ES2652348T3

ES2652348T3 - Composición para regenerar tejido normal a partir de tejido fibrótico

Info

Publication number: ES2652348T3
Application number: ES11814740.4T
Authority: ES
Inventors: Yoshiro Niitsu; Akihiro Yoneda; Hirotoshi Ishiwatari
Original assignee: Nitto Denko Corp
Current assignee: Nitto Denko Corp
Priority date: 2010-08-05
Filing date: 2011-08-05
Publication date: 2018-02-01
Anticipated expiration: 2031-08-05
Also published as: PL2601971T3; DK2601971T3; KR20190018545A; RU2013109370A; US20160312223A1; RU2650796C2; NO2601971T3; HRP20171556T1; AU2011286636B2; RS56493B1; EP2601971A4; CY1119527T1; JP2012051868A; US9926561B2; KR20130095739A; TW201210583A; CA2807033A1; KR20220047888A; JP5950428B2; WO2012018115A1

Abstract

Composición farmacéutica para su uso en la regeneración de tejido normal mediante crecimiento y diferenciación de células madre en un espacio formado debido a una reducción de colágeno acumulado en tejido fibrótico, en la que el tejido fibrótico recibe continuamente un estímulo fibrótico, en la que la composición comprende una sustancia reductora de colágeno y un retinoide, en la que la sustancia reductora de colágeno se une a o se incluye en un portador seleccionado del grupo que consiste en una micela, un liposoma, una microesfera y una nanoesfera, en la que el retinoide se une al portador por medio de un método químico y/o físico, y en la que el retinoide administra específicamente la sustancia reductora de colágeno a células que producen colágeno.

Description

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DESCRIPCION

Composicion para regenerar tejido normal a partir de tejido fibrotico [Campo tecnico]

La presente invencion se refiere a una composicion para regenerar tejido normal a partir de tejido fibrotico.

[Tecnica anterior]

La fibrosis de tejido esta provocada por la produccion y acumulacion excesivas en el tejido de matriz extracelular, que es principalmente colageno. Cuando se dana el tejido por estimulos tales como estres oxidativo, hipoxia, inflamacion o apoptosis, se repara el tejido danado mediante reemplazo con la matriz extracelular, pero en el caso de que el dano sea grave o en el caso de que tal estimulacion se vuelva cronica, la acumulacion de matriz extracelular se vuelve excesiva, y el tejido no puede realizar su funcion suficientemente. Se observa fibrosis en diversos tipos de organos, tales como el dgado, pancreas, pulmon, rinon, medula osea y corazon, y se cree que las celulas que producen colageno tales como los miofibroblastos estan relacionadas con un estado patologico. De manera convencional, se cree que la fibrosis es un fenomeno irreversible y que una vez que el tejido se ha vuelto fibrotico, no regresa a su estado original, pero recientemente, ha habido algunos informes que sugieren que la fibrosis es reversible, y que cuando desaparece el estimulo fibrotico mencionado anteriormente, la matriz extracelular acumulada en el tejido disminuye (veanse los documentos no de patente 1 a 3).

Sin embargo, no ha habido informes detallados respecto a lo que ocurre espedficamente en el tejido despues de que la acumulacion patologica de matriz extracelular disminuya, y hasta ahora se habfa desconocido completamente que se produzca regeneracion de tejido normal en tal tejido fibrotico o que la regeneracion de tejido normal fuera posible.

Ademas, la fibrosis de tejido no solo incluye fibrosis para las que la causa de la enfermedad esta clara y pueden eliminarse, tales como fibrosis derivada de infeccion vmca, consumo de alcohol, farmacos, etc., sino que tambien incluye fibrosis para las que la causa directa de la enfermedad no esta clara, tales como por ejemplo, cirrosis criptogenica, fibrosis pulmonar idiopatica o mielofibrosis idiopatica, y aquellas para las que la causa directa de la enfermedad se conoce pero el origen de la causa de la enfermedad no esta claro o es diffcil de eliminar, tales como por ejemplo, cirrosis biliar primaria, fibrosis hepatica derivada de esteatohepatitis no alcoholica (EHNA) y colangitis esclerosante primaria. El tejido que presenta tal fibrosis, para la que es diffcil eliminar la causa de la enfermedad, esta en un estado en el que siempre esta expuesto a un estfmulo fibrotico, pero se ha desconocido completamente hasta ahora que la acumulacion patologica de matriz extracelular en tal tejido fibrotico puede reducirse, y ciertamente no se sabfa que el tejido podfa regenerarse.

El documento de patente 1 divulga un portador de farmaco espedfico de astrocitos que contiene un derivado de retinoide y/o un analogo de vitamina A como constituyente; un metodo de administracion de farmacos con el uso del mismo; un farmaco que lo contiene; y un metodo terapeutico con el uso del farmaco. Al unir un portador de farmaco con un derivado de retinoide tal como vitamina A o un analogo de vitamina A o encapsulando el mismo en el portador de farmaco, puede administrarse espedficamente un farmaco para uso terapeutico a los astrocitos. Como resultado, puede inhibirse o prevenirse de manera eficiente y eficaz una enfermedad relacionada con astrocitos mientras se minimizan los efectos secundarios. Como farmaco que inhibe la actividad o el crecimiento de astrocitos, por ejemplo, puede encapsularse un siRNA frente a HSP47 que es una chaperona molecular espedfica de colageno en el portador de farmaco. Por tanto, la secrecion de colagenos de tipo I a tipo IV puede inhibirse al mismo tiempo y, a su vez, puede inhibirse eficazmente la fibrosis. El documento de patente 2 divulga un metodo para tratar enfermedades hepaticas o dano hepatico, incluyendo, pero sin limitarse a fibrosis hepatica, y/o para ayudar en la recuperacion de enfermedades hepaticas, incluyendo, pero sin limitarse a fibrosis hepatica, o dano hepatico en un sujeto, incluye trasplantar celulas madre mesenquimatosas umbilicales humanas (HUMSC) obtenidas de gelatina de Wharton a la zona de enfermedad o dano hepatico del sujeto. El documento de patente 3, que es tecnica anterior segun el art. 54(3) EPC, divulga un portador de administracion de sustancias para celulas que producen matriz extracelular en el rinon, incluyendo el portador un retinoide como agente de direccionamiento, un agente para tratar la fibrosis renal utilizando el portador, un procedimiento para producirlos, un kit de produccion, un metodo para tratar la fibrosis renal usando el agente para tratar la fibrosis renal, etc.

[Documentos de la tecnica anterior]

[Documentos no de patente]

[Documento no de patente 1] Issa et al., Gastroenterology. 2004; 126(7): 1795-808 [Documento no de patente 2] Iredale, J Clin Invest. 2007; 117(3): 539-48 [Documento no de patente 3] Sato et al., Nat Biotechnol. 2008; 26(4): 431-42

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[Documento de patente 1] EP 1 842 557 A1 [Documento de patente 2] US 2009/232781 A1 [Documento de patente 3] EP 2 583 691 A1 [Sumario de la invencion]

[Problemas que va a solucionar la invencion]

Un objeto de la presente invencion es proporcionar una composicion para regenerar terapeuticamente tejido normal en tejido en el que esta presente fibrosis.

[Medios para solucionar los problemas]

Mientras llevaban a cabo una investigacion intensiva con el fin de resolver los problemas mencionados anteriormente, los presentes inventores han encontrado que incluso en tejido fibrotico que recibe continuamente un estimulo fibrotico, puede reducirse el colageno acumulado en el tejido y, ademas, puede regenerarse tejido normal a partir del tejido fibrotico eliminando el colageno acumulado en el tejido y garantizando que haya espacio en el que pueden crecer y diferenciarse celulas madre, y por tanto, se ha conseguido la presente invencion. Tal como se describio anteriormente, aunque se sabe que cuando desaparece un estimulo fibrotico, la matriz extracelular acumulada en el tejido puede disminuir, se ha desconocido completamente hasta ahora que en tejido fibrotico que recibe continuamente un estimulo fibrotico, puede reducirse el colageno acumulado en el tejido y que puede regenerarse tejido normal a partir de tejido fibrotico eliminando activamente colageno acumulado en el tejido, y estos son hallazgos sorprendentes.

Por tanto, la presente invencion se refiere a lo siguiente.

(1) Una composicion farmaceutica para su uso en la regeneracion de tejido normal mediante crecimiento y diferenciacion de celulas madre en un espacio formado debido a una reduccion de colageno acumulado en tejido fibrotico, en la que el tejido fibrotico recibe continuamente un estfmulo fibrotico, en la que la composicion comprende una sustancia reductora de colageno y un retinoide, en la que la sustancia reductora de colageno se une a o se incluye en un portador seleccionado del grupo que consiste en una micela, un liposoma, una microesfera y una nanoesfera, en la que el retinoide se une al portador por medio de un metodo qmmico y/o ffsico, y en la que el retinoide administra espedficamente la sustancia reductora de colageno a celulas que producen colageno.

(2) La composicion farmaceutica para su uso segun (1) anteriormente, en la que la sustancia reductora de colageno se selecciona del grupo que consiste en un supresor de la produccion de colageno por celulas que producen colageno, un promotor de la descomposicion de colageno y un supresor de un inhibidor de la descomposicion de colageno.

(2) La composicion farmaceutica para su uso segun (2) anteriormente, en la que el supresor de la produccion de colageno por celulas que producen colageno se selecciona del grupo que consiste en un inhibidor de TGFp, HGF o una sustancia que promueve la produccion del mismo, un ligando de PPARy, un inhibidor de angiotensina, un inhibidor de PDGF, relaxina o una sustancia que promueve la produccion de la misma, una sustancia que inhibe la produccion y secrecion de un componente de matriz extracelular, un supresor de la actividad celular, un supresor del crecimiento celular y una sustancia que induce apoptosis.

(4) La composicion farmaceutica para su uso segun (2) anteriormente, en la que el promotor de la descomposicion de colageno es colagenasa o un promotor de la produccion de colagenasa.

(5) La composicion farmaceutica para su uso segun (2) anteriormente, en la que el supresor de un inhibidor de la descomposicion de colageno es un inhibidor de TIMP.

[Efectos de la invencion]

Segun la presente invencion, ha resultado evidente que puede regenerarse tejido normal a partir de tejido fibrotico, habiendose crefdo hasta ahora que la regeneracion de tejido normal a partir del mismo no se produda. Esto permite que se regenere terapeuticamente tejido normal a partir de tejido fibrotico, y se vuelve posible una nueva terapia regenerativa para una enfermedad fibrotica.

Ademas, segun la presente invencion, se vuelve posible tratar tejido fibrotico que esta continuamente expuesto a un estfmulo fibrotico, y puesto que se realiza un tratamiento medico para todos los tipos de enfermedades fibroticas incluyendo una enfermedad fibrotica para la que no hay terapia convencional efectiva y una enfermedad fibrotica para la que solo hay un tratamiento que implica el trasplante de organos, puede anticiparse una enorme contribucion

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al tratamiento medico y veterinario.

[Breve descripcion de los dibujos]

[Fig. 1] La figura 1 es un diagrama fotografico que muestra el aspecto global de Idgados obtenidos de ratas de prueba e imagenes tenidas con azan de secciones representativas de los mismos.

[Fig. 2] La figura 2 es un diagrama fotografico que muestra la localizacion de a-SMA en secciones representativas de Idgado obtenido de ratas de prueba.

[Fig. 3] La figura 3 es una imagen de fluorescencia que muestra la localizacion de DAPI y GFP en sitios de trasplante de celulas madre hepaticas.

[Fig. 4] La figura 4 muestra imagenes de campo claro e imagenes de fluorescencia de GFP de sitios de trasplante de celulas madre hepaticas.

[Fig. 5A] La figura 5A es un diagrama fotografico que compara imagenes de fluorescencia de DAPI y GFP y una imagen tenida de manera fluorescente por un anticuerpo anti-GFAP en un grupo tratado con VA-lip siRNAgp46 (aumento de 200x).

[Fig. 5B] La figura 5B es un diagrama fotografico que compara imagenes de fluorescencia de DAPI y GFP y una imagen tenida de manera fluorescente por un anticuerpo anti-GFAP en un grupo tratado con VA-lip siRNAgp46 (aumento de 400x).

[Fig. 6] La figura 6 es un diagrama fotografico de aumento 200x que compara imagenes de fluorescencia de DAPI y GFP y una imagen tenida de manera fluorescente por un anticuerpo anti-a-SMA en un grupo tratado con VA-lip siRNAgp46.

[Fig. 7] La figura 7 es un diagrama fotografico de aumento 200x que compara imagenes de fluorescencia de DAPI y GFP y una imagen tenida de manera fluorescente por un anticuerpo anti-albumina en un grupo tratado con VA-lip siRNAgp46.

[Fig. 8] La figura 8 es un diagrama fotografico de aumento 200x que compara imagenes de fluorescencia de DAPI y GFP y una imagen tenida de manera fluorescente por un anticuerpo anti-CK19 en un grupo tratado con VA-lip siRNAgp46.

[Fig. 9A] La figura 9A es un diagrama fotografico que compara imagenes de fluorescencia de DAPI y GFP y una imagen tenida de manera fluorescente por un anticuerpo anti-ve-CAD en un grupo tratado con VA-lip siRNAgp46 (aumento de 200x).

[Fig. 9B] La figura 9B es un diagrama fotografico que compara imagenes de fluorescencia de DAPI y GFP y una imagen tenida de manera fluorescente por un anticuerpo anti-ve-CAD en un grupo tratado con VA-lip siRNAgp46 (aumento de 400x).

[Fig. 10] La figura 10 es un diagrama fotografico de aumento 200x que compara imagenes de fluorescencia de DAPI y GFP y una imagen tenida de manera fluorescente por un anticuerpo anti-albumina en un sitio de un grupo tratado con VA-lip siRNAgp46 en el que no se trasplantan celulas madre hepaticas.

[Fig. 11] La figura 11 es una imagen de fluorescencia que muestra la distribucion intracelular de siRNA marcado con FAM en celulas estrelladas pancreaticas de rata.

[Fig. 12] La figura 12 es un grafico que muestra el resultado de un analisis de FACS con respecto a siRNA incorporado en celulas estrelladas pancreaticas de rata. Se muestran respectivamente en secuencia desde arriba los resultados de un grupo sin tratar, un grupo tratado con Lip siRNAgp46-FAM, un grupo tratado con VA-lip siRNAgp46-FAM, un grupo tratado con anticuerpos VA-lip siRNAgp46-FAM + RBP, y un grupo tratado con anticuerpos Lip siRNAgp46-FAM + RBP.

[Fig. 13] La figura 13 es una imagen de inmunotransferencia de tipo Western que muestra la supresion de la expresion de gp46 en celulas estrelladas pancreaticas de rata por siRNAgp46. A muestra la diferencia en el efecto de supresion segun la concentracion de VA-lip siRNAgp46, y B muestra la duracion del efecto de supresion.

[Fig. 14] La figura 14 es un grafico que muestra las cantidades cuantitativas de colageno producido tras 72 horas por celulas no tratadas y celulas tratadas con cada uno de VA-lip siRNAgp46 y VA-lip siRNA al azar.

[Fig. 15] La figura 15 es un diagrama fotografico que muestra la administracion espedfica de VA-lip siRNAgp46 a celulas estrelladas pancreaticas en ratas tratadas con DBTC. A y B son imagenes de inmunotincion por un

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anticuerpo anti-a-SMA y un anticuerpo anti-FITC de secciones pancreaticas de rata que se hadan tratado tres veces cada dos d^as con VA-lip siRNAgp46-FITC y Lip siRNAgp46-FITC respectivamente. Las imagenes de tincion a a d en el lado derecho son imagenes aumentadas de regiones denotadas por los s^bolos correspondientes en la imagen de tincion en el lado izquierdo. C muestra imagenes de tincion mediante tincion de azan-Mallory, tincion de anticuerpo anti-a-SMA, y tincion de anticuerpo anti-FITC de secciones de dgado de rata que se hadan tratado tres veces cada dos dfas con VA-lip siRNAgp46-FITC. D a F son imagenes de tincion de una tincion con un anticuerpo anti-CD68 y un anticuerpo anti-FITC de pulmon, bazo y retina de rata 24 horas despues de la administracion intravenosa de VA-lip siRNAgp46-FITC.

[Fig. 16] La figura 16 es un diagrama que muestra la expresion de protema gp46 en el pancreas 0, 1, 2, 3, y 4 dfas despues de la administracion de VA-lip siRNAgp46 a ratas a las que se les administro VA-lip siRNAgp46 (siRNA 0,75 mg/kg) el dfa 14 tras el tratamiento con DBTC. A muestra el resultado de inmunotransferencia de tipo Western de residuos de celulas pancreaticas, y B muestra el resultado de un analisis de concentracion cuantitativo que usa p- actina para normalizacion.

[Fig. 17] La figura 17 es un diagrama que muestra el efecto de VA-lip siRNAgp46 en fibrosis pancreatica inducida por DBTC. A muestra imagenes de tincion de azan-Mallory de secciones pancreaticas de rata tratada con DBTC a la que se le administro uno de VA-lip siRNAgp46, Lip siRNAgp46, y PBS 10 veces. B es un grafico que muestra la cuantificacion mediante analisis de imagenes computarizado de regiones que mostraron positivo en las imagenes de tincion de azan-Mallory de A. Se calcularon los datos a partir de 6 campos extrafdos al azar de seis ratas de cada grupo y se expresan como valores promedio ± desviacion estandar. C es un grafico que muestra el contenido de hidroxiprolina en el pancreas. Se expresan los datos como valores promedio ± desviacion estandar.

[Fig. 18] La figura 18 es un diagrama que muestra el efecto de VA-lip siRNAgp46 en fibrosis pancreatica inducida por DBTC. A muestra imagenes de tincion de a-SMA del pancreas de ratas tratadas con DBTC tras el tratamiento con VA-lip siRNAgp46. B es un grafico que muestra la cuantificacion mediante analisis de imagenes computarizado de regiones positivas para a-SMA en A. Se calcularon los datos a partir de 6 campos extrafdos al azar de seis ratas de cada grupo y se expresan como valores promedio ± desviacion estandar.

[Fig. 19] La figura 19 es un diagrama que muestra la regeneracion de tejido normal a partir de tejido pancreatico fibrotico mediante VA-lip siRNAgp46. A muestra imagenes de tincion de hematoxilina-eosina del pancreas de ratas tratadas con DBTC a las que se les hada administrado VA-lip siRNAgp46 (derecha) y Lip siRNAgp46 (izquierda) 10 veces. Los diagramas inferiores son diagramas aumentados de cada region a y b de los diagramas superiores. B es un grafico que muestra el peso del pancreas de ratas tratadas con DBTC.

[Fig. 20] La figura 20 es un grafico que muestra el efecto sobre la diferenciacion de celulas madre en presencia o ausencia de espacio alrededor de las celulas madre. La ordenada muestra el area de colonias positivas para albumina.

[Fig. 21] La figura 21 es un grafico que muestra el efecto sobre la diferenciacion de celulas madre en presencia o ausencia de espacio alrededor de las celulas madre. La ordenada muestra un mdice para la tasa de crecimiento de celulas madre.

[Modos para llevar a cabo la invencion]

La presente invencion se refiere a una composicion, que contiene una sustancia reductora de colageno, para regenerar tejido normal a partir de tejido fibrotico.

En la presente invencion, una “sustancia reductora de colageno” significa cualquier sustancia que puede reducir la cantidad de colageno acumulado en el tejido. Aunque no pretende limitarse a una teona espedfica, puesto que se piensa que una de las causas de la acumulacion de colageno en tejido fibrotico es un desplazamiento en el equilibrio entre produccion y descomposicion de colageno en el lado de produccion, la sustancia reductora de colageno puede incluir no solo un supresor de la produccion de colageno, sino tambien un promotor de la descomposicion de colageno y un supresor de un inhibidor de un promotor de la descomposicion de colageno. Por tanto, los ejemplos de la sustancia reductora de colageno incluyen un supresor de la produccion de colageno por celulas que producen colageno, un promotor de la descomposicion de colageno, y un supresor de un inhibidor de la descomposicion de colageno. Aunque no hay limitacion particular, el colageno en la presente invencion es preferiblemente un colageno implicado en fibrosis tales como por ejemplo colageno de tipo I, III, o V, y de manera particularmente preferible, colageno de tipo I, que esta presente en tejido fibrotico en la mayor cantidad.

En la presente invencion, las celulas que producen colageno significan cualquier celula que produce colageno en tejido fibrotico, y los ejemplos incluyen celulas estrelladas activadas y miofibroblastos. Se piensa que las celulas estrelladas activadas y los miofibroblastos son las principales fuentes que producen colageno en tejido fibrotico, y se caracterizan por la expresion de a-SMA (actina de musculo liso a). Por tanto, las celulas estrelladas activadas y los miofibroblastos en la presente invencion se identifican por medio de inmunotincion, etc. usando un anticuerpo anti-a-

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SMA que se marca de manera detectable.

El supresor de la produccion de colageno por celulas que producen colageno incluye cualquier farmaco que suprime directa o indirectamente las acciones ffsicas, qmmicas y/o fisiologicas, etc. de las mismas celulas implicadas en la acumulacion de colageno en tejido fibrotico, y ejemplos de los mismos incluyen un inhibidor de TGFp (factor de crecimiento transformante beta), HGF (factor de crecimiento de hepatocitos) o una sustancia que promueve la produccion del mismo, un ligando de PPARy (receptor del proliferador activado de peroxisoma gamma), un inhibidor de angiotensina, un inhibidor de PDGF (factor de crecimiento derivado de plaquetas), relaxina o una sustancia que promueve la produccion de la misma, una sustancia que inhibe la produccion y secrecion de un componente de matriz extracelular, un supresor de la actividad celular, supresor del crecimiento celular, y una sustancia que induce apoptosis.

Los ejemplos del inhibidor de TGFp incluyen un receptor de tipo II de TGFp truncado (Qi et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1999; 96 (5): 2345-9), un receptor de tipo II de TGFp soluble (George et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1999; 96 (22): 12719-24), un inhibidor de la actividad de TGFp tal como un anticuerpo anti-TGFp, un inhibidor de la produccion de TGFp tal como una molecula de RNAi, ribozima, o acido nucleico antisentido complementario a TGFp, vectores que los expresan, y celulas asf transformadas. En una realizacion de la presente invencion, el inhibidor de TGFp inhibe la actividad y/o produccion de TGFp1.

Los ejemplos de sustancias que promueven la produccion de HGF o relaxina incluyen un acido nucleico que codifica para HGF o relaxina, un constructo de expresion que lo contiene, vectores de expresion que los contienen, y celulas asf transformadas.

Los ejemplos del ligando de PPARy incluyen un ligando endogeno tal como 15-desoxi-A12,14-prostaglandina J2, acido nitrolinoleico, LDL oxidada (lipoprotema de baja densidad), un acido graso de cadena larga, o un eicosanoide, y un ligando exogeno tal como un agente medico de tiazolidindiona tal como troglitazona, pioglitazona, rosiglitazona, balaglitazona o rivoglitazona, o un farmaco antiinflamatorio no esteroideo.

Los ejemplos del inhibidor de angiotensina incluyen un antagonista del receptor de angiotensina tal como telmisartan, losartan, valsartan, candesartan cilexetilo, olmesartan medoxomilo o irbesartan. La angiotensina incluye angiotensinas I, II, III, y IV. Ademas, los ejemplos del receptor de angiotensina incluyen un receptor de angiotensina de tipo 1 (AT1).

Los ejemplos del inhibidor de PDGF incluyen un inhibidor de la actividad de PDGF tal como un anticuerpo anti- PDGF, un inhibidor de la produccion de PDGF tal como una molecula de RNAi, ribozima, o acido nucleico antisentido complementario a PDGF, vectores que los expresan, y celulas asf transformadas.

Los ejemplos de la sustancia que inhibe la produccion y secrecion de un componente de matriz extracelular incluyen una sustancia, tal como una molecula de RNAi, una ribozima, o un acido nucleico antisentido, que suprime la expresion de un componente de matriz extracelular tal como colageno, proteoglicano, tenascina, fibronectina, trombospondina, osteopontina, osteonectina, o elastina, una sustancia que tiene un efecto negativo dominante tal como un mutante negativo dominante, vectores que los expresan, y celulas asf transformadas. Los ejemplos de farmacos que inhiben la produccion y secrecion de colageno incluyen inhibidores de HSP47 (protema de choque termico), que es una chaperona molecular espedfica para colageno esencial para el transporte intracelular y maduracion molecular comun para los procesos sinteticos para los diversos tipos de colageno, por ejemplo inhibidores de la expresion de HSP47 tales como una molecula de RNAi, ribozima, o acido nucleico antisentido complementario a HSP47, una sustancia que tiene un efecto negativo dominante tal como un mutante negativo dominante de HSP47, vectores que los expresan, y celulas asf transformadas.

Los ejemplos del supresor del crecimiento celular incluyen un agente alquilante (por ejemplo ifosfamida, nimustina, ciclofosfamida, dacarbazina, melfalan, ranimustina, etc.), un antibiotico antitumoral (por ejemplo idarubicina, epirubicina, daunorubicina, doxorubicina, pirarubicina, bleomicina, peplomicina, mitoxantrona, mitomicina C, etc.), un antagonista de metabolismo (por ejemplo gemcitabina, enocitabina, citarabina, tegafur-uracilo, farmaco de combinacion de tegafur-gimeracilo-oteracilo potasio, doxifluridina, hidroxicarbamida, fluorouracilo, metotrexato, mercaptopurina, etc.), un alcaloide tal como etoposido, irinotecan, vinorelbina, docetaxel, paclitaxel, vincristina, vindesina, o vinblastina, un complejo de platino tal como carboplatino, cisplatino, o nedaplatino, y una estatina tal como lovastatina o simvastatina.

Los ejemplos del supresor de la actividad celular incluyen un inhibidor del canal de sodio.

Los ejemplos de la sustancia que induce apoptosis incluyen el compuesto 861, gliotoxina, y atorvastatina.

Los ejemplos del promotor de la descomposicion de colageno incluyen diversos tipos de colagenasa y una sustancia que promueve la produccion del mismo. Los ejemplos de la colagenasa incluyen la familia de MMP, tal como MMP (metaloproteinasa de matriz) 1, 2, 3, 9, 13 y 14. Los ejemplos del promotor de la produccion de colagenasa incluyen

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un acido nucleico que codifica para la colagenasa, un constructo de expresion que lo contiene, vectores de expresion que los contienen, y celulas asf transformadas.

Los ejemplos del inhibidor de un promotor de la descomposicion de colageno incluyen TIMP (inhibidor tisular de metaloproteinasa, TIMP1 y TIMP2, etc.). Por tanto, los ejemplos del supresor del inhibidor anterior incluyen un inhibidor de la actividad de TIMP tal como un anticuerpo para TIMP, un inhibidor de la produccion de TIMP tal como una molecula de RNAi, ribozima, o acido nucleico antisentido complementary a TIMP, vectores que los expresan, y celulas asf transformadas.

La molecula de RNAi en la presente invencion incluye RNA tal como siRNA (RNA interferente pequeno), miRNA (micro RNA), shRNA (RNA de horquilla corta), ddRNA (RNA dirigido a DNA), piRNA (RNA de interaccion de Piwi), rasiRNA (siRNA asociado a repeticion), y modificaciones de estos. Ademas, el acido nucleico en la presente invencion incluye RNA, DNA, PNA, y compuestos de los mismos.

En la presente invencion, “tejido fibrotico” significa tejido en el que la matriz extracelular, principalmente colageno, se ha acumulado en una cantidad mayor a la normal. Ademas de colageno, los ejemplos de la matriz extracelular incluyen proteoglicano, tenascina, fibronectina, trombospondina, osteopontina, osteonectina, y elastina. La cantidad de colageno acumulado en el tejido puede cuantificarse, por ejemplo, usando la cantidad de hidroxiprolina en el tejido como indicador o sometiendo el tejido a tincion de colageno (por ejemplo, tincion tricromica de Masson, tincion de azan, tincion con rojo sirio, tincion de Elastica van Gieson, etc.) y llevando a cabo un analisis de imagenes. La cantidad de matriz extracelular en tejido fibrotico en la presente invencion puede ser de al menos el 5 %, al menos el 10 %, al menos el 25 %, al menos el 50 %, al menos el 100 %, al menos el 200 %, al menos el 300 %, al menos el 400 %, o al menos el 500 % en comparacion con la de tejido normal. Puesto que se piensa que la produccion de colageno por celulas estrelladas activadas y/o miofibroblastos contribuye a la fibrosis del tejido, el tejido fibrotico en la presente invencion contiene normalmente celulas estrelladas activadas y/o miofibroblastos. El tejido fibrotico puede ser cualquier tejido en el cuerpo siempre que tenga las caractensticas mencionadas anteriormente, y los ejemplos de los mismos incluyen el Imgado, el pancreas, el pulmon, el rinon, la medula osea, las cuerdas vocales, la laringe, la cavidad bucal, el corazon, el bazo, el mediastino, el retroperitoneo, el utero, la piel, la glandula mamaria, y el tubo intestinal.

Por tanto, el tejido fibrotico puede ser un area afectada en diversas fibrosis del organo. Los ejemplos de las fibrosis del organo incluyen fibrosis hepatica, cirrosis hepatica, cicatrizacion de las cuerdas vocales, fibrosis mucosa de las cuerdas vocales, fibrosis larmgea, fibrosis pulmonar, fibrosis pancreatica, mielofibrosis, infarto de miocardio, fibrosis del miocardio tras infarto de miocardio, fibrosis miocardica, fibrosis endomiocardica, fibrosis esplenica, fibrosis mediastmica, fibrosis submucosa lingual, fibrosis intestinal (por ejemplo la asociada con una enfermedad intestinal inflamatoria, etc.), fibrosis retroperitoneal, fibrosis uterina, esclerodermia, y una enfermedad fibrosa de la mama.

La fibrosis hepatica y cirrosis hepatica en la presente invencion incluyen no solo las provocadas por una infeccion vmca con virus de la hepatitis B o C, consumo de alcohol, Imgado graso, una infeccion parasitaria, una anomalfa metabolica congenita, una sustancia hepatotoxica, etc., sino tambien aquellas cuya causa no esta especificada. Por tanto, los ejemplos de la cirrosis hepatica en la presente invencion incluyen cirrosis de Charcot, cirrosis de Todd, cirrosis biliar primaria, cirrosis unilobular, cirrosis biliar secundaria, cirrosis obstructiva, cirrosis colangiolftica, cirrosis biliar, cirrosis atropica, cirrosis nutricional, cirrosis posnecrotica, cirrosis poshepatica, cirrosis nodular, cirrosis mixta, cirrosis micronodular, cirrosis compensada, cirrosis macronodular, cirrosis septica, cirrosis criptogenica, cirrosis descompensada, cirrosis periportal, cirrosis portal, y cirrosis alcoholica.

La fibrosis pulmonar en la presente invencion incluye no solo fibrosis pulmonar en el sentido estricto si no tambien fibrosis pulmonar en un sentido amplio, incluyendo la coexistencia con neumoma intersticial. La fibrosis pulmonar en la presente invencion puede estar provocada por cualquier neumoma intersticial tal como por ejemplo neumoma intersticial infecciosa asociada con neumoma vmca, neumoma fungica, Mycoplasma pneumoniae, etc., neumoma intersticial asociada con una enfermedad del colageno tal como artritis reumatoide, esclerodermia sistemica, dermatomiositis, polimiositis, una enfermedad de tejido conectivo mixta (MCTD, enfermedad de tejido conectivo mixta), neumoma intersticial asociada con exposicion a radiacion, neumoma intersticial inducida por un farmaco tal como un antineoplasico tal como bleomicina, una medicina herbal china tal como Sho-saiko-to, interferon, un antibiotico, o Paraquat, o neumoma intersticial idiopatica tal como fibrosis pulmonar idiopatica, neumoma intersticial no espedfica, neumoma intersticial aguda, neumoma organizada criptogenetica, una enfermedad pulmonar intersticial respiratoria asociada con bronquiolitis, neumoma intersticial descamativa, o neumoma intersticial linfocftica, y la fibrosis pulmonar en la presente invencion incluye, por tanto, aquellas en las que la neumoma intersticial anterior se ha vuelto cronica.

La mielofibrosis en la presente invencion incluye no solo mielofibrosis primaria sino tambien mielofibrosis secundaria. Los ejemplos de la mielofibrosis secundaria incluyen las que son secundarias a una enfermedad tal como leucemia mieloide aguda, leucemia linfoblastica agua, leucemia mieloide cronica, policitemia verdadera, tromobocitemia primaria, smdrome mielodisplasico, mieloma multiple, linfoma maligno, carcinoma, lupus eritematoso sistemico, o esclerosis sistemica progresiva, o a exposicion a radiacion.

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La fibrosis renal en la presente invencion puede estar causada por cualquier nefritis intersticial tales como por ejemplo nefritis intersticial infecciosa asociada con nefritis estreptococica, nefritis estafilococica, nefritis pneumococica, nefritis vmica asociada con varicela, hepatitis B, hepatitis C, VIH, etc., nefritis debida a una infeccion parasitaria tal como malaria, nefritis fungica, nefritis asociada a Mycoplasma, etc., nefritis intersticial asociada con una enfermedad del colageno tal como lupus eritematoso sistemico (nefritis lupica), esclerodermia sistemica (enfermedad de colageno del rinon), o smdrome de Sjogren, nefritis asociada con una enfermedad inmunitaria de los vasos sangumeos tal como nefritis purpurica, poliarteritis, glomerulonefritis rapidamente progresiva, etc., nefritis intersticial asociada con exposicion a radiacion, nefritis intersticial inducida por un farmaco tal como un farmaco de referencia, un AINE, penicilamina, un antineoplasico tal como bleomicina, un antibiotico, o Paraquat, etc., una nefritis alergica debido a una picadura de insecto, polen, o un planta de la familia Anacardiaceae, nefritis amiloidosis, nefropatfa diabetica, glomerulonefritis cronica, nefritis asociada con nefroesclerosis maligna o una enfermedad de rinon poliqmstico, tubulonefritis intersticial, nefritis asociada con toxicosis gestacional o un cancer, glomerulonefritis membranoproliferativa, nefritis de nefropatfa por IgA, nefritis crioglobulinermica mixta, nefritis de smdrome de Goodpasture, nefritis granulomatosa de Wegener, o una nefritis intersticial idiopatica tal como nefritis intersticial aguda, etc., y la fibrosis renal en la presente invencion incluye, por tanto, aquellas en las que la nefritis intersticial anterior se ha vuelto cronica.

En la presente invencion, el tejido fibrotico es el que recibe continuamente un estfmulo fibrotico. En la presente invencion, el estfmulo fibrotico significa cualquier estfmulo que induce fibrosis, y los ejemplos incluyen estres oxidativo, hipoxia, inflamacion, y apoptosis (vease Ghiassi-Nejad et al., Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 2008; 2(6): 803-16). Los ejemplos de tal tejido incluyen tejido fibrotico que experimenta inflamacion cronica y tejido que esta continuamente expuesto a una sustancia citotoxica (por ejemplo, tejido hepatico en el que la colestasis esta provocada por una enfermedad del conducto biliar, etc.). Ademas, tal tejido tambien incluye tejido afectado por fibrosis para la que la causa directa de la enfermedad no esta clara, tal como por ejemplo cirrosis criptogenica, fibrosis pulmonar idiopatica o mielofibrosis idiopatica, etc., o afectada por aquellas para las que la causa directa de la enfermedad se conoce pero el origen de la causa de la enfermedad no esta claro o es diffcil de eliminar, tal como por ejemplo cirrosis biliar primaria, fibrosis hepatica derivada de esteatohepatitis no alcoholica (EHNA), colangitis esclerosante primaria, fibrosis pulmonar idiopatica, fibrosis pulmonar derivada de neumorna intersticial idiopatica, mielofibrosis primaria, fibrosis renal derivada de nefritis intersticial idiopatica, enfermedad inflamatoria del intestino (por ejemplo enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, etc.), o esclerodermia sistemica, etc.

En la presente invencion, “regenerar tejido normal a partir de tejido fibrotico” significa lo siguiente: segun avanza la fibrosis, el tejido se reemplaza por tejido fibroso, que es principalmente matriz extracelular, y la regeneracion de tejido normal a partir de tejido fibrotico en la presente invencion invierte el flujo anterior y reemplaza el tejido fibroso proliferado con el tejido normal original. Por tanto, la regeneracion de tejido normal a partir de tejido fibrotico en la presente invencion incluye no solo recuperar completamente el tejido fibrotico al estado original sino recuperar parcialmente el tejido fibrotico al estado original. El grado de regeneracion de tejido normal puede evaluarse mediante un examen histologico de una muestra de biopsia, etc., basandose en la normalizacion de la estructura tisular, reduccion en la region ocupada por tejido fibroso, aumento en la region ocupada por tejido normal, etc., o cuando se observa una anomalfa de un mdice bioqmmico debido a fibrosis antes del tratamiento con la presente composicion, la evaluacion puede llevarse a cabo basandose en la mejora del mdice, etc.

Segun la presente invencion, la regeneracion de tejido normal se lleva a cabo mediante crecimiento y diferenciacion de celulas madre en un espacio que se forma debido a la reduccion de colageno acumulado en tejido fibrotico. Por tanto, la presente invencion se refiere a la composicion farmaceutica que es para regenerar tejido normal a partir de tejido fibrotico en un espacio para el crecimiento y diferenciacion de celulas madre, formandose el espacio por una reduccion de colageno acumulado en el tejido fibrotico. En este caso, los ejemplos de las celulas madre incluyen los que estan originalmente presentes en el tejido que se ha vuelto fibrotico (celulas madre hepaticas, celulas madre pancreaticas, celulas madre de pulmon, celulas madre de rinon, celulas madre de medula osea, celulas madre de corazon, celulas madre de bazo, celulas madre de utero, celulas madre de piel, celulas madre de mama, celulas madre de intestino, celulas madre mesenquimatosas, etc.), aquellas que se han movido de otro lugar en el cuerpo y, ademas, aquellas que se han administrado terapeuticamente. Ademas, el “espacio” incluye no solo una cavidad dentro del tejido sino tambien un espacio con sitio en el que las celulas pueden aumentar y crecer tal como por ejemplo un espacio en el que la presion entre celulas se disminuye o un espacio que tienen flexibilidad.

La composicion de la presente invencion contiene ademas un retinoide. Al contener el retinoide, se vuelve posible administrar espedficamente a celulas que producen colageno, que son celulas diana, una sustancia reductora de colageno que selecciona como dina a celulas que producen colageno tales como, por ejemplo, una sustancia que inhibe la produccion y secrecion de un componente de matriz extracelular, HGF o una sustancia que promueve la produccion del mismo, MMP o una sustancia que promueve la produccion del mismo, un inhibidor de TIMP, un inhibidor de la produccion de TGFp, relaxina o una sustancia que promueve la produccion de la misma, etc., potenciando asf el efecto de la sustancia reductora de colageno usada.

Aunque el mecanismo en el que la seleccion como diana se lleva a cabo por medio de un retinoide aun no se ha aclarado, se resume, por ejemplo, que un retinoide unido espedficamente a una RBP (protema de union a retinol) se incorpora en una celula que produce colageno en tejido fibrotico mediante un determinado tipo de receptor situado

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sobre la superficie de la celula. La capacidad de un retinoide para actuar como agente diana para celulas que producen colageno se describe en los documentos WO 2006/068232, JP, A, 2009-221164, JP, A, 2010-59124, etc.

Un retinoide es un elemento de un grupo de compuestos que tiene un esqueleto en el que se conectan cuatro unidades de isoprenoide de manera de cabeza a cola (vease G. P. Moss, “Biochemical Nomenclature and Related Documents”, 2a ed. Portland Press, pags. 247-251 (1992)), y vitamina A es un descriptor generico para un retinoide que muestra cualitativamente la actividad biologica de retinol. Los ejemplos del retinoide que pueden usarse en la presente invencion incluyen retinol (incluyendo holo-trans-retinol), retinal, acido retinoico (incluyendo tretinoina), un ester de retinol y un acido graso, un ester de un alcohol alifatico y acido retinoico, un derivado de retinoide tal como etretinato, isotretinoina, adapaleno, acitretina, tazaroteno, o palmitato de retinilo, y un analogo de vitamina A tal como fenretinida (4-HPR) o bexaroteno.

Entre ellos, retinol, retinal, acido retinoico, un ester de retinol y un acido graso (por ejemplo, acetato de retinilo, palmitato de retinilo, estearato de retinilo, y laurato de retinilo, etc.), y un ester de un alcohol alifatico y acido retinoico (por ejemplo, retinoato de etilo, etc.) son preferibles en cuanto a eficiencia de administracion espedfica de una sustancia a celulas que producen colageno en tejido fibrotico.

Todos los isomeros, incluyendo los retinoides cis/trans, estan incluidos en el alcance de la presente invencion. Un retinoide puede sustituirse con uno o mas sustituyentes. El retinoide en la presente divulgacion incluye no solo uno en un estado aislado sino un retinoide en un estado en el que se disuelve o mezcla en un medio que puede disolverlo o retenerlo. Segun la invencion, el retinoide se une al portador que contiene la sustancia reductora de colageno, tal como se define en las reivindicaciones.

La composicion mencionada anteriormente de la presente divulgacion puede contener un componente que constituye el portador distinto de lo anterior. El componente que constituye el portador en la presente divulgacion no esta particularmente limitado; puede usarse cualquier componente que es conocido en los campos medicinales y/o farmaceuticos, siempre que sea uno para el cual al menos la union a un retinoide es posible.

Los ejemplos de un componente de este tipo incluyen un lfpido, por ejemplo, un fosfolfpido tal como un glicerofosfolfpido, un esfingolfpido tal como esfingomielina, un esterol tal como colesterol, un aceite vegetal tal como aceite de soja o aceite de semilla de amapola, un aceite mineral, una lecitina tal como lecitina de yema de huevo, y un polfmero. Entre ellos, es preferible uno que puede formar un liposoma, tal como por ejemplo un fosfolfpido natural tal como lecitina, un fosfolfpido semisintetico tal como dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), o diestearoilfosfatidilcolina (DSPC), dioleilfosfatidiletanolamina (DOPE), dilauroilfosfatidilcolina (DLPC), o colesterol.

Se prefiere particularmente un componente que puede evitar la captura por el sistema reticuloendotelial, y ejemplos de los mismos incluyen lfpidos cationicos tales como cloruro de N-(a-trimetilamonioacetil)-didodecil-D-glutamato (TMAG), N,N',N",N'"-tetrametil-N,N',N",N"-tetrapalmitilespermina (tMtPS), trifluoroacetato de 2,3-dioleiloxi-N- [2(esperminacarboxamida)etil]-N,N-dimetil-1-propanaminio (DOSPA), cloruro de N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N- trimetilamonio (DOTMA), cloruro de dioctadecildimetilamonio (DODAC), bromuro de didodecilamonio (DDAB), 1,2- dioleiloxi-3-trimetilamoniopropano (DOTAP), 3p-[N-(N',N'-dimetilaminoetano)carbamoil]colesterol (DC-Chol), bromuro de 1,2-dimiristoiloxipropil-3-dimetilhidroxietilamonio (DMRIE), y cloruro de 0,0’-ditetradecanoil-N-(a-

trimetilamonioacetil)dietanolamina (DC-6-14). Segun la invencion, el portador anterior tiene una forma tridimensional seleccionada del grupo que consiste en una micela, un liposoma, una microesfera, y una nanoesfera.

La union de un retinoide al portador se efectua por medio de un metodo qmmico y/o ffsico. La union de un principio activo al portador o la inclusion del mismo en el portador tambien puede ser posible mezclando un principio activo y un componente que constituye el portador. La cantidad de retinoide en la composicion de la presente invencion puede ser, por ejemplo, de 0,01 a 1000 nmol/^l, y preferiblemente de 0,1 a 100 nmol/^l. Ademas, la cantidad de principio activo en la composicion de la presente invencion puede ser de, por ejemplo, 1 a 10000 ng/|il, y preferiblemente de 10 a 1000 ng/|il, o de 1 a 1000000 |ig/kg de peso corporal, y preferiblemente de 10 a 100000 |ig/kg de peso corporal. Las cantidades de retinoide y principio activo pueden, en algunos casos, encontrarse fuera de los intervalos anteriores segun la actividad de estos componentes, la via de administracion de la composicion, la frecuencia de administracion, el sujeto al que se le administran, etc., y estos casos tambien estan incluidos en el alcance de la presente invencion. La union de un retinoide y/o un principio activo a un portador o la inclusion de un principio activo en un portador puede llevarse a cabo antes de soportar un principio activo sobre el portador, puede llevarse a cabo mezclando simultaneamente un componente que constituye el portador, un retinoide, y un principio activo, o puede llevarse a cabo mezclando un portador que tiene un principio activo ya soportado en el mismo y un retinoide. Por tanto, tambien se describe en el presente documento un metodo para producir una composicion farmaceutica para regenerar tejido normal a partir de tejido fibrotico que incluye una etapa de union de un retinoide a cualquier portador de union a farmaco existente o portador que encapsula el farmaco, por ejemplo, una preparacion de liposoma tal como DaunoXome(R), Doxil, Caelyx, o Myocet(R).

La composicion de la presente invencion se encuentra en una forma tal que puede transportarse un principio activo

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deseado a celulas que producen colageno en tejido fibrotico como diana. La forma se selecciona del grupo que consiste en una micela, un liposoma, una microesfera, y una nanoesfera. En la presente invencion, desde el punto de vista de una alta eficiencia de administracion, amplia eleccion de sustancias a administrar, facilidad de preparacion, etc., entre los anteriores, una forma de liposoma es preferible, y un liposoma cationico que contiene un ifpido cationico es particularmente preferible. Cuando la composicion se encuentra en la forma de un liposoma, la razon molar de retinoide y lfpido que constituye un liposoma es preferiblemente de 8:1 a 1:4, y mas preferiblemente de 4:1 a 1:2, mientras se tiene en cuenta la eficiencia de la union de un retinoide a un portador o la inclusion del mismo en un portador.

La composicion de la presente invencion puede contener un principio activo en el interior, puede tener un principio activo unido al exterior, o puede estar mezclado con un principio activo tal como se especifica en la reivindicacion adjunta 1. Por tanto, la composicion de la presente invencion puede estar en forma de un complejo entre un liposoma y un principio activo, es decir, un lipoplex; segun la via de administracion, la manera en la que se libera el farmaco, etc., la composicion puede recubrirse con un material adecuado tal como por ejemplo un recubrimiento enterico o un material de desintegracion programada, o puede incorporarse en un sistema de liberacion de farmaco adecuado.

El retinoide esta presente en una forma en la que actua de manera tal, que la composicion que contiene un retinoide alcanza y/o se incorpora en una celula que produce colageno, que es la celula diana, en tejido fibrotico a una velocidad mayor y/o en una mayor cantidad que la de una composicion que no contiene el retinoide, y esto puede confirmarse facilmente, por ejemplo, anadiendo una composicion marcada o que contiene marcador a un cultivo de celulas diana y analizando el sitio en el que el marcador esta presente despues de que haya transcurrido un tiempo predeterminado. En cuanto a la estructura, por ejemplo, si un retinoide se expone al menos parcialmente al exterior de la composicion como muy tarde antes de que alcance la celula diana, pueden satisfacerse los requisitos mencionados anteriormente. Puede evaluarse si un retinoide esta expuesto o no al exterior de la composicion poniendo en contacto la composicion con una sustancia que se une espedficamente a un retinoide, por ejemplo, una protema de union a retinol (RBP), etc., y examinando la union a la composicion.

Exponer un retinoide al menos parcialmente al exterior de la composicion como muy tarde antes de que alcance una celula diana puede llevarse a cabo, por ejemplo, ajustando la razon de composicion del retinoide y el componente que constituye el portador. Ademas, cuando se utiliza una estructura lipfdica tal como un liposoma como portador, por ejemplo, cuando se forma un complejo entre la estructura lipfdica y el retinoide, puede usarse un metodo en el que la estructura lipfdica se diluye en primer lugar en una disolucion acuosa, y luego esto se pone en contacto, se mezcla, etc., con el retinoide. En este caso, el retinoide puede estar en un estado en el que se disuelve en un disolvente, por ejemplo, un disolvente organico tal como DMSO. La estructura lipfdica a la que se hace referencia en este caso significa cualquier estructura tridimensional, por ejemplo, una estructura que tiene una forma lineal, de tipo pelroula, esferica, etc. y que contiene un lfpido como componente constituyente, y los ejemplos de la misma incluyen un liposoma, una micela, una microesfera lipfdica y una nanoesfera lipfdica. La posibilidad de aplicacion a otro portador de farmaco del mismo agente diana que el que se usa para seleccionar como diana un liposoma se describe en, por ejemplo, Zhao y Lee, Adv Drug Deliv Rev. 2004; 56 (8): 1193-204, Temming et al., Drug Resist Updat. 2005; 8(6): 381-402, etc.

Ademas de una sustancia reductora de colageno, la composicion de la presente invencion puede contener una sustancia que reduce un estfmulo fibrotico como principio activo, o puede usarse en combinacion con una sustancia de este tipo. Los ejemplos de la sustancia que reduce un estfmulo fibrotico incluyen un antioxidante, un promotor de la circulacion sangumea, un farmaco antiinflamatorio, un farmaco antivmco, un antibiotico, un agente antiparasitario, un farmaco de proteccion del hugado, un farmaco coleretico, y un supresor de la apoptosis. Estas sustancias pueden seleccionarse segun sea adecuado segun el tejido que se seleccione como diana y el cuadro clmico.

La composicion de la presente invencion puede contener un marcador. El marcaje permite que se monitorice el exito/fallo de la administracion a celulas diana, el aumento/disminucion de celulas diana, etc., y es util no solo a nivel de prueba e investigacion, sino tambien a nivel clmico. El marcador puede seleccionarse de cualquier marcador conocido para un experto en la tecnica tal como, por ejemplo, cualquier radioisotopo, material magnetico, sustancia que se une a una sustancia marcada (por ejemplo, un anticuerpo), sustancia fluorescente, fluoroforo, sustancia quimioluminiscente, o enzima. El marcaje puede fijarse a al menos un componente constituyente de la composicion de la presente invencion; por ejemplo, puede fijarse a uno o mas de un principio activo, el retinoide, y un componente que constituye el portador, o el marcaje puede contenerse en la composicion como componente distinto de lo anterior.

El termino “para celulas que producen colageno en tejido fibrotico” o “para la administracion a celulas que producen colageno en tejido fibrotico” en la presente invencion significa que es adecuado usar celulas que producen colageno en tejido fibrotico como celulas diana, y esto incluye por ejemplo ser capaz de administrar una sustancia a dichas celulas a una mayor velocidad, una mayor eficiencia, y/o en una mayor cantidad que para otras celulas, por ejemplo, celulas normales. Por ejemplo, el portador para celulas que producen colageno en tejido fibrotico o el portador para la administracion a celulas que producen colageno en tejido fibrotico puede administrar un principio activo a celulas que producen colageno en tejido fibrotico a una velocidad y/o eficiencia de al menos 1,1 veces, al menos 1,2 veces,

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al menos 1,3 veces, al menos 1,5 veces, al menos 2 veces y, ademas, al menos 3 veces en comparacion con otras celulas. Puesto que la composicion de la presente invencion contiene un agente diana para celulas que producen colageno en tejido fibrotico, puede elaborarse como composicion para celulas que producen colageno en tejido fibrotico o para la administracion a celulas que producen colageno en tejido fibrotico.

La composicion de la presente invencion es una composicion farmaceutica para su uso en medicina y puede administrarse por medio de diversos tipos de vfas, incluyendo vfas orales y parenterales; los ejemplos de las mismas incluyen, pero no se limitan a, vfas orales, entericas, intravenosas, intramusculares, subcutaneas, locales, intrahepaticas, intrabiliares, intrapulmonares, traqueobronquiales, intratraqueales, intrabronquiales, nasales, intrarrectales, intraarteriales, intraportales, intraventriculares, intramedulares, ganglio intralinfatico, intralinfaticas, intracerebrales, intratecales, intracerebroventriculares, transmucosales, percutaneas, intranasales, intraperitoneales e intrauterinas, y puede formularse en una forma de dosificacion que es adecuada para cada via de administracion. Una forma de dosificacion y metodo de formulacion de este tipo pueden seleccionarse segun sea adecuado a partir de cualquier forma y metodo conocidos (vease, por ejemplo, “Hyojun Yakuzaigaku” (Standard Pharmaceutical Science), ed. porYoshiteru Watanabe et al., Nankodo, 2003).

Los ejemplos de formas de dosificacion adecuadas para la administracion oral incluyen, pero no se limitan a, polvo, granulo, comprimido, capsula, lfquido, suspension, emulsion, gel yjarabe, y los ejemplos de formas de dosificacion adecuadas para la administracion parenteral incluyen inyecciones tales como una disolucion inyectable, una suspension inyectable, una emulsion inyectable, y una inyeccion en una forma que se prepara en el momento de su uso. Las formulaciones para la administracion parenteral pueden estar en una configuracion tal como una suspension o disolucion aseptica, isotonica acuosa o no acuosa.

La composicion de la presente invencion puede proporcionarse en cualquier configuracion, pero desde el punto de vista de la estabilidad de almacenamiento, se proporciona en una configuracion que puede prepararse en el momento de su uso, por ejemplo, en una configuracion que permite que un medico y/o un farmaceutico, un enfermero, otro paramedico, etc., la prepare en el lugar de tratamiento o en las vecindades del mismo. En este caso, la composicion de la presente invencion se proporciona por medio de uno o mas recipientes que contienen al menos un elemento constituyente esencial de la misma, y se prepara antes de su uso, por ejemplo, dentro de las 24 horas antes de su uso, preferiblemente dentro de las 3 horas antes de su uso, y mas preferiblemente inmediatamente antes de su uso. Cuando se lleva a cabo la preparacion, puede usarse un reactivo, un disolvente, equipo de preparacion, etc., que estan normalmente disponibles en un lugar de preparacion segun sea adecuado.

Tambien se describe en el presente documento un kit de preparacion para la composicion, incluyendo el kit uno o mas recipientes que contienen de manera individual o en combinacion un principio activo y/o un agente diana o sustancia que constituye el portador opcional, y tambien se refiere a un elemento constituyente necesario para la composicion proporcionado en forma de un kit de este tipo. El kit puede contener, ademas de lo anterior, instrucciones, un medio de registro electronico tal como un CD o DVD, etc., relacionado con un metodo preparativo y metodo de administracion para la composicion de la presente invencion, etc. Ademas, el kit puede incluir todos los elementos constituyentes para completar la composicion de la presente invencion, pero no tiene por que incluir siempre todos los elementos constituyentes. Por tanto, el kit no tiene por que incluir un reactivo o un disolvente que esta normalmente disponible en un lugar de tratamiento medico, una planta experimental, etc. tal como, por ejemplo, agua esteril, solucion salina fisiologica, o una disolucion de glucosa.

Tambien se describe en el presente documento un metodo para regenerar tejido normal a partir de tejido fibrotico, incluyendo el metodo una etapa de administracion de una cantidad eficaz de la composicion o la sustancia reductora de colageno de la presente invencion a un sujeto que lo requiere. La cantidad eficaz a la que se hace referencia en este caso es una cantidad que provoca la regeneracion de tejido normal en tejido fibrotico.

La cantidad de matriz extracelular puede determinarse cuantitativamente mediante diversos metodos tales como, por ejemplo, sin limitacion, analisis de imagenes de una imagen especialmente tenida de matriz extracelular o medicion de un marcador de matriz extracelular. Por ejemplo, puede determinarse cuantitativamente colageno midiendo la cantidad de un marcador de colageno tal como hidroxiprolina, o sometiendo tejido a tincion de colageno (por ejemplo, tincion tricromica de Masson, tincion de azan, tincion con rojo sirio, tincion de Elastica van Gieson, etc.) y llevando a cabo un analisis de imagenes. La reduccion en porcentaje de matriz extracelular en tejido fibrotico puede ser, por ejemplo, de al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 % y, ademas, al menos el 75 % en comparacion con un caso en el que la composicion de la presente invencion no se ha administrado. En este caso, el caso en el que la composicion de la presente invencion no se ha administrado incluye no solo un caso en el que la administracion en sf no se ha llevado a cabo, sino tambien un caso en el que se ha administrado un vehroulo solo, un caso en el que se ha administrado una composicion correspondiente a la composicion de la presente invencion excepto porque no contiene el principio activo y un caso en el que se ha administrado una composicion correspondiente a la composicion de la presente invencion excepto porque no contiene el retinoide (denominada controles negativos). Ademas, puede evaluarse la regeneracion de tejido normal mediante observacion histologica o mediante administracion de celulas madre marcadas a tejido fibrotico y llevando a cabo un estudio de seguimiento de la misma.

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La cantidad eficaz es preferiblemente una cantidad que no provoca un efecto adverso que supera el beneficio de la administracion. Tal cantidad puede determinarse segun sea adecuado mediante una prueba in vitro usando celulas cultivadas o mediante una prueba en un animal modelo tal como un raton, una rata, un perro, o un cerdo, y tales metodos de prueba los conoce bien un experto en la tecnica. Ademas, la dosis del farmaco usada en el metodo descrito en el presente documento la conoce un experto en la tecnica, o puede determinarse segun sea adecuado mediante la prueba mencionada anteriormente, etc. Como animal modelo para fibrosis, pueden usarse diversos modelos tales como un modelo de cirrosis hepatica obtenido por tetracloruro de carbono (CCU), suero porcino, dimetilnitrosamina (DMN), una dieta deficiente en metionina-colina (MCDD), concanavalina A (Con A), ligadura de las vfas biliares, etc., un modelo de fibrosis pulmonar obtenido por bleomicina (BLM), etc., un modelo de fibrosis pancreatica obtenido por dicloruro de dibutilestano, etc., y un modelo de mielofibrosis tal como un raton transgenico con trombopoyetina (TpO) (Leukemia Research 29: 761-769, 2005).

En el metodo descrito en el presente documento, la dosis espedfica de la composicion o sustancia reductora de colageno administrada puede determinarse mientras se tienen en cuenta diversas condiciones con respecto al sujeto que requiere el tratamiento, tales como por ejemplo la gravedad de los smtomas, el estado de salud general del sujeto, la edad, el peso y el genero del sujeto, la dieta, el momento y la frecuencia de administracion, un medicamento usado en combinacion, reaccion al tratamiento, cumplimiento con el tratamiento, etc.

Como via de administracion, existen diversas vfas que incluyen tanto la administracion oral como parenteral, y los ejemplos de las mismas incluyen vfas orales, entericas, intravenosas, intramusculares, subcutaneas, locales, intrahepaticas, intrabiliares, intrapulmonares, traqueobronquiales, intratraqueales, intrabronquiales, nasales, intrarrectales, intraarteriales, intraportales, intraventriculares, intramedulares, ganglio intralinfatico, intralinfaticas, intracerebrales, intratecales, intracerebroventriculares, transmucosales, percutaneas, intranasales, intraperitoneales e intrauterinas.

La frecuencia de administracion depende de las propiedades de la composicion usada y el estado mencionado anteriormente del sujeto, y puede ser una pluralidad de veces al dfa (es decir, 2, 3, 4, 5, o mas veces al dfa), una vez al dfa, cada pocos dfas (es decir, cada 2, 3, 4, 5, 6 o 7 dfas, etc.), algunas veces a la semana (por ejemplo 2, 3, 4 veces, etc., a la semana), cada semana, o cada pocas semanas (es decir, cada 2, 3, 4 semanas, etc.).

En el metodo descrito en el presente documento, el termino “sujeto” significa cualquier individuo vivo, preferiblemente un animal, mas preferiblemente un mairnfero, y aun mas preferiblemente un individuo humano. El sujeto puede estar sano o afectado por algun trastorno, pero normalmente significa un sujeto que tiene tejido fibrotico o tejido que tiene el riesgo de volverse fibrotico. Los ejemplos de un sujeto de este tipo incluyen, pero no se limitan a, un sujeto afectado por la fibrosis de organo anterior o que tiene el riesgo de verse afectado y un sujeto cuyo tejido recibe un estfmulo fibrotico o tiene el riesgo de recibirlo.

Se describe adicionalmente en el presente documento un metodo para regenerar tejido normal a partir de tejido fibrotico, incluyendo el metodo una etapa de reduccion de colageno en el tejido fibrotico y una etapa de formacion de un espacio para crecimiento y diferenciacion celular en el tejido fibrotico.

En el presente metodo, la reduccion de colageno en tejido fibrotico y la formacion de un espacio para crecimiento y diferenciacion celular pueden llevarse a cabo administrando la composicion de la presente invencion a tejido fibrotico.

[Ejemplos]

La presente invencion se explica en mas detalle por medio de los ejemplos a continuacion, pero solo son ilustraciones de la presente invencion tal como se define por las reivindicaciones adjuntas. En los ejemplos a continuacion, se expresan los datos como valores promedio (± desviacion estandar). Se llevaron a cabo multiples comparaciones entre un grupo de control y otro grupo por medio de la prueba de Dunnett.

Ejemplo 1. Preparacion de VA-lip siRNA

(1) Preparacion de siRNA

Como cadena sentido y cadena antisentido de siRNA (Hokkaido System Science Co., Ltd., Sapporo, Japon) dirigidas a la secuencia de bases de gp46 (n.° de registro GenBank M69246), que es el homologo de rata de HSP47 humana, una chaperona molecular comun a los colagenos (tipos I a IV), se usaron las siguientes a continuacion.

A: GUUCCACCAUAAGAUGGUAGACAACAG (siRNA de cadena sentido empezado por la base 757 en la secuencia de bases de gp46, SEQ ID NO: 1)

B: GUUGUCUACCAUCUUAUGGUGGAACAU (siRNA de cadena antisentido, SEQ ID NO: 2)

Como siRNA aleatorio (tambien denominado siRNA reorganizado al azar), se usaron los siguientes a continuacion.

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C: CGAUUCGCUAGACCGGCUUCAUUGCAG (siRNA de cadena sentido, SEQ ID NO: 3)

D: GCAAUGAAGCCGGUCUAGCGAAUCGAU (siRNA de cadena antisentido, SEQ ID NO: 4)

En algunos experimented, se usaron cadenas codificantes que teman 6'-carboxifluorescema (6-FAM) o isotiocianato de fluorescema (FITC) conjugados al extremo 5'. Se confirmo mediante una busqueda BLAST que estas secuencias no teman homologfa con otro mRNA de rata conocido.

(2) Preparacion de VA-lip siRNA

Como lfpido cationico, se adquirio un liposoma cationico (LipoTrust) que contema cloruro de 0,0’-ditetradecanoil-W- (a-trimetilamonioacetil)dietanolamina (DC-6-14), colesterol, y dioleilfosfatidiletanolamina (DOPE) a una razon molar de 4:3:3 de Hokkaido System Science Co., Ltd. (Sapporo, Japon). Antes de su uso, se preparo el liposoma a una concentracion de 1 mM (DC-6-14) anadiendo agua doblemente destilada (DDW) a una mezcla de lfpidos liofilizada con agitacion. Con el fin de preparar un liposoma acoplado a VA, se mezclaron 200 nmol de vitamina A (retinol, Sigma, EE. UU.) disueltos en DMSO con una suspension de liposoma (100 nmol como DC-6-14) en un tubo de 1,5 ml con agitacion a 25 °C. Con el fin de preparar un liposoma acoplado a VA que soporta siRNAgp46 (VA-lip- siRNAgp46), se anadio una disolucion de siRNAgp46 (580 pmol/ml en DDW) a la disolucion de liposomas acoplada a retinol con agitacion a temperatura ambiente. La razon molar de siRNA y DC-6-14 fue de 1:11. Con el fin de obtener una dosis deseada in vitro, se reconstituyo el VA-lip siRNA usando solucion salina tamponada con fosfato (PBS).

Ejemplo 2. Experimento de terapia regenerativa usando una rata modelo de fibrosis hepatica

(1) Preparacion de rata modelo de fibrosis hepatica

Se preparo una rata modelo de fibrosis hepatica sometiendo una rata SD macho (peso corporal de 150 a 200 g) (Slc Japan, Shizuoka, Japon) a una ligadura de las vfas biliares comun, y se sometio un individuo el dfa 28 tras la ligadura al presente experimento. La rata modelo presente estaba en un estado en el que se provoco colestasis mediante la ligadura de las vfas biliares comun y se expuso continuamente el tejido hepatico a un estimulo fibrotico.

(2) Preparacion de celulas madre hepaticas de rata marcadas con GFP

Se recogieron celulas madre hepaticas de rata marcadas con GFP del Imgado de una rata transgenica con GFP de 4 semanas de edad (Slc Japan). En primer lugar, se perfundieron una disolucion de EGTA y una disolucion de colagenasa en toda la rata transgenica con GFP, entonces se extrajo el tegado, y se corto finamente el hfgado extrafdo y luego se filtro usando un filtro de celulas (diametro de poro 100 |im). Se anadieron disolucion salina equilibrada de Hank (HBSS) + disolucion de albumina serica bovina al 0,25 % (BSA) a la suspension de celulas obtenida, y se sometio la mezcla a centrifugacion a 4 °C y 500 rpm durante 2 minutos. Se recogio el sobrenadante y se sometio a centrifugacion a 4 °C y 1300 rpm durante 5 minutos. Despues de que se eliminara el sobrenadante, se anadio tampon MACS® (separacion magnetica de celulas activadas) (Miltenyi Biotec, Auburn, CA, EE. UU.) al precipitado y se mezclo. Despues de que se contara el numero de celulas, se llevo a cabo MACS® usando un anticuerpo anti-CD45 de raton conjugado con FITC (BD Pharmingen), un anticuerpo anti-CD133 policlonal de conejo (Abcam), y un anticuerpo anti-EpCAM monoclonal de raton (Santa Cruz), y CD133-positive, se obtuvieron celulas positivas para EpCAM y negativas para CD45 y se usaron como celulas madre hepaticas de rata en el presente experimento.

(3) Tratamiento de rata modelo de fibrosis hepatica

Se trasplantaron localmente las celulas madre hepaticas marcadas con GFP preparadas en (2) en ratas modelo de fibrosis hepatica preparadas en (1) a una concentracion de 2 x 106 recuentos en 200 |il de medio de DME/F12.

A partir de las 24 horas despues del trasplante de las celulas madre hepaticas, se administro siRNAgp46 encapsulado en liposoma acoplado a vitamina A (VA-lip siRNAgp46) o VA-lip siRNA reorganizado al azar como simulacion por medio de la vena de la cola cada dos dfas un total de 12 veces. La concentracion de siRNA administrado fue de 0,75 mg/kg de peso corporal de rata. La razon molar de vitamina A, liposoma (LipoTrust, Hokkaido System Science Co., Ltd., Sapporo, Japon), y siRNA fue de 11,5:11,5:1.

(4) Tincion tisular

24 horas despues de la 12a administracion de VA-lip siRNAgp46 en (3) (es decir, el dfa 52 despues de la ligadura de las vfas biliares comun), se extrajo el tegado de la rata con ligadura de las vfas biliares a la que se le habfan trasplantado las celulas madre hepaticas que expresaban GFP. Despues de que el hfgado extrafdo se incrustara usando compuesto OCT, se prepararon secciones congeladas. Se fijaron las secciones de hfgado usando paraformaldeh^do al 4 %. Se sometieron algunas de las secciones a tincion de azan mediante un metodo

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convencional. Se sometieron algunas de las secciones a bloqueo con PBS que contema suero de cabra al 5 %, se lavaron con PBS, y luego se hicieron reaccionar a 4 °C durante la noche usando un anticuerpo anti-actina de musculo liso a (a-SMA) monoclonal de raton (Sigma), un anticuerpo anti-protema acida fibrilar glial (GFAP) monoclonal de raton (Sigma), un anticuerpo anti-albumina policlonal de conejo (MP Biomedicals), un anticuerpo anti- CK19 monoclonal de raton (Novocastra), y un anticuerpo anti-cadherina endotelial vascular (ve-CAD, cadherina endotelial vascular) monoclonal de raton (Santa Cruz). Despues de lavar con PBS, se hicieron reaccionar con un anticuerpo de cabra anti-IgG de raton marcado con Alexa555 y un anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo marcado con Alexa555 (ambos de Invitrogen) a temperatura ambiente durante 60 minutos. Despues de lavar con PBS, se incrustaron usando ProLong(R) Gold con DAPI (Invitrogen) y se examinaron por medio de un microscopio de fluorescencia. En lugar de la reaccion con anticuerpo de cabra anti-conejo, se hicieron reaccionar algunas porciones de las secciones con un anticuerpo anti-a-SMA (Dako) y luego se sometieron a coloracion por medio de diaminobencidina (DAB) y ademas a tincion nuclear por medio de hematoxilina.

Resultados

La figura 1 muestra el aspecto de hugados extrafdos de las ratas de prueba e imagenes tenidas con azan de secciones representativas del mismo. En el grupo al que se le habfa administrado VA-lip siRNA reorganizado al azar, el hngado se contrajo, la superficie fue irregular, se observo ampliamente la acumulacion de matriz extracelular que se habfa tenido de azul en el tejido en la imagen tenida con azan, y se altero la estructura lobular hepatica. Por otro lado, en el grupo al que se le habfa administrado VA-lip siRNAgp46, no hubo contraccion evidente, la superficie fue lisa, apenas hubo acumulacion de matriz extracelular en el tejido, y hubo una reduccion obvia en el tamano de la region fibrotica en comparacion con el grupo tratado con VA-lip siRNA reorganizado al azar. Ademas, se observo claramente que se habfa recuperado una estructura lobular hepatica normal, en la que los sinusoides discurren radialmente desde la vena central.

La figura 2 muestra imagenes tenidas con DAB de anticuerpo anti-a-SMA. Las porciones azules son nucleos tenidos con hematoxilina y las porciones marron oscuro son regiones positivas para a-SMA. La a-SMA es conocida como marcador para celulas estrelladas activadas, y se piensa que en las regiones positivas para a-SMA estan presentes celulas estrelladas activadas. En el grupo tratado con VA-lip siRNAgp46 hubo una marcada reduccion en las celulas estrelladas activadas en comparacion con VA-lip siRNA reorganizado al azar.

La figura 3 muestra imagenes de fluorescencia de DAPI y GFP de sitios de trasplante de celulas madre hepaticas marcadas con GFP. En el grupo tratado con VA-lip siRNAgp46, se observo coloracion con GFP en aproximadamente el 80 % de la region, mientras que en el grupo tratado con VA-lip siRNA reorganizado al azar apenas hubo coloracion.

La figura 4 muestra imagenes de campo claro y de fluorescencia de GFP de sitios de trasplante de celulas madre hepaticas marcadas con GFP. En el grupo tratado con VA-lip siRNA reorganizado al azar, la forma de las celulas se volvio borrosa debido a la acumulacion de matriz extracelular, particularmente en areas unidas a vasos sangumeos, y los sinusoides discurren de modo aleatorio, mientras que en el grupo tratado con VA-lip siRNAgp46 la forma de las celulas era clara y se observo una estructura de sinusoides en la que discurrieron radialmente desde la vena central. Ademas, en el grupo tratado con VA-lip siRNA reorganizado al azar no hubo coloracion con GFP, mientras que en el grupo tratado con VA-lip siRNAgp46 se observo coloracion con GFP en todo el tejido.

La figura 5 es una comparacion entre imagenes de fluorescencia de DAPI y GFP y una imagen tenida de manera fluorescente por un anticuerpo anti-GFAP en el grupo tratado con VA-lip siRNAgp46 (figura 5A es un aumento de 200x y la figura 5B es un aumento de 400x). GFAP es una protema conocida como marcador para celulas estrelladas hepaticas en un estado de reposo. Las celulas que expresaban GFAP no expresaban GFP.

La figura 6 es una comparacion entre imagenes de fluorescencia de DAPI y GFP y una imagen tenida de manera fluorescente mediante un anticuerpo anti-a-SMA en el grupo tratado con VA-lip siRNAgp46 a un aumento de 200x. Las celulas que expresaban a-SMA no expresaban GFP. Los resultados de las figuras 5 y 6 sugieren que no se derivan celulas estrelladas hepaticas a partir de celulas madre hepaticas.

La figura 7 es una comparacion entre imagenes de fluorescencia de DAPI y GFP y una imagen tenida de manera fluorescente mediante anticuerpo anti-albumina en el grupo tratado con VA-lip siRNAgp46 a un aumento de 200x. La albumina es un marcador para hepatocitos, y muchas de las celulas que expresaban GFP expresaban albumina.

La figura 8 es una comparacion entre imagenes de fluorescencia de DAPI y GFP y una imagen tenida de manera fluorescente mediante anticuerpo anti-CK19 en el grupo tratado con VA-lip siRNAgp46 a un aumento de 200x. CK19 es un marcador para celulas epiteliales de las vfas biliares, y celulas positivas para CK-19 que formaban las vfas biliares expresaban GFP.

La figura 9 es una comparacion entre imagenes de fluorescencia de DAPI y GFP y una imagen tenida de manera fluorescente mediante anticuerpo anti-ve-CAD en el grupo tratado con VA-lip siRNAgp46 (figura 9A es un aumento

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de 200x y la figura 9B es un aumento de 400x). La ve-CAD es conocida como marcador para celulas endoteliales de vasos sangumeos, y en algunas de las celulas que expresaban GFP, se observaron celulas que expresaban ve- CAD.

La figura 10 es una comparacion entre imagenes de fluorescencia de DAPI y GFP y una imagen tenida de manera fluorescente mediante anticuerpo anti-albumina en un sitio del grupo tratado con VA-lip siRNAgp46 en el que las celulas no se hadan trasplantado a un aumento de 200x. En el sitio en el que las celulas no se hadan trasplantado, no hubo celulas que expresaban GFP.

Discusion

Puesto que las celulas que expresaron GFP eran celulas derivadas de las celulas madre hepaticas trasplantadas, debido a la administracion de VA-lip siRNAgp46, en el sitio de trasplante de celulas la region fibrotica se redujo en tamano y las celulas madre hepaticas se diferenciaron para dar hepatocitos, celulas epiteliales de las vfas biliares, y celulas endoteliales de vasos sangumeos, mostrando por tanto que se regenero tejido hepatico normal. Es decir, ha quedado claro que el tratamiento que implica la administracion de VA-lip siRNAgp46 no solo cura la fibrosis hepatica, sino que tambien induce la regeneracion del dgado. Ademas, el resultado de que no pudieron detectarse celulas madre hepaticas en el grupo tratado con VA-lip siRNA reorganizado al azar (figura 3) sugiere que la reduccion en tamano de la region fibrotica debido a VA-lip siRNAgp46 esta plenamente implicada en el crecimiento y la diferenciacion de celulas madre hepaticas.

Ejemplo 3. Administracion especifica de celulas estrelladas por medio de VA

(1) Aislamiento de celulas estrelladas pancreaticas de rata (PSC)

Se aislaron celulas estrelladas pancreaticas de rata (PSC) usando un metodo de centrifugacion de gradiente de densidad segun un informe previo (Apte et al. Gut 1998; 43: 128-133). Se sometio a ensayo la pureza mediante examen microscopico, autofluorescencia de VA endogena, y un metodo inmunocitoqdmico que usa un anticuerpo monoclonal (1:25, Dako) para desmina, que es una protema de reticulacion de actina de musculo. Se sometio a ensayo la viabilidad de celulas mediante exclusion con azul de tripano. Tanto la pureza como la viabilidad celular superaron el 95 %. Se cultivaron las celulas en medio de Iscove modificado con Dulbecco (medio de Iscove modificado con Dulbecco: IMDM) complementado con suero bovino fetal al 10% (FBS) a 37 °C con el 95% de aire/el 5 % de CO2 en un ambiente humidificado.

(2) Analisis de distribucion intracelular de VA-lip siRNAgp46-FAM

Se sembraron pPSC de rata (celulas estrelladas pancreaticas primarias, PSC primarias) de manera que hubo 1 x 104 celulas por camara en un cubreobjetos de camara Lab-Tek. Se anadio VA-lip siRNAgp46-FAM o Lip siRNAgp46- FAM a las celulas de manera que la concentracion de siRNA final fue de 50 nM. Se cultivaron las celulas en dMeM que contema FBS al 10 % durante 30 minutos, y se intercambio el medio con medio nuevo. 30 minutos despues y 2 horas despues del tratamiento, se lavaron las celulas con PBS tres veces, y se fijaron tratando con paraformaldeddo al 4 % a 25 °C durante 15 minutos. Despues de la fijacion, se lavaron las celulas con PBS tres veces y se expusieron a ProLong(R) Gold con DAPI (Invitrogen) durante 1 minuto para tenir asf el nucleo. Se sometio a ensayo la ubicacion intracelular de siRNAgp46 marcado con FAM usando un microscopio de fluorescencia (Keyence, BZ-8000).

(3) Analisis de FACS de VA-lip siRNAgp46-FAM

Se trataron pPSC de rata (1 x 104 celulas) con VA-lip siRNAgp46-FAM (siRNA 50 nM) en presencia de FBS al 10 % y se cultivaron durante 30 minutos. Para un ensayo de bloqueo, antes de que se anadiera VA-lip siRNAgp46-FAM, se trataron 1 x 104 celulas con un anticuerpo anti-RBP de raton (10 |ig/ml, BD Pharmingen), o IgG1 de raton (10 |ig/ml, Dako) como control negativo, durante 30 minutos. Se sometio a ensayo la intensidad de fluorescencia media (MFI) de celulas VA-lip siRNAgp46 tratadas con FAM usando FACScalibur con software CellQuest (Becton Dickinson).

(4) Inmunotransferencia de tipo Western

Con el fin de evaluar el efecto de atenuacion de siRNAgp46, se llevo a cabo un experimento de inmunotransferencia de tipo Western. Espedficamente, se separaron extractos de protema de PSC tratados respectivamente con VA-lip siRNAgp46 (1 nM, 5 nM, 50 nM), VA-lip-siRNA aleatorio (50 nM), y Lip-siRNAgp46 (50 nM) durante 30 minutos por medio de gel de poliacrilamida-SDS 4/20, se transfirieron a pelfcula de nitrocelulosa, se sondearon con un anticuerpo (Stressgen) para HSP47 (gp46) o un anticuerpo (Cell Signaling) para p-actina, y se marcaron con un anticuerpo unido a peroxidasa (Oncogene Research Products, Boston, MA) como anticuerpo secundario. Finalmente, se visualizaron las celulas por medio de un sistema de deteccion de inmunotransferencia de tipo Western ECL (Amersham Life Science, Arlington Heights, IL).

Ademas, con el fin de confirmar la duracion de la supresion de la expresion de gp46, se trataron PSC con VA-lip

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siRNAgp46 (50 nM) durante 30 minutos y luego se cultivaron durante 24 horas, 48 horas, 72 horas, y 96 horas, y tras esto se extrajo la protema y se sometio a un experimento de inmunotransferencia de tipo Western de la misma manera tal como se describio anteriormente, junto con uno 30 minutos tras el tratamiento con VA-lip-siRNA aleatorio (50 nM).

(5) Determinacion cuantitativa de la produccion de colageno

Se sembraron pPSC de rata sobre una placa de cultivo tisular de 6 pocillos a una densidad de 5 x 104 celulas/pocillo en DMEM que contema FBS al 10 %. Despues de cultivar durante 24 horas, se trataron las pPSC de rata con VA-lip siRNAgp46 (siRNA 50 nM) y VA-lip siRNA aleatorio (siRNA 50 nM). Se cultivaron las celulas en DMEM que contema FBS al 10% durante 30 minutos, y luego se intercambio el medio con medio nuevo. 72 horas despues del tratamiento, se lavaron las celulas con PBS tres veces, y se tino colageno depositado en el pocillo usando rojo sirio (Biocolor, Belfast, R. U.) segun un informe previo (Williams et al. Gut 2001; 49: 577-583). Se elimino tinte sin unir mediante lavado, y se disolvio el complejo unido en hidroxido de sodio al 0,5 %. Se llevo a cabo un analisis cuantitativo de colageno mediante analisis de intensidad de absorcion a 540 nm, y se expreso el resultado como porcentaje relativo a un control no tratado.

Resultados

La figura 11 muestra imagenes de fluorescencia de la distribucion intracelular de siRNA marcado con FAM. Las dos imagenes a la izquierda son imagenes de fluorescencia de PSC tratadas con VA-lip siRNAgp46-FAM, y las dos imagenes a la derecha son imagenes de fluorescencia de PSC tratadas con Lip siRNAgp46-FAM. Las dos imagenes superiores son imagenes 30 minutos despues del tratamiento, y las dos imagenes inferiores son imagenes 2 horas despues del tratamiento. 30 minutos despues del tratamiento con VA-lip siRNAgp46-FAM, se observo una leve fluorescencia verde debido a FAM en un patron granular dentro del citoplasma, y 2 horas despues del tratamiento, se observo un patron granular mas oscuro en una region alrededor del nucleo. En comparacion con ello, en el grupo tratado con Lip siRNAgp46-FAM, no se observo fluorescencia verde 30 minutos despues del tratamiento, y la fluorescencia alrededor del nucleo 2 horas despues del tratamiento fue leve.

La figura 12 muestra graficos de los resultados de los analisis de FACS. Se muestran los resultados del grupo no tratado, el grupo tratado con Lip siRNAgp46-FAM, el grupo tratado con VA-lip siRNAgp46-FAM, el grupo tratado con VA-lip siRNAgp46-FAM + anticuerpo anti-RBP, y el grupo tratado con Lip siRNAgp46-FAM + anticuerpo anti-RBP en secuencia desde arriba. En los resultados de los analisis de FACS, en comparacion con el grupo tratado con VA-lip siRNAgp46-FAM, en el grupo tratado con VA-lip siRNAgp46-FAM + anticuerpo anti-RBP, se suprimio la intensidad de fluorescencia al mismo nivel que la del grupo tratado con Lip siRNAgp46-FAM, lo que sugiere que la incorporacion de VA-lip siRNAgp46 en PSC esta mediada por un receptor de RBP.

La figura 13A muestra los resultados de inmunotransferencia de tipo Western, que muestran la diferencia en el efecto de supresion segun la concentracion. En las celulas tratadas con VA-lip siRNAgp46, se observo que la supresion de la expresion de gp46 dependfa de la concentracion de VA-lip siRNAgp46, estando la expresion casi completamente suprimida a 50 nM, mientras que no se observo supresion de la expresion con VA-lip siRNA aleatorio o Lip siRNAgp46.

La figura 13B muestra el resultado de inmunotransferencia de tipo Western para determinar la duracion del efecto de supresion. Cuando se trata con VA-lip siRNAgp46, en celulas cultivadas durante 72 horas despues del tratamiento, se observo una supresion marcada de gp46. Por tanto, se confirmo que el efecto de suprimir la expresion de gp46 continuo durante al menos 72 horas despues del tratamiento.

La figura 14 es un grafico que muestra la determinacion cuantitativa de la cantidad de colageno producida despues de 72 horas en celulas no tratadas y celulas tratadas con VA-lip siRNAgp46 y VA-lip siRNA aleatorio respectivamente. En comparacion con las celulas no tratadas y las celulas tratadas con VA-lip siRNA aleatorio, cuando se tratan con VA-lip siRNAgp46, se confirmo una supresion marcada de la produccion de colageno.

Discusion

A partir de los resultados anteriores puede observarse que, in vitro, se incorpora VA-lip siRNAgp46 espedficamente en PSC mediante incorporacion mediada por receptor de RBP para, por tanto, suprimir la expresion de gp46, y como resultado, la produccion de colageno se suprime marcadamente. Esto sugiere que, en pancreas afectado por fibrosis pancreatica, VA-lip siRNAgp46 puede reducir colageno.

Ejemplo 4. Experimento de terapia regenerativa de rata modelo de fibrosis pancreatica (1) Preparacion de rata modelo de fibrosis pancreatica

Se usaron ratas Lewis macho que teman un peso corporal de 150 a 200 g (Charles River). Segun un informe previo (Inoue et al. Pancreas 2002; 25: e64-70), se disolvio dicloruro de dibutilestano (dicloruro de dibutilestano, DBTC) en

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1 parte de etanol y luego se mezclo con 2 partes de glicerol y 2 partes de sulfoxido de dimetilo (DMSO) para preparar asf una disolucion (disolucion de DBTC), y se administro una cantidad correspondiente a 5 mg (DBTC)/kg (peso corporal) a la arteria carotida derecha de la rata por medio de una jeringa.

(2) Localizacion in vivo de VA-lip siRNAgp46-FITC en pancreas de rata y otros tejidos

Despues de 43 dfas desde el inicio de la administracion de DBTC, en el momento en el que se observo fibrosis pancreatica grave, se administro 1 |il/g de peso corporal de VA-lip siRNAgp46-FITC o Lip siRNAgp46-FITC a la rata tratada con DBTC por medio de la vena de la cola. Se llevo a cabo la administracion a presion normal tres veces cada dos dfas con 0,75 mg/kg de siRNA cada vez. 24 horas despues de la administracion final, se sacrifico la rata mediante perfusion con solucion salina fisiologica, y se extrajeron el pancreas y otros organos (el hngado, el pulmon, el bazo, y la retina). Se fijaron las muestras de organo con paraformaldehndo al 10%, y se tineron secciones incrustadas en parafina usando tincion de azan-Mallory. Se llevo a cabo tincion inmunohistoqmmica mediante el metodo de polfmero de dextrano que usa cada uno de un anticuerpo anti-a-SMA monoclonal (1:1000, Sigma), un anticuerpo anti-CD68 (1:500, Dako), y un anticuerpo anti-FITC (1:500, Abcam) y por medio de un kit Envision (Dako), y se llevaron a cabo la coloracion por medio de DAB (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japon) y la tincion nuclear por medio de disolucion de hematoxilina de Gill (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) posteriores.

(3) Inmunotransferencia de tipo Western

Con el fin de evaluar la duracion de la supresion de la expresion por medio de siRNAgp46 in vivo, se sometieron extractos de protema del pancreas 0, 1, 2, 3, y 4 dfas despues de la administracion intravenosa de VA-lip siRNAgp46 a inmunotransferencia de tipo Western de la misma manera que en el ejemplo 3.

(4) Tratamiento de siRNAgp46 in vivo

Se usaron tres grupos de ratas (n = 6 por grupo) para la evaluacion histologica. 43 dfas despues de la administracion de DBTC, se trato cada grupo con administracion de PBS, VA-lip siRNA aleatorio, y VA-lip siRNAgp46 10 veces respectivamente (0,75 mg/kg de siRNA, administrado 10 veces cada dos dfas). Se llevaron a cabo todas las administraciones por medio de la vena de la cola a presion normal con una cantidad de 1 |il/g de peso corporal. Se fijo el pancreas con paraformaldehndo al 10 % y se incrusto en parafina, y luego se tino una seccion usando tincion de azan-Mallory y tincion de hematoxilina-eosina. Se llevo a cabo la tincion inmunohistoqmmica mediante el metodo de polfmero de dextrano usando un anticuerpo anti-a-SMA monoclonal (1:1000, Sigma) y por medio de un kit Envision (Dako), y posteriormente se llevaron a cabo la coloracion por medio de DAB (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japon) y la tincion nuclear por medio de disolucion de hematoxilina de Gill (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Con el fin de llevar a cabo una determinacion cuantitativa precisa de regiones tenidas por medio de azan-Mallory, hematoxilina-eosina, y a-SMA, se seleccionaron aleatoriamente seis campos de bajo aumento (100x) para cada seccion pancreatica de rata y se examinaron usando un microscopio (Axioplan 2; Carl Zeiss, Inc). Se tomo una imagen digital por medio de un sistema de grabacion de video que usaba un sistema de camara de TV digital (Axiocam High Resolution color, Carl Zeiss, Inc.). Se determino la proporcion de la region tenida por azan-Mallory y a-SMA en una fotograffa de microscopio digital usando un programa de analisis de software automatico (KS400, Carl Zeiss, Inc.).

(5) Ensayo de hidroxiprolina

Se determino el contenido de hidroxiprolina mediante el metodo de Weidenbach segun un informe previo (Weidenbach et al. Digestion 1997; 58: 50-57). Resumidamente, se centrifugaron residuos de celulas pancreaticas a 3000 rpm durante 15 minutos, se hidrolizo completamente un sedimento en HCl 6 N a 96 °C durante 16 horas, se ajusto el pH a de 6,5 a 7,5, y se sometio de nuevo a centrifugacion (a 3000 rpm durante 15 minutos). Se secaron 25 |il de una almuota a 60 °C, y se disolvio el precipitado en 1,2 ml de isopropanol al 50 % y se incubo en 200 ml de tampon de acido acetico/acido cftrico (pH 6,0) que contema disolucion de cloramina T al 0,56% (Sigma). Despues de incubar a 25 °C durante 10 minutos, se anadio 1 ml de reactivo de Ehrlich, y se incubo la mezcla a 50 °C durante 90 minutos. Despues de enfriar, se midio la absorcion a una longitud de onda de 560 nm.

(6) Actividad colagenasa de residuos de celulas pancreaticas

Se llevo a cabo la medicion de la actividad colagenasa mediante un metodo modificado de un informe previo (Iredale et al. J. Clin. Invest. 1998; 102: 538-549). Resumidamente, se trituro pancreas extrafdo de una rata de tipo natural y una rata modelo de fibrosis pancreatica y se congelo con nitrogeno lfquido en hielo en un tampon de muestra (50 mM Tris, pH 7,6, Triton X-100 al 0,25 %, NaCl 0,15 M, CaCl2 10 mM) que contema un inhibidor de proteasa de serina y tiol (PMSF 0,1 mM, leupeptina 10 |iM, pepstatina A 10 |iM, aprotinina 25 |ig/ml, yodoacetamida 0,1 mM). Se centrifugo el residuo celular a 4 °C y 14000 g durante 30 minutos, eliminando asf el residuo celular y agregado de protema. Se determino la actividad colagenasa en los residuos de celulas pancreaticas usando un kit conjugado de colageno de ensayo de colagenasa EnzCheck (Molecular Probes) segun el manual de instrucciones. En paralelo a lo mismo, se llevo a cabo un analisis usando un control negativo y control positivo adecuados (colagenasa bacteriana),

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y se expresaron los resultados como fluorescencia de colageno degradado por mg de protema (determinado mediante densidad optica a 280 nm en comparacion con patron de albumina serica).

Resultados

En secciones del pancreas consecutivas, se inmunotineron celulas estrelladas activadas y siRNAgp46-FITC, y los resultados fueron los que en el grupo tratado con VA-lip siRNAgp46-FITC, en una region en la que se agregaron celulas estrelladas activadas (celulas positivas para a-SMA), se identificaron celulas positivas para FITC, mientras que en el grupo tratado con Lip siRNAgp46-FITC, el numero de celulas positivas para FITC identificadas en una region positiva para a-SMA fue muy pequeno (figura 15 A y B).

Tambien se observaron celulas positivas para FITC en una region positiva para a-SMA en una muestra de Idgado (figura 15C). Este resultado coincide con el conocimiento de que DBTC no solo induce fibrosis pancreatica sino tambien cirrosis hepatica. En otros organos de rata, incluyendo el pulmon y el bazo, se tineron pocas celulas con FITC en una region con infiltracion de macrofagos (celulas positivas para CD68) (figura 15D y E), lo que sugena la incorporacion no espedfica de siRNAgp46-FITC mediante macrofagos. La retina fue negativa en la tincion de FITC (figura 15F), y esto coincide con el conocimiento obtenido en VA-lip siRNAgp46-FAM en cirrosis hepatica. Se piensa que el globo ocular constituye probablemente un sistema independiente debido a la baja permeabilidad de la barrera sangre-retina.

Se confirmo a partir de los resultados de inmunotransferencia de tipo Western que, tambien in vivo, el efecto de siRNAgp46 en la supresion de la expresion de gp46 continuo durante al menos 3 dfas (figura 16A y B).

Se evaluo una rata tratada con DBTC a la que se le habfa administrado VA-lip siRNAgp46 10 veces mediante tincion de azan-Mallory (figura 17 A). La region fibrotica tal como se determino mediante analisis de imagenes computarizado estaba marcadamente reducida en una muestra del grupo tratado con VA-lip siRNAgp46 en comparacion con una muestra de control (P < 0,01) (figura 17B). Este resultado coincidio con datos que mostraban una clara supresion de hidroxiprolina en el pancreas del grupo tratado con VA-lip siRNAgp46 (figura 17C).

Con el fin de evaluar el cambio en celulas estrelladas en el pancreas de rata tras el tratamiento con VA-lip siRNAgp46, se sometio una muestra de pancreas de rata tras el tratamiento con VA-lip siRNAgp46 a tincion de a- SMA, y el resultado mostro que el numero de celulas positivas para a-SMA disminuyo marcadamente en comparacion con el de una rata tratada con Lip siRNAgp46 y PBS (figura 18A y B).

Se midio la actividad colagenasa en residuos de celulas pancreaticas de una rata de tipo natural y una rata tratada con VA-lip siRNAgp46 tratada con DBTC basandose en el supuesto de que la mejora de fibrosis posterior a la supresion de la secrecion de colageno nuevo de PSC mediante administracion de VA-lip siRNAgp46 implica colagenasa derivada de celulas inflamatorias y PSC por sf mismas, y los resultados se muestran en la tabla a continuacion.

[Tabla 1]

Tabla 1. Actividad colagenasa en residuos de celulas pancreaticas de rata

Actividad colagenasa (unidades arbitrarias de fluorescencia/mg protema)

Rata normal: 20500±300

Rata DBTC (dfa 29): 26300±700

Rata DBTC (dfa 57): 25400±1000

Los valores numericos son valores promedio ± desviacion estandar (n=5 para cada grupo)

Tal como se muestra en la tabla, la actividad colagenasa en la rata tratada con DBTC fue casi la misma que la de la rata de tipo natural.

Cuando se comparan las imagenes de tincion de hematoxilina-eosina de las muestras pancreaticas de las ratas tratadas con VA-lip siRNAgp46 y Lip siRNAgp46 tratadas con DBTC en el dfa 65, en la rata tratada con VA-lip siRNAgp46, se observo una clara normalizacion de tejido pancreatico, aunque no fue completa, mientras que en el tejido de rata tratada con Lip siRNAgp46 no se observo normalizacion (figura 19 A). Esto coincidio con la normalizacion del peso pancreatico de la rata tratada con VA-lip siRNAgp46 tratada con DBTC (figura 19 B).

Discusion

A partir de los resultados mencionados anteriormente, puede observarse que debido al tratamiento con VA-lip siRNAgp46, siRNAgp46 se incorpora espedficamente en celulas estrelladas pancreaticas activadas (aPSC) para, por tanto, suprimir la expresion de gp46; como resultado, se suprime la secrecion de colageno de aPSC, y se presenta asf un marcado efecto en la mejora de fibrosis pancreatica. Ademas, se observo una marcada disminucion

Claims

REIVINDICACIONES

1. Composicion farmaceutica para su uso en la regeneracion de tejido normal mediante crecimiento y diferenciacion de celulas madre en un espacio formado debido a una reduccion de colageno acumulado en

5 tejido fibrotico, en la que el tejido fibrotico recibe continuamente un estimulo fibrotico, en la que la

composicion comprende una sustancia reductora de colageno y un retinoide, en la que la sustancia reductora de colageno se une a o se incluye en un portador seleccionado del grupo que consiste en una micela, un liposoma, una microesfera y una nanoesfera, en la que el retinoide se une al portador por medio de un metodo qmmico y/o ffsico, y en la que el retinoide administra espedficamente la sustancia reductora 10 de colageno a celulas que producen colageno.
2. Composicion farmaceutica para su uso segun la reivindicacion 1, en la que la sustancia reductora de colageno se selecciona del grupo que consiste en un supresor de la produccion de colageno por celulas que producen colageno, un promotor de la descomposicion de colageno y un supresor de un inhibidor de la

15 descomposicion de colageno.
3. Composicion farmaceutica para su uso segun la reivindicacion 2, en la que el supresor de la produccion de

colageno por celulas que producen colageno se selecciona del grupo que consiste en un inhibidor de TGFp, HGF o una sustancia que promueve la produccion del mismo, un ligando de PPARy, un inhibidor de

20 angiotensina, un inhibidor de PDGF, relaxina o una sustancia que promueve la produccion de la misma, una

sustancia que inhibe la produccion y secrecion de un componente de matriz extracelular, un supresor de la actividad celular, un supresor del crecimiento celular y una sustancia que induce apoptosis.
4. Composicion farmaceutica para su uso segun la reivindicacion 2, en la que el promotor de la

25 descomposicion de colageno es colagenasa o un promotor de la produccion de colagenasa.
5. Composicion farmaceutica para su uso segun la reivindicacion 2, en la que el supresor de un inhibidor de la

descomposicion de colageno es un inhibidor de TIMP.