JP2001514873A - 結合特性が改善されたアンチセンスおよびアンチジーン治療薬並びにそれらの使用方法 - Google Patents

結合特性が改善されたアンチセンスおよびアンチジーン治療薬並びにそれらの使用方法

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Abstract

(57)【要約】 本発明は新規な核酸分子及びそれらの使用方法に関する。更に詳しくは、本発明の新規な核酸分子は通常のワトソン−クリック塩基対合によるだけでなく、アンチセンス分子を標的核酸にトポロジー的に“ロックされる”ようにする付加的な特徴により関係する標的分子としっかりと、かつ特異的に相互作用し、それにより改良された転写及び翻訳抑制特性を付与することができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の分野 本発明は、一般に診断薬および治療薬の他にプローブとしてのアンチセンスお
よびアンチジーンオリゴヌクレオチド並びにそれらの使用に関し、より具体的に
は、堅固な結合性を付与するために標的核酸分子とトポロジー的に結合し、その
結果、翻訳および転写抑制特性が改善されたアンチセンスおよびアンチジーンオ
リゴヌクレオチドに関する。本発明はまた、オリゴヌクレオチドのアンチセンス
特性およびトリプレックス（三重らせん）形成特性を改善し、それらオリゴヌク
レオチドをアンチセンスメカニズムによって二本鎖ＤＮＡに結合させるためにオ
リゴヌクレオチドに白金を付加する新規な方法に関する。
【０００２】 発明の背景 遺伝子発現の治療的調節のためのアンチセンスによるアプローチは、培養細胞
でも動物体でも効果的であることが示された（Crook, Antisense Nucleic Acid
Drug Dev. 8:115-122(1998); Matteucci & Wagner, Nature 384:20-21(1996);お
よびMesmaeker et al., Acc. Chem. Res. 28:366-374(1995)）。しかしながら、
ヌクレアーゼ耐性が改変されたオリゴヌクレオチドの体内配送を必要とする標準
的なアンチセンス法はいくつかの問題を有する。ホスホロチオエートおよび他の
誘導体の毒性が懸念されるし、細胞特異的配送も困難で、さらに標的細胞での量
は注入頻度によってのみ制御可能である。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオ
チド製造の自動合成法はなお高価で、いくつかの徴候について臨床的に有効なア
ンチセンス治療薬の使用を妨げるであろう。外因性オリゴヌクレオチドを導入す
る場合の厄介な問題は、多くの細胞でそれらオリゴヌクレオチドはエンドサイト
ーシスによって取り込まれ、核と反応するよりはエンドソームに閉じ込められる
ということである。この隔離の問題は、in situでアンチセンス遺伝子を転写し アンチセンスＲＮＡを生成するか、またはしばしば陽イオン性脂質を用いてオリ
ゴヌクレオチドを配送することによって避けることができる。このin situによ るアプローチは、非天然の有毒なＤＮＡ誘導体を避け、さらに、導入されたＤＮ
Ａが安定的に発現される場合にはアンチセンス分子またはリボザイムへの継続的
な暴露を可能にするという更なる利点を有する。さらにまた、調節下にある適切
なプロモータを用いて配送も外部シグナルによって調節できる。しかしながら、
アンチセンスＲＮＡは、コード領域への効果的な標的到着を達成するためにリボ
ヌクレアーゼＨの切断を利用することができない。効果を改善するリボース２’
位での改造もまたリボヌクレアーゼＨ活性を妨害する。リボヌクレアーゼＨによ
る活性がなければ、コード領域内のセンス−アンチセンス複合体は翻訳時にリボ
ソームの通過によって破壊される。二本鎖ＲＮＡ改造酵素もまたセンス−アンチ
センス複合体を破壊する。したがって、現時点ではアンチセンスＲＮＡとのハイ
ブリダイゼーションによってコード領域内の翻訳の遮断を達成することはできな
い。全てではないにしても、臨床試験のために開発中（または現在臨床試験中）
のほとんどのアンチセンス鎖は非コード領域内のｍＲＮＡと結合する。 上記を考慮すれば、上記で考察した標準的なアンチセンスによるアプローチに
固有の多くの制限を受けないin vivoおよびin vitroの両方で蛋白発現を効果的 にダウンレギュレートさせる、新規なアンチセンスおよびアンチジーン組成物並
びにそれら組成物の使用方法が強く希求される。特に、トポロジー的連結の種々
の形態を介して標的ＲＮＡ分子と結合した後に解離に対して耐性をもち、したが
って標的の転写および／または翻訳を効果的に抑制することができる新規なアン
チセンスおよびアンチジーン治療薬が要求される。
【０００３】 発明の要旨 本発明は、トポロジー的に標的核酸分子と結合することができ、それによって
堅固な結合特性および標的との解離耐性能力を付与することができる新規なアン
チセンスおよびアンチジーンオリゴヌクレオチドを用いて、細胞の遺伝子発現を
ダウンレギュレートする改善されたアンチセンスおよびアンチジーンオリゴヌク
レオチド並びにダウンレギュレートのための方法を目的とする。より具体的には
、本発明は、遺伝子発現の特異的制御のための新世代アンチセンスおよびアンチ
ジーン薬剤を目的とする。これらの薬剤は、（標準的アンチセンス薬剤のように
）単にワトソン−クリック対合形成力によってＲＮＡおよび／またはＤＮＡ標的
分子と結合するだけでなく、アンチセンスおよびアンチジーン分子を標的核酸上
に“ロック”し、それによってヘリカーゼ、リボソームまたは改造酵素によって
促進される解離に強い耐性を示す新たな別の特性を利用する。我々は、本明細書
で極めて堅固な結合の達成を開示し、この堅固な結合の要因であるメカニズムを
特定する。さらにまた、この方法が、無処置細胞の場合と同様に無細胞翻訳系で
リボソームスキャンニングを非常に効果的に遮断することを確認した。アンチセ
ンスまたはアンチジーンおよび標的分子をトポロジー的に一緒に“南京錠でロッ
クする”、核酸の構造を斟酌するこのアプローチは、特にアンチセンスおよびア
ンチジーンを制御することが可能で、さらに細胞特異的配送のための手段として
、一般的なアンチセンスおよびアンチジーン治療、遺伝子の機能分析および標的
の証明、および遺伝子治療のためにめざましい進歩である。in vitroおよびin v
ivoでこれらのアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いる方法もまたそれらを含 むキットとともに提供される。例えばオリゴヌクレオチドのアンチセンスおよび
三重らせん形成特性を改善するために、オリゴヌクレオチドの白金付加もまた提
供される。さらに、これらのアンチセンス構築物のいくつかの力学的特性を基に
した核酸の検出および増幅方法もまた提供される。
【０００４】 発明の詳細な説明 本発明は、標的核酸分子との解離に耐性を有する能力をもつ新規なアンチセン
スおよびアンチジーンオリゴヌクレオチドを用いて、細胞内の種々の蛋白質発現
をダウンレギュレートする改善されたアンチセンスおよびアンチジーンオリゴヌ
クレオチド並びにダウンレギュレートのための方法を目的とする。より具体的に
は、本発明は、新規なアンチセンスおよびアンチジーン分子並びのそれらの使用
方法を目的とし、この場合、新規なアンチセンスおよびアンチジーン分子は、（
標準的なアンチセンス薬剤の場合のように）標準的なワトソン−クリック対合形
成により標的核酸と堅固に結合するだけでなく、トポロジー的にアンチセンスま
たはアンチジーン分子を標的核酸分子に“ロックし”、それによってヘリカーゼ
、リボソームまたは改造酵素によって促進される解離に対して強い抵抗性をもち
、したがって翻訳抑制特性が改善される。
【０００５】 “トポロジー的に連結する”とは、アンチセンスまたはアンチジーンオリゴヌ
クレオチドが標的分子の周囲で環状化することを意味する。例えば、最初直線状
のアンチセンスまたはアンチジーン分子がｍＲＮＡ標的と結合し、ｍＲＮＡ標的
の周囲を包み込みさらに環状化する場合、追い出すことは非常に困難であろう。
エンドヌクレアーゼによる事象がこの環状分子で発生しないかぎり、この２つの
分子の間の水素結合が同時に破壊され、続いてｍＲＮＡが環の外へ抜けでなけれ
ばならないであろう。これは理論的には可能であるが、ｍＲＮＡの二次構造によ
ってその過程は動態力学的に極めて緩慢になるであろう。そのような分子は、本
明細書ではＲＮＡ標的と“トポロジー的に連結している”という。図１および２
は標的核酸とのトポロジー的なくつかの連結例を示している。我々は、そのよう
なトポロジー的な連結能力を有する分子を“南京錠”と称する。トポロジー的に
連結された分子は、本明細書で述べる多様なメカニズムの１つまたは２つ以上に
よって、標的核酸の構造に関係なく標的上に“ロック”または“留め金で固定”
される。標的核酸は直線状でも環状でもよく、またアンチセンスまたはアンチジ
ーンオリゴヌクレオチドを標的上でトポロジー的に連結させることができる他の
任意の形態をとることができる。トポロジー的に連結されたオリゴヌクレオチド
は、（１）オリゴヌクレオチドのバックボーンが破壊されるか、または（２）オ
リゴヌクレオチドを標的核酸の末端からはずし水素結合を破壊しないかぎり、そ
れらが結合している標的核酸分子から追い出すことはできない。本発明のアンチ
センスおよびアンチジーン分子は、標的分子と“実質的に相補的な”配列を有し
、これは、通常の塩基対結合によってそれらの間でハイブリダイゼーションを許
容するために十分相補的であることを意味している。そのような配列は完全に相
補的であってもよいし、また１つまたは２つ以上のミスマッチを含んでいてもよ
い。本発明の分子は、核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含む）またはその類似
体である。“その類似体”には、１つまたは２つ以上の非天然または合成塩基を
含む核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、１つまたは２つ以上のヌクレオチド間原子
（例えばイオウ、酸素、窒素など）を含む核酸が包含される。
【０００６】 本発明の新規なアンチセンスおよびアンチジーン分子が標的核酸分子にトポロ
ジー的に連結されるメカニズムは多様である。例えば、天然の核酸結合または連
結構造を介して触媒ＲＮＡ分子に連結されるアンチセンスを用いてもよい。触媒
ＲＮＡ分子は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’および３’末端を共有結
合または非共有結合によって互いに反応させることができ、それによって効果的
に標的核酸にアンチセンス分子を“トポロジー的に”連結させることができる。
ある実施態様では、本発明のアンチセンスまたはアンチジーン分子で有用な触媒
ＲＮＡはヘアピンリボザイムで、これは、タバコのリングスポットウイルスに付
随するサテライトＲＮＡのマイナス鎖に由来する（Buzayan et al., Nature 323
:349-353(1986a); Feldstein et al., Gene 82:51-63(1989); およびHampel & T
riz, Biochemistry 28:4929-4933(1989)）。ヘアピンリボザイムの触媒ドメイン
は、コンパクトで安定した構造をもち、特異的部位で自己触媒的に切断および連
結する能力を有し、共有結合によって閉じた環状形と非共有結合により閉じた環
状形（これは５’ＯＨ基および２’，３’−シクロホスフェート末端をもつ）と
の間で相互変換が可能である（図２）。したがって標準的アンチセンスまたはア
ンチジーンＲＮＡ分子（すなわち、一般に標的と標準的なワトソン−クリック塩
基対形成により結合するもの）が、ヘアピンリボザイムの触媒ドメインを含むよ
うに改造されたとき、この改造アンチセンスＲＮＡは、標準的ワトソン−クリッ
ク塩基対形成および他の同様な相互反応によってその標的を認識し結合するだけ
でなく、リボザイムの触媒機能によって標的分子上に“ロック”され固定される
。このリボザイムは、アンチセンス分子（またはそれをコードする核酸）が細胞
内に導入されるとき触媒として活性をもつものでもよいし、また下記に述べるそ
の後の事象に際して活性化されるものでもよい。種々の触媒ＲＮＡ分子が当分野
で知られており、標的核酸とのトポロジー的な連結を促進するために、アンチセ
ンスオリゴヌクレオチドとの連結に日常的に用いることができる。触媒ＲＮＡを
含むアンチセンスまたはアンチジーン構築物の例は、下記に述べるＡＴＲ構築物
である（図２および７を参照）。
【０００７】 アンチセンスまたはアンチジーン／分子標的複合体をさらに安定化させるため
に、アンチセンスまたはアンチジーン分子に三重らせん形成領域を導入してもよ
い。三重らせん形成領域は、アンチセンスまたはアンチジーン分子に取り込まれ
、さらにアンチセンスまたはアンチジーン分子とその標的の相補的配列の間で生
成される二重らせんとともに三重らせんを形成するために機能する核酸配列であ
る。三重らせん形成およびそのために必要な配列に関するさらに詳細な記載は下
記に提示されるが、三重らせん形成配列の利用性、標的核酸および対応するアン
チセンスまたはアンチジーン分子の配列に依存することは当業者には明らかであ
ろう。 本発明の新規なアンチセンスまたはアンチジーン分子が標的分子に効果的にト
ポロジー的に連結されるまた別のメカニズムは、標的分子との特異的結合に際し
て構造を形成する配列をその中に取り込むことによるものである。この場合、形
成された構造は、アンチセンスまたはアンチジーンオリゴヌクレオチドを標的分
子から容易に追い出させない“留め金”として本質的に機能する“ロック分子”
によって続いて結合される。“ロッキング分子”のための結合部位として役立つ
ように機能する配列は、一般にアンチセンスまたはアンチジーン分子の末端に配
置され、それによってそれら配列は、分子が標的と結合するとき相互作用するこ
とができる。これらの末端が相互に反応してロッキング分子結合部位を形成する
とき、それらはしばしば不安定でないように十分に弱い構造を形成する。しかし
ながら、この構造が実際にロッキング分子によって結合されるとき、この構造は
安定化され、標的分子との堅固な結合を維持する。上記で述べたように、ロッキ
ング分子は、実質的に配列または構造特異的態様で核酸構造物と結合するいずれ
のものでもよく、例えば蛋白質、核酸、金属イオン（単独でまたは核酸などの他
の成分と複合体を形成して）、有機または無機分子、薬剤などを含む。図３０Ａ
−Ｈは、これらのメカニズムのいくつかの模式図を提供する。この方法について
の更なる詳細は下記に提示する。
【０００８】 上記のアンチセンスおよびアンチジーン分子は、トポロジー的に連結される、
または標的周囲で環状に固定されるその能力のゆえに、標的分子と堅固に結合し
た複合体を形成する。これに関して、アンチセンスまたはアンチジーンポリヌク
レオチドを標的核酸分子に環状連結させることについて多くの利点がある。例え
ば、環状ＲＮＡ分子は直線状分子よりも細胞内の環境で一般により安定である。
直線状アンチセンスＲＮＡ（挿入遺伝子のin situ転写物として、または体内に 注射されたリボザイムとして）は、血液のような細胞外の液に存在する場合と同
様に細胞内でヌクレアーゼによる分解に特に感受性を有する。しかしながら、環
状化はほとんどの主要なヌクレアーゼ（これらはエキソヌクレアーゼである）に
よる損傷から防御される。例えば、in vitro実験で、共有結合によって閉環され
た血清中の環状オリゴヌクレオチドの半減期は、直線状のオリゴマーのそれより
少なくとも１００倍長いことが示された（Nilsson et al., Science, 265:2085-
2088(1994)）。さらにまた、ＨｅＬａ細胞の核抽出物および細胞質抽出物では、
環状リボザイム分子は、ヌクレアーゼ分解に対して直線状のリボザイムよりも強
い抵抗性をもつ（Puttaraju et al., Nucl. Acids Res. 21:4253-4258(1993))。
【０００９】 アンチセンスまたはアンチジーンオリゴヌクレオチドを標的核酸分子に環状に
連結することに関するまた別の利点は、直線状アンチセンスまたはアンチジーン
オリゴヌクレオチドで得られる結合強度および結合特異性と比較したときそれら
が改善されるということである。３０から４０ヌクレオチド程度の小さいアンチ
センス環状物は、ｍＲＮＡとしての標的配列と均整のとれた１５−１８ｂｐの二
重らせんを形成することができることが示された（Dolinnaya et al., Nucl. Ac
ids Res. 21:5403-5407(1993))。ＤＮＡの場合には、環状オリゴヌクレオチドは
、一本鎖ホモプリンまたはホモピリミジン核酸と三重らせん形成によって効果的
に結合することが示された（Kool, J. Amer. Chem. Soc. 113:6265-6266(1991))
。それらは、標的配列に対して通常の直線状オリゴマーよりも強い配列選択性お
よびより低いミスマッチ許容性を示す（Kool(1991)上掲書；Prakash & Kool, J.
Chem. Soc. Chem. Commun. 1161-1163(1991); Prakash & Kool, J. Am. Chem.
Soc. 114:3523-3527(1992); Wang & Kool, Nucl. Acid. Res. 22:2326-2333(199
4)）。同じ配列をもつ環状ＲＮＡおよびＤＮＡの比較によって、ＲＮＡ環状物は
、本明細書で述べる標的とのオリゴヌクレオチドのトポロジー的な連結がない場
合でさえ、ＤＮＡ環状物よりも極めて強い親和性で一本鎖ＲＮＡと結合すること
が示された(Wang & Kool(1994)、上掲書）。
【００１０】 小さなＲＮＡ分子はまた、アンチセンスおよびアンチジーン薬剤として有利で
ある。なぜならば、それらは、標的認識を妨害するまた別の構造に折れ曲がる可
能性を最小にするためである（Foster & Symons, Cell 50:9-16(1987); Hｅlｅn
e & Toulmｅ, Biochim. Biophys. Acta 1049:99-125(1990); およびDolinnaya e
t al.(1993)、上掲書）。しかしながら、in situ発現については、また別の配列
が高レベルまたは細胞タイプ特異的発現のために必要である。環状ＲＮＡが上記
で述べた理由のために活性なアンチセンスまたはアンチジーン薬剤である場合に
は、構造的問題を最も少なくする方法は、標的結合と無関係の一切の配列を最終
的な環状物から自己触媒的に切り出すことである。 我々は、標的核酸とアンチセンスまたはアンチジーンオリゴヌクレオチドをト
ポロジー的に連結させるために、ヘアピンリボザイムが適していると考えた。そ
の理由は、その触媒ドメインのコンパクトで安定な構造（Feldstein & Bruening
, Nucl. Acids Res. 21:1991-1998(1993); Anderson et al., Nucl. Acids Res.
22:1096-1100(1994);およびButcher & Burke, J. Mol. Biol. 244:52-63(1994)
）およびin vitroおよびin vivoの両実験でのその高い触媒活性（Yu et al.,Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6340-6344(1993); Chowrira et al., J. Biol. C
hem. 268:25856-25864(1994))のためである。ヘアピンリボザイムは、タバコリ ングスポットウイルスに付随するサテライトＲＮＡのマイナス鎖に由来する。前
駆体ＲＮＡは、自己切断によりモノマー単位を生じるマルチマーとして感染細胞
で合成される。このモノマー形は、共有結合によって閉じた環状物と５’−ヒド
ロキシルおよび２’，３’−シクロホスフェート末端を含む非共有結合によって
閉じた形態との間で自由に相互変換する。自己触媒的切断および連結は特異的部
位で生じる（図２Ｂ、下記記載を参照のこと）。
【００１１】 ヘアピンリボザイムは、触媒部分、基質部分および基質結合部分に分けること
ができる。変異誘発、欠失分析、化学構造マッピングおよびin vitro選別実験に
よって最小の４８ヌクレオチド配列（本明細書ではＥ４８またはミニモノマーと
呼ぶ）およびヘアピンリボザイム自己触媒機能のために要求される必須の二次構
造（Hampel et al., Nucl. Acid Res. 18:299-304(1990); Feldstein & Bruenin
g(1993）、上掲書；Anderson et al.(1994）、上掲書；およびButcher & Burke(
1994）、上掲書）（図２Ｂ、下記参照）が特定された。リボザイムと基質配列と
の複合体は以下を含むいくつかの因子によって安定化される：切断／連結部位近
くの対称的な内部ループと接する２つのらせん（ループＬＡ；図２Ｄ参照）、の
他にループ内（ループＬＡ内）およびループ間（ループＬＡおよびＬＢとの間）
の特異的な非標準的Ｈ−結合（Berzal-Herranz et al., EMBO J. 12:2567-2574(
1992); Butcher & Burke(1994)、上掲書）によってである。ヘアピンリボザイム
の基質と酵素部分との間の結合の構造および配列を置換または挿入のために用い
ることができる。 三重らせん：核酸三重らせんの最も一般的な対合形成モチーフは、ワトソン−
クリック二重らせんと対合を形成するピリミジンの第三鎖から成り、この場合、
チミンはＡ：Ｔ塩基対を認識し、プロトン付加シトシンはＧ：Ｃ塩基対を認識し
、さらに第三鎖は二重らせんのプリン鎖とパラレルである。最近になって、我々
は、このモチーフが第二のプリン第三鎖モチーフと合体して、純粋なホモプリン
−ホモピリミジンブロック以外の配列で三重らせん形成を許容することを示した
（Jayasena & Johnson, Biochemistry 31:320-327(1992a);Jayasena & Johnson,
Nucl. Acids Res. 20:5279-5288(1992b);およびJayasena & Johnson, Biochemi
stry 32:2800-2807(1993a)）。この能力は、本明細書で提唱するアンチセンス三
重らせんまたはアンチジーン三重らせんのアプローチを、これまでに可能であっ
たものよりもはるかに多様な標的配列に応用することを可能にする。
【００１２】 三重らせん形成には第三鎖のシトシンのプロトン付加が要求されるであろう。
シトシンのｐＫAは三重らせんで実質的に中性に移動するので、提唱される三重 らせんは生理的条件下で安定であると期待される。しかしながら、三重らせんの
安定性が限定される場合、構築物は第三鎖の位置でシトシンの代わりに５−メチ
ルシトシンで合成されるであろう。これによってｐＫはより高い値にシフトする
。 コードおよび／または非コード配列の少なくとも一部分が既知であるか、また
は容易に入手でき、さらにその発現を低下させることによって利益が得られるい
ずれの遺伝子も、本発明の新規なアンチセンスおよびアンチジーン分子のための
標的として有用である。本開示から明らかなように、本発明のアンチセンスおよ
びアンチジーンオリゴヌクレオチドを日常的に用いて、問題の標的核酸の実質的
にいずれのものとも結合させトポロジー的に連結させることができる。したがっ
て、本アンチセンス分子はアンチセンス治療分野で大きな前進を示すものである
。
【００１３】 細胞内への配送： 以前の実験では、触媒ＲＮＡは陽イオン性脂質、例えばＮ〔１−（２，３−ジ
オレイルオキシ）プロピル〕−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（
ＤＯＴＭＡ）を用いて細胞に配送することができることが示された（Sioud et a
l., J. Mol. Biol. 242:831-835(1991))。他の研究者ら（Zhu et al., Science
261:209-211(1993))は、ＤＯＴＭＡとジオレオイルホスファチジルエタノールア
ミン（ＤＯＰＥ）の１：１の比で、プラスミドＤＮＡ：ＤＯＴＭＡ：ＤＯＰＥ複
合体をマウスに静脈内注射した後プラスミドＤＮＡの全身的発現を達成した。他
の陽イオン性脂質製剤も市販ルートで入手できるようになり（例えばＤＯＳＰＡ
：ＤＯＰＥ、ＤＯＴＡＰ、ＤＭＲＩＥ：コレステロール、ＤＤＡＢ：ＤＯＰＥ、
および他のもの）、ＤＮＡの発現の改善が提供された。ジオクタデシルアミドグ
リシルスペルミン（ＤＯＧＳ）：ＤＯＰＥの１：１混合物によって、リボザイム
構築物をin vivoin vitroの両方で細胞内に効果的に導入できる（例えば以下を 参照されたい：Kisich & Erickson, J. Leukocyte Biol. Suppl. 2:70(要約）（
1991a)およびKisich & Erickson, FASEB J. 4:1860（要約）（1991b)）。下記に
示すように、１：１のＤＯＳＰＡ：ＤＯＰＥ（リポフェクタミン、Life Technol
ogies, Inc.)は、南京錠ＲＮＡをマウスマクロファージにin vivoおよびin vitr
oで導入するのに有効であることが示された。
【００１４】 本発明のアンチセンスおよびアンチジーン分子は、in vitroおよびin vivoの 両方で標的遺伝子の発現の低下または抑制に有用であろう。投与に関しては、ア
ンチセンスおよびアンチジーン分子は、当分野で既知の多様な技術（核酸感染（
トランスフェクション）、形質転換、感染などを含む）により直接投与できる。
さらに、発現構築物は、問題のアンチセンスまたはアンチジーン分子の連続的供
給源を細胞に提供することができる発現鋳型（誘発性または非誘発性）を提供す
るために用いることができる。したがって、遺伝子治療は本発明に包含される。
導入および導入核酸の発現誘発のための賦形剤は当分野で周知で、本発明で容易
に利用することができる。 我々はまた、ホモピリミジン配列のホスホロチオエート（ＰＯＳ）連結または
プリン富裕オリゴヌクレオチドのグアニン残基の選択的改造によって、アンチセ
ンスまたはアンチジーンオリゴヌクレオチドおよび三重らせん形成オリゴヌクレ
オチド（ＴＦＯ）の白金付加のための新規な方法を本明細書で開示する。
【００１５】 三重らせん形成に対する金属およびポリアミンの影響： 三本鎖核酸構造は、特に第三の鎖がホスホロチオエート置換のようなバックボ
ーンの改造を有する場合は通常は対応する二本鎖より安定性は低いという事実は
、アンチジーン薬剤としてＴＦＯの使用を制限する要因の１つである（Wilson e
t al., 1993; Lacoste et al., 1997)。核酸の三重らせんの相互反応のより低い
安定性は、少なくとも部分的には二本鎖に対する第三の鎖の付加された静電気的
反発によって生じる。さらにまた、ピリミジン富裕ＴＦＯを利用するほとんどの
三重らせんは生理学的ｐＨで安定ではなく（シトシンのプロトン付加のための必
要性のゆえに）、Ｋ＋の生理学的濃度は、プリン富裕ＴＦＯによる三重らせん形
成を妨害するであろう（Thuong & Helene, 1993)。プリン−プリン−ピリミジン
三重らせん形成に対するＫ+のマイナスの影響は、おそらくパラレル二重らせん （ＧＡ富裕ＴＦＯ）および／または四重体（ＧＧＧＧ含有ＴＦＯ）のような競合
構造におけるオリゴヌクレオチドの自己結合のためである（Musso & Van Dyke,
1995; Olivas & Maher, 1995a; Lacoste et al., 1997)。いくつかの一価、二価
および多価金属陽イオン（Malkov et al., 1993; Thuong & Henle, 1993; Kazak
ov, 1996; Ellouze et al., 1997）は陽イオン性ポリアミン（Thomas & Thomas,
1993; MUsso & Van Dyke, 1995; Pallan & Ganesh, 1996）と同様に、三重らせ
ん（ピリミジン富裕およびプリン富裕ともに）形成を促進する。
【００１６】 しかしながら、Ｋ+の抑制的影響は、Ｍｇ2+、スペルミン4+またはスペルミジ ン3+のような促進性補助因子の生理学的濃度によって完全に克服または逆転させ
ることができる（Musso & Van Dyke, 1995; Olivas & Maher, 1995a)。生理学的
条件下でプリン富裕ＴＦＯの凝集物を脱安定化させるアプローチはそれらの生物
学的利用を助けるであろう（Olivas & Maher, 1995a; Svinarchuk et al., 1996
）。この問題の驚くべき解決は、グアニンの代用として６−チオグアニンを用い
ることによって達成された。これは、おそらくＣ６位のイオウの影響半径の増加
およびＨ−結合能の減少が潜在的グアニン四重体の脱安定をもたらしたためであ
ろう（Olivas & Maher, 1995b)。我々は、Ｎ７位のグアニンの白金付加（図１７
Ｂ参照、これはまたＨ−結合による四重体形成に重要な役割を果たす）は、４つ
組グアニン仲介ＴＯＦ凝集に対して同様な抑制的作用を生じるであろうと提唱す
る。
【００１７】 三重らせん形成オリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドへ
の官能基の付加： 陽イオンによる三重らせんの安定性の強化は、それら陽イオンのＴＦＯとの共
役によってさらに開発できる。例えば、異なる陽イオンペプチド（Tung et al.,
1996)およびスペルミンのようなポリアミン（Tung et al., 1993)のホモピリミ
ジンオリゴヌクレオチドの５’末端への結合は、基本となる二重らせんの安定性
には影響を与えずに三重らせんの安定性を強化する。 ここで我々は、白金およびポリアミン陽イオンの共役物のＴＦＯへの付加を提
案する。現在のところ、ＴＦＯにつながれた白金複合体の三重らせんの安定性に
対する影響について利用可能な情報は存在しない。しかしながら、オリゴヌクレ
オチドの適切な“白金付加”はそれらの三重らせん形成能を損なわず、プラスの
影響を与える可能性すらあると考えることは合理的である。例えば、オリゴヌク
レオチドの末端部分、塩基部分または糖部分のいずれかに結合させた他のいくつ
かの金属複合体、〔Ｆｅ2+−ＥＤＴＡ〕および〔Ｃｕ+−フェナントロリン〕は 、三重らせん構造の化学的プローブとして用いられ成功した（Moser & Dervan,
1987; Francois et al., 1989; Beal & Dervan, 1992; Jayasena & Johnson, 19
92; Thuong & Helene, 1993; Shimizu et al., 1994; Tsukahara et al., 1996)
。
【００１８】 オリゴヌクレオチドへの他の官能基の共有結合による付加は、二本鎖および一
本鎖の相補的核酸に対するそれらの親和性を変更するために、さらに構造分析の
ためのレポーター基の導入、非放射性標識の提供、または合成“ エキソヌクレ アーゼ”の調製のために用いられた（概説として以下を参照されたい：Helene,
1993; Thuong & Helene, 1993; Plum & Pilch, 1995; O'Donel & McLaughlin, 1
996; Haner & Hall, 1997)。さらに別の官能基を市販の脱保護オリゴヌクレオチ
ドまたはそれらの誘導体に導入するために、多くの化学的および生化学的アプロ
ーチを用いることができる（概説として以下を参照されたい：Thuong & Helene,
1993; O'Donel & McLaughlin, 1996)。これらの中で、末端およびヌクレオチド
間ホスホロチオエート基の官能基付加は、ヌクレオチド残基の改造よりも多くの
利点を提供する（Chu & Orgel, 1994; Fidanza et al., 1994; O'Donnel & McLa
uglin, 1996)。利点の１つは、そのような部位での官能基または標識の付加は核
酸複合体の安定性を劇的に変化させることはないということである。置換ハロゲ
ン化アルキルによる末端ホスホロチオエートのイオウのアルキル化は、アンチセ
ンスおよび三重らせん形成オリゴヌクレオチドの官能基付加および／または標識
のために広く用いられた（Thuong & Helene, 1993; Chu & Orgel, 1994; Shimiz
u et al., 1994; Tavitian et al., 1998)。
【００１９】 ヌクレオチド間ホスホロチオエートジエステルは、末端ホスホロチオエートエ
ステルまたはアルキルチオールほど求核性ではない（O'Donnel & McLaughlin, 1
996)。しかしながら、反応基、例えばハロアセトアミド、アジリニルスルホンア
ミド、γ−ブロモ−α，β−不飽和カルボニル、およびモノブロモバ−ネイン（
O'Donnel & MaLaughlin, 1996)は、二価の水銀および白金（下記を参照）と同様
に用いて、チオエステルを改造して二価アダクツを形成することができる。これ
らは中性および酸性条件下で安定であるが、高ｐＨで水解を受ける。このアプロ
ーチの重要な特性は、合成オリゴヌクレオチド内の個々のホスホロチオエートの
位置にしたがって正確に官能基を配置することである（Ozaki & McLaughlin, 19
92）。さらにまた、すべてのヌクレオチド間ＰＯＳの改造は、多数の基、理想的
には各ＰＯＳについて１つの基の取り込みを可能にする（Conway et al., 1989;
Hodges et al., 1989; Conway & McLaughlin, 1991)。ホスホロチオエートオリ
ゴヌクレオチドのイオウの求核性はまた、それらを白金試薬と共役させるために
利用された（下記参照）。
【００２０】 ホスホロチオエート核酸の特異的白金標識： 白金（および水銀）化合物は、核酸内に天然に存在するか（例えばｔＲＮＡ分
子）または合成により取り込まれたイオウ原子と特異的に結合することができる
（Pal et al., 1972; Jones et al., 1973; Scheit & Faeber, 1973; Strothkam
p & Lippard, 1976; Strothkamp et al., 1978; Szalda et al., 1979; Chu & O
rgel, 1989, 1990, 1991; Elmroth & Lippard, 1994; Slavin et al., 1994）。
得られた改造核酸は、Ｘ線結晶学、電子顕微鏡法または重金属標識を必要とする
他の応用（Strothkamp & Lippard, 1976; Lippard, 1978; Strothkamp et al.,
1978; Szalda et al., 1979)の他に、アンチセンスおよびアンチジーンプローブ
のために（Chu & Orgel, 1989, 1990, 1991, 1992)潜在的な有用性をもつ。
【００２１】 しかしながら、核酸のホスホロチオエートの白金試薬反応性について利用でき
る定量的情報はほとんどなく、これまでのところ数種のそのような試薬が調べら
れただけである。それらのうちの１つは、〔（テルピ）ＰｔIIＸ〕n+（図１５）
で、これは、ヌクレオシドモノホスホロチオエート（ＡＭＰＳおよびＵＭＰＳ）
および二本鎖ポリ（ｓＡ−Ｕ）内のイオウ原子とほぼ定量的な結合を示し（Stro
thkamp & Lippard, 1976）、さらにその３’末端に改造ＣS−ＣS−Ａを含む酵母
ｔＲＮＡPhe内のイオウ原子ともほぼ定量的な結合を示した（Szalda et al., 19
79)。０．００５から５の範囲のｒf（白金対核酸分子比）をもつこの白金試薬の
４−４０μＭの間での反応を〔５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１
ＭＮａＣｌ〕緩衝液中で２５℃１０分実施した。ＡＧ５０Ｗ−Ｘ８（Bio-Rad)で
の陽イオン交換カラムクロマトグラフィーを用いて全ての非共有結合[(テルピ）
ＰｔＣｌ〕+を除去し成功した。精製した白金付加ポリリボヌクレオチドのホス ホロチオエート結合からの白金の損失またはホスホロチオエート結合の分解の証
拠は得られなかった。このデータは、白金試薬は、これらのポリリボヌクレオチ
ドのホスホロチオエート基に、たとえ白金試薬が過剰であっても選択的に結合す
ることを示した。（なぜならば、同じ条件下で対応する、全てがホスホロジエス
テルのＲＮＡへの白金結合は認められなかったからである（Strothkamp & Lippa
rd, 1976))。ＣS−ＣS−Ａ改造ｔＲＮＡ分子への結合は、２つの白金複合体の結
合（各ホスホロチオエート基について１つ）に関して完全であった。保温時間を
２４時間まで延長したときでも、各ＲＮＡ分子につき１＞ｒf＞５で〔（テルピ ）Ｐｔ〕部分の更なる結合は生じなかった（Szalda et al., 1979)。高分子電解
質作用のために（Gueron & Weibuch, 1981; Elmroth & Lippard, 1994)、陽イオ
ンおよびＨ−結合ドナーは、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの陰性
荷電表面に選択的に引きつけられる。その結果、ポリマー分子の近傍の高い局所
濃度、ポリマー表面の凝集、および多価陰イオンバックボーンに沿った高い移動
性は引きつけられた陽イオン試薬の反応性を顕著に高めることができる。反対に
、多価陰イオンに対する陰イオン試薬の反応性はモノマーまたは中性荷電ポリマ
ーとの反応性と比較して極めて低いはずで、陽性荷電ポリマーに対して強化され
るはずである。Elmroth & Lippard(1994）は、そのようなポリマー表面作用は、
シス−〔Ｐｔ（ＮＨ3）（ＮＨ2Ｃ6Ｈ11）Ｃｌ（Ｈ2Ｏ）〕＋（周知の抗癌剤シス
−〔Ｐｔ（ＮＨ3）2Ｃｌ2〕の反応形の類似体）（図１５）によるジヌクレオシ ド一燐酸ｄ（ＴＳＴ）の白金付加と比較して、ｄ（ＴＴＴＴＴＴＴSＴＴＴＴＴ ＴＴ）とのＰｔ−Ｓ連結の形成について約２５倍高い速度を提供する。一本鎖ホ
スホロチオエート含有ヘキサデカオリゴヌクレオチドおよびその対応するオリゴ
ヌクレオチド二重らせんに対するこの試薬の反応性に違いは認められなかった。
【００２２】 Orgelと共同研究者らは、種々の白金試薬によるＤＮＡ／ＲＮＡ二重らせん（C
hu & Orgel, 1989, 1990a, 1990b)、ＤＮＡ三重らせん（Gruff & Orgel, 1991) 、およびＤＮＡ−蛋白質複合体（Chu & Orgel, 1992)の特異的架橋のために、ホ
スホロチオエートおよびシスタミン基を含むオリゴヌクレオチドを用いた。架橋
実験は、３０−５０ｍＭのＮａＣｌＯ4、１−７ｍＭのＮａ−リン酸塩（ｐＨ７ −７．４）および０．０２５−０．１ｍＭのＥＤＴＡを含む緩衝溶液中で室温で
オリゴヌクレオチド誘導体（１８−７２ｎＭ）に対して大過剰の白金試薬（１−
５μＭ）の存在下で一晩実施された（Chu & Orgel, 1989; 1990a）。著者らは、
ＰＯＳオリゴヌクレオチドとの白金複合体の収量および性状を、これらの複合体
はゲル電気泳動でシャープなバンドを生じなかったので決定できなかったが、通
常の全部がホスホジエステルであるオリゴヌクレオチドの場合よりもホスホロチ
オエートオリゴヌクレオチドではるかに高い効率で架橋が生じるのを認めた（Ch
u & Orgel, 1989, 1992)。しかしながら、彼らは、陽性または中性荷電シス／ト
ランス−〔（ＮＨ3）ＰｔＣｌ2〕（およびそれらの水解生成物）は陰性荷電Ｋ2 〔ＰｔＣｌ4〕よりも反応性が高いことを見出した（Chu & Orgel, 1990a）。Chu
& Orgel(1990a)はまた、４つの反応性Ｐｔ−Ｃｌ同等物を有するＫ2〔ＰｔＣｌ 4 〕によるホスホロチオエートオリゴヌクレオチド内への分子内架橋の可能性を 論じ、そのような架橋生成物は（それらが生成されるとして）安定ではなく更な
る化学的変換を受けることに気付いた（Chu & Orgel, 1990a）。
【００２３】 ジエチレントリアミンはオリゴヌクレオチドの白金付加を触媒する： 水溶液中では、〔ＰｔＣｌ4〕2-（図１５）は、ポリヌクレオチド単独（Wheel
and et al., 1973; Chu & Orgel, 1989; Kasianenko et al., 1995)またはジエ チレントリアミン（ジエン）単独（図１６）（Watt & Cude, 1968;Mahal & Van
Eldik, 1987)で非常に緩徐に反応し、両事例で複合体混合生成物を生じることが
知られている。我々は、３成分混合物ではジエンの存在下では、たとえ低いマイ
クロモル濃度の白金濃度（１０−３０μＭ）であってもオリゴヌクレオチドの白
金付加は急速に（４５℃で＜２時間）かつ高収量の均質な生成物を生じながら進
行することを見出した。５０−１００ピコモルの白金オリゴヌクレオチド誘導体
を調製するために、わずかに０．３ナノモルの白金試薬が要求される。陽性に荷
電したジエンＨ2 2+は、おそらく〔ＰｔＣｌ4〕2-と多価陰イオンホスフェートバ
ックボーンとの間の静電気的反発を中和し、これら２つを非常に接近させ、オリ
ゴヌクレオチドへの最初の白金結合を刺激する（図１６）。続いて、オリゴヌク
レオチドは、陰性荷電核酸表面と予め結合している陽イオン性ポリアミンのため
に、ジエンによってつながれた白金のキレート化を促進させる。最終反応生成物
は、おそらくジエチレントリアミノ白金（ＩＩ）、〔ジエンＰｔ〕2+から成り、
ＰＯＳのイオウを介して（図１７Ａ）、またはグアニン残基のＮ７を介して（図
１７Ｂ）不活性で熱力学的に安定なアダクツを生成する。これらのアダクツはコ
ンパクトで、他の核酸とのハイブリダイゼーションを促進する潜在能力をもつ陽
性荷電を保持する（Lepre & Lippard, 1990)。白金基の付加された陽性荷電はま
た、調製用電気泳動（本研究で用いられる）またはＨＰＬＣによって白金付加オ
リゴヌクレオチドを反応混合物から容易に分離させる。我々はまた、金属親和性
クロマトグラフィーを、白金付加ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの一工
程精製方法選択肢として考えている。
【００２４】 この新規な合成方法の主要な利点は、放射性分子によるオリゴヌクレオチドプ
ローブの標識と関係がある。これは、どこの生化学実験室でも実施できる一試験
管反応である。多段工程、白金化合物の放射性合成および生成物単離工程のため
の特別な装置も技量も要求されない（比較のために以下を参照されたい：Hoesch
ele et al., 1980; Anad & Wolf, 1992; Azure et al., 1992)。放射性白金アイ
ソトープ193mＰｔおよび195mＰｔの比較的迅速な崩壊のゆえに〔ｔ1/2は約４日 （Stepanek et al., 1996)〕、オリゴヌクレオチドの全体的標識時間の短さ（精
製を含めて数時間）は非常に重要である。対照的に、長い（一晩から数日）多段
工程合成方法はまた別の白金試薬、例えば〔（ジエン）ＰｔＣｌ〕Ｃｌ（図１５
）（Mahal & Van Eldik, 1987)および〔（テルピ）ＰｔＣｌ〕Ｃｌ（図１５）（
Strothkamp & Lippard, 1976) （これはオリゴヌクレオチド標識に潜在的に有用
である）の調製に要求される。放射性白金製造の高コストのため、微量スケール
で高収量の合成方法が放射性白金試薬の製造で要求される。残念なことに、オリ
ゴヌクレオチド標識に適した白金試薬の無機的合成は微量スケール工程用に最適
化されていない。通常は、微量スケール合成の収量は、大規模工程で報告される
ほどには高くない（Azure et al., 1992）。例外は、〔195mＰｔ〕シス−〔（Ｎ
Ｈ3）2ＰｔＣｌ2〕の多段工程半自動化合成で、これは少なくとも８時間を要す る（Anad & Wolf, 1992)。しかし、シス−〔（ＮＨ3）2ＰｔＣｌ2〕（図１５） は、核酸複合体を不安定にする分子内架橋生成物の混合物を生じる傾向があるの
で特定のオリゴヌクレオチド標識には適切ではない（Sherman & Lippard, 1987;
Lepre & Lippard, 1990）。
【００２５】 核酸のホスホロチオエート（ＰＯＳ）類似体： 核酸のホスホロチオエート（ＰＯＳ）類似体は、末端またはヌクレオチド間ホ
スフェートの燐に結合した非架橋酸素の代わりにイオウをもつ（概説のためには
以下を参照された：Eckstein, 1983; Zon & Stec, 1991）。ホスホロチオエート
オリゴヌクレオチドは、選択された位置で、またはホスフェートバックボンーン
全体を通してＰ−Ｓ残基により構築できる。バックボーン改造は、ホスホロチオ
エートオリゴヌクレオチドについて以下を含む固有の物理化学的（下記参照）、
化学的（下記参照）および生化学的特性をもたらす：いわゆるＲpおよびＳp立体
異性体を生じる燐原子でのキラリティ；より強い求核性および重金属に対する親
和性（下記参照）；in vivoでの酵素切断に対する抵抗性；および35Ｓアイソト ープを用いる簡便な放射能標識。35Ｓ標識（さらにまた白金の放射能標識）は、
ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの濃度および分布についてin vitroおよ
びin vivoの両方で制御を可能にする。これらの分子的特性は、既に多様な生物 医学的、生化学的および生物物理的応用（例えばアンチセンスおよびアンチジー
ン技術、電子顕微鏡のための核酸重原子標識、核酸の金属親和性クロマトグラフ
ィー、触媒ＲＮＡ（リボザイム）、酵素生化学、核酸−蛋白質相互作用、および
オリゴヌクレオチド誘導変異誘発）で利用されてきた。 ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドはすでに重点的な生物学的検査に付さ
れているという事実は、白金付加類似体を用いる同様な実験を繰り返すことを容
易にするであろう。
【００２６】 ホスホロチオエートの調製と精製： 末端ホスホロチオエートは、ポリヌクレオチドキナーゼおよびＡＴＰγＳによ
って未改造オリゴヌクレオチドのＲＮＡおよびＤＮＡ両方のの５’末端に容易に
結合させることができ、さらにＲＮＡ（ＤＮＡではなく）の３’末端はＲＮＡリ
ガーゼおよびｄｐＣｐ（Ｓ）によってホスホロチオエート化できる（Eckstein,
1985）。 非架橋ホスホロチオエートは、化学的または酵素的方法によって核酸のバック
ボーン中に取り込むことができる（Zon & Stec, 1991）。ホスホロチオエートオ
リゴヌクレオチドの精製および分析のために効果的な分析用クロマトグラフィー
および調製用クロマトグラフィー（逆相ＨＰＬＣ）法は、アンチセンス薬剤とし
てのそれらの臨床的評価のために開発された（Zon & Geiser, 1991; Zon & Stec
, 1991; Padmapriya et al., 1994; Gerstner et al., 1995）。今のところ化学
的な立体特異的合成が利用できないので、ｎホスホロチオエート残基をもつ合成
オリゴヌクレオチドは、存在しうる２nジアステレオマー（ＲpおよびＳp）の混 合物である。少しのホスホロチオエート残基をもつオリゴヌクレオチドの立体異
性体のみが分離され、ＨＰＬＣによって精製できる（Chu & Orgel, 1990)。適切
な鋳型、ポリメラーゼ、およびチオトリホスフェートヌクレオチドを用いたホス
ホロチオエートポリヌクレオチド（ＲＮＡおよびＤＮＡ）の酵素合成によって、
Ｒp異性体が立体特異的に得られる。５０量体以上の長さのホスホロチオエート ポリヌクレオチドの精製プロトコルは、通常は金属親和性クロマトグラフィーお
よび電気泳動を基にしている（下記参照）。
【００２７】 ホスホロチオエートの物理化学的特性： ホスフェート内の酸素をイオウに置き換えることによって、残存する酸素の電
荷が減少し、イオウの陰性電荷は増加する。ホスホロチオエートのプロトン付加
は、ホスホロチオエートがホスフェートよりも強酸（より低いプロトン親和性を
もつ）であるのでイオウよりも酸素上で優先的に生じる（Frey & Sammons, 1985
; Liang & Allen, 1987)。 ホスホロチオエートの電荷の分極（Ｏ＝Ｐ−Ｓ）およびジアステレオマー連結
は、それらの複合体（アンチセンスおよび三重らせんの両方）の構造および安定
性について暗示させる（Frey & Sammons, 1985）。さらに、より大きなイオウ原
子およびより長いＰ−Ｓ結合（Ｐ−Ｏと比較して）は、特に三重らせんで立体的
混み合いを生じる（Latimer et al., 1989; Hacia et al., 1994）。さらにまた
、イオウは酸素よりも弱い水素結合を生じるので、ホスホロチオエート改造は、
二重らせんの大きな溝（major groove）における最初の水の殻との特定のＨ−結
合相互反応を妨害または改変することができるであろう（Hacia et al., 1994）
。生物物理的実験によって、もっぱら全てＲpもしくは全てＳpを含むオリゴヌク
レオチド、またはＰＯＳ連結のランダムなジアステレオマー混合物は、相補的一
本鎖および二本鎖配列に対して異なる親和性を有することが明らかにされた（Ki
m et al., 1992; Hacia et al., 1994; Lacoste et al., 1997）。
【００２８】 ホスホロチオエート（ＰＯＳ）オリゴヌクレオチド誘導体によって形成された
ＤＮＡ二重らせんは、ＰＯＳ連結数並びにそれらの立体化学およびＤＮＡ配列に
おけるそれらの位置によって通常は未改造のオリゴヌクレオチドで生成されたも
のより不安定である（Latimer et al., 1989; Kibler-Herzog et al., 1991; Ja
roszewski et al., 1992; Kanehara et al., 1995; Hashem et al., 1998）。例
えば、二重らせん〔ｄ（ＧＧｓＡＡＴＴＣＣ）〕2では、“ 内向き”の方向をも
つ（Ｓ原子が大きな溝の内部に面しているとき）Ｒpホスホロチオエート異性体 は、全部がホスホジエステルの二重らせんの場合よりわずかに１℃低いＴmを有 し、一方、“外向き”の方向をもつＳp異性体はＴmについて殆ど影響をもたない
（Zon & Geiser, 1991）。全部がＰＯＳの短いアンチセンスオリゴヌクレオチド
のより低い結合親和性は、いくつかのヌクレオチドによりそれらの相補的配列を
伸長させることによって簡単に埋め合わせることができる（Zon & Geiser, 1991
）。
【００２９】 三重らせん形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）では、末端のまたは末端近くの
少数のＰＯＳ連結（図１９参照）は、プリン（Lacoste et al., 1997）またはピ
リミジン富裕オリゴヌクレオチド（Kim et al., 1992; Alumni-Fabbroni et al.
, 1994; Xodo et al., 1994; Tsukahara et al., 1993, 1996, 1997)によって形
成された三重らせん複合体を著しくは不安定にしない。さらに、全部がＰＯＳの
連結をもつホモプリン（ＧおよびＡ富裕）オリゴヌクレオチドは、それらの配列
にしたがって、相補的二重らせんに対する結合親和性の顕著な低下を示さないか
（Latimer et al., 1989; Musso & Van Dyke, 1995; Joseph et al., 1997; Lac
oste et al., 1997)、または中等度の安定性の増加すら提供した（Latimer et a
l., 1989; Hacia et al., 1994; Musso & Van Dyke, 1995）。対照的に、全部が
ＰＯＳのホモピリミジ（Kim et al., 1992; Hacia et al., 1994）およびＧＴ含
有オリゴヌクレオチド（Lacoste et al., 1997）は、関連性をもつ、全部がホス
ホジエステルのオリゴヌクレオチド（Kim et al., 1992; Hacia et al., 1994）
と比較して、劇的に低い親和性で標的二重らせんＤＮＡと結合する。一般に、ピ
リミジンＴＦＯの誘導体に対する三重らせん形成の結合エネルギーは、ＰＯＳ連
結数にしたがって減少した（Lacoste et al., 1997）。しかしながら、２０％ま
でのＰＯＳ連結を有するピリミジンＴＦＯは、全部がホスホジエステルのオリゴ
ヌクレオチドの効率に匹敵する効率で転写を抑制することができる（Alumni-Fab
broni et al., 1994）。 実際のところ、それらはエキソヌクレアーゼに対する高い抵抗性を有するので
、ＰＯＳキャップ末端をもつオリゴヌクレオチドはin vivo実験では通常のオリ ゴヌクレオチドより優れているはずである（Alumini-Fabbroni et al., 1994)。
【００３０】 比較的新しい二官能基オリゴヌクレオチドプローブ（アンチセンスおよび三重
らせん形成ドメインを結合させている）（図１９ＤおよびＥを参照）は、ｍＲＮ
Ａ内の一本鎖のヘアピン領域を特異的に標的に到達させる（Brosalina et al.,
1993; Kandimalla et al., 1995; Francois & Helene, 1995; Moses & Schepart
z, 1996)。そのようなＴＦＯは、オルタネート鎖三重らせん形成によってＤＮＡ
を認識するオリゴヌクレオチド（Beal & Dervan, 1992; Jayasena & Johnston,
1992）および可撓性リンカーによって連結された２つのＴＦＯドメインを有する
ＤＮＡ（Kessler et al., ）と同様に、これらのドメイン間にＰＯＳ連結または
反応性を有する非ハイブリダイズ性ヌクレオチド配列を導入するために便利な部
位を有する（図１９Ｂおよび１９Ｃ参照）。我々は、これらの部位は、これらの
オリゴヌクレオチド能力を損なうことなく核酸標的との特異的複合体形成のため
の化学的な後改造に最適であるように思う。最近になって、パラレル鎖のヘアピ
ン複合体ループの内部のホスホロチオエートヌクレオチド間連結（図１９Ｅ参照
）は、三重らせん複合体の安定性に影響を与えないことが示された（Tsukahara
et al., 1997）。しかしながら、この問題に関するその他の情報は現在のところ
ない。
【００３１】 核酸内のプリンに対するホスホロチオエートの反応性： アデノシンのＮ７およびＮ１位はともに白金と結合することが知られているが
、Strothkamp & Lippard(1976)は、ｒfでの〔（テルピ）ＰｔＸ〕n+とＡＭＰＳ との間の反応では、結合はもっぱらイオウで生じることが示された。ポリヌクレ
オチドに関するこの実験とは対照的に、白金がＡＭＰＳより過剰に存在するとき
には塩基での反応が実際のところ観察された（Strothkamp & Lippard, 1976）。
白金に対するイオウの強い親和性を示す更なる証拠は塩基の予備結合実験から得
られた。この実験では、〔（テルピ）Ｐｔ（ＮＯ3）〕+は、２５℃で４５分で１
５０倍過剰のＡＭＰおよびＵＭＰの存在下で塩基と反応した（おそらくアデノシ
ンのＮ７／Ｎ１原子を介して）。しかしながら、この混合物に白金１モルにつき
１モルのＵＭＰＳを添加することによって、数分以内の〔（テルピ）Ｐｔ（ＵＭ
ＰＳ）〕の定量的形成が得られ、Ｐｔ−塩基結合からＰｔ−Ｓ結合への再構成が
生じたことが示唆された（Strothkamp & Lippard, 1976）。
【００３２】 嵩張る塩基よりも〔（テルピ）ＰｔＸ〕n+のコンパクトなホスホロチオエート
部分に向かう選択性は、Ｐｔ2+に統合された大きなテルピリジンリガンドによっ
て強化される。白金の周囲で立体的に妨害されている系は、塩基集積相互反応（
base stacking interaction)、Ｈ−結合とのかかわり合いまたは三次構造ケージ
を有する組織化されたポリヌクレオチドでは特に〔（テルピ）Ｐｔ〕と塩基との
間の反応速度（Howe-Grant & Lippard, 1980）を急激に減少させるはずである。
さらに、二重らせんへのテルピリジン（ＩＩ）複合体の強い挿入結合は、集積相
互反応への塩基の参画に対するそれらの反応性を低下させる（Lippard, 1980)。
【００３３】 〔（ジエン）ＰｔＣｌ）〕Ｃｌ（図１５）のアシドトリアミノ白金の構造およ
び、したがって一座配位子試薬（ただ１つの反応性調整因子Ｐｔ−Ｃｌをもつ）
としてのその化学的特性は、〔（テルピ）ＰｔＣｌ〕Ｃｌ（図１５）と同様であ
る。しかしながら、ジエチレントリアミンリガンドはテルピリジンよりはるかに
コンパクトで、挿入能をもたない。Savin et al.(1994)は、プリンの窒素（Ｎ７
およびＮ１）がｐＨ６．５で統合のために利用可能であったとしても、〔（ジエ
ン）Ｐｔ〕＋はまた、２５−４０℃の温度範囲でアデノシンホスホロチオエート
（ＡＭＰＳ、ＡＤＰ−β−ＳおよびＡＴＰ−γ−Ｓ）ともっぱら結合することを
確認した。複合体は、おもにホスホロチオエートヌクレオチドと二次反応により
生成される： 〔（ジエン）ＰｔＣｌ〕+＋ＡＭＰＳ −−＞〔（ジエン）Ｐｔ（Ｎｕ）〕 対照的に、未改造ＧＭＰ（Ｎ７を介して）およびＡＭＰ（Ｎ７を介して）の同じ
白金試薬による白金付加は、直接反応（マイナー経路）および間接反応（ヌクレ
オチドとの相互反応の前により反応性のアコ白金の生成を伴う）（主要経路）を
経る混合メカニズムを有する： 〔（ジエン）ＰｔＣｌ〕+＋Ｈ2Ｏ−−＞〔（ジエン）Ｐｔ（Ｈ2Ｏ）〕2+ 〔（ジエン）Ｐｔ（Ｈ2Ｏ）〕2+＋ＮＭＰ−−＞〔（ジエン）Ｐｔ（ＮＭＰ）〕
【００３４】 チオヌクレオチドの二次速度定数の規模は、ＧＭＰに対するそれより約２０倍高
く、ＡＭＰに対するそれより約５０倍高い（Slavin et al., 1994)。 イオウは、アコ化することなく〔Ｐｔ−アミン〕化合物と主にＣｌ-リガンド の直接置換を介して反応するので、〔（ジエン）ＰｔＣｌ〕+とグルタチオン（ ＨＳＤＲ）との間の反応は〔Ｃｌ-〕濃度とほぼ無関係で、一方、ＧＭＰとの反 応は高濃度のＮａＣｌで完全に抑制される（Reedjik, 1991)。対照的に、〔（ジ
エン）Ｐｔ（Ｈ2Ｏ）〕2+はほぼ選択的にＧＭＰと反応する（Reedjik, 1991)。
【００３５】 Elmroth & Lippard(1994）は、オリゴヌクレオチドの構造が一本鎖または二本
鎖であるか否かにかかわらず、シス−〔Ｐｔ（ＮＨ3）（ＮＨ2Ｃ6Ｈ11）Ｃｌ（ Ｈ2Ｏ）〕＋によるｄ（ＴＴＴＴＴＴＴＴＧＧＴＴＴＴＴＴＴＴ）のＧＧ部位の 白金付加（Ｎ７を介して）の速度は、ジヌクレオチドｄ（ＧＧ）の場合よりも約
３５倍高く、ｄ（ＴＴＴＴＴＴＴｓＴＴＴＴＴＴＴ）のホスホロチオエート部位
よりも約３倍低い反応性であることを示した。 白金試薬との反応では、Ｇｎクラスター（ここでｎ3２）はＤＮＡの最も反応 性の高い部位である（Bruhn et al., 1990; Lepre & Lippard, 1990; Gonnet et
al., 1996）。ＧＧＧ（およびもっと長いＧの紐）では、中央残基のＮ７は最も
求核性部位で、〔（ジエン）ＰｔＣｌ〕＋は優先的にこの部位を攻撃する（Yoha
nnes et al., 1993)。
【００３６】 理論的には、１つの〔Ｌ3Ｐｔ〕2+基（ここでＬはアミノリガンド）がすでに グアニンに結合している場合、隣接するグアニンと反応する第二の基を撃退する
ことが予想される。しかしながら、〔（ＮＨ3）3ＰｔＣｌ〕+（図１５）を用い たモデル実験では、グアニンにつながれた第一の〔（ＮＨ3）3Ｐｔ〕2+の反発作
用は非常に穏やかなものであることが判明し、化学量論的条件下でさえｄ（ＣＴ
ＧＧＣＴＣＡ）の第二のグアニンの白金付加を妨げなかった（Reeder et al., 1
996)。この結果は、Ｇｎクラスターの隣接するグアニンの多重白金付加の可能性
を与える。 したがって、ホモピリミジンホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（この場
合は最終的にＰＯＳ残基の選択的白金付加が得られる）とは対照的に、ホスホロ
チオエート基およびＧｎクラスターの両方を含むオリゴヌクレオチドの白金付加
はＰ−ＳおよびＰｔ−Ｎ７（グアニン）アダクツの混合物を生じる。 本発明の更なる詳細は下記の非限定的実施例で詳述する。
【００３７】 実施例１：腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）のアンチセンス仲介ダウンレギュ
レーション 腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）は感染に対する免疫反応で重要な役割を果
たす。しかしながら、このサイトカイン（カケチンとも称される）の過大な発現
は、細胞毒性、器官不全をもたらし、さらに敗血症性ショックの場合には死に到
らしめる（例えば以下を参照：Beutler & Grau, Crit. Care Med. 21:S423-435(
1993); Dinarello, J. Infec. Dis. 163:1177-1184(1991)）。さらにまた、ＴＮ
Ｆαはインターロイキン−１と一緒になって、慢性炎症併発疾患（例えば関節炎
）(Probert et al., Eur. J. Immunol. 25:1794-1797(1995)）とともに悪液質、
または消耗性症候群（Tracey & Cerami, Ann. N.Y. Acad. Sci/ 569:211-218(19
89))の病理発生を仲介することが示された。ＴＮＦαに対する抗体は、敗血症性
ショックおよび悪液質の致死的作用に対して防御することが示され（Beutler &
Grau(1993); Tracy & Cerami(1998)）、ＴＮＦαはアンチセンスおよびアンチジ
ーン治療の有望な候補対象であることが示唆された。 下記に示すように、我々は、マクロファージでのＴＮＦαの発現をin vitroお
よびin vivoの両方でダウンレギュレートさせることについて上記の方法の有効 性を調べた。具体的には、予め生成したアンチセンス−ＴＮＦαｍＲＮＡ複合体
がin vitroでの翻訳時にリボソーム通過を遮断する能力を調べ、アンチセンス配
列のみを有する従来の構築物と比較した。我々はまた、マクロファージ様細胞株
およびこの系についてすでに立証された配送方法を用いてマウスのマクロファー
ジで、本発明の構築物のＴＮＦα産生の抑制効果を調べた。
【００３８】 Ａ．アンチセンス分子の構築と構造 最小ヘアピンリボザイム配列＋アンチセンスおよび、ＴＮＦαｍＲＮＡの標的
配列に到達するようにした三重らせん形成部分（ＡＴＲ１）から成るキメラＲＮ
Ａを図２Ａに模式的に示すようにデザインした。Ｔ７プロモータをコードする１
５０ｂｐのＤＮＡフラグメント、ＴＮＦαＲＮＡの予め選択した領域と相補的な
２１−ｎｔ配列（“Ａ”）、潜在的三重らせん形成配列（“Ｔ”）、および最小
ヘアピンリボザイムの配列を、４つのオーバーラップしているオリゴヌクレオチ
ドからＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて組み立て、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
で増幅し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼで転写して前駆体（プレ−ＡＴＲ１）ＲＮＡ
を生成した。コントロール実験には“ＡＴ”と称するＲＮＡ種を用いた。これは
ＴＮＦαＲＮＡ標的と複合体を形成するために必要な三重らせん形成配列とアン
チセンスを含むが、触媒ヘアピンリボザイムドメインを欠いている。
【００３９】 成熟ＡＴＲ１配列と接する部位での転写時の一次プレＡＴＲ１ＲＮＡの３７℃
での自己プロセッシング（図２Ａの切断／連結部位参照）によって、多数のＲＮ
Ａ種（Ｒ２、Ｒ３ａ、Ｒ３ｂおよびＲ４と称する）が生じた。これらの個々のゲ
ル精製ＲＮＡ種の長さの比較並びにそれらの末端構造およびそれらが相互に変換
される態様の分析によって、明確に以下のように特定した：プロセッシングを受
けていない転写物（Ｒ２）、半分プロセッシングを受けた直線状ＡＴＲ１（Ｒ３
ａおよびＲ３ｂ）、完全にプロセッシングを受けた直線状ＡＴＲ１ＲＮＡ（Ｒ４
）、および成熟ＡＴＲ１ＲＮＡの環状形（図示されていない）。全てのこれらの
ＲＮＡプロセッシング事象は内部のリボザイム部分による自己触媒切断の結果で
ある。これらＲＮＡ種の特定は、５’−および３’−末端標識実験によって確認
された（データは示されていない）。直線状Ｒ４および環状種の自己連結および
自己切断による相互変換（図２Ｆ）は、広範囲の条件下で生じることが分かった
が、これは、他のヘアピン“ ミニリボザイム”について得られた結果と一致す る（Buzayan et al. (1986); Hampel & Tritz(1989); Chowrira et al., Bioche
mistry 32:188-1095(1993); Feldstein & Bruening (1993)9。
【００４０】 図２Ｂおよ２Ｃは、ＴＮＦαＲＮＡ標的とＡＴＲ１およびＡＴアンチセンスＲ
ＮＡ種との間で形成される複合体の推定される二次構造を示している。特にＡＴ
Ｒ１構造のデザインでは、我々は、共有結合によって閉ざされた環状形が連結に
よって得られやすくするために、ヘアピンリボザイムドメインの末端を接近させ
るように三重らせん形成成分を取り込ませた（図２Ｂ）。ＴＮＦαｍＲＮＡとア
ンチセンス配列との最初の結合の後で、ヘアピンリボザイムドメインの共有結合
による閉鎖がｎ−ループの他の末端との三重らせん形成によって促進され、これ
によってミニモノマーのＰ５ドメインはＤ８末端近くに配置される。二重らせん
および三重らせん領域の長さは、この２つの分子が相互に巻き込み合いしたがっ
て分離することができないように選択される。
【００４１】 直線種（Ｒ４）は、リボザイムの折り畳まれた構造が開かれるかぎり結合に際
して標的と完全に対合を形成する。対合を形成した後、おそらく三重らせん領域
の形成によって補助されて図２Ｂに示すように末端は再び互いに接近することが
可能である。リボザイムをその天然の構造に再度折り畳むことを許容する条件が
強力な結合のために必要で、これは標的周辺の末端に連結を発生させることによ
って最大になるはずである。偶発的に新しい連結が発生することによって、アン
チセンスＲＮＡと標的ＲＮＡとの共有結合による連結がもたらされるであろう。
２つの末端が、Ｐ５らせんと同様に三重らせんによって互いに接近した状態で保
持されるので、連結速度は増加し、一方切断速度はほぼ同じままである。したが
って、平衡は連結状態、共有結合で連結された状態にシフトするはずである。ｍ
ＲＮＡは、三重らせんがほどけ、さらに二重らせんがほどけた後で偶発的な切断
によってのみこの構造から遊離できる。これらの現象の３つ全てが発生する可能
性は極めて小さいと考えられる。
【００４２】 Ｂ．ＡＴＲ１アンチセンスオリゴヌクレオチドの結合特性の改善 ＴＮＦαｍＲＮＡの最初の７０９ｎｔ（本明細書では“ＴＮＦ１”と称する）
を含むＲＮＡ分子をｐＧＥＭ−４ベクター系およびＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用
いて転写し、種々のアンチセンスＲＮＡ分子のための標的として用いた。具体的
には、その環状“ Ｒ１”形と平衡状態のゲル精製ＡＴＲ１ＲＮＡ（“Ｒ４”形 ）（図３のレーン１−６）およびＡＴＲＮＡ（図３のレーン７−１２）（これら
は全てＴ７ＲＮＡポリメラーゼによって内部標識されている）を単独で保温する
か、または０．１μｇ／μｌのＴＮＦ１ＲＮＡ（図３のレーン２、５、８および
１１）もしくは０．２μｇ／μｌのＴＮＦ１（図３のレーン３、６、９および１
２）のいずれかとともに５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭＭｇ
Ｃｌ2中で６０分３７℃で保温した後、これらを６％の変性（８Ｍ尿素、２ｍＭ ＥＤＴＡ）ポリアクリルアミドゲルで電気泳動してからオートラジオグラムを作
製した。電気泳動の前に、全てのサンプルは等容積の２×ＦＬＳ（９０％ホルム
アミドおよび１０ｍＭＥＤＴＡを含む標準的ゲルローディング溶液）と混合し、
３７℃で５分（図３のレーン１−６）または９５℃で２分（図３のレーン７−１
２）保温した。
【００４３】 ＡＴＲ１アンチセンスは標的ＴＮＦαＲＮＡ分子と超強力な複合体を形成でき
ることを発見した。これらの複合体は、８Ｍ尿素、２ｍＭＥＤＴＡを含む６−８
％の変性ポリアクリルアミドゲルで４５℃で変性電気泳動を施して調べたとき、
近い移動性をもついくつかの個々のバンドとして検出できるほど安定であるよう
であった（図３、レーン２−３参照）。これらの発見は、高度に組織化されたＲ
ＮＡの変性ポリアクリルアミドゲルでの速度減速に関する報告と一致する（Dant
e et al., Anal. Biochem. 225:348-351(1995)）。さらにまた、〔32Ｐ〕標識キ
メラＲＮＡと非放射性ＴＮＦ１ＲＮＡとの複合体の電気泳動移動能は、〔32Ｐ〕
標識ＴＮＦ１単独のそれと比較してわずかに減速した。
【００４４】 コントロール実験では、我々はＡＴＲＮＡとともに“ｍ１０１”を用いた。Ａ
ＴＲＮＡは、上記で述べたようにヘアピンリボザイムドメインを欠くが、ＴＮＦ
１ＲＮＡと特異的複合体を形成することができる配列を保持し（図２Ｃ参照）、
ｍ１０１は、アンチセンスおよび三重らせん形成配列の代わりに最小ヘアピンリ
ボザイムドメイン＋無関係配列を含む（図２Ｄ参照）。最適条件下で〔32Ｐ〕標
識ＡＴＲＮＡと非放射性ＴＮＦ１との間で形成された複合体は電気泳動中に解離
し、ＡＴＲＮＡの主要バンドの後ろにスメアーを生じた（図３、レーン５−６）
。同様なスメアー発生は、ヘアピンリボザイムとその基質類似体との間で形成さ
れた複合体（これは長い分子間二重らせんによってさらに安定化されている）の
ゲル電気泳動分析について報告された（Feldstein et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 87:2623-2627(1990)）。〔32Ｐ〕標識ｍ１０１と０．０２−０．２μ
ｇ／μｌのＴＮＦ１ＲＮＡの混合物の同様なゲル電気泳動分析では特異的な減速
もスメアー発生も検出されなかった。
【００４５】 ＲＮＡ複合体を４５％ホルムアミドおよび５ｍＭＥＤＴＡに溶解し、９５℃で
２分加熱して変性条件下でゲル電気泳動に付したとき、ＴＮＦ１と〔32Ｐ〕標識
ＡＴＲ１ＲＮＡとの超強力な複合体が少量検出され、スメアー発生を誘発する安
定性のより低い複合体は全てこのような条件下では認められなかった（図３、レ
ーン７−１２）。我々は、このＲＮＡ複合体から過剰ＥＤＴＡによるＭｇ2+イオ
ンの高温抽出は、これらの複合体の不可逆性解離をもたらす重要な因子であるこ
とを発見した。さらにまた、マグネシウムイオンがＮａ−ＥＤＴＡまたはマンガ
ンイオンで置き換えられたとき、ＴＮＦ１ＲＮＡと〔32Ｐ〕標識Ｒ１／Ｒ４ＲＮ
Ａとの超強力複合体は形成されなかった（データは示されていない）。このこと
は、Ｍｇ2+は、活性な構造にＨＰＲが折り畳まれるの助けるが、Ｍｎ2+は助けな
いという事実と一致する。ＴＮＦ１ＲＮＡとアンチセンスＲＮＡとの複合体形成
の動力学的態様とゲルシフト分析によって、最初の結合（おそらく通常のワトソ
ン−クリックセンス−アンチセンス塩基対合形成による）は迅速で比較的弱く、
さらにＡＴおよびＡＴＲ１ＲＮＡについてほぼ同じ結合定数および形成速度で生
じることが明らかになった（データは提示されていない）。これらの一次複合体
は非変性条件下でゲル電気泳動によって検出できる。
【００４６】 Ｃ．リボソームスキャンニングまたは翻訳を遮断するＡＴＲアンチセンスの能
力の評価 我々は、ＡＴＲ１アンチセンスＲＮＡとＴＮＦαＲＮＡ標的との間の極めて強
化された結合安定性を明らかにしたが、この強力な複合体が、ｍＲＮＡ鋳型の５
’非翻訳領域のリボソームのスキャンニングまたはこの鋳型からの翻訳をどの程
度遮断することができるかを続いて調べた。したがって、我々は以下のようにし
てＴＮＦα−ルシフェラーゼ融合物（本明細書では“プロモータ−標的−開始コ
ドン（Promoter-Target-Start Codon)”を意味する“ＰＴＳ”と称する）を構築
した：Ｔ７プロモータ転写エンハンサーおよびＡＵＧ翻訳開始コドンと接するＴ
ＮＦα標的配列をｐＧＬ３コントロールベクター（Promega, Madison, Wisconsi
n)のＮｃｏＩ部位に挿入、ルシフェラーゼベクターはＳＶ４０翻訳プロモータお
よびエンハンサーを含んでいる（図４Ａを参照）。挿入物を連結する前にオープ
ンにしたＮｃｏＩ部位を部分的にふさいで、通常のＡＵＧおよび導入したＴＮＦ
α配列の直後の新しいＡＵＧを除外した。このプラスミド構築物を適切な部位で
直線化して転写し、転写物をリボマックス（Ribomax)in vitro転写キット(Prome
ga, Madison, Wisconsin）を用いてキャップを付けた。
【００４７】 ＰＴＳ融合物を５０ｍＭトリスアセテート（ｐＨ７．５）／１０ｍＭ酢酸マグ
ネシウム中で、単独または１０−４０倍モル過剰のＡＴＲ１もしくはＡＴアンチ
センスＲＮＡの存在下で１時間３７℃で予備保温した。続いて生じたセンス−ア
ンチセンス複合体をウサギの網状赤血球溶解物（Promega, Madison, Wisconsin)
に加えた。複合体のin vitro翻訳に続いて、ルシフェラーゼの産生を測定した。
ＴＮＦα標的配列を欠くＴ７プロモータ−ルシフェラーゼ発現プラスミド（本明
細書では“ＰＳ”と称する）を更なるコントロールとして用いた。 これらの実験結果は図４Ｂに示されている。具体的には、図４Ｂの結果は、Ａ
ＴＲ１アンチセンスＲＮＡは、ＡＴアンチセンスＲＮＡよりもはるかに効果的に
ＰＴＳｍＲＮＡの翻訳を抑制する。３０：１の最適〔ＡＴＲ１：標的〕分子比で
ＰＴＳｍＲＮＡとのＡＴＲ１アンチセンスＲＮＡの保温によって≧９５％の翻訳
抑制が得られ、一方、ＴＮＦα配列を欠くＰＳとのハイブリダイゼーションはほ
とんど翻訳抑制をもたらさなかった。コントロールＰＳｍＲＮＡのわずかな配列
非特異的抑制は、これらのＲＮＡとの間の相補性を有する短い領域（これは翻訳
条件下で複合体の形成をもたらすであろう）の出現によるものと考える。そのよ
うな観察はＲＮＡ−ＲＮＡアンチセンス手法では一般的で（Eguchi et al., Ann
. Rev. Biochem. 60:631-652(1991)）、細胞内の“校正用”蛋白補助因子によっ
て減少させることができるであろう。
【００４８】 Ｄ．他のアンチ−ＴＮＦＡＲＴ ＡＴＲ１６ａ、ＡＴＲ１６ｂおよびＡＬＲ２２９構築物（図７参照）は、それ
らがＴＮＦα標的分子の異なる領域を指令するという点を除いてＡＴＲ１構築物
と同様である。ＡＴＲ１６ａは、異なるホモプリン配列を標的とするという点で
ＡＴＲ１と異なっている。このホモプリンはＴＮＦＲＮＡの５’ＵＴＲに位置し
、より短い三重らせん形成配列を有し（複合体には三重らせんよりもっと多くの
二重らせんの回転が存在することを担保するために）、三重らせん形成配列はリ
ボザイムの連結部位の基部にあり、ＡＴＲ１ではそれは遠位にある。ＡＴＲ１６
ｂは、三重らせん形成領域と連結部位近くのらせんをつなぐリンカーがもっと長
いという点を除いてＡＴＲ１６ａと同一である。ＡＬＲ２９９は三重らせん形成
領域を含まないが、その代わりに（ＡＡＣ）6ループ（ある程度の自己集積構造 を提供するが自己対合形成構造は提供しないように選択された配列）を含む。し
たがって、ＡＬＲ２９９は三重らせん形成ホモプリン配列を標的として限定しな
いが、ＡＴＲ１のようにコード配列を標的とする。我々のこの４つのＡＴＲ／Ａ
ＬＲの各々は、標的との結合に際して切断−連結平衡を連結側にシフトさせるこ
とを意図した配列特性を含み、安定に連結された構造を形成するチャンスを最大
にする。ＡＴＲ１、ＡＴＲ１６ａおよびＡＴＲ１６ｂについては、結合時の三重
らせん形成は折り畳まれた構造の安定化を助けることが意図されていた。ＡＬＲ
２２９（三重らせん形成配列を欠く）については、我々は異なるアプローチを用
いた。具体的には、アンチセンス配列内で５’−ＧＧＣＵＧＡ−３’ブロックに
相補的であるように、連結部位に隣接する配列を５’−ＵＣＡＧＣＣ−３’に変
更した。この変更は通常は触媒活性に影響を与えないが、これら２つの配列の対
合形成は正常なリボザイムの折り畳みを脱安定化させる。結果として、そのＤＮ
Ａ鋳型から転写されるとき、ＡＬＲ２２９は部分的なプロセッシングのみを受け
、標的の非存在下では成熟した直線状または環状物のいずれも生成することはな
い。したがって、それは部分的にプロセッシングを受けた直線状分子として維持
され、立体的妨害を受けることなく標的の周囲を包み込むことができる。標的Ｒ
ＮＡに添加される際に、プロセッシングおよび環状物形成は効果的に進行する。
これは、おそらく標的ＲＮＡによる内部塩基対形成の破壊のためであるが、さら
に、リボザイムの残りのものを触媒的に活性な構造に折り畳むことを許容し、連
結を惹起する。その後の再切断がまた発生することは保証されなかったが、ルシ
ャトリエの物質作用の原理ために全体的な効果は共有結合による連結に有利であ
ろうと考えられた。
【００４９】 新規なＡＴＲ１６ａ、ＡＴＲ１６ｂおよびＡＬＲ２２９構築物のＴＮＦαＲＮ
Ａと強力な複合物を形成する能力は図１１に示す。具体的には、図１１は変性ゲ
ル上でのゲルシフト分析を示す。図１１の結果は、検査したＡＴＲおよびＡＲＬ
構築物の各々は標的ＴＮＦαＲＮＡと強力な複合体を形成できることを示してい
る。放射能標識ＲＮＡ（“ＴＴ”）はＡＴＲ１のための結合部位を含まず、この
実験では陰性コントロールとして用いられ、予想通り、減速した複合体を全く示
さなかった。
【００５０】 Ｅ．強力な複合体形成の動力学的態様 ハイブリダイゼーションと強力な複合体形成の相対的速度を知るために、種々
の時間一緒に保温した後ＡＴＲ−標的複合体の部分標本を取り、各部分標本の半
分を非変性ゲルで（強力または弱いハイブリダイゼーション複合体を検出するた
め）、他の半分を変性ゲルで電気泳動した。ＡＴＲ１６ａ、ＡＴＲ１６ｂおよび
ＡＬＲ２２９については、最初の動力学的態様は、相補的ハイブリダイゼーショ
ンおよび強力な複合体形成の両方でほぼ同一で（図２Ａ−Ｃ）、ハイブリダイゼ
ーションは速度限定工程であることを示している。対照的に、適切なＴＮＦ標的
とのＡＴＲ１の結合分析（図１２Ｄ）は、センスおよびアンチセンス配列のハイ
ブリダイゼーションによる最初の結合は比較的迅速で、ＡＴおよびＡＴＲ１ＲＮ
Ａの両方についてほぼ同じ結合定数および結合速度で生じることを示した（３７
℃、１０ｍＭＭｇＣｌ2および５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０でｔ1/2＝１
０分）。強力な複合体のＡＴＲ１ＲＮＡによる形成は、最初の結合より遅い反応
である（ｔ1/2＝４０分）。さらにまた、放射能標識ＡＴＲ１ＲＮＡは、過剰の 非標識ＡＴＲＮＡの添加によってＴＮＦ１ＲＮＡとの最初の複合体から追い出す
ことができるが、そのような置換は強力な複合体の形成後には検出できない。Ａ
ＴＲ１６ａ、ＡＴＲ１６ｂ、ＡＬＲ２２９の場合には迅速で強力な複合体が形成
されるということは、ＡＴＲ１よりもこれらの構築物を優れたものにする。
【００５１】 Ｆ．ＴＮＦαをダウンレギュレートさせるためにマクロファージへＡＴＲ１ア
ンチセンス構築物を配送する 生物学的に活性なＲＮＡ（Malone et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:
6077-6081(1989))およびリボザイム（Sioud et al., J. Mol. Biol. 223:831-83
5(1992))の効果的な配送が造血起源の細胞について示された。リポフェクタミン
（ＤＭＲＩＥ／ＤＯＰＥ；Life Technologies, Bethesda, Maryland)を用いて、
我々の構築物をin vivoおよびin vitroでネズミの腹腔マクロファージに導入し た。これは、リポフェクタミンが以前の実験で種々の他の脂質製剤より毒性が低
く優れていることが示されたからである（Kisich & Erickson, J. Leukocyte Bi
ol. Suppl. 2:70(要約）(1991a); Kisich & Erickson, FASEB J. 4:1860(要約）
(1991b))。 例えば、１０μｇの32Ｐ−標識ヘアピンリボザイム（ＨＰＲ）をリポフェクチ
ン（ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ）、ＤＭＲＩＥ／ＤＯＰＥまたはリポフェクタミンと
複合体を形成させ、マウスの腹腔内に１ｍｌの容積で投与した。マクロファージ
を８時間後に採集し、９７％ホルムアミド、５ｍＭＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳに
溶解させた。溶解物をゲル電気泳動および燐画像化によって分析し、マクロファ
ージ当たりの完全なＨＰＲ分子を算出した。結果を図５に示す。
【００５２】 図５に示すように、ただ１回の１０μｇのＨＰＲ／リポフェクタミン複合体の
腹腔投与を実施したマウスから単離された第一位のマクロファージは、細胞当た
り約３×１０6分子を蓄積したが、これはＤＭＲＩＥ／ＤＯＰＥまたはリポフェ クチンの場合よりもはるかに大きかった。取り込まれた分子は少なくとも２４時
間残留する（データは示されていない）。フルオレセイン共役ＨＰＲを同様に供
給した後採集したマクロファージの９０％以上が蛍光陽性であった（図６Ａおよ
びＢ参照）。リンパ球は検出可能な蛍光を示さないので、この態様での構築物の
配送は相応にマクロファージ（ＴＮＦαの主要な供給源）特異的である。リポフ
ェクタミンなしで投与されたＨＰＲは腹腔マクロファージにほとんど蓄積されな
い（図６ＣおよびＤ参照）。これらのデータを基に、我々の構築物をマクロファ
ージにin vivoおよびin vitroで配送するためにリポヘクタミンを使用すること が所望の効果を得るために適切であると判断した。
【００５３】 反応性マクロファージを産生するために、熟成滅菌チオグリコレート液状ブロ
ス１ｍｌ（Difco, Detroit, MI）を６週齢の雌のＣ５７ｂｌ／６ＮＣＲマウスの
腹腔に腹腔洗浄の３日前に注射した。生じた腹腔滲出細胞（ＰＥＣ）をハンクス
緩衝塩溶液（ＨＢＳＳ）を用いて洗浄によって得、１０％熱不活化ウシ胎児血清
添加イーグル最小必須培養液（ＥＭＥＭ）とともに２４穴プレートに１×１０6 ／穴（ウェル）で平板培養した。２時間付着させた後、ウェルを洗浄して非付着
細胞を除去した。 マクロファージまたはＲＡＷ２６４．７細胞（マクロファージ様細胞株）のin
vitroトランスフェクションのために、リポフェクタミンをポリスチレン試験管
でＨＢＳＳを用いて１：４に希釈し、渦動性ミキサーで攪拌し、さらにリボザイ
ム構築物を２．２−３．３：１〔ＤＯＳＰＡ：ＲＮＡ〕ホスフェート添加比で加
えた（リポフェクタミンは３：１のｗ／ｗ比のＤＯＳＰＡおよびＤＯＰＥから成
る）。再び渦動ミキサーで攪拌後、続いて直ちに１μｇのＲＮＡを含む量の混合
物を血清非含有ＥＭＥＭ洗浄細胞培養に添加し、３時間保温した。
【００５４】 in vivoトランスフェクションのためには、１０μｇのＲＮＡを各マウスに用 いることができるように量をスケールアップした点を除いて上記で述べたように
トランスフェクション試薬を調製した。渦動性ミキサーで攪拌した後、得られた
〔リポソーム：ＲＮＡ〕複合体の１ｍｌを３０ゲージ注射針を装備した１ｃｃの
注射筒に入れ、反応性マクロファージを補充するために先にチオグリコレートで
処置したマウスの腹腔に注射した。マクロファージをＨＢＳＳによる腹腔洗浄に
よって３時間後に採集した。滲出物を２４ウェルプレートに１×１０6／ウェル で平板培養し、２時間付着させてから非付着細胞を除去するためにＨＢＳＳで洗
浄した。 トランスフェクション後に上記のように単離したマクロファージ、またはＲＡ
Ｗ２６４．７細胞を１００ｎｇ／ｍｌのリポ多糖類（ＬＰＳ）で刺激し、ＴＮＦ
αの産生を誘発した。ＬＰＳ刺激後０、２、４、８および２４時間で上清のサン
プルを取り、定量まで−７０℃で保存した。定量はＴＮＦα特異的ＥＬＩＳＡ（
Biosource International)によって実施した。
【００５５】 Ｇ．ＡＴＲ１アンチセンスＲＮＡの内因性配送のためのベクターの開発 遺伝子治療でＡＴＲアンチセンスＲＮＡを使用することの実現可能性を明らか
にするために、これらの分子をコードする遺伝子を真核細胞発現ベクターに取り
込ませた。ＡＴＲ生成用の哺乳類高発現ＤＮＡベクターの構築方法は以下のとお
りである。ＡＴＲＤＮＡ鋳型の単一コピーまたは連鎖コピーをＰＣＲ反応で生成
し、ＣＭＶプロモータ駆動ｐＳ６５Ｔ−ＧＦＰ−Ｃ１ベクター（Clontech Labs,
Palo Alto, CA）のＧＦＰ（緑色蛍光蛋白質）発現領域の下流でクローニングす
る。本発明のＡＴＲのin vitro合成のために用いたＴ７プロモータによるベクタ
ーを、哺乳類のクローニング配列の生成のためのＤＮＡ鋳型として用いた。５’
オーバーハングプライマーを用い、ＥｃｏＲＩおよびＢｂｌＩＩのための制限ク
ローニング部位並びに真核細胞性終止コドンをＡＴＲ配列の上流に導入し、Ｔ７
プロモータは排除する。ただ１つのＡＴＲコピーを発現するベクターを、ＧＦＰ
ベクターのＭＣＳ内のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ部位でＡＴＲ鋳型をクローニング
することによって構築する。連鎖コピー発現ベクターは、ＢｇｌＩＩ頭部部位お
よびＢａｍＨＩ尾部部位の適合粘着末端間で頭部尾部連結のマルチマーを生成す
ることによって作製する。頭部頭部連結および尾部尾部連結は、連結混合物中に
存在するＢｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩ酵素によって抑制される（“スター（star
)”活性を避けるために１００ｍＭのＮａＣｌで）。頭部尾部連結はこれらの酵 素によって切断されないであろう。最終的なはしご状生成物はアクリルアミドゲ
ル電気泳動で単離し、ＧＦＰベクターのＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ部位でクローニ
ングする。これら２つの酵素によって切断されるその特徴によってインフレーム
の方向性をもつクローンを選別する。
【００５６】 発現構築物は、ネズミのマクロファージ様細胞株、ＲＡＷ２６４．７に電気穿
孔（９６０μＦｄおよび２３０Ｖ、この条件はこの細胞株で最適であることが以
前に明らかにされた）、または２：１の添加比で加えたＤＮＡとのリポフェクチ
ン複合体の脂質感染（リポフェクション）によって導入される。ＡＴＲアンチセ
ンスＲＮＡの発現レベルは、ノザン分析またはＲＴ−ＰＣＲ（Sambrook et al.,
(1998)）によって検定される。プラスミドによって発現される三重らせんアンチ
センスリボザイムの効能は、リポ多糖類でトランスフェクトした細胞を刺激し、
続いて上清中の分泌ＴＮＦαについてＥＬＩＳＡによって検定する。この一過性
発現アッセイで有効性が証明された構築物を、続いてアデノウイルスまたはアデ
ノ付随ウイルスベクター（Kozarsky & Wilson, Curr. Op. Gen. Dev. 3:499-503
(1993); Xiao et al., Adv. Drug Del. Rev. 12:201-205(1993))に取り込ませ、
in vivoでの有効性を評価することができる。必要な場合には、この基本ＡＴＲ カセット（アンチセンスおよび三重らせん形成配列をもたないＡＴＲ１）の更な
る最適化は、欠失分析および改良変型種の部分的任意抽出配列ライブラリーから
の単離によって実施される。最後に、アンチジーンの適用（この場合二本鎖ＤＮ
Ａが標的である）もまた試験できる。
【００５７】 Ｈ．結論 南京錠ＲＮＡ−標的複合体の優れた安定性を示す我々のデータは、南京錠アン
チセンスＲＮＡは、標的ＲＮＡの周囲に巻きつき、トポロジー的に標的ＲＮＡ分
子とそれらを本物の南京錠と同様な態様で連鎖によって連結することを提唱する
。ＡＴＲＮＡはそのような強力な複合体をＴＮＦ１標的と形成することができな
いので、この“錠”は明らかにヘアピンリボザイムドメインである。環状化プロ
ーブ分子は、ＴＮＦ１標的の二次構造および三次構造のために非変性条件で標的
ＲＮＡとともに一次元拡散で制限を受けるはずである。しかしながら、Nilsson
et al.（1994、上掲書）は、環状オリゴヌクレオチドプローブは、変性時には標
的鎖とともに顕著な距離を自由に移動することを示した。これらの発見と一致し
て、３９６−ｎｔより長い（ＴＮＦ１の３’末端と比較して）標的“ＴＮＦ２”
ＲＮＡと複合体を形成したＡＴＲ１アンチセンスＲＮＡは、より短いＴＮＦ１Ｒ
ＮＡ標的と複合体を形成したもの（センス配列は両標的ＲＮＡの５’末端から５
６３ｎｔであった）よりも変性条件に対してより耐性を有していた（データは示
さず）。 ＡＴＲ１アンチセンスＲＮＡにおけるヘアピンリボザイムドメインの共有結合
による環状化（自己連結）は、ＴＮＦ１標的との強力な複合体形成のために厳密
には要求されないことを我々は発見した。したがって、上記で考察したように、
５’−〔32Ｐ〕−ホスフェートおよび３’−ＯＨ末端をもつＡＴＲ１ＲＮＡ（す
なわち“Ｒ４”形）は共有結合の環状ＲＮＡを形成することができないことを我
々は示した。しかしながら、共有結合切断は明らかに最も強力な南京錠を生じる
はずであるという事実にもかかわらず、この“ 末端が間違って燐酸化されてい る”ＲＮＡ分子もまた、ＴＮＦ１標的と強力な複合体を形成することができた。
さらに最近の結果は、連結能をもつリボザイム標的複合体のある分画ははるかに
安定で、このことはこれらが共有結合によって連結されていることを提唱する。
【００５８】 自己切断および自己連結の両方に必要なヘアピンリボザイムの構造は本質的に
同一であることが示されたので（Chowrira et a.(1993); Butcher & Burke(1994
))、切断／連結部位の共有結合自体は、触媒的に活性なリボザイム構造の安定化
におそらく役割をもたない。同様な特色が環状に変更されたｔＲＮＡについても
示されたが、これは、それらのヌクレオチド鎖がらせんの中央またはアンチコド
ンループ内でニックを入れることによって妨害されたときでさえ同じ構造を形成
することができる（Pan et al., Science 254:1361-1364(1991))。切断部位を貫
通する共通の軸をもつ集積は、おそらくこれらの構造を安定化させる因子の１つ
であろう（Walter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:9218-9222(1994))
。最近得られた結果（Butcher & Burke(1994))は、ヘアピンリボザイムは安定な
、マグネシウム依存性三次構造（この構造では、切断／連結部位に隣接する配列
ははおそらく非ワトソン−クリック塩基対合反応に必要とされる）をとることを
示唆する。
【００５９】 実施例ＩＩ−ＡＴＲ構築物によるＴＮＦαの抑制 種々の抗ＴＮＦαアンチセンス構築物のＲＡＷ２６４．７細胞からのＴＮＦα
の分泌を抑制する能力を決定した。具体的には、２×１０5ＲＡＷ２６４．７細 胞を４．５μｇのアンチセンス構築物ＡＴＲ１、ＡＴＲ１６ａ、ＡＴＲ１６ｂも
しくはＡＬＲ２９９、またはコントロールＲＮＡ（ｍ１０１）で上記の節Ｉ−Ｆ
に記載したように処理した。ＲＮＡは３．３：１の添加比のリポフェクタミンと
１ｍｌのＤＭＥＭ中で２時間複合体を形成させた。上清のＴＮＦαは、１００ｎ
ｇ／ｍｌのＬＰＳで刺激後間隔を増しながら特異的ＥＬＩＳＡで測定した。これ
らの実験の結果は図１０に示す。 図１０に示したように、南京錠ＲＮＡＡＴＲ１、ＡＴＲ１６ａ、ＡＴＲ１６ｂ
もしくはＡＬＲ２９９は、培養で増殖させたＲＡＷ２６４．７細胞によるＴＮＦ
α蛋白質の分泌を顕著に抑制することができた。対照的に、コントロールＲＮＡ
（ｍ１０１）で処理した細胞または未処理細胞はなお、アンチセンス処理細胞よ
りも顕著に高いレベルでＴＮＦαを産生した。これらの結果は、構築物ＡＴＲ１
、ＡＴＲ１６ａ、ＡＴＲ１６ｂもしくはＡＬＲ２９９は、ＴＮＦα蛋白質の発現
をこれらの構築物で処理した培養細胞で抑制できることを示している。
【００６０】 トランスフェクション複合体の脂質：ＲＮＡ添加比を３．３：１から２．２：
１に下げたという点を除いて全く同じように上記の実験を繰り返し、これによっ
て結果が改善された。この改善は、図１３（ここでは、８時間での時点における
ＴＮＦα分泌がＲＮＡ用量に対してプロットされている）に示した用量反応曲線
で明瞭である。ＡＬＲ２２９は、比特異的な毒性を引き起こさないレベル（この
レベルでのｍ１０１による分泌における剥離の欠如によって示されたとおり）（
各々２×１０5細胞を含むウェルにつき１０μｇ）でＴＮＦαの分泌を９０％抑 制し、最も有効であることが明らかにされた。ＡＴＲ１６ａは、このアッセイで
はＡＴＲ１６ｂよりも有効であることが判明し（データは示さず）、より短いリ
ンカーは明らかにより好ましい結合特性を提供することを示した。
【００６１】 これらのデータは以下の点を明らかにする： １． ２．２：１のリポフェクタミン：ＲＮＡ添加比は、先に用いられた３．
３：１の比よりはるかに毒性が少ない（例えば図１０）。この製剤は、コントロ
ール群（アンチセンス配列を欠く構築物（ｍ１０１）を投与された群）でＴＮＦ
α分泌を減少させることなく以前に用いられた用量の２倍以上を許容する。 ２． 標的の選別はホモプリンブロックに限定されず、任意の配列が可能であ
る。例えば、ＡＬＲ２９９（これは三重らせん形成配列を含まず非ホモプリン配
列を標的とし、これらの分子の最も強力なアンチセンスである（ＩＣ50は約４６
ｎＭ）。 ３． ハンマーヘッドリボザイムまたはＲＮＡ分解酵素Ｈによる切断に依存す
るアンチセンスＤＮＡとは対照的に、その有効性発揮のためにそれらの標的ｍＲ
ＮＡの切断に依存しないアンチセンス分子（ＡＴＲ１、ＡＬＲ２２９）を用いて
細胞内のコード領域を有効に標的とすることが可能である。これは、我々の知る
かぎりでは以前には全く達成されなかった。 ４． 我々のより新規な南京錠ＲＮＡ構築物は最初の我々のＡＴＲ１よりも一
層優れている。したがってＡＴＲアプローチはデザインの刷新によってさらに改
善することができる。にもかかわらず、デザインした４つの構築物のうち３つま
たは４つが細胞分析で有効であったという事実は、我々の基本的なデザイン原理
が、アクセス可能な２、３の例に限定されず、むしろ普遍的であることを示して
いる。
【００６２】 実施例ＩＩＩ−ＴＮＦαのマウスでの抑制 マウスでのin vivo有効性の試験のために、細胞培養アッセイで最も有効な我 々の南京錠ＲＮＡを選んだ（図１４）。in vitroアッセイの場合のように、ＡＬ
Ｒ２９９とリポフェクチンで複合体を形成させ、腹腔内に供給し、その後マクロ
ファージを回収し、図１４の図面の簡単な説明に記載したようにＬＰＳ刺激後に
ＴＮＦα産生についてin vitroでアッセイした。明らかにリポフェクタミンの前
炎症作用のためにある程度の非特異的ＴＮＦα分泌刺激が認められたが、ＡＬＲ
２９９を投与されたマウスは、無関係の遺伝子（ヒトＶＣＡＭ−１；ヒトのＶＣ
ＡＭ−１ＡＴＲはマウスのＶＣＡＭ遺伝子にも他のいずれの遺伝子にも結合しな
いと考えられる）の指令をもつコントロールＡＴＲを投与されたマウスによって
示されたＴＮＦα産生レベルの半分を示した。これは、ＡＬＲ２９９がin vivo で顕著なアンチセンス活性をもつことの強力な証拠であると考える。これはまた
、リポフェクタミン（および一般に陽イオン性脂質）は、抗ＴＮＦα薬剤のin v
ivo配送のための最善の賦形剤ではないであろうということを示唆している。
【００６３】 実施例ＩＶ−アンチセンス仲介ＶＣＡＭのダウンレギュレーション 損傷または感染に対する反応で、白血球は、その領域内の血管の壁に並ぶ内皮
細胞に粘着し、血管壁を通過して影響を受けている組織に移動する。この過程は
、内皮細胞表面のいくつかの粘着分子（セレクチン類に属するもの（Ｐ−セレク
チン、Ｅ−セレクチン）（Lawrence et al., Cell 65:859(1991)）および免疫グ
ロブリン類に属するもの（ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２およびＶＣＡＭ−１)(Op
penheimer-Marks et al., J. Immunol. 147:2913(1991)を含む）のサイトカイン
誘発発現によって仲介される。ＶＣＡＭ−１は、ＩＬ−１、ＩＬ−４およびＴＮ
Ｆによって誘発され、サイトカイン処理後１０−１４時間で最大レベルに達し、
７２時間まで上昇したままである（Rice & Bevilacua, Science 246:1303(1989)
; Masinovsky et al., J. Immunol. 145:2886(1990))。 ＶＣＡＭ−１遺伝子（これはヒトゲノムにただ１つのコピーとして存在する）
は、約２５キロベースのＤＮＡに広がる９つのエクソンを含む。エクソン２−８
はＣ２またはＨ−タイプの免疫グロブリンドメインを含む。少なくとも２つの異
なるＶＣＡＭ−１前駆体は、別個のｍＲＮＡスプライシング事象（これはエクソ
ン５を包含するかまたは排除する）の結果としてヒト遺伝子から生成される（Cy
bulsky et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:7859(1991)）。
【００６４】 ＶＣＡＭ−１のレベル上昇の維持はいくつかの病理（粥状硬化症、網膜症、炎
症性大腸疾患および喘息を含む）に付随する（Smith et al., Am. Rev. Respir.
Dis. 148:S75-78(1993); Gosset et al., Ann. N.Y. Acad. Sci.725:163-172(1
994); Ohkawara et al., Am. J. Resip. Cell. Mol. Biol. 12:4-12(1995))。Ｖ
ＣＡＭ−１は、粥腫発生性食餌の開始後１週間以内にin vivoでウサギの動脈内 皮で誘発され、さらにウサギの粥状硬化症病巣にin vivoで発現される（Li et a
l., Am. J. Pathol. 143:1551-1559(1993))。高コレステロール血症のウサギで 、ＶＣＡＭ−１は、動脈内皮の前病巣領域への最初の単球補充に関与する（Libb
y & Clinton, Nouv. Rev. Fr. Hematol. 34(supp):S47-53(1992)）。したがって
、この遺伝子は本明細書で開示するようにアンチセンス治療のための優れた候補
対象である。 ＶＣＡＭ−１遺伝子へのこの新規なアプローチを適用する最初の工程は、ＡＵ
Ｇ開始コドン（ゲノム配列のｎｔ６３６−６５５〔Cybulsky et al., (1991）〕
とオーバーラップする、ＶＣＡＭ−１ＲＮＡ上の２０−ｎｔ部位を標的とするＡ
ＲＬアンチセンスＲＮＡ（ＶＡＬＲ１）のためのＤＮＡ鋳型を合成することであ
る。この部位は、ＨＵＶＥＣ細胞でのＶＣＡＭ−１の発現を抑制する顕著な活性
をもつことが判明したホスホロチオエートオリゴデオキシリボヌクレオチドの標
的部位と同一であった（Bennett et al., J. Immunol. 152:3530-3540(1994))。
この別のオリゴヌクレオチドは“ＩＳＩＳ３７９２”で，ＡＵＧコドンに対抗し
て指令されている。ＩＳＩＳ３７９２が２’−Ｏ−メチル誘導体（これは標的と
ハイブリダイズしたときＲＮＡ分解酵素Ｈの切断を助けない）として合成される
とき、アンチセンス活性は失われ、このことはＩＳＩＳ３７９２は細胞内でのそ
の活性についてＲＮＡ分解酵素Ｈの切断に依存することを示している（Bennett
et al., (1994)）。これらの結果から我々は、ＩＳＩＳ３７９２と相補的なＶＣ
ＡＭｍＲＮＡ上の部位はin vivoでハイブリダイゼーションを受け入れやすく、 さらにＲＮＡ分解酵素Ｈの切断をその活性のために依存することなくリボソーム
の進行を停止させる南京錠ＲＮＡ構築物の能力のテストとして優れているであろ
うと推論した。ＶＡＬＲ１およびＩＳＩＳ３７９２のアンチセンス配列は、ＶＣ
ＡＭｍＲＮＡ（開始コドンには下線）とともに以下のとおりである：
【００６５】 ＩＳＩＳ３７９２ ３’−ＧＣＴＧＴＣＧＴＴＧＡＡＴＴＴＴＡＣＧＧ−５’ ＶＡＬＲ１アンチセンス配列 ３’−ＧＣＵＧＵＣＧＵＵＧＡＡＵＵＵＵＡＣＧＧ−５’ ＶＣＡＭ−１ｍＲＮＡ標的配列 ５’−ＣＧＡＣＡＧＣＡＡＣＵＵＡＡＡＡＵＧＣＣＵＧＧＧＡＡＧＡ−３’ リボザイムおよびリンカー配列は、その標的と結合する際に生成される構築物の
期待される構造が図７に示すようなものとなるようにアンチセンス配列に対して
付加された。ＶＡＬＲ１標的複合体は、三重らせんではなく二重らせんの完全な
もう１つの回転を含む。これに関して、三重らせんよりも過剰の二重らせんが存
在しない場合は、第三の鎖の回転が標的の周囲の二重らせんの回転をほどくので
連結は存在しないであろう。
【００６６】 完全なＶＡＬＲ１ＡＴＲＲＮＡ（ＶＡＬＲ１と称する）の合成は、ＴＮＦα系
について上記で述べたように適切なＤＮＡ鋳型のＴ７転写によって達成された。
標的部位については、我々は、ＶＡＬＲＴ１、ｐＳＰ−ｌｕｃ＋ＮＦベクター配
列片に融合させたＶＣＡＭｍＲＮＡの６４２−ｎｔの部分的転写物を用いた。こ
のＲＮＡは、ＶＡＬＲ１分子（図参照）のアンチセンスドメインと相補的な、Ａ
ＵＧコドン周辺の２０−ｎｔ配列を含み、これは標的５’末端の２４７ヌクレオ
チド（ｎｔ）下流で、かつ３’末端の３７５ｎｔ上流に位置していた。 ＶＡＬＲ１は、その前駆体ＲＮＡの自己プロセッシング（自己切断）でＡＴＲ
１（ＴＡＴＲ１）よりも活性が高いが、ＡＴＲ１とは対照的に、自己プロセッシ
ングを経たＶＡＬＲ１ＲＮＡは標的の非存在下ではほとんど環状化の能力を示さ
なかった。しかしながら、ＶＡＬＲＴ１標的の存在下ではプレ−ＶＡＬＲ１ＲＮ
Ａの自己プロセッシングによって、変性ゲル電気泳動によって検出されるように
環状ＶＡＬＲ１種が形成された。我々は、ＶＡＬＲ１ＲＮＡはＶＡＬＲＴ１ＲＮ
Ａと強力な複合体を形成でき、これは変性条件下で（８Ｍ尿素、２ｍＭＥＤＴＡ
、４５℃２時間）ゲル電気泳動を実施した後も安定であった。
【００６７】 ＶＡＬＲ１のＶＣＡＭ−１発現の抑制能力の試験のために、触媒ヘアピンリボ
ザイムを欠くか、またはその不活性な変異形を含むコントロールＲＮＡを、標的
結合部位を欠くＡＬＲとともに合成した。これらのコントロールは、結合の特異
性、並びに生物学的有効性のために強力な結合および連結の重要性を評価するこ
とを可能にする。現在医薬として開発されているアンチセンス分子タイプとＡＬ
Ｒ構築物の厳密な比較を可能にするために、ＩＳＩＳ３７９２のホスホジエステ
ル型およびホスホロチオエート変形型も用いられる。 ＶＡＬＲ１および無細胞アッセイ系で強力な結合を示す他のアンチセンス構築
物は、コントロールＲＮＡとともに、ヒトの血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）でのＶ
ＣＡＭ−１発現をダウンレギュレートさせる能力についてアッセイされるであろ
う。ＨＵＶＥＣ細胞の結果を理解するうえで適切な場合には、我々はまたルシフ
ェラーゼｍＲＮＡのin vitro翻訳を実施するであろう。このｍＲＮＡは、上記実
施例Ｉで開示したように、５’ＵＴＲまたはコード領域のどちらかに適切なＡＬ
Ｒ標的配列を含むように改造されたものである。ウサギの網状赤血球溶解物にお
けるＡＬＲ標的／ルシフェラーゼ融合ｍＲＮＡ（これはＡＬＲＲＮＡと予め複合
体を形成）からのルシフェラーゼ産生が抑制される場合は、翻訳を抑制するため
に複合体が十分に安定していることが示唆される。細胞内での翻訳遮断を試験す
るために、上記の構築物を予め形成させたプラスミド−ＡＬＲ複合体としてＨＵ
ＶＥＣ細胞にトランスフェクトし、無細胞工程の場合のようにルシフェラーゼ活
性をモニターし、コントロールＲＮＡを用いるかまたはアンチセンスの非存在下
で活性を比較することができる。この場合には、融合遺伝子はＳＶ４０プロモー
タから発現されるであろう。in vivoでは試験はまたＴＮＦαアンチセンス分子 について上記で述べたように実施されるであろう。
【００６８】 実施例Ｖ−細胞特異的アンチセンス治療 癌細胞は多くの点についてそれらの正常な対応物と類似しているので、実質的
に全ての有効な抗癌剤は癌細胞だけの必須の特異性を欠き、したがって強い毒性
を有する。したがって、２つの別個の認識レベルを有する治療用アンチセンス薬
剤を提供することによって癌細胞特異性を達成するために、我々は本明細書で新
規な方法を開示する。アンチセンス薬剤が細胞に対して活性であるためには、両
方のレベルで認識が発生しなければならない。一方のレベルは、標的ＲＮＡと薬
剤内のアンチセンス配列との間のワトソン−クリック対合形成から成る。この薬
剤は、安定な二重らせん形成は癌細胞でのみ豊富なまた別の分子の結合を必要と
するようにデザインされる。この細胞特異的本質が第二の認識レベルである。ア
ンチセンスの標的遺伝子は、その過剰発現が腫瘍の進行または転移に付随し、そ
のダウンレギュレーションが増殖制御を正常化させるために要求されるいずれの
遺伝子でもよい。多くのそのような蛋白質が本方法で有用であろうが、我々はア
ンチセンスの標的として本明細書ではＨＥＲ−２を選んだ。マウスの腫瘍でＨＥ
Ｒ−２を抑制することによって、腫瘍の増殖が抑制され、マウスはより長期間生
存する。したがって、それはアンチセンス療法の魅力的な標的である。二元性薬
剤の構造および配列は、結合の堅固さおよび特異性についての生化学的アッセイ
、並びに必要な場合には任意抽出配列の選別によって最適化されるであろう。続
いて、翻訳遮断におけるその有効性が、先ずin vitro翻訳系で、続いて培養腫瘍
細胞株で調べられるであろう。
【００６９】 癌のアンチセンス治療の臨床試験は癌関連の少なくとも２つの遺伝子について
進行している。しかしながら、このアプローチ（実際のところ現在使用されてい
る癌のための全ての薬剤治療）の主な制約は、癌細胞に特異的に薬剤を向かわせ
る能力の欠如である。したがって、本明細書で開示した研究のゴールは、乳癌の
アンチセンス治療にこの必要とされている細胞特異性要素を提供するために新規
な方法を利用することである。このアプローチに基づいて乳癌患者を処置するこ
とによって効果が高められ、さらに副作用が顕著に低下するであろう。上記で述
べたように、我々は、標的ｍＲＮＡとハイブリダイズした後そのｍＲＮＡの周囲
でそれ自身を共有結合で連結しようとするリボザイムをベースにした薬剤をデザ
インした。この連結は、はるかに強力な結合および翻訳遮断能を提供した。しか
しながら、我々は、この連結をｃ−ｍｙｃ（乳癌細胞で高レベルで存在する核蛋
白質で特異的なＤＮＡ配列と結合する）の存在に依存させるように広げた。した
がって、アンチセンスオリゴヌクレオチドはｍＲＮＡ標的に結合し、センス−ア
ンチセンス二重らせんのらせんの巻き込みのためにｍＲＮＡ周囲を包み込む。末
端同士をより接近させ、分子の構造的エントロピーを減少させることによる標的
との結合は、ｃ−ｍｙｃ（およびその補助因子ｍａｘ）に対する結合部位を含む
短くて弱いさらに別の二重らせんとして末端同士が互いに対を形成することを可
能にする（例えば図１Ｃ、ＤおよびＨ、並びにその模式図として図８を参照）。
センス−アンチセンスだけのこの複合体の結合エネルギーは極めて弱く標的遺伝
子を抑制することはできない。しかしながら、ｃ−ｍｙｃが高レベルで存在する
場合には、ｃ−ｍｙｃはこの弱い二重らせんと結合し、それを安定化させてそれ
らのらせんインターワインディングによりこの複合体を一緒に“ロック”する。
アンチセンスオリゴヌクレオチドはＤＮＡでもＲＮＡでもよいが、ＤＮＡはヌク
レアーゼの攻撃に対してより安定であろう。アンチセンスオリゴヌクレオチドは
、単純なワトソン−クリック対合形成または三重らせん形成によって標的ｍＲＮ
Ａと結合することができる。この考えを普遍化して、理論的にはいずれの蛋白質
または他の細胞特異的分子にもロッキング薬剤または“留め金”として使用し、
さらに任意の所望の遺伝子のｍＲＮＡを標的とするために使用することができる
。通常は配列特異的にＤＮＡまたはＲＮＡと結合しない留め金の場合は、図９に
示した方法と同様に２部分“アプトマー”を適切な結合特性をもつ核酸配列の任
意抽出ライブラリーから選択してもよい。この考えはまた、三重らせん形成によ
って遺伝子自体を標的とすることにより転写を抑制するために応用することがで
きる。重要なことには、留め金蛋白質および標的遺伝子は関連をもつ必要はなく
、癌の選択性について２つが別個のレベルにあってもよい。
【００７０】 末期癌で生命に関わる激烈に増殖し侵襲する癌細胞は、通常は何年にもわたっ
て生じる一連の遺伝子変化の最終生成物である。乳癌の場合は、特定された遺伝
子変化は、ほとんどが少数のオンコジーン、とりわけｃ−ｍｙｃおよびＨＥＲ−
２（ｃ−ｅｒｂ−Ｂ２）の増幅である（Van de Vijfer & Nusse, Biochim. Biop
hys. Acta 1072:33-50(1991); Kozbor & Croce, Cancer Res. 44:438-441(1984)
）。これらの遺伝子のどちらかの増幅は、激烈な乳癌および予後不良に付随して
いる（Wong et al., Am. J. Med. 92:539-548(1992))。強力なプロモータによっ
て駆動されているｃ−ｍｙｃ遺伝子を含む遺伝子導入マウスでは妊娠中に乳房の
腺癌をが進行する（Stewart et al., Cell 38:627-637(1984); Leder et al., C
ell 45:485-495(1986)）。同様に、ＨＥＲ−２の過剰発現は、悪性および転移の
表現型を高めることが示された（Hung et al., Gene 159:65-71(1995))。ある種
のウイルス遺伝子（アデノウイルス−５ＥｌａおよびＳＶ４０大型Ｔ抗原）をマ
ウスの腫瘍細胞内に配送することによるＨＥＲ−２の抑制は、腫瘍増殖の抑制と
マウスのより長期の生存をもたらした（Hung et al., (1995))。したがって、Ｈ
ＥＲ−２はアンチセンス治療の非常に魅力的な候補対象で、ｃ−ｍｙｃはほとん
どの危険な細胞の有用なマーカーである。
【００７１】 癌は“感染物質”が殆どの点で正常細胞に似ている点で感染症とは異なる。そ
れ故、癌治療における最大の挑戦は細胞毒性薬又は細胞増殖抑制薬が治療レベル
で最小の毒性を有する癌細胞に充分に特異性の細胞毒性薬又は細胞増殖抑制薬を
見出すことである。ここで、本発明者らはニ成分ウェポンと同様に、認識の二つ
のレベルを有することにより必要とされる特異性を得るという新規なアプローチ
を提供する。こうして、例えば、活発に分裂している細胞、又は特別な細胞−表
面マーカーを有する細胞の全てを攻撃することに代えて、提案された薬剤は主と
して又は専ら癌細胞中に存在する或る種の分子に結合した後にのみ適当な標的遺
伝子をダウンレギュレートする。その方法の大きな力は、誘発分子及び標的遺伝
子が完全に無関係にし得る（しかし、そうであることは必要とされない）ことで
ある。標的遺伝子は潜在的にはあらゆる遺伝子であってもよく、更にはハウスキ
ーピング遺伝子であってもよいが、特異性の最高レベルが主として、又は専ら癌
細胞中で活性である標的遺伝子を選択することにより得られる。ここで、本発明
者らは誘発分子としてc-myc遺伝子のリンタンパク質産物を選択し、また標的遺 伝子としてHER-2を選択する。誘発のメカニズムはパッドロック理念に基いてい るが、トポロジー連鎖が別の薬剤の結合による安定化を必要とする場合には、“
クラスプ”に基いている。本発明者らはクラスプとしてc-mycを使用することを 提案する。
【００７２】 このニ段階アプローチの新規な特徴は、その有効性が乳癌細胞中で更に多量で
ある２種の要素：c-mycタンパク質及びHER-2 mRNA（又はそのアプローチのアン チジーンバージョンでは、DNA）の濃度の積に比例すべきであることである。HER
-2遺伝子はしばしば10倍程度に多く増幅され、またc-mycの存在量は幾つかの癌 細胞中で同様に上昇し得るので、本発明者らのアプローチの治療インデックスは
癌治療よりも極めて大きいと予想される。 このアプローチはその他の通常の治療の補助として良く適している。c-myc過 剰発現は乳癌の不充分な予知と関連しているので、通常の化学療法薬に対する腫
瘍細胞の耐性はc-myc発現と相関関係があり得ることが予想し得る。これはシス −プラチンの場合であることがわかった。c-mycアンチセンスオリゴヌクレオチ ドによる培養中のシス−プラチン耐性細胞の処理は、おそらくシス−プラチンの
とり込みを増大することによりその耐性を反転し、またc-mycを発現する非耐性 細胞中でさえも、細胞毒性相乗効果があった(Mizutaniら, Cancer 74:2546-2554
(1994))。相乗効果がまた組み合わせc-myc-P53アンチジーン療法についても見 られた(Janicekら, Gynecol. Oncol. 59:87-92 (1995))。
【００７３】 mycファミリーのその他の員のように、c-mycは細胞増殖及び分化に機能する(V
astrikら, Crit. Rev. Oncog. 5:59-68 (1994)及びPennら, Semin. Cancer Biol
. 1:69 (1990))。正常な静止細胞が細胞サイクルに入ることが必要かつ充分の両
方であることが示されていた。幾つかの状況において、それはまたアポトーシス
を媒介する(Cherneyら, Proc. Natl. Acad. Sci USA 91:12967-12971 (1994)、S
aito及びOgawa, Oncogene 11:1013- 1018 (1995)並びにShiら, Circulation 88:
1190-1195 (1993))。リンタンパク質であるc-mycは核に局在化され、オルニチン
デカルボキシラーゼ、p53、プロチモシンα及びECA39を含む、幾つかの遺伝子の
転写調節に関係する。それは関連タンパク質であるmaxと、それらの相同らせん −ループ−らせん及びロイシンジッパードメインを介してヘテロダイマーを形成
し、そのダイマーがタンパク質単独よりも極めて配列特異的にDNAに結合する(Bl
ackwood及びEisenman, Science 251:1211-1217 (1991))。ヘテロダイマーは配列
CACGTGへの結合により標的遺伝子をトランスアクチベートする。トランスアクチ
ベーションは活性化される遺伝子に関してこの配列の配向又は位置に比較的非感
受性である(Packhamら, Cell Mol. Biol. Res. 40:699-706 (1994))。
【００７４】 幾つかの研究が細胞をc-mycに対して誘導されたアンチセンスオリゴヌクレオ チドで処理することの効果を実証していた。例えば、Ｔ細胞ハイブリドーマの処
理は活性化誘発アポトーシスに干渉する(Shiら(1993)上記文献)。結腸癌細胞の 処理はそれらのコロニー形成能を抑制する(Collinsら, J. Clin. Invest. 89:15
23-1527 (1992))。10μMのc-mycアンチセンスオリゴヌクレオチドによるエスト ロゲン依存性(MCF-7)乳癌細胞の処理はc-mycタンパク質発現の95％抑制、エスト
ロゲン刺激細胞増殖の75％減少、そしてまたエストロゲン非依存性MDA-MB-231細
胞に対する細胞増殖抑制効果をもたらした(Watsonら, Cancer Res. 51:3996-400
0 (1991))。c-mycレベル及び増殖抑制の同様の減少がポリ（L-リシン）との複合
により更に低いオリゴヌクレオチド濃度（<1μM）で得られた(Degolsら, Nuclei
c Acids Res. 19:945-948 (1991))。ポリアミンと複合体形成されたアンチジー ン、三重らせん形成オリゴヌクレオチドは乳癌細胞中でc-myc発現を抑制するこ とが示されていた(Thomasら, Nucleic Acids Res. 23:3594-3599 (1991))。
【００７５】 HER-2のプロモーター領域中のＧに富む配列と三重らせんを形成するように設 計されたオリゴヌクレオチドは転写因子結合(Noonbergら, Nucleic Acids Res.
22:2830-2836 (1994))及びin vitroの転写(Ebbinghausら, J. Clin. Invest. 92
: 2433-2539 (1993))を抑制することが示されていた。 完全長c-mycは関連タンパク質max（Blackwood及びEisenman (1991)、上記文献
）とのヘテロダイマーとしてのみその標的部位に配列特異的に結合する。本発明
者らの無細胞アッセイにおいてc-myc及びmaxの両方を使用しなければならないこ
とを避けるために、本発明者らは塩基性らせん−ループ−らせん、及びロイシン
ジッパードメインからなるc-mycの末端切断型バージョンがc-myc/maxダイマーと
して同じ部位に結合するという事実を利用する。 候補アンチセンス構築物は最初に無細胞系中でc-myc依存性結合及び翻訳抑制 について試験され、次いで培養乳癌細胞に関する生物学的効果について試験され
るであろう。これらのプロトタイプ実験の目標はあらゆる所定のタンパク質の存
在下であらゆる遺伝子をダウンレギュレートするための一般操作であろう。 上記を達成するために、以下のことが行なわれるであろう。最初に、図８に示
された配列HER-5'、HERMYC1、及びHERMYC2がホスホジエステル形態及びホスホロ
チオエート形態の両方で合成されるであろう。c-mycクラスプの存在につき高度 に感受性のパッドロックをつくるのに正しい条件を見つけることが困難であると
判明する場合、本発明者らはc-myc-max結合部位に代えてE.coli lacオペレータ ー配列を含む類似のオリゴヌクレオチドを合成する。これは最適化が単一の容易
に入手し得るタンパク質トリガーであるlacリプレッサーで行なわれることを可 能にするであろう。必要により、リンカー及びらせん領域の長さがin vitro選択
により最適化されるであろう。lacリプレッサーについて決定されたらせんセグ メントの最適の長さはまたクラスプとして使用されるc-mycについておそらく最 適である。
【００７６】 次に、5'-32P標識パッドロックオリゴヌクレオチドを使用するポリアクリルア
ミドゲルシフトアッセイによる結合特性及び速度論が確かめられるであろう。DN
Aが加熱し、２℃に徐々に冷却することによりアニールされ、次いでMgCl2の存在
下で４℃から37℃までの範囲の異なる温度で電気泳動されて利用可能なMg2+の細
胞内濃度を模擬する。 次に、錯体の安定性が25mM Tris HCl (pH 7.4)、100 mM KCl、1 mM EDTA中で 温度を２°から45°まで傾斜し、0.5°／分であともどりして、UV吸収により標 的HER-5'を含むパッドロックオリゴヌクレオチドHERMYC1及びHER-5'を含むHERMY
C1の融解温度を測定することにより確かめられるであろう。本発明者らは末端切
断型c-mycタンパク質（化学量論量の２倍過剰、10倍過剰、及び100倍過剰）の存
在下で繰り返す。Tmがc-mycの存在下で37°より上ではなく、その不在下で20° より下ではない場合、本発明者らはこの差を得るために図８に示された部分ラン
ダム化されたHERMYC1R及びHERMYC2Rについてin vitro選択を行ってらせんセグメ
ントの長さを最適化する。必要により、本発明者らはシトシンリンカーの長さを
調節し、かつ／又はオリゴ（エチレングリコール）リンカーと交換する（in vit
ro選択後に）。 次に、HER-5'に融合されたT7プロモーターがSV40プロモーター及びエンハンサ
ーを含むルシフェラーゼベクターであるpGL3コントロールベクター(Promega, Ma
dison, WI)のNcoI部位に挿入されるであろう。本発明者らはin vitro翻訳並びに
T7 RNAポリメラーゼ及びキャッピング試薬（リボマックスキット、Promega）を 使用する5'キャッピングを行う。次いで本発明者らは末端切断型c-mycの存在下 及び不在下でウサギ網状赤血球溶解産物系を使用して得られるRNAのin vitro翻 訳を阻止するHERMYC1及びHERMYC2の能力を試験する（ルシフェラーゼ依存性光生
成によりモニターされるように）。本発明者らは両方の場合に末端切断型c-myc 依存性阻止を予想する。
【００７７】 幾つかのパラメーターはパッドロック／標的錯体がクラスプの不在下の低安定
性とその存在下の高安定性の最良のバランスを有するための最適化を必要とする
かもしれないので、RNA配列のランダム化ライブラリーから最良の配列を選択す ることが有利と判明するかもしれない。それ故、その選択は図９に示されたスキ
ームに従ってもよい。標的ストランドはHER-2 mRNAの標的領域の配列に相当する
一本鎖DNA（安定性のため）である。そのDNAは5'-ビオチン標識を用いて合成さ れ、ストレプトアビジンアガロースビーズ（又は更に高い熱安定性が必要とされ
る場合にはその他のマトリックス）のカラムに固定されるであろう。ポリメラー
ゼ連鎖反応(PCR)プライマー結合配列はプラスミドpUC18 (New England Biolabs)
について通常のフォワード及びリバースの配列決定プライマー配列である。ラン
ダム化領域は図９（上部）中の太字の領域及びその配列中のｎとマークされた領
域（図９、下部）：太字で示されたその配列の末端が固定されて示された様式で
折りたたみへの初期の刺激を与えること以外は、幹の両側の７ヌクレオチド及び
幹中の７以上のヌクレオチドからなるであろう。部分ランダム化DNAのこのプー ルが末端切断型c-mycタンパク質の存在下で固定DNA標的とともにインキュベート
されるであろう。そのプールの未結合部分がカラムから洗浄されて除かれ、結合
DNAが温和な加熱（必要により、0.1％SDSの存在下で）により回収されるであろ う。c-mycの不在下で結合する（こうしてクラスプをバイパスする）DNAがこの選
択されたプールをc-mycの不在下でカラムにもう一度通し、フロー−スルーを回 収することにより排除されるであろう。この減少されたプールがPCRにより増幅 され、次いで選択の更なるラウンドにかけられるであろう。c-mycの濃度が次第 に低下されて、c-mycが強い“クラスピング”効果を有するリガンドについて選 択圧力を増大するであろう。プールはその検索が狭いかどうかを知るために一緒
に配列決定され、特定の配列パターンが出現する場合に、プールがクローン化さ
れ、個々のコロニーが配列決定され、コンセンサス配列が誘導される。これらは
個々に合成され、スイッチとして機能するそれらの能力について試験されるであ
ろう。
【００７８】 リボザイム閉塞に関するin vitro翻訳アッセイが、HER-2 mRNAとルシフェラー
ゼの間の融合構築物を使用して、上記実施例に記載されたようにして行なわれる
であろう。コントロールはアンチセンス配列に代えてスクランブリングされたセ
ンス配列、及びc-mycを結合することができないクラスプ配列を有するオリゴを 含むであろう。ウサギ網状赤血球溶解産物翻訳混合物の添加後に、オリゴが単独
又は10-40倍モル過剰のin vitro転写された(T7)HER-2-ルシフェラーゼ融合構築 物の存在下の50 mM Trisアセテート(pH 7.5)/10 mM酢酸マグネシウム中でインキ
ュベートされるであろう。ルシフェラーゼは翻訳キット製造業者(Promega)から の指示に従ってアッセイされるであろう。標的配列を欠いているT7プロモーター
−ルシフェラーゼ発現プラスミドが更なるコントロールとして使用されるであろ
う。 細胞試験について、本発明者らは先の実験からの成功裏のオリゴヌクレオチド
のホスホロチオエートバージョンを使用する。次いで本発明者らはエストロゲン
を用いて、又は用いずにエストロゲン依存性MCF-7乳癌細胞又はその他の適当なc
-myc過剰発現細胞をこのオリゴヌクレオチド又はコントロールオリゴヌクレオチ
ドに暴露し、HER-2 mRNA、タンパク質生成、及び細胞増殖についてアッセイする
。適当な場合には、本発明者らはエストロゲン非依存性MDA-MB-231細胞と比較し
、これらは高レベルのc-mycを構成的に発現する。本発明者らは遺伝子治療アプ ローチ(Hungら(1995)、上記文献)によりHER-2発現のダウンレギュレーションに ついてそれ程毒性ではないことが既に示されていた陽イオンコレステロール誘導
体（DCコレステロール）と一緒に陽イオン脂質ビヒクル：リポフェクタミン又は
リポフェクチン(Life Technologies)、又はジオレオイルホスファチジルエタノ ールアミン(DOPE)を使用する。また、本発明者らは未修飾DNAオリゴヌクレオチ ドを試験する。何とならば、或る場合に、それらは細胞をin vitroで処理するの
に有効であるのに充分に長く無傷で生存するからである。
【００７９】 本発明者らのクラスプ依存性翻訳阻止はまた転写阻止、即ち、アンチジーン物
質として適用し得る。本発明者らは下記の配列： CACAGGAGAAGGAGGAGGTGGAGGAGGAGGGCT GTGTCCTCTTCCTCCTCCACCTCCTCCTCCCGA 3'-TGGTGTTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGG-5' （これは転写因子結合 (Noonbergら, Nucl. Acids. Res. 22:2830-2836 (1994))
及びin vitro転写(Ebbinghausら, J. Clin. Invest. 92:2433-2539 (1993)) を 抑制することが示されていた）で、CAATボックスとTATAボックスの間のHER-2プ ロモーター領域をターゲティングすることにより本発明者らのロッキング系のア
ンチジーン能力を試験する。送出及びアッセイはアンチセンスオリゴについてと
同じであろう。魅力的な別の標的遺伝子として、H-ras及びVEGFが挙げられる。 後者について提案されたパッドロックが図１Ｇに示され、連鎖を与える単一らせ
んターンとc-myc結合部位を有する。VEGF抑制はおそらく多種の腫瘍の増殖コン トロールに有益である。このアプローチの重要な利点は、パッドロックが多量の
c-mycを“ソーキング”アップするデコイとして作用し、それ自体が細胞増殖を 低下することである。
【００８０】実施例VI −核酸検出のための標的活性化RNA触媒作用 利用可能なDNA配列情報の迅速な増大により、核酸をベースとする診断が非常 に重要な主題である。サンプル調製、核酸増幅、及び検出の効率の改良がルーチ
ン診断目的のためのこのような方法の大幅に増大した使用を可能にするであろう
。この実施例は標的結合がRNA触媒作用を活性化して、標的分子の検出又は診断 の改良された方法をもたらす方法を記載する。検出の前にDNAを増幅するのに最 も広く使用される方法はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)である。別の等温方法は付 随の複雑さ、タンパク質酵素のコスト、及び多重管開口部中の汚染のリスクを伴
う一連の酵素工程を伴う。ここで、本発明者らは増幅可能なプローブとしてのRN
Aの使用及びそれ自体の開裂反応及び再結合反応を触媒作用するRNAの能力に基く
等温増幅の革新を提案する。RNA触媒作用を利用することにより、本発明者らはR
NAポリメラーゼ以外の全てのタンパク質因子の必要をなくすことができ、かつ管
開口部の数を減少することができる。ハイブリッド捕獲及び洗浄操作の付加的な
革新が自動化の速度及び容易さを更に増大する。これらの操作は増幅中の密閉管
の多重蛍光検出に適し、多くの異なる標的の迅速なスクリーニングを可能にする
とともに病原体への暴露又は増幅された標的による実験室汚染のリスクを最小に
する。
【００８１】 最終目標はDNA又はRNAを検出するのに使用でき、かつ高感度、迅速であり、熱
サイクリングを必要とせず、しかも自動化に容易に適している核酸をベースとす
る診断のスキームを設計することである。本発明者らが提案したスキームはRNA 触媒作用及び増幅用のＱβ−レプリカーゼの使用に基いている。このRNA依存性R
NAポリメラーゼはプライマー又は熱サイクリングを必要としないで適当な末端配
列を有するRNA分子の指数的複製を触媒作用するであろう。Tyagiら, Proc. Natl
. Acad. Sci. USA 93:5395-5400 (1996)の研究に従って、本発明者らは基質RNA を二つのハーフ（複製プローブと称される）に分けることにより末端配列を分離
する。それ故、二つの複製プローブが一緒につながれる場合にのみ、増幅が進行
し得る（図25）。それらは標的RNAの隣接部位にハイブリダイズするように設計 され、その結果、連結反応（ひいては増幅）が標的の存在に依存する。バックグ
ラウンドが標的を捕獲プローブによるハイブリダイゼーションにより固体基質に
捕獲し、続いてハイブリダイズしていないRNAを洗浄して除き、次いで基質から 放出することにより最小にされる。精製された標的を複製プローブにハイブリダ
イズし、次いでこれらをつなぎ、増幅する。一実施態様において、この操作は３
種の酵素：固体担体から放出するためのリボヌクレアーゼＨ(RNase H)、複製プ ローブをつなぐためのDNAリガーゼ（これは二重らせんRNAに作用する）、及びＱ
β−レプリカーゼを必要とする。本発明者らの提案において、本発明者らはヌク
レアーゼタンパク質及びリガーゼタンパク質の両方を置換するために標的依存性
RNA触媒作用を利用する（図26）。それらの触媒機能をRNAプローブ分子にとり込
むことにより、本発明者らはレプリカーゼ以外のあらゆるタンパク質酵素の必要
をなくし、また更に短いハイブリダイゼーションプローブを使用することにより
標的認識の特異性を増大する。本発明者らはこの目的のためにヘアピンリボザイ
ムを使用する。何とならば、それが開裂及び連結反応の両方を有効に触媒作用す
るからである。
【００８２】 以上に鑑みて、本発明者らは、ランダム化操作及び選択操作を使用して、標的
配列への結合後にのみ触媒活性になる潜在的ヘアピンリボザイム誘導体を設計、
構築し（図29）、二つのRNAが標的RNAの隣接配列にハイブリダイズされる場合に
別のRNAを開裂（トランスで）するその能力を実証し、その二つが近くの部位に ハイブリダイズされる場合に別のRNAをつなぐその能力を実証し、またつながれ たリボザイムによる連結反応後のＱβ−レプリカーゼによる複製プローブの増幅
を実証する（図26）。本発明者らはまた5'-ビオチニル化RNA捕獲プローブを使用
し、ストレプトアビジン被覆常磁性ビードによる標的分子の捕獲を実証し、隣接
部位へのリボザイムRNAのハイブリダイゼーション後の捕獲された標的の放出を 実証し（図28）、また複製プローブをつなぐ標的ハイブリダイズされたリボザイ
ムの能力を実証する（図26）。開裂部位／連結反応部位の周囲のらせん幹の長さ
及び／またはAT/GC組成が必要により調節される。サンプル取り扱い及び検出に おける本発明者らの革新と一緒に、このアプローチは核酸検出のための有意に簡
単、安価かつ速い操作をもたらすであろう。
【００８３】 核酸をベースとする診断 DNA及びRNAの検出及び定量は次第に重要になりつつあ
る技術である。それらはウイルス及び微生物により生じた感染症を診断し、遺伝
子異常を検出し、特性決定し、また癌又は治療の種々の型と関連する遺伝子変化
を同定するのに使用される。更なる使用は医療供給（例えば、血液バンク）、食
品及び環境サンプル中の病原生物を検出することにある。検索手段として、これ
らの技術は遺伝学、ウイルス学及び微生物学に使用されるだけでなく、法科学、
人類学及び考古学に使用される。それらの次第に増大する重要性により、多くの
種々の用途にルーチンで使用されるために、それらの簡素化及び改良に対する要
望がある。
【００８４】 ゲノム物質を検出するための普通の方法は核酸プローブによるハイブリダイゼ
ーションにより特定の核酸配列を定量することである。これらのプローブは検出
部分、例えば、ストレプトアビジン又はジゴキシゲニンと相互作用し得るリガン
ドを含む放射能標識又はその他の型の標識を有し得る。しかしながら、核酸ハイ
ブリダイゼーションの感度はプローブの比活性により制限される。最適条件下で
さえも、直接ハイブリダイゼーション方法は106までの核酸分子を検出し得るに すぎず(Horn及びUrdea, Nucl. Acids Res. 17:6959-6967 (1989)、これは多くの
所望の用途には不充分である。更に、最も感度の良いハイブリダイゼーションア
ッセイはルーチン用途に必要とされる特性−安全性、経済性、便宜及び速度を通
常欠いている。 この制限された感度の一つの解決策は標的配列の指数的増幅である。これは温
度サイクルアッセイ、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)及び連結連鎖反応、 又は等温操作、例えば、転写媒介増幅及び制限ヌクレアーゼ/DNAポリメラーゼ方
法により行い得る。また、ハイブリダイゼーションは反応の別の成分を変化させ
てそれを増幅可能にすることができる。例として、線形増幅方法、例えば、蛍光
生成物を生成するための酵素反応の誘導、Ｑβレプリカーゼの使用によるリポー
ターRNAの指数的増幅(Chuら, Nucl. Acids Res. 14:5591-5603 (1986))が挙げら
れる。
【００８５】 実際に、PCRは非常に高い感度を与えるが、幾つかの制限：(1)非標的DNA中の 相同部位へのプライマーのハイブリダイゼーションにより生じる擬陽性の発生、
(2)標本中のPCRインヒビターの存在、及び(3)その熱不安定性のためにRNAを直接
増幅することができないことを有する。これらの欠点は、特許されたPCR技術の 使用のためのライセンス料金及び熱サイクラーのかなりのコストについての市場
の考慮と一緒に、別法についての探索を刺激した。更に新しい技術の中で、Ｑβ
−レプリカーゼによる組換えRNAプローブの等温の指数的増幅が主要である。PCR
及びＱβ−レプリカーゼアッセイは同様の感度を有するが(Lizardiら, Biotechn
ology 6:1197-1202 (1988))、Ｑβ−レプリカーゼアッセイはPCRよりも簡単で、
速く、しかも安価である。Ｑβ−レプリカーゼの基質はDNAではなくRNAであり、
RNAはハイブリダイゼーションプローブ及び増幅可能なリポーターの二重機能を 併有している。この提案において、本発明者らはRNAの特異な能力である自己触 媒作用を使用して、Ｑβ−レプリカーゼを使用する有望な現行の増幅スキーム(T
yagiら(1996)、上記文献)に使用される２種のタンパク質酵素の必要をなくす。
【００８６】 Ｑβ−レプリカーゼはコリファージＱβからのRNA依存性RNAポリメラーゼであ
る。それは大過剰の細菌RNAを無視しながら感染細胞中の一本鎖ＱβRNAゲノムを
複製することができ、同様の特異性がin vitroアッセイで観察されていた(Harun
a及びSpiegelman, Science 150:884-886 (1965))。１モル程度に少ない鋳型RNA が主としてプライマーを必要としないでＱβ−レプリカーゼによるその指数的増
幅を開始し得る。その第一工程は相補ストランドの鋳型誘導合成であり、その後
に二つの相補ストランドが自然に分離し、夫々が相補ストランド合成の別のラウ
ンドの鋳型であることを可能にする。化学量論上過剰の酵素がある限り、複製さ
れたRNA分子の数が指数的に増大する。RNAレプリカの数が酵素分子の数に等しく
なった後に、RNA増幅が線形で続く。合成されたRNAの最終的な量（百万より多い
コピー）（典型的には、50μl中で15分間で37℃で200ng）は、それが簡単な比色
分析技術(Lizardiら(1988)、上記文献)により容易に検出し得る程に大きい。 天然Ｑβゲノム、MDV-1 RNA以外に、ニ三のRNAのみがＱβ−レプリカーゼの鋳
型活性を示すことがわかった(Munishkinら, J. Mol. Biol. 221:463-472 (1991)
)。Ｑβ−レプリカーゼは30年以上にわたって研究されていたが、複製のための 正確なRNA構造要件は曖昧なままである。わずかに明らかな共通の要素は一本鎖 中の広範な二次構造であり、これはおそらく複製後に二重らせん形成を阻止又は
抑制するのに利用できる（図24を参照のこと）。RNA二本鎖複合体は鋳型として 利用できない(Brown及びGold, Biochemistry 34:14775-14782 (1995))。in vitr
oで、適当な鋳型の不在下で、Ｑβ−レプリカーゼはランダム配列を有する短いR
NA種（長さ30-45 nt）を自然に合成することができる(Biebricherら, J. Mol. B
iol. 231:175-179 (1993))。しかしながら、この無鋳型合成は長いラグタイム後
に開始し、鋳型誘導RNA増幅よりも極めて遅く進行するので(Biebricherら(1993)
上記文献)、この二次プロセスはＱβ−レプリカーゼ増幅アッセイの複雑化を生 じない。
【００８７】 二つの開発が、任意のRNA配列の複製について、その高度に特殊化された鋳型 要件にもかかわらず、Ｑβ−レプリカーゼを使用する可能性をもたらした。第一
の開発は、オリゴリボヌクレオチドフラグメント（長さ58 ntまで）がその複製 可能性を妨げないで位置63と66のヌクレオチドの間の221-nt MDV-1 (+)RNA（Ｑ β−レプリカーゼの天然産鋳型）の配列内に挿入し得るという発見である(Lizar
diら(1988)、上記文献)。この能力は増幅可能なリポーターであることに加えて 機能のとり込みを可能にする。第二の開発は潜在的RNAプローブがそれらの標的 にハイブリダイズしない限り増幅し得ない潜在的RNAプローブ、所謂、“スマー ト”プローブの設計である(EP-A-707076及びTyagiら(1996)、上記文献)。これら
はハイブリダイゼーションアッセイで非常に低いバックグラウンドを可能にする
。何とならば、シグナル発生が標的RNAの存在に厳密に依存性であるからである 。 一つのスマートプローブアプローチは増幅可能なリポーターRNAを二つの別々 の分子（そのいずれもが複製に必要とされる配列及び構造の全ての要素を含まな
いので、そのいずれもがそれ自体で増幅し得ない）に分けることである。分割部
位は埋め込まれたプローブ配列の中央に位置される。これらの“２成分プローブ
”がそれらの標的の隣接位置にハイブリダイズされる場合、それらは適当なリガ
ーゼとともにインキュベーションにより互いに結合されて、増幅可能なリポータ
ーRNAを生成する。一方、ハイブリダイズしなかったRNAプローブは、それらが標
的に配列されないので、非常に低いつながれる可能性を有する。
【００８８】 別のアプローチ(EP-A-707076)において、潜在的Ｑβ−レプリカーゼ鋳型がMDV
-1 RNAの5'末端で延長することによりつくられ、Ｑβ−レプリカーゼによるその
複製の抑制をもたらした。この潜在的基質、第二RNAプローブ、及び標的RNAの間
で形成された３成分ハイブリッドは２価の陽イオンの存在下で潜在的鋳型から5'
延長を開裂し、それによりそれを有効な複製形態に変換し、担体からのその放出
を行う自己触媒RNA構造（ハンマーヘッドリボザイム）を生じる。このアプロー チは核酸をベースとする診断でRNA分子の触媒潜在性を使用する最初の試みとし て重要である。しかしながら、それは二つの欠点を有する。それは要素GAAA（活
性ハンマーヘッドリボザイムを生じるのに必要とされる）を含む標的配列に制限
され、また意図されない自然のRNA開裂（ひいては複製の活性化）がリボザイム の触媒コファクターとして必要とされる同じ２価の金属イオンにより触媒作用さ
れたエステル交換により容易に生じ得る。 このアプローチにおいて、本発明者らはＱβ−レプリカーゼのスプリット基質
の二つのハーフの標的依存性連結反応のためにヘアピンリボザイム構築物を使用
することによりこれらの二つのアプローチの最良の特徴を組み合わせる。本発明
者らのアプローチは標的RNAに配列制限を課さないし、また自然連結反応が自然R
NA開裂よりも極めて稀にし得るので、擬陽性のバックグラウンドが非常に低くあ
るべきである。更に、ヘアピンリボザイムは連結反応及び開裂の両方を触媒作用
することができるので（以下を参照のこと）、それは標的依存性リガーゼ及び特
異的エンドヌクレアーゼの二重の役割を果たすことができる。本発明者らはTyag
iらの操作に使用されたリボヌクレアーゼＨ(RNase H)に代えてハイブリッド捕獲
後に固体担体からの放出のためにエンドヌクレアーゼ活性を使用する（上記のよ
うに、捕獲は増幅の前の精製工程を可能にし、これがバックグラウンドを減少す
る）。更に、本発明者らは操作の夫々の工程が標的の認識に依存することを必要
とすることによりバックグラウンドを抑制する。これは５種の別個のRNAによる ハイブリダイゼーションにより行なわれる。実際に、このアプローチはRNA標的 及びssDNA標的の両方に作用する。
【００８９】 HPRは特定の３成分接触（上記を参照のこと）により相互作用する基質結合及 び触媒作用のための異なるドメインを有する。これらのドメインは同じRNA分子 又は別々の分子にあってもよい(Feldsteinら, Gene 82:53-61 (1989))。開裂産 物の放出は更なる開裂または連結反応のための別の基質への結合を可能にする。
HPR及びＱβ−レプリカーゼの両方が希薄な溶液中の活性のためにマグネシウム イオンを必要とする。 隣接基質、離れた基質、及び未結合基質を開裂し、つなぐHPRの能力 本発明 者らは同じRNAストランドの隣接基質配列又は離れた基質配列を開裂し、またつ なぐ（シスの反応）だけでなく、特定のRNA-RNA複合体の形成により別個の分子 の基質をつなぐ（トランスの反応）２種のHPR構築物、HPR1及びHPR2の能力を実 証した。T7プロモーター、スペーサー配列、及びミニモノマーヘアピンリボザイ
ムの前プロセシングした配列をコードする150-nt DNA鋳型を転写してプレ-HPR1
RNA (161-nt)を生成した。この鋳型を非放射能ヌクレオシドトリホスフェート及
び/または〔α-32P〕CTPの存在下でT7 RNAポリメラーゼにより転写した。転写産
物の変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動は幾つかのRNA種の存在を明らかにし た（図2E）。これらの種をプロセシングされなかった線状RNA、半プロセシング された線状RNA、完全にプロセシングされた線状RNA、完全にプロセシングされた
環状HPR1、及び線状HPR1ダイマー（上記を参照のこと）と同定した。全てのプロ
セシングイベントは単一リボザイム部分の自己触媒開裂反応の結果であった。こ
れらの実験は隣接部位及び数十ヌクレオチド離れた部位の両方で開裂を生じる単
一触媒ドメインの能力を強調した。その他の実験は連結反応が多量体の存在をも
たらすことを示し、一つのHPR分子からの触媒ドメインが別の分子へのその結合 を触媒作用することを示した。非隣接基質の開裂及び連結反応の両方を触媒作用
する単一触媒ドメインのこの能力を図25に図示され、以下に記載される本発明者
らのスキームに利用する。
【００９０】 凍結及びエタノールによる触媒作用 HPR T7転写産物の自己プロセシングによ
り生成された個々の形態の広範な特性決定は、凍結単独又は>40％エタノールへ の暴露単独が２価の陽イオンの不在下で線状形態の連結反応をもたらすことを明
らかにした(Kazakovら, 提出済み)。実際の凍結が必要とされた。何とならば、 連結反応が-21℃で過冷却されたが、凍結されなかった溶液中で起こらなかった からである。 凍結及びエタノール処理の両方が通常の水溶液中の収率（約50％）を超えるつ
ながれた生成物の収率（85％まで）を生じることができた。Ｑβレプリカーゼに
よる増幅のための本発明者らのスキームの主要工程は複製プローブの連結反応で
あるので（以下を参照のこと）、本発明者らは最大感度のために必要により凍結
工程を含むという選択肢を有する。
【００９１】 ここで、本発明者らはmRNAの検出により病原体について分析される細胞のサン
プルの分析のための操作を記載する。初期の変性工程により、同様のプロトコル
が、例えば、遺伝子変異体の検出に適したDNA標的に作用するであろう。一般ス キームを図26に概説する。最初の工程は所望の標的に相補性であるプローブを使
用する固体基質による標的の捕獲、所謂、ハイブリッド捕獲を伴う。ハイブリッ
ド捕獲のための操作は、緩衝液の組成及び捕獲プローブの構造を除いて、Tyagi ら(1996)、上記文献により使用された操作と同様である。捕獲プローブは標的RN
Aに相補性の配列、短いリンカー、HPRの基質配列、別のリンカー、及び末端ビオ
チニル化ヌクレオチドからなる（図26）。それは開裂部位の領域にRNA残基を含 むことを要する。残部はDNA又はヌクレアーゼ耐性類似体であってもよい。本発 明者らの第一バージョンにおいて、それは簡素化のために全RNAであろう。 病 原体について分析される細胞のサンプルを37℃で60分間にわたって5Mのグアニジ
ンチオシアネート中のインキュベーションにより溶解する。この処理は細胞を溶
解し、酵素を不活化し、DNA及びRNAを細胞内構造から除き、RNA二次構造を弱く する(Pelligrinoら, Biotechniques 5:452-460 (1987))。溶解産物を低下したグ
アニジンチオシアネート濃度に調節する（緩衝液Ａ：2Mのグアニジンチオシアネ
ート、400 mM Tris-HCl (pH 7.5)、0.5％のナトリウムN-ラウロイルサルコシン 、0.5％のBSA）。この溶液はヌクレアーゼ活性を阻止し続け、細胞デブリから干
渉されないでRNA-RNAハイブリッド形成を促進する(Tyagiら(1996)、上記文献)。
捕獲プローブRNA1を添加し、60分間にわたってハイブリダイズさせる。次いで捕
獲プローブに相補性の標的RNAを、ストレプトアビジン被覆常磁性粒子(Promega)
の懸濁液20μlを添加し、37°で10分間インキュベートすることにより捕獲する （図26、工程１）。2Mのグアニジンチオシアネートの存在はストレプトアビジン
へのビオチン基の結合に干渉しない(Tyagiら(1996)、上記文献)。
【００９２】 非相補性核酸分子、過剰の捕獲プローブ、及び細胞デブリを最初に緩衝液Ａ（
４回）、次いで緩衝液Ｂ（5 mM MgCl2、66 mM Tris-HCl (pH 7.5)、0.5％のノニ
デットP-40(Sigma)）（４回）で充分にすすいでグアニジンチオシアネートを除 去することにより除去する。夫々の洗浄サイクルについて、混合物を攪拌し、ビ
ーズを磁石で管の側面に集め、溶液を除去し、新しい洗浄液と交換する。 最後の洗浄工程後に、緩衝液Ｂの最終アリコートをRNA2及びRNA3とともに添加
する（図26、工程２）。これらのRNAはリボザイムの触媒ドメインＥの殆ど（＋ その基質結合配列）を含むが、実質的ならせん幹の部分に代えて、それらは標的
RNAの隣接領域に相補性の配列を含む。Sargueilら, Biochemistry 21:7739-7748
(1995)は、この幹が短すぎる場合、リボザイムが不安定であり、触媒不活性で あるが、その活性が幹を長くすることにより天然リボザイムのそれよりも更に大
きいレベルまで増大し得ることを示した。本発明者らの系では、短い幹が標的へ
のその末端のハイブリダイジング後に安定化され、こうしてドメインＥの活性コ
ンホメーションを生じる。次いでHPRの基質結合ドメインが捕獲プローブのHPR基
質配列と対合し、少なくとも50％の効率で後者の迅速な開裂をもたらす。ハーフ
−基質配列の結合のオフーレート(off-rate)は迅速であるので、複合体がビード
から解離され、ドメインＥが工程３で新しい基質に利用できるであろう。
【００９３】 過剰の捕獲プローブ及び未開裂複合体を更なる反応から除去するために、ビー
ズを磁石で離れて取り出し、その溶液をRNA4及びRNA5、緩衝液Ｃ（15 mM MgCl2 、45 mM Tris-HCl (pH 8)、100μMのATP、600μMのCTP、600μMのUTP、及び600 μMのGTP）及びＱβ−レプリカーゼ（６μg、Vysis）を含む別の管に移す。 この時点から先に、更なる操作が必要とされない。残りの工程が自動的に順に
進行する。RNA4及びRNA5がHPRドメインＥの結合部位から50ntに位置される部位 の対にハイブリダイズし、RNA4の2'-3'-環状ホスフェート末端及びRNA5の5'-OH 末端がHPRを結合し、HPRによりつながれる基質対を構成する。それらが図26に示
されたように標的RNAのルーピングにより複合体を形成し得る。この複合体はそ の開裂形態で天然HPRの構造を模擬し、約50％の効率で連結反応をもたらす。
【００９４】 適当な末端を有するRNAの合成 複製プローブはHPRドメインＥによりつながれ
るために5'-OH末端及び2'-3'-環状ホスフェート末端を有する必要がある。これ を達成する最も簡単な方法は図28に示された自動的スキームである。夫々が完全
HPR基質ドメインを含むが、唯一のＱβ−認識配列を含む２種のRNAを標的ハイブ
リダイズされたドメインＥに用意する。これらのRNAの一つが標的にハイブリダ イズし、基質結合部位を占有する時にはいつでも、それが開裂されるであろう（
図28）。開裂された生成物について高いオフ−レートのために、これらの生成物
がドメインＥから解離し、別の開裂されなかった生成物が結合し、開裂されるこ
とを可能にするであろう。しばらくの時間後に、妥当な可能性で、左利き(left-
hand)複製プローブ及び右利き複製プローブが同じドメインＥに結合する充分なR
NAが開裂され、それらが今適当な末端を有するので、それらがつながれるであろ
う。次いでＱβがこれらの分子を迅速に増幅するであろう。そのプロセスは、大
きい開裂生成物が標的へのハイブリダイゼーションのためにドメインＥ付近に残
り、一方、小さいフラグメントが拡散して離れるという事実により促進される。
【００９５】 上記スキームはHIV-1のpol遺伝子からの配列を標的として使用して試験される
であろう。ドメインＥはHIVゲノムのnt 4668-4682に結合し(Tyagiら(1996)、上 記文献)、捕獲プローブはnt 4716-4760に結合し、左複製プローブはnt 4577-458
8に結合し、右複製プローブはnt 4607-4618に結合するであろう。本発明者らは 最初に32P標識標的又はプローブを使用し、夫々の工程で回収後に個々の工程の 効率について試験する。 また、本発明者らは標的結合に依存性の触媒活性を有するHPRの誘導体を設計 する必要がある。通常のHPRでは、触媒ドメイン(E)はループによりキャップされ
た短いワトソン−クリックらせんにより安定化される。ループは三つの付加的な
塩基対により置換でき、充分な活性が維持される。しかしながら、このらせんの
安定性のその他の変化がヘアピンリボザイムの熱安定性及び触媒活性の両方に強
く影響し得る。触媒活性を標的結合に依存性にするために、本発明者らは密閉ル
ープに代えてＹ−分岐を使用し、標的が正確に対合されない限り、触媒活性を支
持しない配列を選択する。
【００９６】 配列NNNNを選択するためのスキームは連続のRNA触媒開裂反応及び連結反応(Be
rzal-Herranzら, Genes Dev. 6:129-134 (1992))をベースとするin vitro選択及
び増幅操作(Breaker及びJoyce, TIBTECH 12:268-275 (1994))である。オリゴヌ クレオチド標的の存在下で図29の右パネルに示されたヘアピンリボザイムのよう
な構造に折りたたむ２種のRNA分子を合成する。夫々のストランドの４ヌクレオ チドNNNNを化学合成中にランダム化し、その結果、全ての可能な配列組み合わせ
が提示される。残部を標的とハイブリダイズし、プライマー結合部位に相補性の
プライマーを使用して逆転写及びPCRにかける。右利きプライマーはT7 RNAポリ メラーゼのプロモーターからなる5'延長を有し、増幅されたDNAが転写によりRNA
プールのサブセットを再生することを可能にするであろう。これらのRNAが標的 にハイブリダイズされ、触媒活性配列が部分的に自己開裂されるであろう。開裂
された分子が変性ゲル電気泳動により単離され、標的の存在下で連結反応のため
の選択の別のサイクルにかけられるであろう。256にすぎない異なる配列が可能 であるので（28）、せいぜいニ三のサイクルがプールから最良の候補を同定する
のに充分であるべきである。標的非依存性連結反応に対し負の選択は標的を用い
ないインキュベーションの幾つかのサイクル、続いてつながれなかった分子のゲ
ル精製により行なわれるであろう。最後に、最終PCR生成物がクローン化され、 配列決定されるであろう。DNAが依存性触媒活性（開裂及び連結反応の両方）に ついてテンプレートする。ウィナーが合成され、個々のRNA転写産物が所望の標 的依存性触媒活性について試験されるであろう。
【００９７】 別法はNNNNに代えて０から６までのA-U塩基対及び０から４までのG-C塩基対を
有する一連の分子を合成し、それらを個々に標的依存性触媒活性について試験す
ることである。 標的依存性触媒部分に良好な候補を得たので、次の工程は、２種のRNAが標的R
NAの隣接配列にハイブリダイズされる場合に別のRNAを（トランスで）開裂する その能力を実証することであろう。この目的のために、本発明者らは全てのプロ
ーブが結合するHIVの領域(nt 4500-4800)をスパンする標的RNAの転写のためのDN
A鋳型を構築する。図27に示されたビオチニル化プローブを使用して、本発明者 らは先に示され、またTyagiら(1996)の上記文献に示された操作後にストレプト アビジン−常磁性ビーズによるこの（標識）RNAの捕獲を実証する。RNA2及びRNA
3を添加した後、本発明者らはビーズからの標識RNAの放出について試験する。結
合された複合体の妥当なフラクション（50％が十分であろう）の放出を得るのに
必要により、本発明者らは反応条件（温度、マグネシウムイオン濃度、等）及び
捕獲プローブのオリゴ(U)スペーサーの長さを調節する（図27）。
【００９８】 次の工程はＱβ複製プローブ（上記のように適当な末端で構築された）をつな
ぎ、レプリカーゼの存在下で増幅を得る標的につながれたリボザイムの能力を試
験することである。必要により、本発明者らは短い相補RNAを合成して末端を一 緒に保持し、DNAリガーゼで連結反応を行うことにより本発明者らのプローブを 基質として使用するＱβレプリカーゼの能力を試験する。 最後に、本発明者らは上記工程を組み合わせ、捕獲プローブの開裂から標的の
存在下のレプリカーゼプローブの連結反応へスイッチするリボザイムの能力を試
験する。必要により、本発明者らは必要とされる場合の開裂／連結反応部位の周
囲のらせん幹の長さ及び／またはAT/GC組成を調節する。
【００９９】 感度及びバックグラウンドについて試験するために、T7転写標的RNAの連続希 釈液を使用することにより模擬診断サンプルを調製し、その結果、サンプルは１
分子程度に少量の標的を含むであろう。α-〔32P〕-CTPが工程３に含まれ（図25
を参照のこと）、反応が35分間にわたって進行するまで、アリコートが10分で開
始して１分間隔で反応に除去されるであろう。夫々のアリコートは酸により沈殿
されるであろう（400μlの360 mMリン酸、20 mMピロリン酸ナトリウム及び2 mM
EDTA (Tyagiら(1996)、上記文献)の添加）。沈殿が真空マニホルドによりナイロ
ン膜(Zeta-Probe, BioRad)で回収され、洗浄され、オートラジオグラフィーによ
り、又はホスファーイメージャー(Storm 840, Molecular Dynamics)を使用して 定量されるであろう。 哺乳類細胞中のHIV-1 pol遺伝子RNAの検出のために、本発明者らはモデルとし
てプラスミドpCMVgagpol-rre-r（gag遺伝子及びpol遺伝子を含む）で安定にトラ
ンスフェクトされたCOS様サル腎臓細胞系(CMT3)を使用する(Anazodoら, J. Clin
. Microbiol. 33:58-63 (1995))。これらの細胞はHIV-1 pol mRNAを発現する生 物活性プロウイルスを含む。模擬臨床サンプルは非発現細胞の一定の集団中のHI
V-1 pol RNAを発現する細胞の一連の希釈液として調製されるであろう。100,000
の非発現細胞当りの発現細胞の数は０及び１から10,000までの範囲であろう。最
後に、実際の臨床標本が試験されるであろう。また、本発明者らは血液サンプル
及び尿サンプルについてサンプル調製操作の有効性を試験して、グアニジンチオ
シアネート単独がこれらの液体中でヌクレアーゼの効果に対してどのように良好
に保護するのかを見る。付加的なヌクレアーゼインヒビター及び／またはRNAプ ローブについての2'-アミノ修飾もしくはその他の適当な修飾の使用が必要によ り使用されるであろう。
【０１００】 別の検出操作として、本発明者らは単に少量の臭化エチジウム又はヨウ化プロ
ピジウムを添加し、Ｑβ反応が進行するにつれてフルオロメーターの蛍光の増加
を追跡する。蛍光検出はこの方法の商用バージョンに特別な方法であろう。蛍光
体はここのように単一インターカレーティング色素を使用してもよく、又はそれ
らの発光最大又は励起最大により区別できる異なる蛍光体に夫々結合されたオリ
ゴヌクレオチドのパネルであってもよい。夫々のオリゴヌクレオチドは異なる複
製プローブ及び異なる標的に相補性であり、同じサンプル中の多種の異なる標的
の多重増幅及び検出を可能にするであろう。適当な反応容器により、蛍光が容器
を開けないでも測定でき、増幅された生成物による実験室の汚染のリスクを低減
し、測定の直後にサンプルの破壊を可能にする。
【０１０１】 Plunnoら, Anal. Chem. 67:2635-2643 (1995)は石英光学繊維フィラメントの 表面にオリゴヌクレオチドプローブをつなぐことを伴う、核酸の蛍光測定のため
の光学繊維DNAセンサーを記載している。プローブにハイブリダイズされた標的 核酸がインターカレートされた臭化エチジウムの増進された蛍光を生じ、これが
繊維に沿った全内部反射による励起及び発光に基くエピフルオレセンスにより検
出される。本発明者らはハイブリッド捕獲のためにストレプトアビジンビーズに
代えてつながれたプローブを有する毛細管の使用を試験することを計画する。固
体繊維と違って、毛細管はピペット操作によらずに反応工程及び洗浄工程が行な
われることを可能にし、多くのDNAが固相カラムで合成される。検出は依然とし て光学繊維装置により行い得る。何とならば、毛細管が固体繊維と少なくとも同
じく有効に励起光及び発光の全内部反射を与えるからである。
【０１０２】 凍結による連結反応の増進 連結反応の効率は溶液を15分間にわたって-5℃に
凍結することにより約50％から約85％まで増大し得る。本発明者らはこの操作を
試みて追加された効率が付加的な工程を正当化することを見る。 緩和ストリンジェンシー 上記操作は増幅が進行するために５種の別個のRNA 分子による非依存性標的認識を必要とすることにより擬陽性シグナルからの最大
レベルの保護を与える。このような高い“ストリンジェンシー”は特に或る種の
用途には必要ではないかもしれない。こうして、ドメインの触媒活性が厳密に標
的結合に依存性である限り、複製プローブを標的に結合させることは必要ではな
いかもしれない。複製プローブは共有結合又はハイブリダイゼーションもしくは
金属配位によりドメインＥにつながれてこの場合に有効な標的依存性連結反応を
与え得る。 感度 このアッセイの感度は標的RNAの増幅をもたらす全ての工程の効率に依 存する。Tyagiら(1995)の上記文献のバージョンにおいて、増幅可能な生成物を もたらす標的分子の比率は2.5％であった。損失の主要な源はT4 DNAリガーゼを 使用する連結反応工程であり、これはRNAに非効率に作用し、わずかに８％のつ ながれた生成物を生じた。対照的に、HPR1の如き典型的なHPR誘導体は50％また 凍結後には85％程度に高い連結反応効率を示す。2.5％の全効率でさえも、Tyagi
ら(1995)の上記文献は100分子の標的の存在を検出できたが、10分子の標的の存 在を検出できなかった。本発明者らはHPR連結反応の高収率が感度を10分子未満 に増大するものと予想する。
【０１０３】 有効な診断技術のその他の重要な特性は擬陽性イベントのバックグラウンドで
ある。この操作における擬陽性は標的へのハイブリダイゼーションの不在下で生
じる連結反応イベントから生じる。Ｑβ−レプリカーゼは互いに若干併置される
複製プローブの間のギャップを横切って時折重合を続けて、増幅可能なリポータ
ーRNAをもたらす。Tyagiら(1995)の上記文献は、このようなイベントのわずかに
重大な源がビーズであり、このような併置のプローブを時折明らかに結合するこ
とを判明した。捕獲工程を含むことにより、自由複製プローブの濃度は、単一の
増幅可能なRNAでさえもが100の未感染細胞を含むサンプルから生成されない程に
低かったが、100,000中の単一感染細胞が検出された。本発明者らの操作はこの 特性を保持し、増幅可能なRNA分子を生成するためには、４種の別個のRNAが単一
標的分子へのハイブリダイゼーションにより一緒にされる必要があるという追加
されたセキュリティを有する。ドメインＣは結合タンパク質(Sargueilら, Bioch
emistry 21:7739-7748 (1995))又は本発明者らの標的によるような或る種の安定
化相互作用がなくても触媒不活性である。連結可能な複合体が標的結合されたド
メインＣと標的に結合されなかったRNA4及びRNA5との間に生じ得る若干の可能性
があるが、このような複合体の発生は三次のイベントであり、パートナー間の個
々の結合エネルギーが低い。いずれにしても、このようなありそうにないイベン
トは擬陽性をもたらさないであろう。何とならば、それらは依然として標的に結
合するドメインＣに依存するからである。
【０１０４】 本発明者らの提案した核酸の全てがRNAであり、それ故、汚染リボヌクレアー ゼによる開裂に感受性である。細胞溶解産物混合物中の2Mのグアニジンチオシア
ネートの混入はアッセイの感度を有意に低下する程度に標的RNAの開裂を阻止す るのに充分であった。本発明者らの操作に必要とされるRNAの長さが匹敵するの で、この予防措置がおそらくここでもまた充分でありそうである。ヌクレアーゼ
開裂の更なる低下が望ましい場合、幾つかの選択肢が利用できる。RNaseの付加 的なインヒビター、例えば、SDS、リン酸イオン、及びRNaseインヒビター、例え
ば、RNasin (Promega)が捕獲工程に含まれる。また、RNA 1-3（そしておそらくR
NA 4及び5）がそれらをRNase耐性にするアミノ基の如き2'修飾により合成し得る
。これらの修飾されたヌクレオチドがニ三の位置以外の全ての位置に存在しても
よく、依然として有効な触媒作用を可能にする。更に、それらは適当なヌクレオ
シドトリホスフェートを使用してT7 RNAポリメラーゼにより合成し得る。
【０１０５】 また、本発明者らはRNA 4及びRNA 5の基質配列中の長い対合幹を使用し、RNA
1に短い対合幹を使用し、次いで捕獲された標的の放出がつながれた複製プロー ブの良好な収率を与えつつ有効であるようにインキュベーションの温度を調節し
てもよい。必要により、本発明者らは複製プローブの結合部位の近くに結合し、
また連結反応活性について標的結合に依存性の第二ドメインＥを使用し得る。
以上の説明は、標的の結合が潜在的リボザイムを活性化して標的分子を検出する
ためのシグナルを生じる一つの様式を示す。この理念の別の実施態様が図32に示
される。ここで、核酸標的分子の結合はハンマーヘッドリボザイムの構造を安定
化し、その基質ストランドの開裂をもたらす。このような開裂は、基質ストラン
ドが一端で固体担体につながれ、他端にシグナル基、例えば、蛍光体又はビオチ
ンを有する場合に、例えば、左利き構築物の場合のようにシグナルを誘発し得る
。標的分子の結合は固体担体からのシグナル基の分離をもたらし、この場合、そ
れが固体担体の溶液からの除去後に通常の方法により定量し得る。また、一端が
蛍光基に結合され、他端が蛍光のクエンチャーに結合されてもよく、その結果、
開裂がクエンチングを生じ、蛍光が現れる(Walter及びBurke, RNA 3:392-404 (1
997))。標的核酸分子はリボザイムにより開裂可能である必要がないので、その 配列に制限がない。 この理念の更に一般的な実施態様が図31に示される。ここで、標的分子は潜在
的には、タンパク質、小分子、及び金属イオンを含む、関係するあらゆる分子で
あってもよい。標的分子の結合部位は示されたようにハンマーヘッドリボザイム
の二つのストランドの末端を含む。これらの末端の配列は関係する標的に特異的
かつしっかりと結合するDNA配列又はRNA配列のコンビナトリアルライブラリー(T
ang及びBreaker, RNA 3:914-925, 1997)から選ばれる。標的分子の結合はリボザ
イムの活性コンホメーションを安定化し、基質ストランドの開裂を生じる。
【０１０６】 実施例VII−白金によるアンチセンス及び三重らせん形成オリゴヌクレオチドの 標識方法 全ての原液をミリ-Q装置(Millipore)により脱イオンされた水中で調製し、次 いで0.22μmのフィルターユニット(Nalgene)で濾過した。使用した共通の原緩衝
液及び原液の内容物は以下のとおりであった。 20％AUB：19％のアクリルアミド、１％のN,N'-メチレン-ビス-アクリルアミド/8
.8M尿素/1xTBE EB：0.5M 酢酸NH4/0.1％のSDS/1 mM EDTA 2xFLS：92％のホルムアルデヒド/10 mM EDTA/ 0.04％のXC/ 0.04％のBPB 10xPKB：0.5 M Tris-HCl, pH 7.5/ 0.1 M MgCl2/ 50 mM DTT/ 1 mM スペルミジ ン/ 1 mM EDTA 10xTBE：445 mM Tris-ホウ酸塩, pH 8.3/ 12.5 mM EDTA 1xTE：10mM Tris-HCl, pH 8.0/ 1 mM EDTA 100xTAE：100 mM Tris-酢酸塩, pH 7.5/ 10 mM EDTA
【０１０７】 合成16-merオリゴデオキシリボヌクレオチド(TT)及びそのホスホロチオエート
誘導体（TST及びSTT）（１マイクロモルスケール、GFグレード）をMidland Cert
ified Reagentから得た。 TT: d(TTCCTCTTTGGGGTGT) TST: d(TTCCTCTTsTGGGGTGT) STT: d(TsTsCsCsTsCsTsTsTsGsGsGsGsTsGsT) オリゴデオキシヌクレオチドの乾燥ストックを1xTE緩衝液に溶解して濃度約10μ
g/μlを得、次いで“ウルトラフリーMCフィルターユニット”に通した。これら の溶液20μlを2xFLS 20μlと混合し、20％変性ポリアクリルアミドゲル(1.6mm) に装填し、次いで800ボルトで電気泳動した。主要オリゴヌクレオチドバンドを ゲルのUVシャドーイングにより配置し、次いで切断し、37℃で２時間にわたって
溶離緩衝液(EU)にソーキングすることにより砕かれたゲル薄片から抽出した。抽
出液を小型遠心分離フィルター0.22μmに通し、得られた透明溶液を４倍容積の 無水エタノールと混合し、-80℃で一夜保った。精製オリゴヌクレオチドの沈殿 を４℃で10分間にわたって14,000 rpmで遠心分離により完結した。ペレットを無
水エタノール１mlにより２回洗浄し、乾燥させ、1xTE 100μl中で再度懸濁させ 、小型遠心分離フィルター0.22μmに通した。使用中ではない時、オリゴヌクレ オチド溶液を-20℃に保った。これらの溶液のアリコート（25μl）を１mlに希釈
し、UVスペクトルを測定してそれらの濃度を測定した。T4ポリヌクレオチドキナ
ーゼ(Richardson, 1981)を使用するオリゴデオキシヌクレオチドの5'末端標識を
以下に記載された標識プロトコルを使用して行った。
【０１０８】 0.5 mM (2.5μg/μl)のゲル精製オリゴヌクレオチド１μl H2O ２μl 10xPNK緩衝液(Promega) １μl 〔γ-32P〕ATP (10μCi/μl) (Amersham) ５μl T4ポリヌクレオチドキナーゼ(10 U/μl) (Promega) １μl 混合し、37℃で30分間にわたってインキュベートする。 32P標識オリゴヌクレオチド種を20％変性ポリアクリルアミドゲル中の電気泳 動により精製した（そして分析した）。ゲルに装填する直前に、溶液を等容積の
2xFLSと混合し、95℃で２分間加熱した。個々のオリゴヌクレオチドバンドをオ ートラジオグラフィーにより配置し、上記のようにしてゲルから単離した。
【０１０９】 ジエチレントリアミンがオリゴヌクレオチドの白金化を触媒作用する。種々の反
応混合物（全容積10μl）を以下のように合わせた。32 P標識オリゴヌクレオチド １μl 150μMの同じ非放射性オリゴヌクレオチド 14μl 5-50xTAE緩衝液 ２μl 0.01-1mM K2PtCl4 0.3μl 10-100xTAE中0.1-15mMジエン 0.3μl 0.5-500 mM NaCl、もしくは0.05-50 mM KI、又は0.075-7.5 mM DMSO、或いは0.0
5-5 mM チオ尿素 0.3μl H2O 0.7μl 試薬濃度、インキュベーションの温度及び時間を含む反応条件が図面の脚注に示
される。白金化反応を1M NaCl １μlの添加(Brabecら, 1994)により停止し、等
容積の2xFLSと混合し、20％変性ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動により 分析した。
【０１１０】 核酸に対する陰イオン〔PtCl4〕2-の低反応性に関する文献データ(Wherlandら
, 1973; Kasianenkoら, 1995)と一致して、本発明者らは30μM濃度のK2〔PtCl4 〕が10xTAE〔10 mM Tris-OAc (pH 7.5)、1 mm EDTA〕中45μCで１時間のインキ ュベーション後に10μMのオリゴヌクレオチドTT又は単一ホスホロチオエート(PO
S)連鎖を有するその誘導体TSTの電気泳動移動度（図21、レーン２及び13）に影 響しないことを見出した。pH 7.5で陽イオンジエンH2 2+として生じる陽イオンジ
エチレントリアミン（ジエン）(Watt an Cude, 1968)は核酸と不安定なイオン結
合を形成し、オリゴヌクレオチドの電気泳動移動度に影響しない（図21、レーン
１及び12）。しかしながら、反応混合物が3 mMジエンを含む場合、本発明者らは
オリゴヌクレオチドの修飾を観察し、ゲル中で徐々に移動する種の約50％の収率
を得た（図21、レーン３及び14）。このようなゲル移動度シフトはオリゴヌクレ
オチドへの一つ以上の正に荷電された基の共有結合を示す。ジエンH2 2+は〔PtCl 4 〕2-とオリゴヌクレオチドポリアニオンの間の静電反発に明らかに対抗し、イ オン結合によりそれらを一緒にし、オリゴヌクレオチドの付近に反応性白金種の
有効濃度を与えてオリゴヌクレオチドの白金化をもたらした（図16）。TT〔d(TT
CCTCTTTGGGGTGT)及びTST〔d(TTCCTCTTsTGGGGTGT)の白金化は白金(II)試薬に対す
るGnクラスター及びPOS部分の既知の高反応性(Elmroth及びLippard, 1994; Gonn
etら, 1996)と一致する。
【０１１１】 オリゴヌクレオチドにつながれた白金基の信頼できそうな構造 ２分子反応が
最初に反応体の高い局所濃度でこのような前もって生成された〔クロロプラチネ
ート−ジエン−オリゴヌクレオチド〕複合体中で進行する二つの可能な経路があ
る。第一の経路は〔（ジエン）PtCl〕+を生じる〔PtCl4〕2-とジエンH2 2+の反応
であるが、この反応は高度に濃縮された溶液中でさえも非常に遅く進行する(Wat
t an Cude, 1968; Mahal及びVan Eldick, 1987)。第二の可能な経路は〔PtCl4〕 2- （又はそのアクオテーション(aquotation)の生成物）とオリゴヌクレオチド中
で利用できる求核性原子の直接反応、続いてつながれた白金基と負に荷電された
核酸表面と会合したジエンH2 2+の結合である。ポリヌクレオチドへの〔PtCl4〕2 - の初期の結合の生成物は不均一、不安定かつ非常に反応性であることが知られ ている(Chu及びOrgel, 1990a; Kasianenkoら, 1995)。更に、POS硫黄及びグアニ
ンN7の両方がそれらの強いトランス作用によりつながれた白金基を更に活性化し
得る(Howe-Grant及びLippard, 1980)。これらの二つの経路を区別するために、 本発明者らはTTオリゴヌクレオチド及びTSTオリゴヌクレオチドの白金化に関す るCl-の次第に増加する濃度の効果を研究した（図21、レーン8-11及び19-22）。
〔（ジエン）PtCl〕+とPOS硫黄の反応はCl-濃度にほぼ独立であることが知られ ているが、グアニンN7との反応は高濃度のNaClで完全に抑制し得る(Reedijk, 19
91; Slavinら, 1994)。実際に、本発明者らは100 mM濃度のNaClでTTオリゴヌク レオチド及びTSTオリゴヌクレオチドの両方の白金化の抑制を観察した（図21、 レーン11及び22）。更に、オリゴヌクレオチドと混合する前の異なる条件におけ
る〔クロロプラチネート−ジエン〕混合物のプレインキュベーションはオリゴヌ
クレオチドの白金化を加速しなかった（データは示されていない）。これらの結
果は第二の経路を示唆する。
【０１１２】 重要なことに、反応混合物中の1 mM NaClの存在は白金化収率を低下しないが （図21、レーン9及び20）、TTオリゴヌクレオチドの場合には、NaClを使用しな い場合よりも生成物バンドをシャープにする（図21、レーン９及び３）。TTオリ
ゴヌクレオチド及びTSTオリゴヌクレオチドの両方の白金化により生成された生 成物の移動度は高分解能の20％ゲル電気泳動下でさえも同じであったので、本発
明者らはつながれた白金基の構造が両方の場合に同じであると推定する。白金と
非常に強い結合を形成するリガンド、例えば、陰イオンI-（図21、レーン4-7及 び15-18）、及び中性チオ尿素の存在下で行なわれた白金化反応は、生成物のゲ ル移動度を変化しなかった。それ故、これらのリガンドはつながれた白金基の結
合についてジエン（非常に強いキレート剤）と競合することができない。しかし
ながら、それらは高濃度でオリゴヌクレオチドに結合する白金の初期反応を抑制
し得る（図21、レーン７及び18）。本発明者らは、結合された白金基が〔（ジエ
ン）Pt〕2+であることを示唆し、これはPOSの硫黄又はグアニンのN7位置の両方 により化学的に不活性かつ熱力学的に安定な付加物を形成することが知られてい
る。
【０１１３】 どの金属結合中心：POS又はGnクラスターが反応性であるのか？ 45℃におけ る長い反応時間は１時間後（図21に示された実験に使用された）の収率よりも２
時間のインキュベーション後のTTオリゴヌクレオチド及びTSTオリゴヌクレオチ ドの両方の白金化の高い収率を与えるが（図22、レーン４及び10）、４時間のイ
ンキュベーション後に更なる増加を示さなかった（図22、レーン６及び12）。ま
た、それはTSTの白金化（図22、レーン10及び12）がTT（図22、レーン４及び６ ）よりも特異的に進行することを明らかにし、これは付加的な生成物バンドの形
成を示した。重要なことに、同様のモデル系、S-グアノシル-L-ホモシステイン(
GSH)の白金化はグアニンN7よりもシステイン硫黄修飾の速度論的優位を示した(B
loemink及びReedijk, 1996)。Elmroth及びlippard (1994)はシス-〔Pt(NH3)(NH2 C6H11)Cl(H2O)〕+によるd(TTTTTTTTGGTTTTTTTT)中のGG部位におけるグアニンN7 の白金化の速度がd(TTTTTTTsTTTTTTT)中のPOS硫黄よりも３倍未満にすぎないこ とを示した。Gnクラスター(n>3)では、中心グアニン残基のN7は隣接残基よりも 求核性であり(Yohannesら, 1993)、GG中のN7よりも明らかに反応性である。K2〔
PtCl4〕によるPOS残基の選択的白金化が生じることが知られているホモピリミジ
ンホスホロチオエートオリゴヌクレオチド(Chu及びOrgel, 1989, 1990, 1992)と
は対照的に、Ｇに富むホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの白金化に関する
公表されたデータは現在入手できない。本発明者らは、一つ以上のホスホロチオ
エート基及びGGGGクラスターの両方を含むTST及びSTT〔d(TsTsCsCsTsCsTsTsTsGs GsGsGsTsGsT)〕オリゴヌクレオチドの白金化がPt-S及びPt-N7(Gua)付加物の混合
物をもたらし得ると考える。
【０１１４】 しかしながら、本発明者らはPOS残基がGGGGクラスターよりも反応性である証 拠を得た。本発明者らはTTオリゴヌクレオチド及びTSTオリゴヌクレオチドにつ いて同じ条件下の全てのホスホロチオエートSTTの白金化｛30μM K2〔PtCl4〕、
10μMのオリゴヌクレオチド（モル比Pt:オリゴヌクレオチド＝3:1）及び3 mMジ エン｝が３バンドのラダー（図23、レーン４及び５）を形成し、一方、TTオリゴ
ヌクレオチド及びTSTオリゴヌクレオチドが唯一の主要バンドを形成することを 示した。更に、20μMのSTT（モル比Pt:オリゴヌクレオチド＝1.5:1）の存在下で
、本発明者らはわずかに二つの異なる生成物バンドの形成を見出した（図23、レ
ーン４及び５）。本発明者らは均一バンドの数がつながれた白金基の数と一致す
ると推定する。 また、白金基の付加的な正電荷が分取電気泳動による反応混合物からの白金化
オリゴヌクレオチドの容易な分離を可能にする。別の単離方法として、本発明者
らはイオン交換カラムクロマトグラフィーを考え得る。また、本発明者らは白金
化ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの精製の１工程方法として水銀化カラ
ムによるメタロアフィニティークロマトグラフィーの使用を示唆する。
【０１１５】 ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド及びＧに富むオリゴヌクレオチドの白金
化に最適の条件 10μMオリゴヌクレオチド 30μM K2PtCl4* 3 mMジエン 10 mM Tris-OAc, pH 7.5 1 mM Na3EDTA 1 mM NaCl 45℃で２時間インキュベートする。 最適白金化混合物（10μl）の内容物は以下のとおりである。 1xTE中の32P標識オリゴヌクレオチド１μl 1xTE中の100μMの非放射性オリゴヌクレオチド１μl 150μM K2PtCl4*２μl 50xTAE中の15 mMジエン２μl 5 mM NaCl２μl H2O２μl （*反応混合物に添加する前に45℃で１時間にわたってプレインキュベートされ たH2O中の新しい溶液）
【０１１６】 最適条件を見つける際に、本発明者らは白金化収率及び生成された生成物の数
に関する反応混合物の種々の成分の有望な効果を見出した。 ジエン ジエン濃度が高い程、白金化の収率が良好である。例えば、1 mMジエン
及び3 mMジエンの存在下の生成物収率を比較のこと（図23、レーン2-5）。しか しながら、3 mMより上の濃度では、反応収率がおそらくオリゴヌクレオチドの沈
殿のために低下する。 Pt濃度及びオリゴヌクレオチド濃度 分取２分子（二次）反応について、両方の
成分の濃度が重要である。本発明者らの場合、放射性白金の量（ひいてはその濃
度）が制限因子である。本発明者らは可能なオリゴヌクレオチド沈殿及び白金化
オリゴヌクレオチドの単離の問題のために過剰のオリゴヌクレオチド成分（擬似
一次反応の構成）を使用することによりこの制限を解決することができない。本
発明者らは10μlの反応混合物（0.03-1ナノモルの白金）中でK2PtCl4の許容濃度
範囲が３〜100μMであることを測定した。そのレベルより下では、本発明者らは
妥当な反応時間についてオリゴヌクレオチドの白金化を検出せず、一方、そのレ
ベルより上では、本発明者らはオリゴヌクレオチドの速い非特異的修飾及び沈殿
を観察した。反応混合物中の最適〔Pt:オリゴヌクレオチド〕モル比は1.5〜６の
範囲で有益であることを測定した（図24、レーン5-7）。 K2PtCl4前処理 〔PtCl4〕2-からそのアコ錯体〔PtCl3(H2O)〕-及び〔PtCl2(H2O
)2〕0への遷移はDNAとのその結合に影響することが示された(Kasianenkoら, 199
5)。アクオテーションは新たに調製されたK2PtCl4溶液中で直ちに開始し、本発 明者らはこのプロセスが本発明者らの実験の再現性に影響し得ることを見出した
。それ故、本発明者らは45℃で１時間にわたってK2PtCl4（10 mM）の新しい原液
をプレインキュベートしてこのプロセスを完結させ、その後にオリゴヌクレオチ
ド修飾に使用することを推奨した。
【０１１７】 以上の記載は本発明を実施するのに使用し得る特別な方法を詳述する。このよ
うな特別な方法を詳述したので、当業者は本発明の成果を使用する際に同じ情報
に到達して別の信頼できる方法を考案する方法を充分に良く知っているであろう
。しかしながら、こうして詳細な以上のことが明細書に見られるが、それは本発
明の全範囲を限定するものと見なされるべきではない。むしろ、本発明の範囲は
特許請求の範囲の法的構成のみにより決められるべきである。本明細書に引用さ
れた全ての刊行物は参考として明らかに含まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】：標的分子にトポロジー的に連結したアンチセンスオリゴヌクレオチ
ドを用いる典型的模式図 Ａ．一本鎖標的にトポロジー的に連結した核酸分子を示す一般的模式図が提示さ
れている。球体は、少なくとも１回のらせんインターワインディングを創出する
標的とのハイブリダイゼーションに続く相互反応をもたらすこの分子の種々な末
端態様のいずれかを示している。三重らせんを形成する第三の鎖の相互反応は任
意である。ある実施態様では、この球体はヘアピンリボザイム部分を含む（図２
参照）。 Ｂ．南京錠ＲＮＡの単純版を示す。この場合、連結は末端の相補的配列のハイブ
リダイゼーションによって達成される。三重らせん形成は任意である。 Ｃ−Ｅ．アンチセンス配列が分割されている、Ａの変型例を示す。この例は、別
個の留め金分子（球体）を使用する場合に特に適しており、細胞特異的標的結合
をもたらす。センス−アンチセンスハイブリダイゼーションは留め金分子の非存
在下では不安定である。図１Ｃおよび１Ｄは、標的が一本鎖ＲＮＡの事例で三重
らせん形成が生じる場合と生じない場合とをそれぞれ示している。Ｅは、三重ら
せん形成によって標的と結合している、標的が二本鎖核酸分子の事例を示してい
る。 Ｆ．Ｄの変型例で、トポロジー的連結後閉鎖が単純な塩基の対合形成によって生
じるもので、らせんのインターワインディングを示している。 ＧおよびＨ．図１Ｃの変型例で、連結は単純ならせんの回転によって達成され、
一切の非対合形成領域の必要性が排除される。Ｇは、ヒトのＶＥＧＦｍＲＮＡの
コード領域の開始部と南京錠ＤＮＡとの結合を示す。南京錠の末端はｃ−ｍｙｃ
のための結合部位を創出する。ｎと標識されている残基は、強力な結合が生理学
的に対応する濃度のｃ−ｍｙｃ（またはｍｙｃ類の他のもの）の存在に左右され
るように最適化実験で決定されるべきである。 Ｈ．図１Ｇの間隙充填モデルで、Ｂ型ＤＮＡ二重らせんを１回の回転をもつＡ型
ＲＮＡ−ＤＮＡ二重らせんとドッキングし、背骨の鎖を連結し、エネルギー最小
化を実施することによって創出された。
【図２】：種々のＡＴＲ１アンチセンスＲＮＡ種の構造およびヘアピンリボザ
イム構造の模式図 Ａ．一次転写物ｐｒｅ−ＡＴＲ１（Ｒ２）の配列が示されている。これは、その
触媒コア（Ｅ４８）（ここで数字はヌクレオチドセグメントの長さを指す）に対
してヘアピンリボザイム（ＨＰＲ）の基部（Ｐ５およびＰ８）および遠位部（Ｄ
８およびＤ９）基質部分並びにアンチセンス（Ａ）および三重らせん（Ｔ）形成
領域を含むその機能的ドメインを示している。さらにまた、Ｒ２自己プロセッシ
ング（Ｒ３ａ、Ｒ３ｂおよびＲ４）または触媒ヘアピンリボザイムドメインを欠
くより短い鋳型を用いた（ＡＴ）転写の生成物として作出されたフラグメントが
示されている。末端基は以下のように示されている：“ｐｐｐ”、５’トリホス
フェート；“ＯＨ”、５’または３’ヒドロキシル；および“＞ｐ”、２’，３
’−環状ホスフェート。 Ｂ．ネズミＴＮＦαｍＲＮＡ標的とＡＴＲ１アンチセンスＲＮＡの“折り畳まれ
た”形（Ｒ１またはＲ４）との間で形成された複合体の推定的二次構造を示す。 Ｃ．ＴＮＦαｍＲＮＡ標的とＡＴアンチセンスＲＮＡ（アンチセンスと三重らせ
ん形成領域のみを含み、ヘアピンリボザイムを欠いている）との間で形成された
複合体の推定的二次構造を示す。 Ｄ．本文中で述べる、ＨＰＲの必須コアの二次構造および配列を示す。 Ｅ．６％変性ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラフィーで、一次ＨＰＲ
１転写物の自己プロセッシングによって生成されたＲＮＡ種を示している。レー
ン１；５ＳＲＮＡマーカー、レーン２；32Ｐ内部標識ＲＮＡ（全種）；レーン３
、Ｔ４リガーゼを用いて５’−〔32Ｐ〕ｐＣｐと連結して末端標識したＲＮＡ。
Ｒ２およびＲ３はプロセッシングを受けていないまたはプロセッシングを受けた
一次転写物で、一方、Ｒ１は環状ＨＰＲでＲ４は直線状ＨＰＲである。 Ｆ．６％変性ポリアクリルアミドゲルで、一次ＨＰＲ１転写物の自己プロセッシ
ングによって生成されたＲＮＡ種を示す。レーン１はゲル精製環状物、レーン２
はゲル精製直線状物、レーン３および４は環状（Ｒ１）および直線状ＨＰＲ（Ｒ
４）で、それぞれＭｇ2+含有緩衝液で１時間３７℃で保温した後の自己切断およ
び自己連結を示している。
【図３】：ＴＮＦα標的ＲＮＡによって形成された複合体の安定性においてＡ
Ｔ（アンチセンス−三重らせん）ＲＮＡを凌ぐＡＴＲ１（アンチセンス−三重ら
せん−リボザイム）ＲＮＡの優秀性 図３は、ゲル精製線状ＡＴＲ１ＲＮＡ（“Ｒ４”形）を、その環状形（“Ｒ１”
形）（レーン１−６）およびＡＴＲＮＡ（レーン７−１２）と平衡させてポリア
クリルアミドゲル電気泳動した後のオートラジオグラムを示す。単独で保温した
後（レーン１，４、７および１０）および、０．１μｇ／μｌのＴＮＦ１ＲＮＡ
（レーン２、５、８および１１）または０．２μｇ／μｌのＴＮＦ１ＲＮＡ（レ
ーン３、６、９および１２）のいずれかととともに保温した後のものである。全
てのサンプルは等容積の２×ＦＬＳ（標準的ゲルローディング溶液で９０％ホル
ムアミドおよび１０ｍＭＥＤＴＡを含む）と混合し、５分３７℃（レーン１−６
）または２分９５℃（レーン７−１２）のいずれかで電気泳動の前に保温した。
“Ｓ”はゲルの開始位置に一致し、“ＳＣ”は強力に相互反応するＲＮＡ複合体
の位置を指す。
【図４】：ＴＮＦα−ルシフェラーゼ融合標的とＡＴＲアンチセンスＲＮＡに
よる発現の抑制 Ａ．ＴＮＦα−ルシフェラーゼ融合遺伝子のためのＤＮＡ鋳型の模式図およびヌ
クレオチド配列を示す。 Ｂ．ルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡ（ＰＳまたはＰＴＳ）をＡＴもしくは
ＡＴＲ１のいずれか、またはアンチセンス配列を欠くコントロールＲＮＡと予備
ハイブリダイズし、続いてウサギ網状赤血球系を用いて翻訳した結果、ルミネッ
センスアッセイによって検出されるルシフェラーゼ発現抑制を示す。
【図５】：ヘアピンリボザイム誘導体／陽イオン性脂質複合体のマクロファー
ジへのin vivo導入 図５は、種々の陽イオン性脂質による配送用賦形剤と結合させてヘアピンリボザ
イム誘導体ｍ１０１を腹腔内投与した後でマクロファージに取り込まれた分子数
を示す。
【図６】：腹腔内投与後のネズミマクロファージ内のヘアピンリボザイムミニ
モノマーの位相差顕微鏡および蛍光顕微鏡検査 Ａ．ハンクス緩衝塩溶液（ＨＢＳＳ）１ｍｌ中のリポフェクタミンと３：１のチ
ャージ比で複合体を形成させたフルオレセイン−１２−ＵＴＰｍ１０１の１０μ
ｇの投与後２４時間のネズミの反応性腹腔マクロファージの位相差像を示す。 Ｂ．Ａの蛍光像で、大半のマクロファージに蛍光シグナルが示されているが、リ
ンパ球には示されていない。 Ｃ．リポフェクタミンを含まないフルオレセイン−１２−ＵＴＰｍ１０１の１０
μｇの投与後２４時間のネズミの反応性腹腔マクロファージの位相差像を示す。 Ｄ．Ｃの蛍光像である。
【図７】：ＴＮＦαまたはＶＣＡＭ領域を標的とするＡＴＲアンチセンスＲＮ
Ａおよびそれら複合体の推定二次構造 図７は、ＴＮＦαの領域（ＡＴＲ１６ａ、ＡＴＲ１６ｂおよびＡＬＲ２２９）ま
たはＶＣＡＭの領域（ＶＡＬＲ１）を標的とするＡＴＲアンチセンスＲＮＡ、お
よびそれぞれの特異的標的との複合体の推定二次構造を示す。
【図８】：翻訳開始部（ＨＥＲ−５’）周辺のＨＥＲ−２ｍＲＮＡを遮断する
ことができる南京錠複合体 オリゴヌクレオチドＨＥＲＭＹＣ１は開始部位の前の配列（太字）を標的とし、
ＨＥＲＭＹＣ２はコード領域内の配列を標的とする。垂直の配列はｃ−ｍｙｃ／
ｍａｘ異種二量体コンセンサス結合部位を含む。“ｘｘｘ”は（ＣＵＵ）ｎまた
はリンカー領域のためのエチレングリコール残基のいずれかを表す。
【図９】：留め金分子によって標的をロックすることができるアンチセンス南
京錠複合体を選別するためにＳＥＬＥＸを使用するための模式図 上段．留め金分子（灰色球体）によって標的をロックすることができるアンチセ
ンス複合体を選別するための模式図を示す。太字で示した領域内で任意抽出した
ヌクレオチドを含むＤＮＡプールと基質に固定した標的ＤＮＡを混合する。 下段．留め金としてｃ−ｍｙｃを、標的ｍＲＮＡとしてＨＥＲ２を用いる例を示
す。ｎは任意抽出されるべき配列、“ｘｘｘ”はＣＵＵまたはエチレングリコー
ル残基を表す。三重らせんモードでは、ｘは、他の２つの鎖によって形成される
二重らせんと対を形成し、それによって更なる安定を付加して翻訳を妨害させる
ように選択されるであろう。この系では、二重らせんおよび一本鎖リンカー領域
の長さが調節され、それによって蛋白質の留め金がない結合は貧弱で留め金をも
つ結合は強化される。この工程では、切り縮められたｃ−ｍｙｃによって結合の
ために要求される二重らせんの長さは自動的に選択されるであろう。
【図１０】：ＡＴＲ構築物によるＴＮＦα分泌の抑制 図１０は、コントロールｍＲＮＡ（ｍ１０１；すなわち無関係のアンチセンス領
域をもつ南京錠構築物）または種々のアンチセンス構築物ＡＴＲ１、ＡＴＲ１６
ａ、ＡＴＲ１６ｂまたはＡＬＲ２２９で処理後のＲＡＷ２６４．７細胞によるＴ
ＮＦαの分泌抑制を示す。
【図１１】：ＡＴＲ１、ＡＴＲ１６ａ、ＡＴＲ１６ｂおよびＡＬＲ２２９構築
物の変性ゲル上でのゲル移動分析 図１１は、ＡＴＲ１、ＡＴＲ１６ａ、ＡＴＲ１６ｂおよびＡＬＲ２２９構築物の
変性ゲル上でのゲル移動分析の結果を示す。ＡＴＲは32Ｐ標識標的ＴＮＦαＲＮ
Ａフラグメント（32Ｐ−ＴＴＲＮＡ）と保温した。ＡＴＲ１は使用したＴＮＦα
ｍＲＮＡと対応するアンチセンス領域をもたないので、それを陰性コントロール
として用いた。
【図１２】：ＡＴＲ１、ＡＴＲ１６ａ、ＡＴＲ１６ｂおよびＡＬＲ２２９構築
物とＴＮＦαＲＮＡとのハイブリダイゼーションおよび堅固な複合体形成の動的
態様 図１２Ａ−Ｄは、ＡＴＲ１、ＡＴＲ１６ａ、ＡＴＲ１６ｂおよびＡＬＲ２２９構
築物とＴＮＦαＲＮＡ標的とのハイブリダイゼーションおよび堅固な複合体形成
の動的態様を示す。ｃｃは相補的複合体、ｓｃは堅固な複合体を表す。
【図１３】：用量反応曲線 図１３は、３種の異なるＴＮＦα標的ＲＮＡ配列に対して実施されたＡＴＲ１、
ＡＴＲ１６ａおよびＡＬＲ２２９の培養細胞における用量反応曲線を示す。
【図１４】：マウスにおけるＡＬＲ２２９の抗ＴＮＦα効果 図１４は、各マウスにつき３組で実施したＴＮＦアッセイによるマウスにおける
ＡＬＲ２２９の抗ＴＮＦα効果を示し、この図では各点は３匹のマウスの平均値
±ＳＥＭを示す。核酸感染（トランスフェクション）試薬は、各マウスにつき１
０μｇのＲＮＡを用いることができるように量をスケールアップしたことを除い
て、下記で述べるＲＡＷ２６４．７細胞アッセイ用に調製した。得られた１ｍｌ
のリポソーム：ＲＮＡ複合体を、反応性マクロファージを補充するために予めチ
オグリコレートを注入したマウスの腹腔内に注射した。マクロファージは３時間
後に腹腔洗浄によって採集した。滲出物を２４穴（ウェル）プレートに１×１０ 6 ／ウェルで平板培養し、付着させて回収し、続いてＬＰＳで刺激しＴＮＦαの 分泌についてアッセイした。
【図１５】：白金試薬の構造式 図１５は、金属南京錠として、さらにオリゴヌクレオチドに陽性荷電を導入する
ために使用が推奨される種々の白金試薬の構造式を示す。
【図１６】：オリゴヌクレオチドに結合するクロロテトラプラチネート（ＩＩ
）のジエチレントリアミン触媒作用の提唱メカニズム 図１６は、オリゴヌクレオチドに結合するクロロテトラプラチネート（ＩＩ）の
ジエチレントリアミン触媒作用のメカニズムを示す。
【図１７】：オリゴヌクレオチドの白金付加のメカニズムおよび白金アダクツ
の構造 Ａ．イオウ原子でホスホロチオエート残基につながれた塩化白金酸基をキレート
するジエチレントリアミン。 Ｂ．１つまたは２つの近傍のグアニン残基のいずれかのＮ７原子につながれた塩
化白金酸基をキレートするジエチレントリアミン。 Ｃ．異なる部位でジエチレントリアミン白金（ＩＩ）基で標識されたオリゴヌク
レオチド。
【図１８】：一本鎖核酸標的との相補的複合体を安定させるオリゴヌクレオチ
ドの白金付加パターン Ａ．ヌクレオチド間のホスホロチオエートのイオウ原子またはプリン塩基のＮ７
位のいずれかの改変によって、アンチセンスオリゴヌクレオチドの内部領域に導
入された陽イオン性白金基。 Ｂ−Ｅ．ヌクレオチド間（および／または末端）ホスホロチオエートのイオウ原
子、またはチオピリミジンもしくはチオ含有ペプチドまたは他の有機オリゴマー
の改変によって非ハイブリダイズ性配列またはリンカーを介してアンチセンスオ
リゴヌクレオチド構築物に結合した陽イオン性白金基。●は、ハイブリダイゼー
ション前にオリゴヌクレオチドに結合させた白金基を表す。模式図の各対は、未
改造および白金付加オリゴヌクレオチドによって形成された核酸複合体を示す。
【図１９】：ＤＮＡ二重らせんまたはヘアピンのいずれかと一本鎖ＲＮＡを含
む三重らせんらせん複合体を安定化させるオリゴヌクレオチドのための白金付加
パターン Ａ．ホモプリンまたはホモピリミジンｔｆｏｓのいずれかを含む“古典的”三重
らせん。 Ｂ．ホモプリンおよびホモピリミジンの両方の三重らせん形成ドメインを含むオ
リゴヌクレオチドを含むオルタネート鎖三重らせん。 Ｃ．非ハイブリダイズ性リンカーによって連結された２つの三重らせん形成ドメ
インを含むハイブリッドオリゴヌクレオチドによって形成された三重らせん。 Ｄ．内部ループを含む標的構造を有する二重らせんおよび三重らせんの両方を形
成するオリゴヌクレオチド。 Ｅ．ヘアピン様構造を特徴とする三重らせん“留め金”。●は、ハイブリダイゼ
ーション前にオリゴヌクレオチドに結合させた白金基を表す。模式図の各対は、
未改造および白金付加オリゴヌクレオチドによって形成された核酸複合体を示す
。
【図２０】：競合する相補性配列と置換させることによってＤＮＡおよびＲＮ
Ａを開いてそれらの二本鎖領域と結合できるようにデザインしたアンチセンスオ
リゴヌクレオチド構築物の陽イオン性白金構築物 アンチセンスオリゴヌクレオチドの分子内の自己相補性構造は、白金基の強いイ
オン性反発および立体的妨害によって安定を失う。●は、ハイブリダイゼーショ
ン前にオリゴヌクレオチドに結合させた白金基を表す。模式図の各対は、未改造
および白金付加オリゴヌクレオチドによって形成された核酸複合体を示す。
【図２１】：ジエチレントリアミンはオリゴヌクレオチドの白金付加を触媒す
る ２０％の変性ポリアクリルアミドゲルで電気泳動後の〔５’−32Ｐ〕標識ＴＴ（
レーン１−１１）およびＴＳＴ（レーン１２−２２）オリゴヌクレオチドおよび
、１０×ＴＡＥ緩衝液（１０ｍＭのトリスＯＡｃ，１ｍＭのＥＤＴＡ）中の｛３
０μＭのＫ2ＰｔＣｌ4＋３ｍＭジエン｝カクテルによって１時間４５℃でそれら
を改造した生成物のオートラジオグラム。全てのサンプルは、白金：オリゴヌク
レオチド分子比を３：１に調節するために同種の非放射能性オリゴヌクレオチド
１０μＭを含んでいた。いくつかのサンプルは、さらにＫＩ（レーン４−７およ
び１５−１８）またはＮａＣｌ（レーン８−１１および１９−２２）を表示濃度
で含んでいた。Ｋ2ＰｔＣｌ4は、サンプル１および１２には添加されなかった。
ＸＣおよびＢＰＢは、キシレンシアノールおよびブロモフェノールブルー追跡染
料のゲル内の位置をそれぞれ示す。
【図２２】：保温時間の延長によってＴＴおよびＴＳＴオリゴヌクレオチドの
異なる白金付加パターンが示される ２０％の変性ポリアクリルアミドゲルで電気泳動後の〔５’−32Ｐ〕標識ＴＴ（
レーン１−６）およびＴＳＴ（レーン７−１２）オリゴヌクレオチドおよび、１
０×ＴＡＥ緩衝液中の３０μＭのＫ2ＰｔＣｌ4または｛Ｋ2ＰｔＣｌ4＋ジエン｝
カクテルで４５℃で２時間（レーン３−４および９−１０）または４時間（他の
全てのレーン）保温後のそれら改造生成物のオートラジオグラム。全てのサンプ
ルは、白金：オリゴヌクレオチド分子比を３：１に調節するために同種の非放射
能性オリゴヌクレオチド１０μＭを含んでいた。Ｋ2ＰｔＣｌ4またはジエンは、
サンプル１または７には添加されなかった。
【図２３】：ＳＴＴ白金付加生成物の数に対するジエン濃度およびＰｔ／オリ
ゴ比の影響 ２０％の変性ポリアクリルアミドゲルで電気泳動後の〔５’−32Ｐ〕標識ＳＴＴ
オリゴヌクレオチドおよびおよび、１０×ＴＡＥ緩衝液中の３０μＭのＫ2Ｐｔ Ｃｌ4または（Ｋ2ＰｔＣｌ4＋ジエン）カクテルで４５℃で２時間処理したその 改造生成物のオートラジオグラム。サンプルは、白金：オリゴヌクレオチド分子
比を３：１または１．５：１にそれぞれに調節するために１０μＭ（レーン１−
５）または２０μＭ（レーン１−５）の非放射能性オリゴヌクレオチドを含んで
いた。ジエンの濃度は１ｍＭ（レーン２−３）および３ｍＭ（レーン４−５およ
び９−１０）であった。ジエンはサンプル１または６には添加されなかった。い
くつかのサンプルはさらに１ｍＭのＫＩ（レーン３、５、８および１０）を含ん
でいた。
【図２４】：ＳＴＴの白金付加に対するＰｔ／オリゴ比の影響 ２０％の変性ポリアクリルアミドゲルで電気泳動後の〔５’−32Ｐ〕標識ＳＴＴ
オリゴヌクレオチドおよびおよび、１０×ＴＡＥ緩衝液中の（３０μＭのＫ2Ｐ ｔＣｌ4＋１ｍＭジエン）で４５℃で２時間処理したその改造生成物のオートラ ジオグラム。添加非放射能性オリゴヌクレオチド濃度および対応する白金：オリ
ゴヌクレオチド分子比は表示のとおりであった。Ｋ2ＰｔＣｌ4はサンプル１−２
には添加されなかった。
【図２５】：ＨＩＶ−１ｐｏｌＲＮＡ標的とハイブリダイズした二元性リコン
ビナントＲＮＡ（レプリカーゼ）プローブの模式図 複製プローブは、標的と相補的な１２ヌクレオチド（ｎｔ）配列と小さな矢印の
位置で合流する約１／２のＭＤＶ−１（＋）ＲＮＡ（完全体の場合はＱβレプリ
カーゼのための鋳型）、続いてヘアピンリボザイム基質配列（７から１０ｎｔ）
、および連結部位での終結から成る。これらの複製プローブは、標的とハイブリ
ダイズしてヘアピンリボザイム触媒コア（図示されていない）（それ自体は標的
の存在下で活性な構造に折り畳まれる）に連結されるまで増幅できない。（矢印
の先端で示した部位での）連結に際して、完全な分子が、Ｑβレプリカーゼを標
的およびリボザイムから剥がし、右側に示した構造に折り畳まれる過程でＱβレ
プリカーゼによって複製される。ヘアピンリボザイムのための連結部位を含む４
０ヌクレオチドの挿入配列は、小さな矢印の上部に示されている。
【図２６】：Ｑβレプリカーゼを用いたリボザイム支援ＲＮＡ増幅の模式図 リボザイム支援方法およびＱβレプリカーゼを用いた核酸増幅の全体系統の模式
図が示されている。
【図２７】：ＨＩＶ−１ＲＮＡ標的の相補的配列と結合したリコンビナントＲ
ＮＡ捕捉プローブの模式図 ＨＩＶ−１ＲＮＡ標的（ヌクレオチド４５７７−４７６０）の相補的配列と結合
したリコンビナントＲＮＡ捕捉プローブ（長さが全体で６０ヌクレオチド）の模
式図が示されている。標的依存性ヘアピンリボザイム（矢印で示した切断部位）
のための１２ｎｔ基質配列は、その３’末端のオリゴＵブリッジを介して４５ｎ
ｔハイブリダイゼーションプローブと、さらに５’末端の磁性ビーズと結合する
。伸長したＵブリッジは標的結合ドメインＥとのドッキングを容易にさせる。
【図２８】：連結に適した５’−ＯＨおよび２’，３’−環状ホスフェート末
端を作製する模式図 連結に適した５’−ＯＨおよび２’，３’−環状ホスフェート末端を作製する模
式図が示されている。
【図２９】：標的ＲＮＡとハイブリダイズすることによってその活性構造で安
定化されたＨＰＲ触媒領域の配列細部 標的ＲＮＡとハイブリダイズすることによってその活性構造で安定化されたＨＰ
Ｒ触媒領域の配列細部が示されている。標的配列はＨＩＶ−１ゲノムのヌクレオ
チド４６６８−４６８２である。ドメインＥを標的相補性配列で連結する配列Ｎ
ＮＮＮは、リボザイムの触媒活性が標的との正確な対合形成に厳密に依存するよ
うに選択されるであろう。右側にはＮＮＮＮ配列の選択に用いられた構築物が示
されている。
【図３０】：種々の手段によるトポロジー的連結の安定化のための典型例 Ａ−Ｇでは、ワトソン−クリック非共有結合塩基対形成は、南京錠または“留め
金”分子の結合が安定性のために要求されるほど極めて弱い。図１Ａ−１Ｃでは
、垂直な幹はランダムオリゴヌクレオチドライブラリーから選別することによっ
て決定できる。 Ａ．完全な二重らせん（例えば転写因子結合のために）またはミスマッチ二重ら
せん（例えばＲＮＡ南京錠およびＲＮＡ結合蛋白質（例えばｔａｔ）の場合）の
いずれかの幹構造と結合した蛋白質が示されている。 Ｂ．幹構造と結合した小さな有機分子が示されている。この場合、この小有機分
子は標的細胞内で天然に存在するものでもよいし、導入されたものでもよい（例
えば薬剤）。 Ｃ．幹構造と結合した金属イオンが示されている。この場合、金属イオンは、天
然の核酸基または合成基、例えばホスホロチオレート誘導物および／または塩基
のイオウ誘導物上のＰ＝Ｓ基と複合体を形成することができる。 Ｄ．幹構造をもたない金属留め金が示されている。例えばホスホロチオレート誘
導物のようなオリゴのＳ−置換末端、またはチオール化末端と結合したシス−Ｐ
ｔ（ＮＨ3）2Ｃｌ2。 Ｅ．標的ｍＲＮＡ上の塩基と白金含有薬剤によって架橋された（Ｓ−Ｐｔ−塩基
結合）ホスホロチオレート誘導体が示されている。 Ｆ．Ｓ−Ｐｔ−Ｓ結合形成を介して架橋されたものが示されている。この場合、
Ｓは、オリゴヌクレオチドのホスホロチオレート誘導体またはチオール化末端か
ら得られる。 Ｇ．比較のために外部留め金を欠く共有結合によって閉じられた南京錠が示され
ている。この場合はＡＴＲ１が例である。 Ｈ．共有結合によって閉じられる前のＧで示した分子である。
【図３１】：任意の分子を検出するためにハンマーヘッドリボザイムを用いる
模式図 任意の分子（塗りつぶした楕円）の存在を検出するためにハンマーヘッドリボザ
イムを用いる模式図が示されている。任意の分子はプローブと遭遇したとき、垂
れ下がった末端からオプトマーを組み立て、プローブはその末端に特異的に結合
し、それによってリボザイムの活性構造を安定化させる。いくつかの技術（例え
ば固形支持体からビオチンを遊離させる）のいずれかによってその後の切断が検
出される。
【図３２】：任意の核酸配列を検出するためにハンマーヘッドリボザイムを用
いる模式図 任意の核酸配列の存在を検出するためにハンマーヘッドリボザイムを用いる模式
図が示されている。切断によって、例えば蛍光または酵素刺激のようなシグナル
発生事象が表示される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 カザコフ セルゲイ エイ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94306 パロ アルト アルマ ストリー ト 3375−＃262 (72)発明者 キシク ケヴィン オー アメリカ合衆国 コロラド州 80026 ラ ファイエット ジョンキル コート 2451

Claims (23)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 標的核酸の配列に実質的に相補性である配列により標的核酸
    に特異的に結合する核酸分子又はその類似体であって、前記核酸分子又はその類
    似体が前記核酸分子又はその類似体の5'末端と3'末端の間の相互作用により前記
    標的核酸の少なくとも一部にトポロジー的に連結することができ、前記トポロジ
    ー連結が前記標的核酸の転写又は翻訳の効率を有効に低下することを特徴とする
    前記核酸分子又はその類似体。
  2. 【請求項２】 触媒RNAを含む請求の範囲第１項記載の核酸分子又はその類 似体。
  3. 【請求項３】 前記触媒RNAがヘアピンリボザイムから誘導される触媒領域 である請求の範囲第２項記載の核酸分子又はその類似体。
  4. 【請求項４】 前記触媒RNAが結合又はリンカーにより標的核酸の配列に実 質的に相補性である前記配列に連結される請求の範囲第２項記載の核酸分子又は
    その類似体。
  5. 【請求項５】 フーグスティーン結合又は逆フーグスティーン結合の形成に
    より前記核酸分子又はその類似体と前記標的分子の間に形成される二重らせんと
    相互作用する三重らせん形成領域を更に含む請求の範囲第２項記載の核酸分子又
    はその類似体。
  6. 【請求項６】 三重らせん形成領域が前記二重らせんよりも一つ少ないらせ
    んターンを形成して前記標的標的核酸への前記核酸分子又はその類似体のトポロ
    ジー連結を確実にする請求の範囲第５項記載の核酸分子又はその類似体。
  7. 【請求項７】 前記核酸分子又はその類似体の5'末端と3'末端の間の前記相
    互作用が共有結合、ワトソン−クリック対合、フーグスティーン結合、逆フーグ
    スティーン結合又はその他の非共有結合相互作用によるものである請求の範囲第
    １項記載の核酸分子又はその類似体。
  8. 【請求項８】 前記核酸分子又はその類似体が前記標的核酸に結合する後ま
    で、前記核酸分子又はその類似体の前記5'末端と前記3'末端が相互作用しない請
    求の範囲第１項記載の核酸分子又はその類似体。
  9. 【請求項９】 標的核酸の配列に実質的に相補性である配列により標的核酸
    に特異的に結合する核酸分子又はその類似体であって、前記核酸分子又はその類
    似体の5'末端と3'末端が相互作用してロッキング分子の結合部位を形成し、前記
    結合部位への前記ロッキング分子の結合により前記核酸分子又はその類似体を前
    記標的核酸にトポロジー連結させ、それにより前記標的核酸の転写又は翻訳の効
    率を有効に低下することを特徴とする核酸分子又はその類似体。
  10. 【請求項１０】 RNA又はDNAである請求の範囲第９項記載の核酸分子又はそ
    の類似体。
  11. 【請求項１１】ワトソン−クリック塩基対合、フーグスティーン塩基対合又
    は逆フーグスティーン塩基対合により前記標的核酸と相互作用する請求の範囲第
    ９項記載の核酸分子又はその類似体。
  12. 【請求項１２】 相互作用して前記結合部位を形成する前記5'配列及び3'配
    列がコンビナトリアルライブラリースクリーニングにより同定される請求の範囲
    第９項記載の核酸分子又はその類似体。
  13. 【請求項１３】 前記ロッキング分子がタンパク質、金属イオン、金属錯体
    、薬物、有機分子及び無機分子からなる群から選ばれる請求の範囲第９項記載の
    核酸分子又はその類似体。
  14. 【請求項１４】 前記タンパク質がc-myc、n-myc又はl-mycである請求の範 囲第１３項記載の核酸分子又はその類似体。
  15. 【請求項１５】 前記ロッキング分子が亜鉛含有分子、銅含有分子、コバル
    ト含有分子又は白金含有分子である請求の範囲第１３項記載の核酸分子又はその
    類似体。
  16. 【請求項１６】 少なくとも一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結
    を含む請求の範囲第９項記載の核酸分子又はその類似体。
  17. 【請求項１７】 前記ロッキング分子の結合により競合される競合内部構造
    を含む請求の範囲第９項記載の核酸分子又はその類似体。
  18. 【請求項１８】 標的核酸分子の転写又は翻訳の抑制方法であって、前記方
    法が前記標的核酸分子と請求の範囲第１項又は第９項記載の核酸分子又はその類
    似体とを接触させることを含み、前記核酸分子又はその類似体が前記標的核酸分
    子にトポロジー連結され、それによりそれからの転写又は翻訳を抑制することを
    特徴とする前記標的核酸分子の転写又は翻訳の抑制方法。
  19. 【請求項１９】 白金分子をオリゴヌクレオチドに共有結合させる方法であ
    って、前記方法が前記オリゴヌクレオチドへの前記白金分子の共有結合を可能に
    する条件下で前記オリゴヌクレオチドと、(1)白金ドナー分子及び(2)正に荷電し
    たポリアミン分子とを合わせることを含み、前記白金分子が前記オリゴヌクレオ
    チドに共有結合させることを特徴とする白金分子をオリゴヌクレオチドに共有結
    合させる方法。
  20. 【請求項２０】 前記白金ドナー分子及び前記正に荷電されたポリアミン分
    子を前記オリゴヌクレオチドと合わせる前に錯生成する請求の範囲第１９項記載
    の方法。
  21. 【請求項２１】 前記白金分子が硫黄分子又は前記オリゴヌクレオチドのグ
    アニン残基のN7に共有結合させる請求の範囲第１９項記載の方法。
  22. 【請求項２２】 請求の範囲第１９項記載の方法により得られるオリゴヌク
    レオチド。
  23. 【請求項２３】 標的分子を含むと推測される組成物中の前記標的分子の存
    在の検出方法であって、前記方法が前記組成物と前記標的分子に結合することが
    できる触媒不活性RNA分子とを接触させることを含み、前記標的分子への前記触 媒不活性RNA分子の結合が前記触媒不活性RNA分子を触媒活性になることを可能に
    し、触媒活性RNAの存在の観察が前記組成物中の前記標的分子の存在を示すこと を特徴とする前記標的分子の存在の検出方法。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006501823A (ja) * 2002-10-07 2006-01-19 バイオガイア・エイ・ビー ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）により引き起こされる炎症を低下させるための乳酸細菌の選択および使用
JP2006507825A (ja) * 2002-11-28 2006-03-09 アメルシャム・バイオサイエンシーズ・アクチボラグ アンチセンスオリゴヌクレオチドの単離
JP2007524395A (ja) * 2003-06-25 2007-08-30 ソーマジェニックス インコーポレイテッド 標的依存性の環状化及びトポロジー的結合が可能なポリヌクレオチド
JP2008525043A (ja) * 2004-12-29 2008-07-17 ヨハネス グーテンベルグ−ウニヴェリジテート マインツ フェアトレーテン ドゥルヒ デン プレジデンテン 核酸配列の機能およびそれにより核酸配列にコードされる発現産物の決定方法
JP2017210448A (ja) * 2016-05-26 2017-11-30 国立大学法人北陸先端科学技術大学院大学 アンチジーン法用光応答性人工核酸プローブ

Families Citing this family (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050059016A1 (en) * 2002-11-05 2005-03-17 Ecker David J. Structural motifs and oligomeric compounds and their use in gene modulation
AUPP249298A0 (en) 1998-03-20 1998-04-23 Ag-Gene Australia Limited Synthetic genes and genetic constructs comprising same I
HU230353B1 (hu) * 1998-03-20 2016-02-29 Benitec Australia Ltd A génexpresszió szabályozása
WO2000044914A1 (en) 1999-01-28 2000-08-03 Medical College Of Georgia Research Institute, Inc. Composition and method for in vivo and in vitro attenuation of gene expression using double stranded rna
US6977295B2 (en) 1999-04-21 2005-12-20 Invitrogen Corporation Locked nucleic acid hybrids and methods of use
US6423885B1 (en) 1999-08-13 2002-07-23 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organization (Csiro) Methods for obtaining modified phenotypes in plant cells
US6310047B1 (en) * 1999-08-24 2001-10-30 Virginia Commonwealth University High affinity DNA binding compounds as adjuvants in antisense technology
GB9922283D0 (en) * 1999-09-22 1999-11-17 Kennedy Rheumatology Inst Adenoviral vectors
CA2369944A1 (en) 2001-01-31 2002-07-31 Nucleonics Inc. Use of post-transcriptional gene silencing for identifying nucleic acid sequences that modulate the function of a cell
US7070933B2 (en) 2001-09-28 2006-07-04 Gen-Probe Incorporated Inversion probes
US7527945B2 (en) 2001-10-22 2009-05-05 Nucleonics, Inc. Transfection kinetics and structural promoters
US7897382B2 (en) 2001-10-22 2011-03-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Transfection kinetics and structural promoters
AUPR975201A0 (en) * 2001-12-24 2002-01-24 Unisearch Limited Enzymatic redox labelling of nucleic acids
FR2858628B1 (fr) * 2003-08-04 2008-01-04 Polyplus Transfection Nouveaux complexes d'acides nucleiques actifs pour l'arn interference et leur utilisation pour inhibiber l'expression de proteines
JP2009221164A (ja) 2008-03-17 2009-10-01 Nitto Denko Corp 肺線維症処置剤
US20120269886A1 (en) 2004-12-22 2012-10-25 Nitto Denko Corporation Therapeutic agent for pulmonary fibrosis
PT2727583T (pt) 2004-12-22 2021-12-27 Nitto Denko Corp Veículo de fármaco e kit de veículo de fármaco para a inibição da fibrose
US7575926B1 (en) * 2005-12-19 2009-08-18 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Method of identification of compounds effective against suppressed cancer cells
US8101159B2 (en) 2005-12-19 2012-01-24 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma In vivo methods of identifying compounds which target suppressed cancer cells
US9572886B2 (en) 2005-12-22 2017-02-21 Nitto Denko Corporation Agent for treating myelofibrosis
WO2008028086A2 (en) * 2006-08-30 2008-03-06 Bioventures, Inc. Methods and substances for isolation and detection of small polynucleotides
US20090147264A1 (en) * 2007-04-30 2009-06-11 The University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Label-free, real-time detection system for molecular interaction analysis
TW201004646A (en) * 2008-07-30 2010-02-01 Nitto Denko Corp Drug carriers
WO2011072240A1 (en) 2009-12-10 2011-06-16 Cedars-Sinai Medical Center Drug delivery of temozolomide for systemic based treatment of cancer
JP5950428B2 (ja) 2010-08-05 2016-07-13 日東電工株式会社 線維化組織から正常組織を再生するための組成物
HUE029521T2 (en) * 2010-08-20 2017-03-28 Replicor Inc Oligonucleotide chelate complexes
US9623041B2 (en) * 2010-12-30 2017-04-18 Cedars-Sinai Medical Center Polymalic acid-based nanobiopolymer compositions
JP6172640B2 (ja) * 2012-04-12 2017-08-02 国立大学法人 東京大学 核酸の定量方法、検出プローブ、検出プローブセット、及び核酸の検出方法
JP6340162B2 (ja) 2012-12-20 2018-06-06 日東電工株式会社 アポトーシス誘導剤
CN104419704B (zh) * 2013-09-05 2016-09-14 中国科学院上海生命科学研究院 一种内含子来源环形rna分子及其成环关键核酸序列的应用
CA2944417A1 (en) 2014-04-02 2015-10-08 Nitto Denko Corporation A targeting molecule and a use thereof
CN106133024B (zh) 2014-04-07 2019-07-05 日东电工株式会社 用于疏水性药物递送的新颖的基于聚合物的助水溶物
DK3313411T3 (da) 2015-06-26 2022-10-31 Univ California Sammensætninger og fremgangsmåder til identificering af polynukleotider af interesse
EP3496727A4 (en) * 2016-08-12 2020-03-18 The Regents of the University of California CONSTRUCTIONS AND METHOD FOR SIGNAL ENHANCEMENT
CN106580380B (zh) * 2016-12-23 2019-07-26 黄建能 一种可崩解膀胱尿道吻合器
WO2024036377A1 (en) * 2022-08-17 2024-02-22 Queensland University Of Technology Hairpin oligonucleotides

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5503979A (en) * 1984-05-25 1996-04-02 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method of using replicatable hybridzable recombinant RNA probes
US4957858A (en) * 1986-04-16 1990-09-18 The Salk Instute For Biological Studies Replicative RNA reporter systems
US5449602A (en) * 1988-01-13 1995-09-12 Amoco Corporation Template-directed photoligation
JP3276955B2 (ja) * 1988-09-30 2002-04-22 ジーン−トラック・システムス Ｒｎａの鋳型の末端に結合したプローブ構造およびその使用方法
AU651380B2 (en) * 1990-07-16 1994-07-21 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Selection of ribozymes that efficiently cleave target RNA
US5496698A (en) * 1992-08-26 1996-03-05 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Method of isolating ribozyme targets
US5401632A (en) * 1992-07-16 1995-03-28 Wisconsin Alumni Research Foundation Triple helix purification and sequencing
WO1994013791A1 (en) * 1992-12-04 1994-06-23 Innovir Laboratories, Inc. Regulatable nucleic acid therapeutic and methods of use thereof
AU675482B2 (en) * 1992-12-04 1997-02-06 Innovir Laboratories, Inc. Ribozyme amplified diagnostics
EP0682716A4 (en) * 1993-01-15 1999-10-27 New York Health Res Inst RNA ASSAYS USING BINARY RNA PROBES AND A RIBOZYME-LIGASE.
WO1994016108A1 (en) * 1993-01-15 1994-07-21 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. Sensitive nucleic acid sandwich hybridization assays and kits
US5871914A (en) * 1993-06-03 1999-02-16 Intelligene Ltd. Method for detecting a nucleic acid involving the production of a triggering RNA and transcription amplification
US5473060A (en) * 1993-07-02 1995-12-05 Lynx Therapeutics, Inc. Oligonucleotide clamps having diagnostic applications
US5624803A (en) * 1993-10-14 1997-04-29 The Regents Of The University Of California In vivo oligonucleotide generator, and methods of testing the binding affinity of triplex forming oligonucleotides derived therefrom
SE9400522D0 (sv) * 1994-02-16 1994-02-16 Ulf Landegren Method and reagent for detecting specific nucleotide sequences
US5631148A (en) * 1994-04-22 1997-05-20 Chiron Corporation Ribozymes with product ejection by strand displacement
US5622826A (en) * 1994-12-22 1997-04-22 Houston Advanced Research Center Method for immobilization of molecules on platinum solid support surfaces
JP2809601B2 (ja) * 1995-07-13 1998-10-15 株式会社分子バイオホトニクス研究所 塩基配列増幅方法
SE506908C2 (sv) * 1995-09-08 1998-03-02 Ulf Landegren Inst F Medicinsk Medicinsk användning av padlockprober
AU7016096A (en) * 1995-10-20 1997-05-07 Trustees Of Boston University Nucleic acid clamps
US5854033A (en) * 1995-11-21 1998-12-29 Yale University Rolling circle replication reporter systems
US5912124A (en) * 1996-06-14 1999-06-15 Sarnoff Corporation Padlock probe detection
CA2264246A1 (en) * 1996-08-26 1998-03-05 Intelligene Ltd. Catalytic nucleic acid and its medical use
EP0958303A4 (en) * 1996-12-19 2004-03-31 Univ Yale BIOREACTIVE ALLOSTERIC POLYNUCLEOTIDES
US6136533A (en) * 1997-07-03 2000-10-24 Id Biomedical Additives for use in cycling probe reactions

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006501823A (ja) * 2002-10-07 2006-01-19 バイオガイア・エイ・ビー ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）により引き起こされる炎症を低下させるための乳酸細菌の選択および使用
JP2011021015A (ja) * 2002-10-07 2011-02-03 Biogaia Ab ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）により引き起こされる炎症を低下させるための乳酸菌の選択および使用
JP4804755B2 (ja) * 2002-10-07 2011-11-02 バイオガイア・エイ・ビー ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）により引き起こされる炎症を低下させるための乳酸細菌の選択および使用
JP2006507825A (ja) * 2002-11-28 2006-03-09 アメルシャム・バイオサイエンシーズ・アクチボラグ アンチセンスオリゴヌクレオチドの単離
JP2007524395A (ja) * 2003-06-25 2007-08-30 ソーマジェニックス インコーポレイテッド 標的依存性の環状化及びトポロジー的結合が可能なポリヌクレオチド
JP2008525043A (ja) * 2004-12-29 2008-07-17 ヨハネス グーテンベルグ−ウニヴェリジテート マインツ フェアトレーテン ドゥルヒ デン プレジデンテン 核酸配列の機能およびそれにより核酸配列にコードされる発現産物の決定方法
JP2012179049A (ja) * 2004-12-29 2012-09-20 Biontech Ag 核酸配列の機能およびそれにより核酸配列にコードされる発現産物の決定方法
JP2017210448A (ja) * 2016-05-26 2017-11-30 国立大学法人北陸先端科学技術大学院大学 アンチジーン法用光応答性人工核酸プローブ

Also Published As

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US20060074041A1 (en) 2006-04-06
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CA2300938A1 (en) 1999-02-25
AU9199998A (en) 1999-03-08

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