세포를 고효율로 아포토시스로 유도할 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉 본 발명은, 다음에 관한 것이다.
(1) GST-π를 억제하는 약물과 오토파지를 억제하는 약물을 활성 성분으로 함유하는 아포토시스(세포 사멸)을 유도하기 위한 제(劑).
(2) 오포파지를 억제하는 약물을 활성 성분으로 포함하는, GST-π가 억제된 세포에서 아포토시스를 유도하기 위한 제.
(3) 변이형 KRAS를 가진 세포에서 아포토시스를 유도하기 위한 상기 (1) 또는 (2)에 기재된 제.
(4) 활성 성분이 RNAi 분자, 리보자임, 안티센스 핵산, DNA / RNA 키메라 폴리 뉴클레오티드 및 이를 발현하는 벡터로 이루어진 군에서 선택되는 상기 (1) ~ (3) 중 어느 하나에 기재된 제.
(5) 상기 (1) ~ (4) 중 어느 한 항의 제를 포함하는 의약 조성물.
(6) 세포의 비정상적인 증식으로 인한 질병의 치료용인, 상기 (5)에 기재된 의약 조성물.
(7) KRAS의 변이에 의한 질병의 치료용인, 상기 (5)에 기재된 의약 조성물.
(8) 암 치료용인, 상기 (5)에 기재된 의약 조성물.
(9) GST-π 및/또는 그 기능 변종을 활성 성분으로 포함하는, PI3K/Akt/mTOR 신호 캐스케이드 및/또는 RAS/Raf/MAPK 신호 캐스캐이드를 촉진하기 위한 제.
(10) GST-π를 억제하는 약물을 활성 성분으로 포함하는, PI3K/Akt/mTOR 신호 캐스케이드 및/또는 RAS/Raf/MAPK 신호 캐스케이드를 억제하기 위한 제.
(11) GST-π 및/또는 그 기능적 변이체를 활성 성분으로 포함하는, 유비퀴틴화를 억제하기 위한 제.
(12) GST-π를 억제하는 약물을 활성 성분으로 포함하는, 유비퀴틴화를 촉진하기 위한 제.
(13) GST-π 및/또는 그 기능적 변이체를 활성 성분으로 포함하는, 오토파지를 억제하기 위한 제.
(14) GST-π를 억제하는 약물을 활성 성분으로 포함하는, 오토파지를 촉진하기 위한 제
본 발명의 아포토시스 유도제는 종래의 것과 비교하여 보다 효과적으로 세포 사멸을 유도할 수 있으므로 의약 조성물로도 효과가 높다. 특히 암 치료에서는 암세포를 아포토시스에 의해 사멸시킬 수 있기 때문에 암의 진행을 억제할 뿐만 아니라 암을 퇴축시키는 효과도 기대할 수 있다. 또한 기존의 제제보다 낮은 용량에서 종래와 동등한 효과를 발휘하므로 부작용의 경감도 가능해진다.
또한, 본 발명에 의해 GST-π의 분자 메커니즘이 밝혀지게 되어, GST-π와 그 저해제의 새로운 용도가 발견되었다. 이것은 질병의 처리 및 실험 방법 등에 대한 새로운 대안을 제공할 것이며, 의료, 수의학뿐만 아니라, 생물학, 생화학, 분자 생물학 등에서 상당한 기여가 기대된다
도 1a는 GST-π siRNA에 의해 GST-π의 발현이 특이적으로 억제되고 있는 모습을 나타내는 웨스턴 블럿팅의 결과이다. 도 1b는 GST-π siRNA의 형질주입(형질주입) 후 1 ~ 4 일째의 세포 수 및 GST-π의 발현 량의 변화를 나타낸 도이다.
도 2는 GST-π siRNA 형질 주입 후 2 일째의, RAS/Raf/MAPK 신호 캐스케이드에 관여하는 단백질의 발현 모습을 나타내는 웨스턴 블럿팅의 결과이다. GST-π의 발현 억제에 따라 Raf 단백질의 발현 량이 감소하고, MEK와 ERK 등의 MAPK의 인산화가 억제되는 것을 알 수 있다.
도 3은 Raf 단백질의 면역 침강 실험의 결과를 나타낸다. GST-π siRNA 처리 군에서 Raf 단백질 및 Ser 621 인산화 Raf 단백질(p-Raf-1(S621))의 발현이 약간 감소하고, 반대로 유비퀴틴화 된 Raf 단백질이 증가하고 있는 것을 알 수 있다.
도 4는 GST-π siRNA 감염체 및 Scramble siRNA 감염체를 프로테아솜 저해제 MG132 및 대조군인 DMSO로 처리했을 때의 Raf 단백질의 존재 량을 비교한 도면이다. GST-π siRNA 감염체에서, 프로테아솜 저해제로 치료함으로써 인산화 Raf 단백질(p-Raf-1 (S338))의 존재 량의 증가가 관찰되었지만, Scramble siRNA에서는 변화가 보고되지 않았다. 이는 곧 GST-π의 발현 억제에 의해 인산화 Raf 단백질이 프로테아솜에 의한 분해를 받고 있음을 시사하고 있으며, 도 3의 유비퀴틴화 Raf 단백질의 증가와도 일치한다.
도 5는 Raf 단백질과 GST-π의 공(共) 면역 침강 실험의 결과를 나타낸다. 항 p-Raf-1 항체에서 침강한 단백질에서 항 GST-π 항체에 대한 반응이 나타난 것으로부터, p-Raf-1과 GST-π가 복합체를 형성하고 있는 것이 시사된다.
도 6은 GST-π 억제(knockdown)세포의 면역 형광 염색 상(像)을 나타낸다. 상단은 항 LC3 항체에 의한 염색 상이며, 하단은 DAPI 염색 상이다. 상단 왼쪽부터 각각 형질주입 후 1 일째, 2 일째, 3 일째, 하단 왼쪽부터 각각 형질주입 후 4 일째, 5 일째 염색 상이다. 도면 중 화살표로 표시된 세포에서 오토파고솜(Autopagosome)으로 생각되는 점 모양 신호가 관찰되었으며, 오토파지가 유도되는 것으로 추측된다.
도 7은 GST-π siRNA 형질주입 후 2 일 경과 시점에서 GST-π 억제 세포의 전자 현미경 사진을 나타낸다. 왼쪽 도면에서 N은 핵을 나타내고 사각형으로 둘러싸인 A 부분의 확대 이미지가 오른쪽 도면이다. 오른쪽 도면에서 M은 미토콘드리아를 나타내고, L은 리소좀을 나타낸다. 화살표로 표시한 부분에서 미토콘드리아를 둘러싸도록 오토파고솜이 형성되어있는 것이 관찰된다.
도 8은 항 LC3 항체를 이용한, GST-π 억제(KD) 세포 추출액의 웨스턴 블럿 결과를 나타낸다. GST-π KD 세포(GST-π siRNA)에서 대조군(Scramble siRNA)과 비교하여 현저하게 LC3의 발현이 증가하는 것이 관찰된다. 특히 II 형의 LC3(LC3-II)가 크게 증가하고 있기 때문에 오토파고솜의 유도가 추측된다.
도 9는 TUNEL 염색 결과를 보여준다. 상단은 대조군의 상(像)이고, 하단은 GST-πKD 세포군의 상이다. 왼쪽부터 각각 형질주입 후 3 일째 4 일째 5 일째의 염색 상을 나타낸다. GST-πKD 세포군에서 TUNEL 양성 세포가 관찰되었다.
도 10은 GST-πKD 세포군과 대조 세포군에서, siRNA 형질주입 후 1~4 일 경과 시점에서 오토파지 양성 세포 및 아포토시스 양성 세포 비율의 경시적 변화를 나타낸 그래프(위) 및 GST-πKD 세포에서 GST-π의 발현 량을 나타내는 도면(아래)이다. 대조군에서는 오토파지도 아포토시스도 거의 관찰되지 않는 반면, GST-πKD 군에서는 2 일째를 피크로 하여, 오토파지 양성 세포가 먼저 급증하고, 그 후 아포토시스가 유도되는 것으로 나타나 있다.
도 11은 GST-πKD 세포에서, EGFR/PI3K/Akt/mTOR 신호에 관여하는 단백질의 웨스턴 블럿 결과를 나타낸다. GST-πKD 세포군에서 EGFR, PI3K와 Akt의 인산화가 현저히 억제되는 것을 알 수 있다.
도 12는 GST-πKD 세포를 프로테아솜 저해제 MG132로 처리한 경우의 인산화 EGFR(p-EGFR)의 발현 량의 변화를 나타내는 웨스턴 블럿의 결과를 나타낸다. GST-πKD 세포의 p-EGFR의 발현 저하가 프로테아솜 저해제 처리로 회복한 것으로부터, p-EGFR의 발현 저하는 프로테아솜에 의한 분해에 기인하는 것으로 추측되었다.
도 13은 항 p-EGFR을 이용하여 공(共) 면역 침강한 단백질을 웨스턴 블럿한 결과이다. 항 GST-π 항체에서 신호가 관찰된 것으로부터, p-EGFRr과 GST-π가 상호 작용하는 것으로 추측되었다.
도 14은 GST-π 저해제 C16C2을 이용한 경우의 Raf 단백질 및 EGFR의 발현 수준의 변화를 저해제 농도에 의존하여 관찰한 결과이다. GST-π 저해제를 이용한 경우에도 GST-π 억제(knockdown)의 경우처럼, EGFR 및 Raf 단백질의 인산화가 억제되는 것이 관찰되었다.
도 15은 GST-π 저해제 C16C2를 첨가한 경우의 세포 수의 변화를 나타내는 그래프이다. GST-π 저해제를 첨가한 경우 세포 수가 거의 증가하지 않는 것을 알 수 있다.
도 16은 Scramble siRNA 처리 군, GST-πKD 군 및 GST-πKD +3 MA 군의 오토파지 양성 세포의 비율을 나타내는 그래프이다. GST-π 억제에 의해 증가된 오토파지가 3-MA에 의해 억제되는 것을 알 수 있다.
도 17은 GST-πKD 세포에 3-MA를 첨가한 경우의 TUNEL 염색 상을 나타낸다. 상단이 3-MA를 1mM 첨가한 경우이며 하단이 3-MA를 5mM 첨가한 경우이다. 왼쪽에서부터 각각 형질주입 후 2 일째, 3 일째, 4 일째의 염색 상을 나타낸다. 3-MA의 첨가량이 많은 것이 사멸 세포가 많은 것으로 관찰되었다.
도 18은 대조 세포군 (Scramble siRNA), GST-πKD 세포군 (GST-π siRNA), GST-πKD 세포 + 1 mM 3-MA 군(GST-π siRNA + 1mM 3-MA) 및 GST -πKD 세포 +5 mM 3-MA 군(GST-π siRNA + 5mM 3-MA)의 세포 사멸 비율을 경시적으로 관찰한 결과를 나타내는 그래프이다. 3-MA의 용량 의존적으로 세포 사멸이 더욱 유도되는 것으로 나타났다.
본 발명은 GST-π를 억제하는 약물과 오토파지를 억제하는 약물을 활성 성분으로 함유하는, 세포 사멸을 유도하기 위한 제 또는 조성물 (이하 "아포토시스 유도제"또는 "아포토시스 유도 조성물 "이라고도 함)에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용하는 경우, GST-π는 GSTP1 유전자에 의해 코드되는, 글루타티온 포함을 촉매하는 효소를 말한다. GST-π는 인간을 포함한 각종 동물에 존재하며, 그 배열 정보도 공지되어 있다(예를 들면, 인간 : NP_000843 (NM_000852) 랫트 : NP_036709 (NM_012577) 마우스 : NP_038569 (NM_013541) 등. 번호는 NCBI 데이터베이스의 액세스 번호를 나타내며, 괄호 밖은 아미노산 서열 괄호 안은 염기 서열의 번호이다).
생물 개체 사이에는 단백질의 생리적 기능을 해치지 않는 유전자 서열이나 아미노산 서열의 변이가 발생할 수 있으므로 본 발명의 GST-π 또는 GSTP1 유전자는 위의 공지 배열과 동일한 서열을 갖는 단백질과 핵산에 한정되지 않고 같은 배열에 대해 1 개 또는 2 개 이상, 일반적으로 하나 또는 몇 개만 예를 들어, 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개 또는 10 개의 아미노산 또는 염기가 상이한 배열이 가지나, 또한 위의 공지 된 GST-π와 상응하는 기능을 갖는 것을 포함할 수 있다. GST-π의 구체적인 기능에 대해서는 다음과 같다.
또한, 본 명세서에서 「본원에서 사용하는 경우」,「본 명세서에서 사용하는」, 「본 명세서에서」, 「본 명세서에 기재되는」 등의 어구는 특히 별기하지 않으면 이에 연이은 구 기재가 본 명세서에 기재된 모든 발명에 적용되는 것을 의미한다. 또 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 가진 모든 기술 용어 및 과학 용어는 당업자가 일반적으로 이해하고 있는 것과 동일한 의미를 나타낸다. 본 명세서에서 참조하는 모든 특허 공보 및 기타 출판물은 그 전체가 본 명세서에 원용된다.
본 명세서에서 이용하는 「GST-π를 억제하는 약물」에는, 한정하지 않고, 예를 들어, GST-π의 생산 및/또는 활성을 억제하는 약물과 GST-π의 분해 및/또는 비활성화를 촉진하는 약물 등이 포함된다. GST-π의 생산을 억제하는 약물로는, 이에 한정하는 것은 아니지만, 예를 들면 GST-π를 코드하는 DNA에 대한 RNAi 분자, 리보자임 안티센스 핵산, DNA/RNA 키메라 폴리 뉴클레오티드 및 이를 발현하는 벡터 등을 들 수 있다.
GST-π의 활성을 억제하는 약물로는, 이에 한정하는 것은 아니지만, 예를 들어, GST-π 결합하는 물질, 예를 들면, 글루타티온, 글루타티온 유사체(예를 들어, WO 95 / 08563, WO 96 / 40205, WO 99 / 54346 상기 Nakajima et al, 2003 등에 기재된 것), 케토프로펜(상기 Takahashi and Niitsu 1994), 인도메타신(Hall et al., Cancer Res 1989; 49 (22) :6265-8), 에타크린산, 피로푸로스토(Tew et al., Cancer Res 1988; 48 (13) :3622-5), 항 GST-π 항체, GST-π의 우성-음성 변이체 등을 들 수 있다. 이 약물은 시판되고 있거나 공지된 기술에 따라 적절하게 제조할 수 있다.
GST-π의 생산 또는 활성을 억제하는 약물로는 특이성이 높고 부작용 가능성이 낮은 점에서, GST-π를 코드하는 DNA에 대한 RNAi 분자, 리보자임, 안티센스 핵산, DNA/RNA 키메라 폴리뉴클레오티드 및 이를 발현하는 벡터가 바람직하다.
GST-π의 억제는 GST-π 저해제를 작용시키지 않은 경우에 비해 세포에서 GST-π의 발현 및 활성이 억제되는 것으로 결정할 수 있다. GST-π의 발현은 알려진 모든 방법, 한정되지 않고, 예를 들면, 항 GST-π 항체를 이용한 면역 침강 법, EIA, ELISA, IRA, IRMA, 웨스턴 블럿팅 법, 면역 조직 화학 법, 면역 세포 화학 법, 유동 세포 계수법, GST-π를 코드하는 핵산 또는 그 독특한 단편 또는 그 핵산의 전사 산물(예 : mRNA) 또는 스플라이싱 산물에 특이적으로 혼성화될 수 있는 핵산을 이용한 다양한 혼성화(hybridization)법, 노던 블럿법, 서던 블럿법, 여러 가지 PCR 법 등에 의해 평가할 수 있다.
또한 GST-π의 활성은 GST-π의 알려진 활성, 한정하지 않고, 예를 들면, Raf-1(특히 인산화 Raf-1)나 EGFR(특히 인산화 EGFR) 등의 단백질과의 결합성 등을 알려진 모든 방법, 예를 들면 면역 침강 법, 웨스턴 블럿팅 법, 질량 분석법, 풀다운 법, 표면 플라즈몬 공명(SPR) 법 등에 의해 분석하여 평가할 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 경우, RNAi 분자는 RNA 간섭을 유발할 모든 분자를 지칭하며, 한정되지 않고, siRNA(small interfering RNA), miRNA(micro RNA), shRNA(short hairpin RNA), ddRNA(DNA- directed RNA), piRNA(Piwi-interacting RNA), rasiRNA(repeat associated siRNA) 등의 이중 가닥 RNA 및 이들의 변형체 등을 포함한다. 이러한 RNAi 분자는 시판되고 있거나 공지된 서열 정보 등을 기반으로 설계, 제작하는 것이 가능하다.
또한, 본 명세서에서 사용하는 경우, 안티센스 핵산은 RNA, DNA, PNA, 또는 이들의 복합물을 포함한다.
본 명세서에서 사용하는 경우, DNA/RNA 키메라 폴리 뉴클레오티드는 한정되지 않고, 예를 들면, 특개 2003-219893에 기재된 표적 유전자의 발현을 억제하는 DNA와 RNA로 이루어진 2 가닥 폴리 뉴클레오티드를 포함한다.
본 명세서에서 사용하는 경우, 오토파지는, 매크로 오토파지, 마이크로 오토파지, 샤페론 개재 오토파지 등을 포함 수 있지만, 일반적으로 매크로 오토파지를 의미한다. 따라서, 본 발명의 「오토파지」라는 용어는 특별히 따로 기재하지 않는 한 「매크로 오토파지」를 의미한다.
오토파지는 「자식(自食)」이라고도 불리는 세포 내 단백질 분해기구의 하나이며 세포 내에서 단백질의 분해, 재활용을 담당하고 있다. 오토파지는 효모와 포유 동물을 포함한 광범위한 생물종에서 보이며, 대체로 (a) PAS(phagophore assembly site)의 형성, (b) 분해해야하는 단백질을 둘러싸는 파고포어(격리막)의 신장 및 확대와, 이것에 의한, 분해해야하는 단백질을 내포하는 오토파고솜의 형성 (c) 오토파고솜과 리소좀의 융합에 의한 오토리소좀 형성, (d) 오토리소좀에서의 단백질의 분해를 포함하는 일련의 프로세스를 수반한다 .
상기 (a) ~ (c) 프로세스에는 특유의 오토파지 관련 인자가 관여하고 있다. 오토파지 관련 인자는 원래 효모에서 연구가 이루어져, 지금까지 Atg1 ~ 27을 비롯한 다수가 동정되어 있지만(Klionsky et al., Dev Cell 2003; 5 (4) :539-45), 포유 동물에서의 연구도 진행되어, 상동체가 복수 동정되고, 오토파지의 핵심 메커니즘도 밝혀지고 있다 (Yang and Klionsky, Curr Opin Cell Biol 2010; 22 (2) :124-31).
포유 동물의 오토파지의 핵심 메커니즘에 관여하는 오토파지 관련 인자로는 예를 들면, PAS의 형성에 관여하는 VMP1, TP53INP2, mAtg9, ULK 복합체(ULK1, ULK2, mAtg13, FIP200로 구성), PI3K 복합체(Beclin1, hVps34, p150, Ambra1, Atg14L로 구성된 Atg14L 복합체, 및 Beclin1, hVps34, p150, Bif-1, UVRAG로 구성된 UVRAG 복합체), 파고포어의 신장에 관여하는 LC3-II , Atg12-Atg5-Atg16L 복합체 등을 들 수 있다.
따라서 오토파지를 억제하는 약물로는, 한정되지 않고, 예를 들면, 상기의 것을 포함하는 오토파지 관련 인자의 생산 및/또는 활성을 억제하는 약물이나 오토파지 관련 인자의 분해 및/또는 불활성화를 촉진하는 약물 등을 들 수 있다. 오토파지 관련 인자의 생산을 억제하는 약물로는 오토파지 관련 인자를 코딩하는 DNA에 대한 RNAi 분자, 리보자임, 안티센스 핵산, DNA/RNA 키메라 폴리뉴클레오티드 및 이를 발현하는 벡터 등을 들 수 있다.
오토파지 관련 인자의 활성을 억제하는 약물로는, 이에 한정하는 것은 아니지만, 예를 들어, PI3K 저해제(예들 들면, 와토마닌 등), 특히 클래스 IIIPI3K 저해제(예를 들면, 3-MA(3-메틸 아데닌) 등), 오토파고솜과 리소좀의 융합을 저해하는 물질(예를 들면, 바필로마이신 A1 등), 오토리소좀의 단백질 분해를 억제하는 물질(예를 들면, 클로로퀸, 로이페푸틴 등), 오토파지 관련 인자를 결합하는 물질 (예를 들면, 오토파지 관련 인자에 대한 항체 등), 오토파지 관련 인자의 우성음성 변이체 등을 들 수 있다. 이 약물은 시판되고 있거나 공지된 기술에 따라 적절하게 제조할 수 있다. 본 발명의 일 구체 예에서, 오토파지를 억제하는 약물은 GST-π 및/또는 그 기능적 변이체를 포함하지 않는다.
오토파지를 억제하는 약물로는 특이성이 높고 부작용이 낮은 점에서, 오토파지 관련 인자를 코딩하는 DNA에 대한 RNAi 분자, 리보자임, 안티센스 핵산, DNA/RNA 키메라 폴리뉴클레오티드 및 이를 발현하는 벡터가 바람직하다.
오토파지 억제는, 본 발명의 오토파지 저해제를 작용시키지 않은 경우에 비해 세포에서 오토파지가 억제되고 있는 것으로 확인할 수 있다. 오토파지 억제는 알려진 모든 방법, 제한되지 않고, 예를 들면 전자 현미경 법에 의한 오토파고솜의 감지, 오토파지 마커 (예를 들면, Atg5, Atg12, LC3, 특히 LC3-II 등)의 검출 등에 따라 평가할 수 있다. LC3-II는 한정되지 않고, 예를 들면, LC3-II에 대한 특이적 항체로 검출하여도 되고, 시료를 전기 영동 등으로 분리 한 후, LC3-I과는 다른 밴드로 나누어진 LC3- II를 LC3-II 또는 LC3-I 및 LC3-II 모두에 반응하는 항체를 이용하여 웨스턴 블럿법 등에 의해 검출할 수 있다. 또한 LC3-I는 세포질에 흩어져 있는 반면, LC3-II는 격리막, 오토파고솜, 오토리소좀 등의 오토파지 특유의 구조에 국소적으로 존재하므로, LC3-II에 반응하는 항체 (LC3-I 및 LC3-II 모두에 반응하는 항체를 포함한다)에 의한 면역 염색 등으로 나타나는, 이러한 구조를 나타내는 점 모양 신호의 존재나 수를 오토파지 지표로 해도 좋다.
GST-π를 억제하는 약물과 오토파지를 억제하는 약물은 단일 제제에 포함할 수도 있고, 2 개 이상의 제제에 별도로 포함할 수도 있다. 후자의 경우 각 제제는 동시에 투여해도 되고, 시간 간격을 두고 투여해도 된다. 시간 간격을 두고 투여되는 경우, GST-π를 억제하는 약물을 포함한 제재를 오토파지를 억제하는 약물을 포함한 제제 전에 투여하여도 되고, 나중에 투여해도 좋다.
본 발명은 또한 오토파지를 억제하는 약물을 활성 성분으로 포함하는, GST-π가 억제된 세포에서 아포토시스(세포 사멸)를 유도하기 위한 제 또는 조성물 (이하 "아포토시스 유도제"또는 "아포토시스 유도 조성물 "이라고도 함)에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용하는 경우, "GST-π가 억제됐다"는, 예를 들어, GST-π가 발현하는 세포에서 GST-π가 억제된 상태를 포함한다. 이러한 상태로는 예를 들어, GST-π가 발현하는 세포에 GST-π를 억제하는 약물(예를 들어, 위에서 설명한 것 등)을 투여한 상태 등을 들 수 있다.
어떤 세포에서 GST-π가 발현하는지 여부는 문헌학적으로 알려져 있는지, 또는 세포에서 GST-π의 발현을 실제로 감지하여 결정할 수 있다. GST-π의 발현은 이미 상술 한 것을 포함하는 알려진 모든 방법을 이용하여 검출할 수 있다.
본 발명의 제 또는 조성물은 변이형 KRAS를 가진 세포에서 아포토시스를 유도하기 위한 것이어도 좋다.
본 명세서에서 사용하는 경우, 변이형 KRAS로는, 한정되지 않고, 예를 들면, KRAS의 계속적인 활성화를 부여하는 변이를 갖는 것, 예를 들면 내인성 GTPase를 저해하는 변이나, 구아닌 뉴클레오티드 교환 속도를 증대시키는 변이 등을 가지는 것을 들 수 있다. 이러한 변이의 구체적인 예로는, 한정되지 않고, 예를 들면, 인간 KRAS의 제 12,13 및/또는 61 아미노산의 변이(내인성 GTPase 억제) 및 인간 KRAS의 제 116 및/또는 119 아미노산의 변이(구아닌 뉴클레오티드 교환 속도를 증가) 등을 들 수 있다(Bos, Cancer Res 1989; 49 (17) :4682-9, Levi et al., Cancer Res 1991; 51 (13) :3497-502). 따라서, 본 발명의 일 구체 예에서, 변이형 KRAS는 인간 KRAS의 제 12,13,61,116,119 아미노산 중 적어도 하나에 변이를 갖는 KRAS를 들 수 있다. 본 발명의 일 구체 예에서, 변이형 KRAS는 인간 KRAS에서 제 12 아미노산에 변이를 갖는다. 또한, 본 발명의 일 구체 예에서, 변이형 KRAS는 GST-π의 과잉 발현을 유도하는 것이어도 좋다. 따라서 변이형 KRAS를 가진 세포는 GST-π의 과잉 발현을 나타내도 좋다.
변이형 KRAS의 검출은 알려진 임의의 방법을 이용하여 할 수 있다. 이러한 방법으로는, 한정되지 않고, 예를 들면, 알려진 변이 배열에 특이적인 핵산 프로브에 의한 선택적인 하이브리드화, 효소미스매치절단법, 시퀀싱(상기 Bos 1989), PCR-RFLP 법(상기 Miyanishi et al. 2001) 등을 들 수 있다.
또한 GST-π 발현의 검출은 위에서 설명한 내용을 포함하는, 알려진 모든 방법을 이용하여 할 수 있다. GST-π가 과잉 발현하는지 여부는 예를 들면, 변이형 KRAS를 가진 세포에서 GST-π의 발현 정도와 정상 KRAS을 갖는 동종의 세포에서 GST-π의 발현 정도를 비교하는 것 등에 의해 평가할 수 있다. 이 경우 변이형 KRAS를 가진 세포에서 GST-π의 발현 정도가 정상 KRAS를 갖는 동종의 세포에서 GST-π의 발현 정도를 넘었으면, GST-π가 과잉 발현하고 있다고 할 수 있다.
본 발명의 제 또는 조성물의 활성 성분의 배합량은 제 또는 조성물이 투여 되는 경우 세포 사멸이 유도되는 양이어도 좋다. 또한 투여에 의한 이익을 초과하는 악영향이 생기지 않는 양이 바람직하다. 이러한 양은 알려진 대로, 배양 세포 등을 이용한 in vitro 시험이나 마우스, 렛트, 개 또는 돼지 등의 동물 모델에서 시험에 따라 적절히 결정할 수 있으며, 이러한 시험 법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 아포토시스의 유도는 여러 가지 알려진 방법, 예를 들면, DNA 단편화, 아네키신V의 세포막에의 결합, 미토콘드리아 막 전위의 변화, 카스파제의 활성화 등의 아포토시스 특유 현상의 검출이나 TUNEL 염색 등에 의해 평가할 수 있다. 활성 성분의 배합량은 제나 조성물의 투약 형태에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 1 회 투여로 여러 단위의 조성물을 사용하는 경우, 조성물 1 단위에 배합하는 유효 성분의 양을 1 회 투여에 필요한 유효 성분 양의 복수 분의 1로 할 수 있다. 이러한 배합량의 조정은 당업자가 적절히 할 수 있다.
본 발명은 또한 GST-π를 억제하는 약물과 오토파지를 억제하는 약물을 활성 성분으로 배합하는 것을 포함하는 아포토시스를 유도하기 위한 제 또는 조성물을 제조하는 방법, GST-π를 억제하는 약물 및 오토파지를 억제하는 약물의 세포 사멸을 유도하기 위한 제 또는 조성물의 제조에의 사용, 아포토시스 유도에의 사용, GST-π를 억제하는 약물 및 오토파지를 억제하는 약물의 조합, 및 유효한 양의 GST-π를 억제하는 약물 및 오토파지를 억제하는 약물을 투여하는 것을 포함하는 아포토시스를 유도하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 오토파지를 억제하는 약물을 활성 성분으로 배합하는 것을 포함하는, GST-π가 억제된 세포에서 아포토시스를 유도하기 위한 제 또는 조성물을 제조하는 방법, 오토파지를 억제하는 약물의, GST-π가 억제된 세포에서 아포토시스를 유도하기 위한 제 또는 조성물의 제조에의 사용, GST-π가 억제된 세포에서 아포토시스의 유도에 이용하는 오토파지를 억제하는 약물, 및 , 유효량의 오토파지를 억제하는 약물을 투여하는 것을 포함하는 GST-π가 억제된 세포에서 아포토시스를 유도하는 방법에 관한 것이다.
상기 제조 방법 또는 사용에 있어서 약물 및 그 배합량은 이미 상술 한 바와 같다. 각 약물의 배합은 기존의 어떤 방법에 따라 할 수 있다.
상기 아포토시스 유도 방법은 모두 in vitro 방법이라도 in vivo 방법이라도 좋다. 또한 해당 방법의 약물은 이미 상술 한 바와 같고, 약물의 유효량은 투여 한 세포에서 세포 사멸이 유도되는 양이면 좋다. 또한 투여에 의한 이익을 초과하는 악영향이 생기지 않는 양이 바람직하다. 이러한 양은 알려진 방법으로, 배양 세포 등을 이용한 in vitro 시험 등에 의해 적절히 결정할 수 있으며, 이러한 시험 법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 아포토시스의 유도는 위에서 설명한 내용을 포함하는 여러 가지 알려진 방법에 의해 평가할 수 있다. 상기 유효량은 약물을 어떤 세포 집단에 투여 한 경우 반드시 같은 세포 집단의 모든 세포에 아포토시스를 유도하는 것이 아니어도 된다. 예를 들어, 상기 유효량은 세포 집단의 세포의 1% 이상, 2% 이상 3% 이상 4% 이상 5% 이상 6% 이상 8% 이상, 10% 이상 12% 이상 15% 이상, 20% 이상, 심지어 25% 이상 등으로 아포토시스를 유도하는 양일 수 있다.
본 발명의 아포토시스 유도 물질은 세포 증식에 이상이 있는 세포 등에서도 효과적으로 아포토시스를 유도할 것이며, 의약 조성물의 성분으로서 효과적이다. 따라서 본 발명의 다른 측면은 본 발명의 아포토시스 유도제를 포함하는 의약 조성물이 포함된다.
본 발명의 의약 조성물은 특히 아포토시스에 이상이 있는 질환을 치료하는 데 효과적이다. 따라서, 본 발명의 일 측면은 상기 아포토시스 유도제를 포함하는, 아포토시스에 이상이 있는 질환을 치료하기 위한 의약 조성물에 관한 것이다. 본 명세서에서 사용하는 경우, 아포토시스에 이상이 있는 질환은, 이에 한정하는 것은 아니지만, 예를 들면 세포의 비정상적인 증식으로 인한 질환, KRAS의 변이에 의한 질병, GST-π의 과잉 발현에 기인하는 질병 등이 포함된다. 세포의 비정상적인 증식에 의한 질환으로는 한정되지 않고, 예를 들면, 양성 또는 악성 종양, 과형성증, 켈로이드, 쿠싱 증후군, 원발성 알도스테론증, 홍판증, 진성 다혈증, 백반증, 과형성 흉터, 편평 태선 및 흑자증 등을 포함한다. KRAS의 변이에 의한 질병으로는 한정되지 않고, 예를 들면, 양성 또는 악성 종양(암, 악성 신생물이라고도 한다) 등을 포함한다. GST-π의 과잉 발현에 기인하는 질환으로는 한정되지 않고, 예를 들면, 양성 또는 악성 종양, 특히 약제 내성(예를 들어, 멜파란, 시클로포스파미드 등의 알킬화제, 아드리아 마이신 등의 안트라사이클린 계 항종양성 항생 물질, 시스플라틴 등의 백금 착체, 에토포시드 등에 대해 내성)의 악성 종양 등을 포함한다. 본 발명의 일 구체 예에서, 아포토시스에 이상이 있는 질환은 암이다.
본 발명에서 암은, 한정되지 않고, 예를 들면, 섬유 육종, 악성 섬유성 조직 구종, 지방 육종, 횡문근 육종, 평활근 육종, 혈관 육종, 카포시 육종, 림프관 육종, 활막 육종, 연골 육종, 골육종 등의 육종, 뇌종양, 두경부암, 유방암, 폐암, 식도암, 위암, 십이지장 암, 충수 암, 대장암, 직장암, 간암, 췌장암, 담낭암, 담관암, 항문 암, 신장암, 요관 암, 방광암, 전립선암, 음경암, 고환암, 자궁암, 난소암, 외음부 암, 질암, 피부암 등의 암, 또 백혈병과 림프종 등이 있다. 또한, 본 발명에서는 「암」은 상피성 악성 종양 및 비상피성 악성 종양을 포함한다. 본 발명의 암은 신체의 모든 부위, 예를 들면, 뇌, 두경부, 흉부, 사지, 폐, 심장, 흉선, 식도, 위, 소장 (십이지장, 공장, 회장), 대장 (결장, 맹장, 충수, 직장), 간, 췌장, 담낭, 항문, 신장, 요관, 방광, 전립선, 음경, 고환, 자궁, 난소, 외음부, 질, 피부, 횡문근, 평활근, 활막, 연골, 뼈, 갑상선, 부신, 복막, 장간막, 골수, 혈액, 혈관, 림프관 등의 림프계, 림프액 등에 존재할 수 있다.
본 발명의 일 구체 예에서, 암은 위에서 정의된 변이형 KRAS를 가진 암 세포를 포함한다. 본 발명의 일 구체 예에서, 암은 호르몬 또는 성장 인자 비의존성의 증식을 나타내는 암세포를 포함한다. 본 발명의 일 구체 예에서, 암은 GST-π의 과잉 발현을 나타내는 암세포를 포함한다. 본 발명의 일 구체 예에서, 암은 약제 내성이다. 본 발명의 일 구체 예에서, 암은, 멜파란, 시클로포스파미드 등의 알킬화제, 아드리아 마이신 등의 안트라사이클린계 항종양 항생제, 시스플라틴과 같은 백금 착체, 에토포시드로 이루어진 군에서 선택되는 약제에 대해 내성을 갖는다. 본 발명의 일 구체 예에서, 암은, 멜파란, 시클로포스파미드, 아드리아 마이신, 시스플라틴, 에토포시드로 이루어진 군에서 선택되는 약제에 대해 내성을 갖는다.
본 발명은 또한 GST-π를 억제하는 약물 및 오토파지를 억제하는 약물을 활성 성분으로 포함하는 아포토시스에 이상이 있는 질환을 치료하는 의약 조성물, GST-π를 억제하는 약물 및 오토파지를 억제하는 약물을 활성 성분으로 함유하는 것을 포함하는 아포토시스에 이상이 있는 질환을 치료하는 의약 조성물의 제조 방법, GST-π를 억제하는 약물 및 오토파지를 억제하는 약물의 아포토시스에 이상이 있는 질환을 치료하는 의약 조성물을 제조하기 위한 사용, 아포토시스에 이상이 있는 질병의 처리에의 사용, GST-π를 억제하는 약물과 오토파지를 억제하는 약물과의 조합, 및 상기 의약 조성물의 유효량을 그것을 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는 세포 사멸에 이상이 있는 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.
상기 제조 방법 또는 사용에 있어서 약물이나 배합량, 아포토시스에 이상이있는 질병에 대해서는 이미 전술 한 바와 같다. 또한 각 약물의 배합은 기존의 임의의 방법에 따라 할 수 있다.
본 발명자들은 이번에, GST-π가 PI3K/Akt/mTOR 신호 캐스케이드의 상류에 있는 티로신키나아제 수용체, 특히 인산화 형태, 및, RAS/Raf/MAPK 신호 캐스케이드 구성 분자인 Raf, 특히 그 인산화 형태와 각각 결합하고, 이러한 분자의 유비퀴틴화를 저지함으로써 이러한 신호 캐스케이드를 촉진하는 것을 제시했다. 따라서, 본 발명은 또한 GST-π 및/또는 그 기능적 변이체를 활성 성분으로 포함하는, PI3K/Akt/mTOR 신호 캐스케이드 및/또는 RAS/Raf/MAPK 신호 캐스케이드를 촉진하기 위한 제 또는 조성물( "신호 캐스케이드 촉진제"또는 "신호 캐스케이드 촉진 조성물」이라고도 한다)에 관한 것이다. 본 발명의 제 또는 조성물은 특히 PI3K/Akt/mTOR 신호 캐스케이드 및 RAS/Raf/MAPK 신호 캐스케이드를 동시에 촉진 할 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 「GST-π의 기능적 변이체」로는, 한정되지 않고, 예를 들어, (i) GST-π의 아미노산 서열에 1 개 또는 2 개 이상, 일반적으로 1 개 또는 몇 개의 변이를 가지나, 또한 GST-π와 동등한 기능을 갖는 변이체, (ii) GST-π를 코딩하는 유전자의 염기 서열을 갖는 핵산 혹은 같은 핵산과 동일한 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 염기 서열에 1 개 또는 2 개 이상, 일반적으로 1 개 또는 몇 개의 변이 핵산에 의해 코딩되고, 또한 GST-π와 동등한 기능을 갖는 변이체, (iii) GST-π를 코딩하는 유전자의 염기 서열을 갖는 핵산, 그 핵산과 동일한 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 또는 (ii)의 변이체를 코딩하는 핵산의 상보 사슬, 또는 단편에 스트린젠트 조건에서 하이브리드하는 핵산에 의해 코딩되고, 또한 GST-π 과 동등한 기능을 갖는 변이체, (iv) GST-π의 아미노산 서열과 60% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 가지며, GST-π와 동등한 기능을 갖는 변이체, (v) GST-π를 코딩하는 유전자의 염기 서열과 60% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 핵산에 의해 코딩되어 있고, GST-π와 동등한 기능을 갖는 변이체 등을 들 수 있다.
GST-π의 아미노산 서열 및 GST-π를 코딩하는 유전자의 염기 서열은 상술 한 바와 같이 각종 동물에서 알려져 있으며 당업자는 이러한 배열 정보를 기초로 상기 기능적 변이체를, 알려진 어떤 방법, 예를 들면, 화학 합성, 제한 효소에 의한 핵산의 절단 또는 삽입, 부위 특이적 변이 도입, 방사선 또는 자외선 조사 등에 의해 적절하게 제작할 수 있다.
어떤 변이체가 GST-π와 동등한 기능을 갖는 여부는 GST-π 알려진 기능, 제한되지 않고, 예를 들면, Raf-1 (특히 인산화 Raf-1)과 EGFR (특히 인산화 EGFR) 등의 단백질과의 결합성 등을 알려진 모든 방법, 예를 들면 면역 침강 법, 웨스턴 블럿팅 법, 질량 분석법, 풀다운 법, 표면 플라즈몬 공명(SPR) 법 등으로 분석하고 적절한 음성 대조군과 양성 대조군으로의 GST-π와 비교함으로써 평가할 수 있다. 예를 들어, 변이체에 있어서, 상기 기능이 음성 대조군보다 우수한 경우, 예를 들어, 10% 이상 25% 이상 50% 이상 75% 이상, 심지어 100% 이상 향상되는 경우 및/또는 이 기능이 GST-π의 1/100 이상, 1/50 이상, 1/25 이상, 1/10 이상, 1/5 이상, 심지어 1/2 이상인 경우 이 변이체를 GST-π의 기능적인 변이체에 포함시킨다.
본 명세서에서 사용하는 「스트린젠트 조건」라는 용어는 당해 기술 분야에서 주지의 파라미터이며, 표준 프로토콜 집, 예를 들면 Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Press (2001)와 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992) 등에 기재되어있다.
본 발명의 스트린젠트 조건은, 예를 들어 65℃에서의, 3.5×SSC(0.15M 염화나트륨/0.15M 구연산 나트륨, pH 7), 휘콜 0.02%, 폴리비닐피롤리돈 0.02%, 소 혈청 알부민 0.02%, NaH2PO4 25mM (pH 7), SDS 0.05%, EDTA 2mM로 구성된 하이브리드화 완충액에 의한 하이브리드화를 가리킨다. 하이브리드화 후 DNA가 옮겨진 막은 2×SSC로 실온에서, 이어서 0.1 ~ 0.5×SSC/0.1×SDS로 68℃까지의 온도에서 세정한다. 또는 스트린젠트한 하이브리드화는 ExpressHyb(R) Hybridization Solution(Clontech 사) 등의 상용 하이브리드화 완충액을 사용하여 공급자가 제시 한 하이브리드화 및 세정 조건에서 수행할 수 있다.
비슷한 스트린젠시를 유발하는 사용 가능한 다른 조건, 시약 등이 존재하지만, 당업자는 이러한 조건을 알고 있다고 생각되기 때문에 이러한 내용은 본 명세서에 특별한 기재는 하고 있지 않다. 그러나 GST-π의 변이체를 코딩하는 핵산의 명확한 식별이 가능하도록 조건을 조작하는 것이 가능하다.
본 발명의 GST-π 및/또는 그 기능적 변이체는, 단백질로서의 GST-π나 그 기능적 변이체 외에, GST-π를 코딩하는 핵산이나 GST-π의 기능적 변이체를 코딩하는 핵산을 포함한다.
본 명세서에서 사용하는 경우, 「신호 캐스케이드」는 여러 신호 전달 분자가 차례 차례로 신호를 전해가는 신호전달을 의미한다. 예를 들어 「PI3K/Akt/mTOR 신호 캐스케이드」의 경우 먼저 PI3K가 활성화되고 그것에 기인하여 다음 Akt가 활성화되고 또한 그것에 기인하여 mTOR이 활성화되는 상황으로 신호가 전달된다. 이것은 다른 신호 캐스케이드의 표기에 있어서도 마찬가지이다. 신호의 상류와 하류의 관계에서 활성화 체인은 직접적으로 일어날 수도 간접적으로 일어날 수도 있다. 예를 들어 PI3K에 의한 Akt의 활성화는 PIP3(Phosphatidylinositol(3,4,5) trisphosphate)와 PDK1(Phosphoinositide dependent protein kinase 1, PDPK1라고도 함)과 같은 분자가 개재하고 있는 것으로 알려져 있다.
PI3K/Akt/mTOR 신호 캐스케이드는 PI3K의 활성화에 의해 구동하는 신호 캐스케이드이며, 세포 생존 등에 관여하는 신호로 알려져 있다. PI3K의 활성화는, 이에 한정하는 것은 아니지만 예를 들어, G 단백질 공역형 수용체와 티로신키나아제 수용체에 리간드가 결합하여 일어나고, 활성화된 PI3K는 이노시톨 인지질을 인산화하는 것으로, 예를 들면 PIP3 등의 포스파티딜 이노시톨을 생산한다. 이것이 PH 도메인에서 PDK1 및 Akt와 결합하는 것으로, 이러한 단백질 막에 국소적으로 존재하는 것을 촉진한다. PDK1는 PIP3와 결합하여 세포막에서 활성화하고 활성화된 PDK1는 Akt의 308 번째 T를 인산화한다. Akt의 473 번째 세린은 mTOR 복합체의 하나인 mTORC2에 의해 인산화되고, 이 두 군데의 아미노산의 인산화에 의해 Akt는 완전히 활성화한다.
Akt가 mTOR을 활성화하는 경로에 대해서는 아직 완전히 해명된 것은 아니지만, PRAS40(proline-rich Akt/PKB substrate 40 kDa)이 관여하고 있다고 생각되고 있다. PRAS40는 그 이름대로 Akt의 기질이며, mTOR 복합체에 결합하여 그 활성을 억제하는 것으로 생각되는 분자이며, Akt가 활성화되면 PRAS40가 인산화되고, 그것 에 의해 PRAS40는 mTOR 복합체에서 탈피하여 mTOR이 활성화한다고 생각되고 있다. 그리고 mTOR이 활성화하면 ULK1 및 ULK2(unc-51-like kinase) 및 mAtg13(mammalian autophagy-related 13)을 인산화하고, 오토파지 신호의 시동을 저해하는 것으로 오토파지를 억제한다.
한편, RAS/Raf/MAPK 신호 캐스케이드는 세포 증식 등에 관계하는 신호 캐스케이드이다. G 단백질 공역형 수용체와 티로신키나아제 수용체, 예를 들면 성장 인자 등의 리간드가 결합하면, 저분자 G 단백질인 KRAS가 활성화되고, 활성화된 KRAS는 Raf(MAPKKK의 일종)를 인산화하여 활성화한다. 활성화된 Raf는 MEK(MAPK/ERK kinase, MAP2K의 일종)를 활성화하고, 활성화된 MEK는 ERK(Extracellular signal-regulated kinase, MAPK의 일종)를 활성화한다. 활성화된 ERK는 핵 내로 이동하고 다양한 mRNA의 전사를 촉진하여 세포 증식을 유발한다.
본 발명에서 신호 캐스케이드를 촉진하는 것은, 신호 캐스케이드의 활성화를 높일 뿐만 아니라, 신호 캐스케이드의 불 활성화를 억제하는 것을 의미한다. 신호 캐스케이드가 촉진되었는지 여부는 본 발명의 제 또는 조성물을 작용시키지 않은 경우에 비해 신호 캐스케이드가 활성화되어 있는 것으로 확인할 수 있다. 신호 캐스케이드의 활성화는 한정되지 않고, 예를 들면 신호 캐스케이드 구성 분자의 활성화(예를 들면, 인산화 등) 및 신호 캐스케이드의 활성화로 인한 세포 현상, 예를 들어 PI3K/Akt/mTOR 신호 캐스케이드 경우, 오토파지의 억제 등 RAS/Raf/MAPK 신호 캐스케이드이면 세포의 증식 등을 감지하여 평가할 수 있다.
본 발명은 또한 GST-π 및/또는 그 기능적 변이체를 배합하는 공정을 포함하는, PI3K/Akt/mTOR 신호 캐스케이드 및/또는 RAS/Raf/MAPK 신호 캐스케이드를 촉진하기 위한 제 또는 조성물의 제조 방법, GST-π 및/또는 그 기능적 변이체의, PI3K/Akt/mTOR 신호 캐스케이드 및/또는 RAS/Raf/MAPK 신호 캐스케이드를 촉진하기 위한 제 또는 조성물의 제조에의 사용, PI3K / Akt / mTOR 신호 캐스케이드 및/또는 RAS/Raf/MAPK 신호 캐스케이드의 촉진에 사용하는, GST-π 및/또는 그 기능적 변이체, 및, 유효량의 GST-π 및/또는 그 기능적 변이체를 투여하는 것을 포함하는, PI3K/Akt/mTOR 신호 캐스케이드 및/또는 RAS/Raf/MAPK 신호 캐스케이드를 촉진하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 신호 캐스케이드를 촉진하기 위해 제 또는 조성물은 PI3K/Akt/mTOR 신호 캐스케이드 및/또는 RAS/Raf/MAPK 신호 캐스케이드 이상, 특히이 신호 캐스케이드의 억제와 관련된 질병의 처리에 유용하다. 이러한 질환으로는 한정되지 않고, 예를 들어,이 신호 캐스케이드 구성 분자의 발현 및 활성 억제 및/또는 분해나 불 활성화의 증대를 수반하는 질병(예를 들어, 이러한 분자의 유전자 이상이나, GST -π의 발현 및 활성의 억제 등에 의한 것) 등을 들 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 GST-π 및/또는 그 기능 변종을 활성 성분으로 포함하는, PI3K/Akt/mTOR 신호 캐스케이드 및/또는 RAS/Raf/MAPK 신호 캐스케이드의 억제와 관련된 질병의 처리를 위한 의약 조성물, GST-π 및/또는 그 기능적 변이체를 배합하는 공정을 포함하는, PI3K/Akt/mTOR 신호 캐스케이드 및/또는 RAS/Raf/MAPK 신호 캐스케이드의 억제와 관련된 질병의 처리를 위한 의약 조성물의 제조 방법, GST-π 및/또는 그 기능적 변이체의, PI3K/Akt/mTOR 신호 캐스케이드 및/또는 RAS/Raf/MAPK 신호 캐스케이드의 억제와 관련된 질병의 처리를 위한 의약 조성물의 제조에의 사용, PI3K/Akt/mTOR 신호 캐스케이드 및/또는 RAS/Raf/MAPK 신호 캐스케이드의 억제와 관련된 질병의 치료에 사용하는, GST-π 및/또는 그 기능적 변이체, 및, 유효량의 GST-π 및/또는 그 기능적 변이체를 투여하는 것을 포함하는 PI3K/Akt/mTOR 신호 캐스케이드 및/또는 RAS/Raf/MAPK 신호 캐스케이드의 억제와 관련된 질병을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 GST-π를 억제하는 약물을 활성 성분으로 포함하는, PI3K/Akt/mTOR 신호 캐스케이드 및/또는 RAS/Raf/MAPK 신호 캐스케이드를 억제하기위한 제 또는 조성물 ("신호 캐스케이드 저해제 " 또는 "신호 캐스케이드 억제 조성물"이라고도 한다)에 관한 것이다.
본 발명에서 신호 캐스케이드를 억제하는 것은, 신호 캐스케이드의 불 활성화를 유도할 뿐만 아니라, 신호 캐스케이드의 활성화를 억제하는 것을 의미한다. 신호 캐스케이드가 억제되었는지 여부는 본 발명의 제 또는 조성물을 작용시키지 않은 경우에 비해 신호 캐스케이드가 억제되고 있는 것으로 확인할 수 있다. 신호 캐스케이드의 억제는 한정되지 않고, 예를 들면 신호 캐스케이드 구성 분자의 활성화(예를 들면, 인산화 등)의 저감이나 신호 캐스케이드의 억제에 의해 초래되는 세포 현상, 예를 들어 PI3K/Akt/mTOR 신호 캐스케이드 경우, 오토파지의 증대 등, RAS/Raf/MAPK 신호 캐스케이드 경우 세포 성장의 억제 등을 감지하여 평가할 수 있다.
본 발명은 또한 GST-π를 억제하는 약물을 배합하는 공정을 포함하는, PI3K/Akt/mTOR 신호 캐스케이드 및/또는 RAS/Raf/MAPK 신호 캐스케이드를 억제하기위한 제 또는 조성물의 제조 방법, GST -π를 억제하는 약물의, PI3K/Akt/mTOR 신호 캐스케이드 및/또는 RAS/Raf/MAPK 신호 캐스케이드를 억제하기 위한 제 또는 조성물의 제조에의 사용, PI3K/Akt/mTOR 신호 캐스케이드 및/또는 RAS/Raf/MAPK 신호 캐스케이드의 억제에 사용하는, GST-π를 억제하는 약물, 및, 유효량의 GST-π를 억제하는 약물을 투여하는 것을 포함하는 PI3K/Akt/mTOR 신호 캐스케이드 및/또는 RAS/Raf/MAPK 신호 캐스케이드를 억제하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 신호 캐스케이드를 억제하기 위한 제 또는 조성물은 PI3K/Akt/mTOR 신호 캐스케이드 및/또는 RAS/Raf/MAPK 신호 캐스케이드 이상, 특히이 신호 캐스케이드의 활성화와 관련된 질병의 처리에 유용하다. 이러한 질환으로는 한정되지 않고, 예를 들어,이 신호 캐스케이드 구성 분자의 발현 및 활성의 증가 및/또는 분해나 불 활성화의 억제와 관련된 질병(예를 들어, 이러한 분자의 유전자 이상이나, GST -π의 발현 및 활성의 증가에 의한 것), 이 신호 캐스케이드 구성 분자 이외의 요인(예를 들면, 수용체 티로신키나아제의 활성화 등)에 의한 신호 캐스케이드의 활성화와 관련된 질병 등을 들 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 GST-π를 억제하는 약물을 활성 성분으로 포함하는, PI3K/Akt/mTOR 신호 캐스케이드 및/또는 RAS/Raf/MAPK 신호 캐스케이드의 활성화와 관련된 질병의 처리를 위한 의약 조성물, GST-π를 억제하는 약물을 배합하는 공정을 포함하는, PI3K/Akt/mTOR 신호 캐스케이드 및/또는 RAS/Raf/MAPK 신호 캐스케이드의 활성화와 관련된 질병의 처리를 위한 의약 조성물의 제조 방법 , GST-π를 억제하는 약물의, PI3K/Akt/mTOR 신호 캐스케이드 및/또는 RAS/Raf/MAPK 신호 캐스케이드의 활성화와 관련된 질병의 처리를 위한 의약 조성물의 제조에의 사용, PI3K/Akt / mTOR 신호 캐스케이드 및/또는 RAS/Raf/MAPK 신호 캐스케이드의 활성화와 관련된 질병의 치료에 사용하는, GST-π를 억제하는 약물, 및, 유효량의 GST-π를 억제하는 약물을 투여하는 것을 포함하는, PI3K/Akt/mTOR 신호 캐스케이드 및/또는 RAS/Raf/MAPK 신호 캐스케이드의 활성화와 관련된 질병을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 GST-π 및/또는 그 기능적 변이체를 활성 성분으로 포함하는 유비퀴틴화를 억제하기 위한 제 또는 조성물 ( "유비퀴틴화 저해제" 또는 "유비퀴틴화 억제 조성물"이라고도 한다)에 관한 것이다.
유비퀴틴화는 단백질에 유비퀴틴이 결합 된 것을 의미하며, 세포 내에서 불필요해진 단백질을 처리하는 과정에 관여하고 있다. 유비퀴틴화된 단백질은 프로 테아좀에서 분해된다.
본 발명의 일 구체 예에서, 유비퀴틴화가 억제되는 단백질은 GST-π가 결합 할수 있는 단백질이다. 또한, 본 발명의 일 구체 예에서, 유비퀴틴화가 억제되는 단백질은 RAS/Raf/MAPK 신호 캐스케이드를 구성하는 단백질, PI3K/Akt/mTOR 신호 캐스케이드를 구성하는 단백질 및 티로신키나아제 수용체로 이루어진 군에서 선택된다. 본 발명의 바람직한 구체 예에서, 유비퀴틴화가 억제되는 단백질은 EGFR 및 Raf-1, 특히 이들의 인산화 형태로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명에서 유비퀴틴화의 억제는 본 발명의 제 또는 조성물을 작용시키지 않은 경우에 비해 유비퀴틴화가 억제되는 것으로 결정할 수 있다. 유비퀴틴화의 억제는 알려진 임의의 방법, 한정되지 않고, 예를 들면 면역 침강 법, 웨스턴 블럿팅 법 질량 분석법, 풀다운 법 등에 의해 평가할 수 있다.
본 발명은 또한 GST-π 및/또는 그 기능적 변이체를 배합하는 공정을 포함하는 유비퀴틴화를 억제하기 위한 제 또는 조성물의 제조 방법, GST-π 및/또는 그 기능적 변이체의, 유비퀴틴화를 억제하기위한 제 또는 조성물의 제조에의 사용, 유비퀴틴화 억제에 사용하는 GST-π 및/또는 그 기능적 변이체, 및, 유효량의 GST-π 및/또는 그 기능적 변이체를 투여하는 것을 포함하는 유비퀴틴화를 억제하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 유비퀴틴화를 억제하기 위한 제 또는 조성물은 유비퀴틴화 항진을 수반하는 질환의 치료에 유용하다. 이러한 질환으로는 한정되지 않고, 예를 들어 유비퀴틴 리가아제의 발현 및 활성의 증가 및/또는 분해나 불 활성화 억제를 동반하는 질환 (예를 들어, 유비퀴틴 리가아제 유전자 이상이나, GST-π의 발현 및 활성 억제 등에 의한 것) 등을 들 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 GST-π 및/또는 그 기능적 변이체를 활성 성분으로 포함하는, 유비퀴틴화 항진에 수반하는 질환의 치료를 위한 의약 조성물, GST-π 및/또는 그 기능적 변이체를 배합하는 공정을 포함하는, 유비퀴틴화 항진에 수반하는 질환의 치료를 위한 의약 조성물의 제조 방법, GST-π 및/또는 그 기능적 변이체의 유비퀴틴화 항진에 수반하는 질병의 처리를 위한 의약 조성물의 제조에의 사용, 유비퀴틴화 항진에 수반하는 질환의 치료에 사용하는 GST-π 및/또는 그 기능적 변이체, 및, 유효량의 GST-π 및/또는 그 기능적 변이체를 투여하는 것을 포함 하는 유비퀴틴화 항진에 수반하는 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 GST-π를 억제하는 약물을 활성 성분으로 포함하는 유비퀴틴화를 촉진하기 위한 제 또는 조성물 ( "유비퀴틴화 촉진제" 또는 "유비퀴틴화 촉진 조성물"이라고도 한다)에 관한 것이다.
본 발명의 일 구체 예에서, 유비퀴틴화를 촉진하는 단백질은 GST-π가 결합 할 수 있는 단백질이다. 또한, 본 발명의 일 구체 예에서, 유비퀴틴화를 촉진하는 단백질은 RAS/Raf/MAPK 신호 캐스케이드를 구성하는 단백질, PI3K/Akt/mTOR 신호 캐스케이드를 구성하는 단백질 및 티로신키나아제 수용체로 이루어진 군에서 선택된다. 본 발명의 바람직한 구체 예에서, 유비퀴틴화를 촉진하는 단백질은 EGFR 및 Raf-1, 특히 이들의 인산화 형태로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명에서 유비퀴틴화의 촉진은 본 발명의 제 또는 조성물을 작용시키지 않은 경우에 비해 유비퀴틴화가 촉진되는 것으로 결정할 수 있다. 유비퀴틴화의 촉진은 알려진 모든 방법, 제한되지 않고, 예를 들면 면역 침강 법, 웨스턴 블럿팅 법, 질량 분석법, 풀다운 법 등에 의해 평가할 수 있다.
본 발명은 또한 GST-π를 억제하는 약물을 배합하는 공정을 포함하는, 유비퀴틴화를 촉진하기 위한 제 또는 조성물의 제조 방법, GST-π를 억제하는 약물의, 유비퀴틴화를 촉진하기 위한 제 또는 조성물의 제조에의 사용, 유비퀴틴화 촉진에 사용하는 GST-π를 억제하는 약물, 및, 유효량의 GST-π를 억제하는 약물을 투여하는 것이 포함하는 유비퀴틴화를 촉진하는 방법에 관한 것이다 .
본 발명의 유비퀴틴화를 촉진하기 위한 제 또는 조성물은 유비퀴틴화 억제와 관련된 질병의 치료에 유용하다. 이러한 질환으로는 한정되지 않고, 예를 들어 유비퀴틴 리가아제의 발현 및 활성 억제 및/또는 분해나 불 활성화의 증대에 따른 질환(예를 들어, 유비퀴틴 리가아제 유전자 이상이나, GST-π의 발현 및 활성의 증가 등에 의한 것) 등을 들 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 GST-π를 억제하는 약물을 활성 성분으로 포함하는 유비퀴틴화 억제와 관련된 질병의 처리를 위한 의약 조성물, GST-π를 억제하는 약물을 배합하는 공정을 포함하는, 유비퀴틴화 억제와 관련된 질병의 처리를 위한 의약 조성물의 제조 방법, GST-π를 억제하는 약물의, 유비퀴틴화 억제와 관련된 질병의 처리를 위한 의약 조성물의 제조에의 사용, 유비퀴틴화 억제에 수반하는 질환의 치료에 사용하는, GST-π를 억제하는 약물, 및, 유효량의 GST-π를 억제하는 약물을 투여하는 것을 포함하는, 유비퀴틴화 억제와 관련된 질병을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 GST-π 및/또는 그 기능적 변이체를 활성 성분으로 포함하는 오토파지를 억제하기 위한 제 또는 조성물("오토파지 저해제" 또는 "오토파지 억제 조성물"이라고도 한다)에 관한 것이다. 본 발명자들은 이번에, GST-π가 PI3K/Akt/mTOR 신호 캐스케이드의 상류에 있는 티로신키나아제 수용체, 특히 그 인산화 형태에 결합하고, 그 유비퀴틴화를 저지하는 것으로, 그 신호 캐스케이드를 촉진하는 것을 밝혔지만, PI3K/Akt/mTOR 신호 캐스케이드의 활성화는 오토파지를 억제하는 것으로 알려져 있다 (예를 들어, 위 Yang and Klionsky, 2010).
본 발명에서 오토파지 억제는 본 발명의 제 또는 조성물을 작용시키지 않은 경우에 비해 세포에서 오토파지가 억제되고 있는 것으로 확인할 수 있다. 오토파지의 평가 방법은 상기와 같다.
본 발명은 또한 GST-π 및/또는 그 기능적 변이체를 배합하는 공정을 포함하는 오토파지를 억제하기 위한 제 또는 조성물의 제조 방법, GST-π 및/또는 그 기능적 변이체의 오토파지를 억제하기 위한 제 또는 조성물의 제조에의 사용, 오토파지 억제에 사용하는 GST-π 및/또는 그 기능적 변이체, 및, 유효량의 GST-π 및/또는 기능적 변이체를 투여하는 것을 포함하는 오토파지를 억제하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 오토파지를 억제하기 위한 제 또는 조성물은 오토파지의 항진에 수반하는 질환 등의 치료에 유용하다. 이러한 질환으로는 한정되지 않고, 예를 들어 PI3K/Akt/mTOR 신호 캐스케이드의 억제와 관련된 질병(예 PI3K/Akt/mTOR 신호 캐스케이드 구성 분자 및/또는 그 상류에 있는 분자의 유전자 이상이나, GST -π의 발현 및 활성의 억제 등에 의한 것), 근 장애, 간 장애, 재관류 장애 등을 들 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 GST-π 및/또는 그 기능적 변이체 활성 성분으로 포함하는 오토파지의 항진에 수반하는 질환을 치료하기 위한 의약 조성물, GST-π 및/또는 기능적 변이체를 배합하는 공정을 포함하는 오토파지의 항진에 수반하는 질환을 치료하기 위한 의약 조성물의 제조 방법, GST-π 및/또는 그 기능적 변이체의, 오토파지의 항진에 수반하는 질환을 치료하는 위한 의약 조성물의 제조에의 사용, 오토파지의 항진에 수반하는 질환의 치료에 사용하는, GST-π 및/또는 그 기능적 변이체, 및, 유효량의 GST-π 및/또는 그 기능적 변이체를 그것을 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는 오토파지의 항진에 수반하는 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명자들은 또한 GST-π를 억제함으로써 오토파지가 촉진되는 것을 이번 에 밝혔다. 따라서, 본 발명은 또한 GST-π를 억제하는 약물을 활성 성분으로 포함하는 오토파지를 촉진하기 위한 제 또는 조성물 ("오토파지 촉진제 "또는 "오토파지 촉진 조성물"이라고도 함)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 GST-π를 억제하는 약물을 배합하는 공정을 포함하는 오토파지를 촉진하기 위한, 제 또는 조성물의 제조 방법, GST-π를 억제하는 약물의, 오토파지를 촉진하기 위한 제 또는 조성물의 제조에의 사용, 오토파지 촉진에 사용하는, GST-π를 억제하는 약물, 및 유효한 양의 GST-π를 억제하는 약물을 투여하는 것을 포함하는 오토파지를 촉진시키는 방법에 관한 것이다 .
본 발명의 오토파지를 촉진하기 위한 제 또는 조성물은 오토파지의 억제와 관련된 질병 등의 치료에 유용하다. 이러한 질환으로는 한정되지 않고, 예를 들어 PI3K/Akt/mTOR 신호 캐스케이드의 활성화와 관련된 질병(예를 들면, PI3K/Akt/mTOR 신호 캐스케이드 구성 분자 및/또는 그 상류에 있는 분자의 유전자 이상이나, GST-π의 발현 및 활성의 증가 등에 의한 것), 에이징, 허혈성 질환 등을 들 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한, GST-π를 억제하는 약물을 활성 성분으로 포함하는 오토파지 억제와 관련된 질병을 치료하기 위한 의약 조성물, GST-π를 억제하는 약물을 배합하는 공정을 포함하는, 오토파지의 억제와 관련된 질병을 치료하기 위한 의약 조성물의 제조 방법, GST-π를 억제하는 약물의, 오토파지의 억제와 관련된 질병을 치료하기 위한 의약 조성물의 제조에의 사용, 오토파지 억제와 관련된 질병의 치료에 사용하는, GST-π를 억제하는 약물, 및, 유효량의 GST-π를 억제하는 약물을, 그것을 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는 오토파지의 억제에 동반하는 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.
신호 캐스케이드, 유비퀴틴화 또는 오토파지 억제/촉진에 관한 본 발명의 상기 각종 제 또는 조성물의 활성 성분의 배합량은 당해 제 또는 조성물이 투여된 경우에 원하는 효과(즉, 신호 캐스케이드, 유비퀴틴화 또는 오토파지의 억제/촉진)를 달성하는 양 이어도 좋다. 또한 투여에 의한 이익을 초과하는 악영향이 생기지 않는 양이 바람직하다. 이러한 양은, 배양 세포 등을 이용한 in vitro 시험이나 마우스, 렛트, 개 또는 돼지 등의 동물 모델에서 시험에 따라 적절히 결정할 수 있으며, 이러한 시험 법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 신호 캐스케이드, 유비퀴틴화 또는 오토파지의 저해/촉진은 위에서 설명한 내용을 포함하여 여러 가지 알려진 방법에 의해 평가할 수 있다. 활성 성분의 배합량은 제나 조성물의 투약 형태에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 1 회 투여로 여러 단위의 조성물을 사용하는 경우, 조성물 1 단위에 배합하는 유효 성분의 양을 1 회 투여에 필요한 유효 성분의 양 복수 분의 1로 할 수 있다. 이러한 배합량의 조정은 당업자가 적절히 할 수 있다.
신호 캐스케이드, 유비퀴틴화 또는 오토파지 억제/촉진에 관한 상기 각종 첨가제 또는 조성물의 제조 방법 또는 사용과 약물 및 그 배합량은 이미 상술 한 바와 같다. 각 약물의 배합은 기존의 임의의 방법에 따라 할 수 있다.
신호 캐스케이드, 유비퀴틴화 또는 오토파지 억제/촉진에 관한 상기 각종 방법은 모두 in vitro 방법이라도 in vivo 방법이라도 좋다. 또한, 상기 방법에 있어서 약물의 유효량은 투여한 세포에서 원하는 효과 (즉, 신호 캐스케이드, 유비퀴틴화 또는 오토파지 억제/촉진)를 달성되는 양 이어도 좋다. 또한 투여에 의한 이익을 초과하는 악영향이 생기지 않는 양이 바람직하다. 이러한 양은, 배양 세포 등을 이용한 in vitro 시험 등에 의해 적절히 결정할 수 있으며, 이러한 시험 법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 원하는 효과의 달성은 위에서 설명한 내용을 포함하는 여러 가지 알려진 방법에 의해 평가할 수 있다. 상기 유효량은 약물을 어떤 세포 집단에 투여 한 경우 반드시 같은 세포 집단의 모든 세포에 원하는 효과를 유도하는 것이 아니어도 된다. 예를 들어, 상기 유효량은 세포 집단의 세포의 1% 이상, 2% 이상 3% 이상 4% 이상 5% 이상 6% 이상 8% 이상, 10% 이상 12% 이상 15% 이상, 20% 이상, 심지어 25% 이상 등으로 원하는 효과를 유도하는 양일 수 있다.
본 명세서에 기재되는 본 발명의 각종 물질 및 조성물, 처리 방법 등의 활성 성분이 핵산, 예를 들면, RNAi 분자, 리보 자임 안티센스 핵산, DNA / RNA 키메라 폴리 뉴클레오티드 등인 경우, 이들은 핵산 그대로도 이용할 수도 있지만, 여러 가지의 벡터에 담지시킬 수도 있다. 벡터로는 플라스미드 벡터, 파지 벡터, 파지 미드 벡터, 코스미드 벡터, 바이러스 벡터 등의 공지의 모든 것을 이용할 수 있다. 벡터는 담지하는 핵산의 발현을 증강하는 프로모터를 적어도 포함하는 것이 바람직하며, 이 경우 그 핵산은 이러한 프로모터와 작동 가능하게 연결되는 것이 바람직하다. 핵산이 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 있다는 것은, 프로모터의 작용에 의해 그 핵산의 코딩하는 단백질이 적절하게 생산되도록, 그 핵산과 프로모터가 배치되어 있는 것을 의미한다. 벡터는 숙주 세포 내에서 복제 가능하여도 가능하지 않아도 좋고, 또한 유전자의 전사는 숙주 세포의 핵 밖에서 이루어져도 핵 내에서 이루어져도 좋다. 후자의 경우, 핵산은 숙주 세포의 게놈에 통합되어있다.
또한, 유효 성분은 각종 비-바이러스성 지질 또는 단백질 담체에 담지시킬 수도 있다. 이러한 담체로는 한정되지 않고, 예를 들면, 콜레스테롤, 리포좀, 항체 프로토머, 시클로덱스트린 나노 입자, 융합 펩타이드, 앱타머, 생분해성 폴리 유산 공중합체, 중합체 등이 세포 내로의 흡수 효율을 높일 수 있다 (예를 들어, Pirollo and Chang, Cancer Res 2008; 68 (5) :1247-50 등 참조). 특히 양이온 성 리포좀이나 폴리머 (예를 들어, 폴리에틸렌 이민 등)가 유용하다. 이러한 담체로서 유용한 폴리머의 새로운 예로는 예를 들어, US 2008 / 0207553, US 2008 / 0312174 등에 기재된 것 등을 들 수 있다.
본 명세서에 기재되는 본 발명의 각종 의약 조성물에 있어서는, 활성 성분의 효과를 방해하지 않으면 활성 성분을 다른 어떤 성분과 결합할 수 있다. 이러한 모든 성분으로서, 예를 들어 다른 화학 치료제, 약학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 등을 들 수 있다. 또한 투여 경로 및 약물 방출 양식 등에 따라 상기 조성물을 적절한 재료, 예를 들어, 장용성 코팅이나, 시한 붕괴성 재료로 피복하여도 좋고, 또한 적절한 약물 방출 시스템에 통합할 수 있다.
본 명세서에 기재되는 본 발명의 각종 제 및 조성물(각종 의약 조성물을 포함)은 경구 및 비-경구 모두를 포함하는 여러 가지의 경로, 예를 들면, 한정하지 않고 경구, 정맥 내, 근육 내, 피하, 국소, 종양 내, 직장, 동맥 내, 문맥 내, 심실 내, 경 점막, 경피, 비강, 복강 내, 폐 내, 및 자궁 내 등의 경로로 투여하여도 좋고, 각 투여 경로에 적합한 제형으로 제조할 수 있다. 이러한 제형 및 제제 방법은 임의의 공지의 것을 적절 채용할 수 있다(예를 들어, 표준 약제학, 와타나베요시테루(渡邊喜照) 외 편,南江堂 2003 년 등 참조).
예를 들어, 경구 투여에 적합한 제형으로는 한정하지 않고 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 액제, 현탁제, 유제, 겔제, 시럽제 등이 있고, 또한 비경 구 투여에 적합한 제형으로는 용액성 주사제, 현탁성 주사제, 유탁성 주사제, 사용시 조제형 주사제 등의 주사제를 들 수 있다. 비-경구 투여용 제제는 수성 또는 비 수성 등장 성 무균 용액 또는 현탁액의 형태일 수 있다.
본 명세서에 기재되는 본 발명의 각종 첨가제 또는 조성물(각종 의약 조성물을 포함)은 특정 조직이나 세포에 표적화되어 있어도 좋다. 표적화는, 알려진 임의의 방법에 의해 달성될 수 있다. 암의 전달을 기도하는 경우는, 한정되지 않고, 예를 들어 제재를 EPR(enhanced permeability and retention) 효과의 발현에 적합한 직경 50 ~ 200μm, 특히 75 ~ 150μm 등의 크기로 하는 것에 의한 수동 타겟팅 및 CD19, HER2, 트랜스페린 수용체, 엽산 수용체, VIP 수용체, EGFR (Torchilin, AAPS J. 2007; 9 (2) : E128-47), RAAG10 (특표 2005-532050), PIPA (특 표 2006-506071), KID3 (특 표 2007-529197)등의 리간드나, RGD 모티프나 NGR 모티프를 갖는 펩티드, F3, LyP-1 (Ruoslahti et al., J Cell Biol 2010; 188 (6) : 759-68) 등을 표적 화제로서 이용하는 활성 타겟팅 등의 방법을 사용할 수 있다. 또한 레티노이드가 암세포에 표적화제로서 유용하다는 것도 알려져 있기 때문에 (WO 2008 / 120815), 레티노이드를 표적화제로 포함하는 담체를 이용할 수도 있다. 이러한 담체는 상기 문헌 외에도 WO 2009/036368, WO 2010/014117에 기재되어 있다.
본 명세서에 기재되는 본 발명의 각종 첨가제 또는 조성물(각종 의약 조성물을 포함)은 어떤 형태로 공급되어도 좋지만, 저장 안정성의 관점에서 사용시 조제 가능한 형태, 예를 들면 의료 현장 또는 그 근방에서 의사 및/또는 약사, 간호사 또는 기타 치료사 등에 의해 조제될 수 있는 형태로 제공하여도 좋다. 이러한 예는 본 발명의 제 또는 조성물이 지질과 단백질, 핵산 등의 안정적인 보존이 어려운 성분을 포함할 때 특히 유용하다. 이 경우, 본 발명의 제 또는 조성물은 이러한 필수 구성 요소 중 하나 이상을 포함하는 1 개 또는 2 개 이상의 용기로 제공되며, 사용 전에 예를 들어, 24 시간 전 이내, 바람직하게는 3 시간 전 이내, 더욱 바람직하게는 사용 직전에 조제된다. 조제시에는 준비하는 장소에서 일반적으로 사용 가능한 시약, 용매, 조제기구 등을 적절하게 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 각종 첨가제 또는 조성물에 포함될 수 있는 활성 성분을 단독으로 또는 조합하여 포함하는 1 개 또는 2 개 이상의 용기를 포함하는 조성물의 조제 키트, 및 이러한 키트의 형태로 제공되는 각종 제 또는 조성물의 필요 구성 요소에 관한 것이다. 본 발명의 키트는 상기 외에 본 발명의 각종 첨가제 또는 조성물의 제조 방법과 투여 방법 등이 포함된 지시, 예를 들면 설명서와 CD, DVD 등의 전자 기록 매체 등을 포함해도 좋다. 또한, 본 발명의 키트는 본 발명의 각종 첨가제 또는 조성물을 완성하기 위한 구성 요소 모두를 포함해도 되지만, 반드시 모든 구성 요소를 포함하지 않아도 된다. 따라서, 본 발명의 키트는 의료 현장이나 실험 시설에서 일반적으로 사용할 수 있는 시약과 용매, 예를 들어, 무균수나 생리 식염수, 포도당 용액 등을 포함하고 있지 않아도 된다.
본 명세서에 기재되는 본 발명의 각종 치료법의 유효량은 예를 들어, 질환의 증상을 감소 또는 질병의 진행을 지연 또는 중지하는 양이며, 바람직하게는 질환을 억제 또는 치유하는 양이다. 또한 투여에 의한 이익을 초과하는 악영향이 생기지 않는 양이 바람직하다. 이러한 양은 배양 세포 등을 이용한 in vitro 시험이나 마우스, 렛트, 개 또는 돼지 등의 동물 모델에서 시험에 따라 적절히 결정할 수 있으며, 이러한 시험 법은 당업자에게 잘 알려진 것이다. 또한, 본 발명의 처리 방법에 사용하는 약물의 복용은 당업자에게 공지되어 있거나, 위의 시험 등에 의해 적절히 결정할 수 있다.
본 명세서에 기재되는 본 발명의 처치 방법에 있어서 투여하는 활성 성분의 구체적인 복용량은 처치를 요하는 대상에 대한 다양한 조건, 예를 들면, 증상의 정도, 대상의 일반 건강 상태, 연령, 체중, 대상의 성별, 식사, 투여시기 및 빈도, 병용하고 있는 의약, 치료에 대한 반응, 제형 및 치료에 대한 적합성 등을 고려하여 결정될 수 있다.
투여 경로로는 경구 및 비-경구 모두를 포함하는 여러 가지의 경로, 예를 들면, 경구, 정맥 내, 근육 내, 피하, 국소, 종양 내, 직장, 동맥 내, 문맥 내, 심실 내, 경 점막, 경피, 비강, 복강 내, 폐 내 및 자궁 내 등의 경로가 포함된다.
투여 빈도는 사용 물질 및 조성물의 성상이나 상기의 것을 포함하는 대상의 조건에 따라서 다르지만, 예를 들면, 1 일 수 회(즉 1일 2, 3, 4회 또는 5회 이상), 1일 1회, 며칠마다 (즉 2,3,4,5,6,7 일당 등), 1 주일마다, 몇 주마다 (즉 2, 3, 4주마다 등)이어도 좋다.
본 명세서에서 사용하는 경우, 용어 "대상"은 모든 생물 개체를 의미하고, 바람직하게는 동물, 더욱 바람직하게는 포유 동물, 더욱 바람직하게는 인간 개체이다. 본 발명에서 대상은 건강하거나 어떤 질병을 앓고 있거나, 어떤 질환에 이환하고 있어도 상관없지만, 특정 질병의 처치를 목적으로 하는 경우에는, 일반적으로는 이러한 질병에 걸려 있던가 이환 위험이 있는 대상을 의미한다.
또한 용어 "처치"는 본 명세서에서 사용하는 경우, 질병의 치유 일시적 회복 또는 예방 등을 목적으로 하는 의학으로 허용되는 모든 종류의 예방 및/또는 치료 적 개입을 포함하는 것이다. 예를 들어, "처치"의 용어는 질병 진행의 지연 또는 중지, 병변의 퇴축 또는 손실, 발병의 예방 또는 재발의 방지 등을 포함하는 여러 가지 목적의 의학적으로 허용되는 개입을 포함한다.
실시 예
다음에 본 발명을 실시 예에 의해 더 설명하지만, 이러한 예는 본 발명의 예시이며, 본 발명을 한정하는 것은 아니다.
예 1 : GST-π 녹아웃에 의한 RAS/Raf/MAPK 신호 캐스케이드에 미치는 영향
(1) 세포 배양
K-RAS 변이양성 대장암 세포주 M7609를, 10% 송아지 혈청(FBS)을 포함하는 RPMI-1640 배지에서 37℃에서 5% CO2를 포함한 대기 하에서 배양하였다. 또한 배지에 항생제로 100U/mL 페니실린, 100μg/mL 스트렙토 마이신을 추가했다.
(2) GST-π siRNA의 형질주입
형질주입의 전날 M7609 세포를 1×106 개/10mL가 되도록 항생물질을 포함하지 않는 10% FBS가 들어 있는 RPMI-1640 배지를 사용하여 100mm 조직 배양 플라스틱 접시에 파종했다. 1mL의 Opti-MEM I Reduced Serum Medium(GIBCO 사) 중에 GST-π siRNA(서열 번호 1 : GGGAGGCAAGACCUUCAUUTT, siRNA ID # 2385, Ambion 사)를 600pmol 추가하고 부드럽게 섞었다. 그런 다음 Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen 사)를 1mL의 Opti-MEM I Reduced Serum Medium 중에 35μL를 희석하여 부드럽게 혼합했다. 희석한 GST-π siRNA와 희석한 Lipofectamine RNAiMAX를 합쳐서 온화하게 혼합 한 후 실온에서 10 분간 배양했다. 그동안 배지를 10mL의 Opti-MEM I Reduced Serum Medium으로 교환했다. 10 분 배양 후 GST-π siRNA와 Lipofectamine RNAiMAX의 복합체를 세포에 첨가하여 37℃에서 5% CO2를 포함한 대기 하에서 배양하였다. 5 시간 배양 후, 10mL의 항생물질을 포함하지 않는 10% FBS가 들어 있는 RPMI-1640 배지로 교환했다. 또한 대조 실험으로 Scramble siRNA (서열 번호 2 : CGAUUCGCUAGACCGGCUUCAUUGCAG, 홋카이도 시스템 사이언스)를 이용하여 비슷한 작업을 실시했다. GST-π siRNA의 형질주입 후 각각 1, 2, 3, 4일째에 세포 수를 측정함과 동시에 GST-π 억제를 관찰했다. GST-π 억제는 아래와 같이 웨스턴 블럿법에 의해 분석했다.
(3) GST-π 억제(knockdown) 웨스턴 블럿 분석
GST-π siRNA의 형질주입 후 위 각 시점에서 채취한 세포를 이용하여 GST-π 억제 웨스턴 블럿 분석을 실시했다. 채취한 세포는 혈청 비포함 배지에서 16시간 배양하였다. 세포를 차가운 PBS로 씻은 후, 차가운 lysis buffer(1% NP-40, 50mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 1mM EDTA, complete Mini EDTA-free(Roche 사), PhosSTOP (Roche 사), pH7.5)를 첨가하여, 얼음으로 냉각하고, 30분간 배양하여 가용화했다. 4℃, 15000rpm에서 15 분간 원심 분리하여 세포 추출액을 얻었다. 얻어진 세포 추출액에 대해 Micro BCA Protein Assay Kit(Thermo SCIENTFIC 사)를 이용하여 단백질의 정량을 했다(GST-π siRNA 감염체: 4.35μg/μL, Scramble siRNA 감염체: 4.56μg/μL). 그런 다음 20μg의 세포 추출액을 환원 조건에서 변성시켜 멀티겔 II 미니 4/20(13W)(코스모 바이오 사)을 이용하여 SDS-PAGE를 실시하여 단백질을 분리하였다. SDS-PAGE 종료 후, 탱크 식 블럿팅 장치를 이용하여 PVDF 막에 전기적으로 전사했다. 전사 막을 5% 탈지유/0.05% Tween20 첨가 PBS(PBS-T로 약칭)에서 4℃, 16시간 배양하여 블로킹을 실시했다. 그런 다음 PBS-T로 희석 한 항 GST-π 항체(MBL 사)와 4℃에서 16시간 반응시켰다. 이차 항체 반응은 양 고추 냉이 퍼옥시 다아제(HRP) 표식한 토끼 항체를 사용하여 실온에서 1 시간 행했다. 그리고 화학 발광 기질과 실온에서 1 분간 반응시킨 후 X 선 필름을 이용하여 화학 발광을 검출했다. 각 작업 사이의 세정은 PBS-T를 이용하여 5 분간의 진탕을 3 회 실시했다. 또한 siRNA의 형질주입 후 1.0×105개/5mL가 되도록 60mm 조직 배양 플라스틱 접시에 파종하여 접시의 총 세포 수를 혈구 계산판을 이용하여 4 일째까지 계측하였다.
(4) RAS/Raf/MAPK 신호 캐스케이드에 관여하는 단백질의 웨스턴 블럿 분석
GST-π siRNA의 형질주입 후 2 일째에 채취한 세포를 이용하여 RAS/Raf/MAPK 신호 캐스케이드에 관여하는 주요 단백질에 대해 상기 (3)과 마찬가지로 웨스턴 블럿 분석을 실시했다. 항체로서 항 GST-π 항체 이외에, 항 p-Raf-1 (Ser338) 항체 (MILLIPORE 사), 항 Raf-1 항체(Santa Cruz 사), 항 p-MEK1/2(Ser217/221) 항체( Cell Signaling 사), 항 MEK1/2 항체(Cell Signaling 사), 항 p-ERK1/2 (Thr202/Tyr204) 항체(Cell Signaling 사), 항 ERK 항체(Cell Signaling 사), 항 GAPDH 항체(Abcam 사)를 사용하였다.
결과를 도 1 및 2에 나타낸다. 도 1a에서는 GST-π의 발현이 GST-π siRNA에 의해 억제되지만, Scramble siRNA는 억제되지 않는 것이 관찰되었다. 도 1b에서는 형질주입 후 4 일 경과 시점에서도 여전히 GST-π siRNA에 의해 안정적으로 GST-π의 발현이 억제되어 있는 것, 또, GST-π의 발현을 억제하면 억제하지 않은 경우와 비교하여 4 일간 배양 후 세포 수가 현저하게 적은 것으로 나타났다. 또한 도 2에서 GST-π siRNA 처리 군에서 RAS/Raf/MAPK 신호 캐스케이드에 관여하는 단백질의 인산화가 모두 Scramble siRNA 처리 군에 비해 저하되어있는 것으로 밝혀졌다. 따라서 GST-π의 발현 억제에 의해 RAS/Raf/MAPK 신호 캐스케이드 및 세포 증식 이상이 억제되는 것을 알 수 있다.
예 2 : GST-π 억제(knockdown)에 의한 유비퀴틴화에 미치는 영향
(1) GST-π 억제에 의한 Raf-1의 유비퀴틴화에 미치는 영향
M7609 세포의 배양 및 GST-π siRNA의 형질주입을, 예 1 (1) ~ (2)과 같이 행했다.
예 1 (3)과 마찬가지로, siRNA의 형질주입 후 2 일째부터 혈청 불포함 배지에서 16 시간 배양하여 세포 추출액을 회수했다. 얻어진 세포 추출액에 대해 Micro BCA Protein Assay Kit를 이용하여 단백질의 정량을 실시했다(Scramble siRNA : 8.88μg/μL, GST-π siRNA : 7.18μg/mL). 0.5μg 세포 추출액을 Dynabeads Protein G(Invitrogen 사)에 결합 된 항 Raf-1 항체와 혼합하고, 진탕기에서 부드럽게 혼합하면서 4℃에서, 2 시간 배양하여 Raf-1 단백질을 단리한 후, 항 유비퀴틴 항체(Santa Cruz 사)를 이용하여 예 1 (3)과 마찬가지로 웨스턴 블럿 분석을 실시했다. Raf-1의 프로테아솜 분해의 억제에 관여하는 Ser621의 인산화 수식은, 항 p-Raf-1(Ser621) 항체(MILLIPORE 사)를 이용하여 마찬가지로 살펴 보았다.
(2) GST-π 억제 하에서의 Raf-1 발현의 프로테아솜 저해제의 영향
M7609 세포의 배양 및 GST-π siRNA의 형질주입을, 예 1 (1) ~ (2)과 같이 행했다. GST-π RNA의 형질주입 후 2 일째부터 세포를 혈청 불포함 배지에서 16 시간 배양하였다. 5μM MG132에서 4시간 처리 한 후, 세포 추출액을 회수했다. MG132 처리의 제어로 하여, 0.05% DMSO 처리를 동일하게 수행하였다. 얻어진 세포 추출액에 대해 Micro BCA Protein Assay Kit를 이용하여 단백질의 정량을 실시했다 (Scramble siRNA-DMSO 처리 군:3.36μg/μ, Scramble siRNA-MG132 처리 군:3.16μg/μL, GST-π siRNA-DMSO 처리 군:3.12μg/μL, GST-π siRNA-MG132 처리 군: 3.16μg/μL). 20μg의 세포 추출액을 SDS-PAGE에 제공한 후, 항 p-Raf-1 (Ser338) 항체 및 항 Raf-1 항체를 이용한 예 1 (3)과 마찬가지로 웨스턴 블럿 분석을 실시했다.
(3) p-Raf-1과 GST-π의 공 면역 침강
M7609 세포의 배양을, 예 1 (1)과 같이 행했다. 이어서 예 1 (2) 단계에서 얻은 GST-π 억제 세포를 차가운 PBS로 씻은 후, 차가운 공 면역 침강 완충액(0.5% NP-40, 50mM HEPES, 150mM NaCl, 1mM EGTA, 1 0.5 mM MgCl 2 , complete Mini EDTA-free, PhosSTOP, pH 7.5)을 첨가하고, 얼음으로 냉각하여, 30 분간 배양하여 가용화했다. 4℃, 15000rpm에서 15 분간 원심 분리하여 세포 추출액을 얻었다. 얻어진 세포 추출액에 대해 Micro BCA Protein Assay Kit를 이용하여 단백질의 정량을 실시했다 (12.1μg/μL). 1mg의 세포 추출액을 Dynabeads Protein G에 복합 백신 p-Raf-1(Ser338) 항체 (US Biological 사)와 혼합하고 진탕기에서 부드럽게 혼합하면서 4℃에서 16시간 배양하여 공 면역 침강했다. 이어서, 항-GST-π 항체를 사용한 웨스턴 블럿 분석을 실시했다.
결과를 도 3 ~ 5에 나타내었다. 도 3으로부터, GST-π siRNA 처리 군에서 Raf-1과 함께 침강한 유비퀴틴 량이 Scramble siRNA 처리 군에 비해 많고, Raf-1의 유비퀴틴화가 증강되어 있는 것으로 밝혀졌다. 또한 도 4에서 GST-π siRNA에 의한 p-Raf-1의 발현 저하에 프로테아솜에 관여하고 있다는 것, 도 5에서 GST-π가 p-Raf-1과 결합하는 것이 각각 나타나 있다. 이상의 결과는 GST-π가 p-Raf-1과 결합하여 그 유비퀴틴화를 억제하고, GST-π의 억제에 의해, p-Raf-1의 유비퀴틴화가 촉진되고 p-Raf- 1의 존재 량이 감소하는 것을 시사하는 것이다.
예 3 : GST-π 억제(knockdown)에 의한 오토파지 및 아포토시스 유도 분석
(1) 면역 형광 염색에 의한 오토파지 유도 분석
GST-π 억제에 의한 오토파지의 유도를 오토파지 특이적 마커 단백질인 LC3의 면역 형광 염색법에 의해 분석했다. 예 1 (2) 단계에서 얻은 GST-π 억제 세포를 1×105개/2mL가 되도록 35mm 조직 배양 플라스틱 접시에 넣은 커버 슬립에 파종했다. 배지를 흡입한 후, 4% 파라 포름 알데히드 첨가 PBS를 첨가하여 실온에서 10분간 배양하여 세포를 고정했다. 세포의 침투화는 0.5% TritonX-100 첨가 PBS를 이용하여 얼음 위에서 5 분간 행했다. 차가운 PBS로 10분간 세정한 후, 1% BSA 첨가 PBS로 희석한 항 LC3B 항체(Invitrogen 사)와 습식 챔버에서 37℃에서, 1 시간 반응시켰다. 이차 항체 반응은 Alexa Fluor488 표식한 토끼 항체(Invitrogen 사)를 이용하여 37℃에서, 1 시간 반응시켰다. ProlongGold antifade reagent with DAPI를 사용하여 슬라이드 글라스에 장착하고 4℃에서 16 시간 배양했다. 항체 반응 후 세정은 PBS를 이용하여 37℃에서, 5 분간 3 회 실시했다. 형광 현미경 관찰시에 오토파지 양성 세포는, 세포질에 존재하는 점 모양의 LC3 신호를 가진 세포로 했다.
(2) 웨스턴 블럿에 의한 오토파지 유도 분석
GST-π 억제 세포의 오토파지의 유도를, 또한 LC3의 웨스턴 블럿 분석을 통해 분석했다. 예 1 (2) 단계에서 얻은 GST-π 억제 세포를 1×105 개/2mL가 되도록 35mm 조직 배양 플라스틱 접시에 넣은 커버 슬립에 파종했다. 소정 시간 배양 후, 세포 추출액을 회수하여 웨스턴 블럿 분석에 사용하였다. 일차 항체로서, 항 LC3B 항체 (SIGMA 사)를 이용하여, 전사 막과 4℃에서, 16 시간 반응시켰다. LC3 분자의 검출은, HRP 표식 2 차 항체와 반응시킨 후, 화학 발광 시약을 사용하여 행했다. 오토파지가 유도되어 있는지 여부는 LC3의 I 형(18kDa)과 II 형(16kDa)으로 이행하여 평가했다.
(3) 전자 현미경 관찰에 의한 오토파지 유도의 분석
예 1 (2)의 siRNA 형질주입 후 1 일째에 세포를 0.4×105 개/0.5mL가 되도록 8 웰 조직 배양 용 슬라이드에 파종했다. 2.5% 글루타르 알데히드를 포함하는 0.1M 카코질산 완충액(pH7.4)에서 1 시간 고정하고, 0.1M 카코질산 완충액으로 린스 한 후, 1% OsO4 와 1.5% 페로시안화 칼륨으로 2 시간, 후 고정했다. 에탄올로 10분간 3회 탈수 한 후, 에폭시 수지 (TAAB Laboratories Equipment 사)에 포매(包埋)하였다. 초박 절편은 다이아몬드 나이프로 제작하고, 초산 우라닐과 구연산 납으로 전자 염색을 하고, 절편을 전자 현미경(히타치 투과 전자 현미경 H-7500, 히타치 하이테크놀로지스)으로 관찰했다.
(4) TUNEL 염색에 의한 아포토시스 유도 분석
TUNEL 방법은 In Situ Cell Death Detection Kit, POD(Roche)를 이용하여 다음과 같이 행했다. 예 1 (2) 단계에서 얻은 GST-π 억제 세포를 1×105개/2mL가 되도록 35mm 조직 배양 플라스틱 접시에 넣은 커버 슬립에 파종했다. 매체를 흡인 후 4% 파라 포름 알데히드 첨가 PBS를 첨가하여, 실온에서 60분간 배양하여 세포를 고정했다. 내인성 퍼옥시다아제의 차단을 위해, 3% H2O2 첨가 메탄올에서, 실온에서 10 분간 배양했다. 이어 0.1% TritonX-100 첨가 0.1% 구연산 나트륨으로, 얼음 위에서, 2 분간 처리하여 세포의 침투화를 행했다. TUNEL 반응은 습식 챔버에서 37℃에서, 60 분간 행했다. TUNEL 양성 세포의 검출은, 퍼옥시다아제 표식 항 플루 오레세인 항체를 37℃에서 30 분간 반응시킨 후, DAB 기질을 이용한 발색 반응에 의해 행했다. 헤마톡실린으로 카운터 염색을 행하고, 광학 현미경으로 염색 세포를 관찰하고 TUNEL 양성 세포를 아포토시스 세포라고 평가했다. 각 작업 사이의 세척은 PBS에 의한 린스로 행했다.
결과를 도 6-10에 나타내었다. 도 6은 항 LC3 항체의 면역 형광 염색 상이며, 화살표로 나타낸 세포에서, LC3를 나타내는 점 모양의 신호가 관찰되었다. 이 LC3의 점 모양 신호는 오토파고솜이라고 추측되는 곳, GST-π 억제(knockdown) 세포에서 오토파지가 유도되고 있는 것을 알 수 있다.
도 7은 GST-π siRNA 형질주입 후 2 일 경과 시점에서, GST-πKD 세포의 전자 현미경 관찰 상이다. 왼쪽 도면에서 사각형으로 둘러싸인 A 부분의 확대 이미지가 오른쪽 도면이다. 오른쪽 도면에서 화살표로 표시된 부분에는 미토콘드리아를 둘러싸도록 오토파고솜이 형성되어있는 것을 확인할 수 있다.
도 8은 LC3의 웨스턴 블럿 결과를 나타낸다. 항 LC3 항체에 의해 인식되는 LC3 단백질에는 두 가지 형식이 존재한다. 오토파지가 일어나고 LC3가 지질 이중 막에 포함되면 LC3는 I 형에서 II 형으로 변화한다. 따라서 LC3-II 형의 검출량의 변화에 따라 오토파지가 유도되어 있는지 확인할 수 있다. 도 8의 결과에서 GST-π siRNA 처리 군에서 LC3가 I 형도 II 형도 함께 발현 유도되며, 특히 II 형의 현저한 증가가 확인되는 반면, Scramble siRNA 처리 군에서는 I 형, II 형 모두 발현이 낮고, I 형이 II 형에 비해 발현 량이 낮은 것을 알 수 있다.
이러한 결과에서 GST-π의 발현을 억제함으로써 오토파지가 유도되는 것을 알 수 있다.
도 9는 TUNEL 염색 결과를 보여준다. 상단은 Scramble siRNA 처리 군의 이미지이고, 하단은 GST-π siRNA 처리 군의 이미지이지만, GST-π를 억제한 세포에서 TUNEL 양성 세포, 즉 세포 사멸이 관찰되었다.
도 10은 GST-π siRNA 처리 군과 Scramble siRNA 처리 군의 오토파지 양성 세포 및 세포 사멸 양성 세포의 비율의 경시적 변화를 나타낸 그래프이다. 또한, 오토파지 양성 세포의 비율은 상기 (1)의 항 LC3 항체에 의한 면역 형광 염색 실험에서 세포 500 개에 대한, 점 모양의 LC3 신호를 가진 세포의 비율을, 아포토시스 양성 세포의 비율은 상기 (4)의 TUNEL 염색 실험에서 세포 1000개에 대한, TUNEL 양성 세포의 비율을 각각 나타낸다. 이에 따르면, 오토파지 양성 세포의 비율은 처리 후 급격히 증가하고 2 일째에 피크를 이룬 다음 하강하는 반면, 아포토시스 양성 세포의 비율은 4 일째까지 서서히 지속적으로 증가하고 있는 것을 알 수 있다.
예 4 : GST-π 녹아웃(knock out)에 의한 EGFR/PI3K/Akt/mTOR 신호 캐스케이드에 미치는 영향
(1) EGFR/PI3K/Akt/mTOR 신호 웨스턴 블럿 분석
일차 항체로 항 p-EGFR (Tyr1068) 항체 (Cell Signaling 사 ), 항 EGFR 항체 (Santa Cruz 사), 항 p-PI3K p85(Tyr458)/p55(Tyr199) 항체(Cell Signaling 사), 항 PI3K, p85 항체(MILLIPORE 사), 항 p-Akt(Ser473) 항체( Cell Signaling 사), 항 Akt 항체(Cell Signaling 사), 항 p-p70S6K(Thr389) 항체(Cell Signaling 사), 항 p-p70S6K(Thr421/Ser424) 항체(Cell Signaling 사), 항 p70S6K 항체(Cell Signaling 사)를 이용한 것 이외에는, 예 1 (1), (2), (4)와 동일하게 하여 EGFR/PI3K/Akt/mTOR 신호 캐스케이드를 구성하는 단백질의 발현을 분석했다.
(2) GST-π 녹아웃(knock out) 하에서 p-EGFR 발현의 프로테아솜 저해제의 영향
M7609 세포의 배양 및 GST-π siRNA의 형질주입을, 예 1 (1) ~ (2)과 같이 행했다. GST-π siRNA의 형질주입 후 2 일째 세포를 혈청 불포함 배지에서 16 시간 배양하였다. 5μM MG132에서 2 시간 처리 한 후, 세포 추출액을 회수했다. MG132 처리의 제어로 하여 0.05% DMSO 처리를 동일하게 수행하였다. 얻어진 세포 추출액에 대해 Micro BCA Protein Assay Kit를 이용하여 단백질의 정량을 실시했다 (Scramble siRNA-DMSO 처리 군 : 11.98μg/μL, Scramble siRNA-MG132 처리 군 : 12.29μg/μL, GST-π siRNA-DMSO 처리 군 : 8.91μg/μL, GST-π siRNA-MG132 처리 군 : 9.24μg/μL). 80μg의 세포 추출액을 SDS-PAGE를 한 후 항 p-EGFR (Tyr1068) 항체 및 항 EGFR 항체를 이용하여 웨스턴 블럿 분석을 실시했다.
(3) p-EGFR 및 GST-π 공 면역 침강
M7609 세포의 배양을, 예 1 (1)과 같이 행했다. 이어서 세포를 차가운 PBS로 씻은 후, 차가운 공 면역 침강 완충액(1.0% TritonX-100, 50mM Tris-HCl, 150mM NaCl, complete Mini EDTA-free, PhosSTOP, pH7.5)을 첨가하여, 얼음으로 냉각하고, 30 분간 배양하여 가용화했다. 4℃, 12000rpm에서 10 분간 원심 분리하여 세포 추출액을 얻었다. 얻어진 세포 추출액에 대해 Micro BCA Protein Assay Kit를 이용하여 단백질의 정량을 실시했다(9.08μg/μL). 1mg의 세포 추출액을 Dynabeads Protein G에 복합 백신 p-EGFR (Tyr1068) 항체 (Calbiochem 사)와 혼합하고 진탕 기에서 부드럽게 혼합하면서 4℃에서, 16 시간 배양하여 공 면역 침강을 실시했다. 이어서, 항 GST-π 항체를 이용하여 웨스턴 블럿 분석을 실시했다.
결과를 도 11~13에 나타낸다. 도 11에서 GST-π siRNA 처리 군에서 EGFR/PI3K/Akt/mTOR 신호 캐스케이드를 구성하는 단백질의 인산화가 Scramble siRNA 처리 군에 비해 감소하고 있는 것을, 도 12에서 GST-π siRNA에 의한 p-EGFR의 발현 저하에 프로테아솜에 참여하고 있다는 것을, 그리고 도 13에서 GST-π가 p-EGFR에 결합하는 것이 각각 나타났다. 이상의 결과는 GST-π가 p-EGFR과 결합하여 그 안정화에 기여하고 있으며, GST-π의 억제에 의하여, p-EGFR 유비퀴틴화가 촉진되고 p-EGFR의 존재 량이 감소하는 것을 시사하는 것이다.
예 5 : GST-π 저해제에 의한 세포 증식 등의 영향
(1) GST-π 저해제 EGFR 및 Raf-1의 인산화에 미치는 영향
M7609 세포의 배양을, 예 1 (1)의 순서대로 실행했다. 세포를 4.0×105 개/ 5mL가 되도록 60mm 조직 배양 플라스틱 접시에 파종했다. GST-π 저해제 C16C2(테이진 파마 사에 의뢰하여 제작)을 10,50,100μM이 되도록 가해, 24시간 후에 세포 추출액을 회수했다. 얻어진 세포 추출액에 대해 Micro BCA Protein Assay Kit를 이용하여 단백질의 정량을 실시했다(비 처리: 8.5μg/μL, 10μL: 8.49μg/μL, 50μM: 7.68μg/μL, 100μM: 6.4μg/μL). 50μg의 세포 추출액을 SDS-PAGE에 공급한한 후 각 단백질의 발현을 웨스턴 블럿 법에 의해 분석했다.
(2) GST-π 저해제에 의한 세포 증식 등에의 영향
M7609 세포의 배양을, 예 1 (1)의 수순에 따라 행했다. 세포를 1.0×105개/5mL가 되도록 60mm 조직 배양 플라스틱 접시에 파종했다. 16시간 후, GST-π 저해제를 50μM이 되도록 추가했다. 접시의 총 세포 수는 혈구 계산판을 이용하여 2 일째까지 측정했다. GST-π 저해제의 대조군으로 0.05% DMSO처리를 실시했다.
결과를 도 14 및 15에 나타내었다. 이러한 결과에서 GST-π 저해제에 의해서도 GST-π 억제와 마찬가지로, EGFR 및 Raf-1의 인산화(도 14) 및 세포 증식(도 15)이 억제되는 것으로 밝혀졌다 .
예 6: GST-π 녹다운 세포의 오토파지 저해제의 영향
(1) 세포 배양
예 1 (2)의 절차에 따라 GST-π siRNA의 형질주입을 한 후, 항생물질 불 포함의 배지로 교환하여, 3 시간 반응시킨다. 세포를 35mm 조직 배양 플라스틱 접시에 넣은 커버 슬립에 파종하고, 오토파지 저해제 3 - 메틸 아데닌(3-MA, SIGMA 사)를 1 및 5mM이 되도록 배지에 가한 후 소정 시간 배양했다.
(2) 오토파지 양성 세포의 평가
예 3 (1)과 마찬가지로, (1)에서 배양 한 세포를 항 LC3 항체로 면역 형광 염색했다.
(3) TUNEL 염색
예 3 (4)와 마찬가지로, (1)에서 배양 한 세포를 TUNEL 염색했다.
결과를 도 16 ~ 18에 나타낸다. 도 16은 각 군에서 세포 1000 개에 대한 오토파지 양성 세포의 비율을 나타내지만, 오토파지 저해제에 의해 오토파지 양성 세포의 비율이 현저히 감소했음을 알 수 있다. 도 17은 상단이 GST-π siRNA+1mM 3-MA 처리 군, 하단이 GST-π siRNA +5 mM 3-MA 처리 군을 나타낸다. 도 9 및 도 17로부터 오토파지 저해제의 병용에 의해, 세포 사멸 양성 세포가 현저히 증가하는 것을 알 수 있다. 도 18은 오토파지 저해제의 용량 의존적으로 세포 사멸이 더욱 유도되는 것을 나타내는 그래프이다. GST-π siRNA의 첨가에 의해 세포 사멸이 유도되었지만, 오토파지 저해제인 3-MA를 더욱 추가한 경우, 3-MA의 추가 용량에 의존하여 새로운 세포 사멸이 유도되었다. 따라서 GST-π를 억제하는 약물과 오토파지를 억제하는 약물을 결합하여보다 효율적으로 아포토시스를 유도할 수 있는 것으로 밝혀졌다.
SEQUENCE LISTING <110> Nitto Denko Corporation <120> Apoptosis-inducing agent <130> PCT2512ND <160> 2 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> GSTpi siRNA <400> 1 gggaggcaag accuucauut t 21 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Scramble siRNA <400> 2 cgauucgcua gaccggcuuc auugcag 27

Claims (14)

  1. GST-π를 억제하는 약물과 오토파지를 억제하는 약물을 활성 성분으로서 함유하는 아포토시스를 유도하기 위한 종양 치료제(劑).
  2. 오포파지를 억제하는 약물을 활성 성분으로서 포함하는, GST-π가 억제된 세포에 있어서 아포토시스를 유도하기 위한 종양 치료제.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 변이형 KRAS를 가진 세포에서 아포토시스를 유도하기 위한 종양 치료제.
  4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, GST-π를 억제하는 약물이 GST-π를 코드하는 DNA에 대한 RNAi 분자, 리보자임, 안티센스 핵산, DNA / RNA 키메라 폴리 뉴클레오티드 및 이들을 발현하는 벡터로 이루어진 군에서 선택되고, 오토파지를 억제하는 약물이 오토파지 관련 인자를 코드하는 DNA에 대한 RNAi분자, 리보자임, 안티센스 핵산, DNA/RNA 키메라 폴리뉴클레오티드 및 이를 발현하는 벡터로 이루어지는 군에서 선택되는 종양 치료제.
  5. 제 1항 또는 제 2항에 기재된 종양 치료제를 포함하는 의약 조성물.
  6. 제 5항에 있어서, 양성 또는 악성 종양, 과형성증, 켈로이드, 쿠싱 증후군, 원발성 알도스테론증, 홍판증, 진성 다혈증, 백반증, 과형성 흉터, 편평 태선 및 흑자증으로 이루어지는 군에서 선택되는 세포의 비정상적인 증식으로 인한 질병의 치료용인, 의약 조성물.
  7. 제 5항에 있어서, 양성 또는 악성 종양인 KRAS의 변이에 의한 질병의 치료용인, 의약 조성물.
  8. 제 5항에 있어서, 암 치료용인, 의약 조성물.
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